Analgesie

Zur Linderung des Operationsschmerzes erhielten die Tiere intraoperativ und an den postoperativen Tagen eins und zwei eine intramuskuläre Injektion von 0,3 mg Buprenorphin (Temgesic, Essex Pharma GmbH, München, Deutschland). Die darüber hinausgehende Analgesie mit Metamizol (Vetalgin®, MSD Tiergesundheit, Unterschleißheim, Deutschland) und Carprofen (Rimadyl®, Pfizer, Berlin, Deutschland) wurde auf das Allgemeinbefinden abgestimmt.

3.6.1 Blutentnahme

Innerhalb der ersten 28 postoperativen Tage (bzw. bei Tieren mit vorgezogener Splenozyteninfusion schon 28 Tage vor der Lungentransplantation) erfolgte die Blutabnahme über den Venenverweilkatheter zu den in Abb. 3.3 angegebenen Zeitpunkten. Bei Bedarf wurden die Probenintervalle individuell angepasst. Die Probenentnahme beinhaltete 1,7 ml heparinisiertes Vollblut zur Blutgasbestimmung (Safe Pico Aspirator, Radiometer, Denmark) sowie zu definierten Zeitpunkten 20 ml heparinisiertes Vollblut für die internen Laboruntersuchungen, wie FACS-Analysen, mit einem Heparingehalt (Heparin-Natrium, Ratiopharm, Ulm, Deutschland) von 40 IE pro ml Blut. Zeitgleich wurde ausserdem 1 ml Serum (S-Monovette^®, Sarstedt, Nürmbrecht, Deutschland) zur Zytokinbestimmung asserviert und einmal wöchentlich wurde zusätzlich Serum zur Bestimmung der Retentionsparameter entnommen. Zudem wurde zur Erstellung eines Differentialblutbildes zu jedem Kontrollzeitpunkt ein Röhrchen mit je 1,5 ml EDTA-Blut (EDTA K Monovette^®, Sarstedt, Nürmbrecht, Deutschland) abgenommen, alle zwei Tage kam ein weiteres EDTA-Röhrchen zur Bestimmung der o.g. Tacrolimusspiegel hinzu. Nach Katheterexplantation wurde zu den Röntgenkontrollen an den postoperativen Tagen 42, 70, 120 und danach in Abständen von acht Wochen, oder bei klinischen Auffälligkeiten, am narkotisierten Tier der Venenwinkel zwischen Vena jugularis externa und interna punktiert. Die zentralvenöse Blutgasmessung (ABL 800 Flex, Radiometer, Willich, Deutschland) diente sowohl der Kontrolle der kardiopulmonalen Funktion über den Sauerstoffpartialdruck und die Sauerstoffsättigung, als auch zur Beobachtung der Elektrolyte und des Säure-Basen-Haushaltes. Die Differentialzellbilder wurden in der Klinik für kleine Klauentiere der Tierärztlichen Hochschule (TiHo) Hannover manuell erstellt. Hier waren vor allem Leukozytenzahl und Verschiebungen der Leukozytenfraktionen sowie die Thrombozytenzahl von Interesse. Die photometrische Bestimmung von Harnstoff- und Kreatininspiegeln (ebenfalls Klinik für kleine Klauentiere der TiHo Hannover) wurde zur frühzeitigen Diagnostik möglicher Nierenschäden infolge nephrotoxischer Nebenwirkungen der immunsuppressiven Therapie durchgeführt. Eosinophilie im peripheren Blut kann ein früher Marker für die Abstoßung von Nieren- und Lebertransplantaten sein (151). Auch bei Herz- und Lungentransplantionen besteht ein signifikanter Zusammenhang zwischen erhöhten Zahlen eosinophiler Granulozyten im peripheren Blut und einer beginnenden akuten Abstoßung (151,152). Eine Lymphozytose ist bereits in der beginnenden vaskulären Phase feststellbar, also zu einem Zeitpunkt, an dem noch keine auffälligen Gewebeschäden sichtbar sind. Damit kann das

wesentlich früher als das Röntgenbild, geben (153).

Abbildung 3.3: BLUTENTNAHMESCHEMA INNERHALB DER ERSTEN 28 POSTOPERATIVEN TAGE. Entlang der Zeitachse A sind die Blutentnahmezeitpunkte für die Tiere mit perioperativer SpTx angetragen. Zeitachse B schematisiert entsprechend die Zeitpunkte bei vorgezogener SpTx. Zu den mit orangenen Pfeilen gekennzeichneten Tagen erfolgten, neben der Überprüfung des Tacrolimusspiegels und der Erstellung eines Differentialzellbildes, zusätzlich eine Serumentnahme für Zytokinbestimmungen sowie eine durchflusszytometrische Analyse der aus dem Vollblut gewonnenen PBMC.

3.6.2 Röntgenologische Untersuchung des Thorax (RöTx)

An den postoperativen Tagen 7, 28, 42, 70, 120 und im Anschluss daran alle acht Wochen, oder bei klinischen Auffälligkeiten, wurden Röntgenaufnahmen (Rotalix tube housing ROT 350 10, Phillips, Hamburg, Deutschland) des Thorax angefertigt, um das Transplantat im Seitenvergleich mit der nativen Lunge darzustellen. Um eine möglichst objektive Bewertung zu gewährleisten, wurde die Ausprägung vorhandener Verschattungen anhand einer Skala von 0 (vollständige seitengleiche Belüftung) bis 4 (homogene Verschattung der linken Lunge bei unveränderter rechter Lunge) eingestuft (Abb. 3.4). Definitionsgemäß wurde die Bewertung L4 nur bei chronisch abgestoßenen Lungen angewandt; bei gleichem röntgenologischem Befund wurden akut abgestoßene Lungen als L3 eingestuft. Die Bewertung nahm eine unabhängige Untersucherin (Dr. Wiebke Sommer, Abt. Herz-, Thorax-, Transplantations- und Gefäßchirurgie der MHH) vor. Besonders im fortgeschrittenen Abstoßungsstadium gibt das Röntgenbild deutliche Hinweise. Die röntgenologische Darstellung des Thorax im perioperativen Zeitraum und im Folgeverlauf ermöglichte außerdem die Diagnose von Komplikationen wie Pleuraerguss oder Pneumothorax (154).

Abb. 3.4: RÖNTGENOLOGISCHE BEISPIELE DER ANGEWANDTEN BEWERTUNGSSKALA. Der Grad der Infiltration wurde immer im Rechts-Links-Seitenvergleich beurteilt und mit einem Score, beginnend bei L0: vollständige beidseitige Belüftung, bis L3/L4: homogene Verschattung der linken Lunge, bei vollständiger Belüftung der rechten Lunge, quantifiziert.

3.6.3 Bronchoskopie

Zu den Röngtenzeitpunkten erfolgte auch eine bronchoskopische Untersuchung der Lunge mittels eines Olympus BF-MP60 Fiber-Bronchoskops mit einer Olympus CLK-3 Kaltlichtquelle (Olympus, Tokio, Japan). Dabei wurde das Bronchoskop über den Beatmungstubus in die Lunge eingeführt um das makroskopische Erscheinungsbild (Farbe, Oberflächenbeschaffenheit und Flüssigkeits- oder Fibrinansammlungen) der Lungen im Seitenvergleich zu bewerten. Neben der Durchführung der visuellen Kontrolle konnten dabei endobronchiale Verlegungen durch Sekret oder Blutkoagel abgesaugt werden. Während der bronchoskopischen Untersuchung wurde zudem die Suffizienz der Bronchusanastomose beurteilt.

3.6.4 Elektive Euthanasie

Eine einseitige Verschattung im Röntgenbild (≥L3), Obliteration der Transplantatbronchien in der Bronchoskopie sowie ein stark eingeschränktes Allgemeinbefinden waren Parameter, die zur Entscheidung für eine elektive Euthanasie herangezogen wurden. Wie zur Operationseinleitung wurden die Schweine mit 0,1 mg/kg KM Tiletamin und 0,1 mg/kg KM Zolazepam sediert und ein intravenöser Zugang in eine oberflächliche Ohrvene gelegt, über welchen sie mit Propofol in Narkose gehalten wurden. Nach vollständiger Blutprobennahme (4x20 ml heparinisiertes Vollblut, Serum, EDTA, Blutgase) folgte die Euthanasie durch eine

Deutschland).

3.6.5 Autopsie

Nach äußerer Begutachtung des Tieres wurde unter sterilen Bedingungen eine Autopsie vorgenommen. Dabei wurde durch beidseitiges Durchtrennen der Rippen-Rippenknorpelgrenze und Absetzen des Sternums der Thorax komplett eröffnet. So konnte das Herz-Lungen-Paket im Tier dargestellt und anschließend zusammenhängend entnommen werden. Die Probenentnahme aus beiden Lungen erfolgte an vier unterschiedlichen Lokalisationen pro Lungenlappen (2x2x2 cm große Gewebestücke). Nach Formalinfixierung wurden diese Präparate in der pathologischen Abteilung des ZTL nach Standardtechnik in Paraffin eingebettet und H/E gefärbt. Die Befundung erfolgte durch eine unabhängige Untersucherin (Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein, Institut für Pathologie, TiHo Hannover) nach den Kriterien der ISHLT wie im folgenden Abschnitt (3.6.6) beschrieben. Im Anschluss erfolgte nach medianer Eröffnung der Bauchhöhle deren sorgfältige Exploration. Aus Leber, Milz und Niere wurden Proben oben genannter Größe entnommen. In Verdachtsfällen weitete man die Probenentnahme auf auffällige Organe aus. Weiterführende mikrobiologische oder virologische Untersuchungen wurden durch die IVD GmbH (Gesellschaft für Innovative Veterinärdiagnostik mbH, Hannover, Deutschland) durchgeführt.

3.6.6 Histologische Beurteilung der Lungenbiopsien

Von der International Society for Heart and Lung Transplantation (ISHLT) wurde seit 1990 ein einheitliches Bewertungsschema für die Histologie der pulmonalen Transplantatabstoßung eingeführt, um die Zusammenarbeit und die Kommunikation zwischen Klinik und Pathologie zu erleichtern. Dieses ISHLT-Grading ist in seiner 2006 überarbeiteten Form bis heute gültig (155). Die histologische Klassifikation der akuten Abstoßung basiert auf der Präsenz perivaskulärer und interstitieller mononukleärer Zellinfiltrate. Die Häufigkeit mononukleärer Zellen, die die Blutgefäße umgeben, lässt Rückschlüsse auf den Schweregrad der Rejektion zu, denn bei fortgeschrittener Abstoßung infiltrieren die Zellen auch die angrenzenden Alveolarsepten. Die Klassifikation erfolgt, international einheitlich, anhand des folgenden Bewertungsschemas: Bei Grad A0 (keine akute Abstoßung) ist das Lungenparenchym im histologischen Präparat frei von mononukleären Infiltraten, Hämorrhagien oder Nekrosen.

Eine minimale akute Abstoßung (A1) ist gekennzeichnet durch vereinzelte perivaskuläre Ringe aus Lymphozyten und plasmazytoiden Zellen. Sie ist, im Gegensatz zur milden akuten

A2 ist das Lungenendothel bereits hyperplastisch oder regenerativ verändert („Endotheliasis“). Entzündungszellen infiltrieren das perivaskuläre Interstitium (vaskuläre Phase), allerdings befinden sich noch keine mononukleären Zellen in den Alveolarsepten oder den Alveolen. In der Phase der moderaten akuten Abstoßung (A3) umgeben breite Schichten mononukleärer Zellen die Blutgefäße, eosinophile und neutrophile Granulozyten infiltrieren die perivaskulären und peribronchialen Alveolarsepten und Alveolen (alveoläre Phase). Im Endstadium, der schweren akuten Abstoßung (A4), befinden sich diffuse mononukleäre Infiltrate um die Blutgefäße, im Interstitium und in den Alveolen. Ausgedehnte Pneumozytenschäden sind sichtbar, einhergehend mit Parenchymnekrosen, Hämorrhagien und Neutrophilie.

3.7 Zusammensetzung der untersuchten Gruppen

Die beiden übergeordneten Gruppen SpTx POD 0 und SpTx POD -28 wurden jeweils noch in drei Untergruppen unterteilt: Beide Gruppen beinhalteten eine Kontrollgruppe, welche zwar zum entsprechenden Zeitpunkt dem Donor-Antigen ausgesetzt wurde, jedoch keine begleitende Induktionstherapie erhielt (KoGru SpTx POD 0/-28). Außerdem waren die Arten der Induktion innerhalb der Gruppen unterschiedlich. Ein Teil der Tiere in jeder Gruppe wurde für die Induktion bestrahlt (IRR+SpTx POD 0/-28), der übrige Teil erhielt zur Induktion Anti-Lymphozyten-Antikörper (mAb+SpTx POD 0/-28).

Gruppe Protokoll Anzahl der Tiere

KoGru SpTx POD 0 perioperativ SpTx 4

IRR+SpTx POD 0 IRR 12 Stunden präOP, perioperativ SpTx 9

mAb+SpTx POD 0 perioperativ mAb +SpTx 4

KoGru SpTx POD -28 SpTx POD -28 5

IRR+SpTx POD -28 IRR POD -28, SpTx POD -27 3

mAb+SpTx POD -28 mAb POD -28, SpTx POD -27 9

Table 3.2: ÜBERSICHT DER IM RAHMEN DIESER ARBEIT MITEINANDER VERGLICHENEN VERSUCHSGRUPPEN mit Benennung der einzelnen Gruppen, dem jeweils angewandten Protokoll und der untersuchten Tierzahl.

3.8.1 Isolation peripherer Blutlymphozyten

Zur Isolation der mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut (PBMC) wurde eine Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt. Hierbei trennen sich die in Lösung befindlichen Zellen aufgrund ihrer Größe und ihres spezifischen Gewichts. Dafür wird die zu untersuchende Probe auf die Oberfläche eines Lösungsmittels mit definierter Dichte gegeben (z.B. Ficoll). Durch diese diffundieren die Blutbestandteile hindurch, die eine höhere Dichte als das Lösungsmittel haben (z.B. Erythrozyten). Bestandteile mit geringerer Dichte (z.B.

Leukozyten) verbleiben an dessen Oberfläche. Nach der durch Zentrifugation beschleunigten Auftrennung können nun die voneinander abgetrennten Zellfraktionen einzeln entnommen werden (156). In unserem Labor wurden je 20 ml heparinisiertes Vollblut im Verhältnis 1:1 mit steriler, 4°C kalter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, Invitrogen Limited, Paisley, Schottland) verdünnt und das Gemisch auf 10 ml Ficoll (Ficoll PaqueTM PLUS, Biotech, Uppsala, Schweden) in einem 50 ml Falcon-Tube (Sarstedt AG und Co., Nümbrecht, Deutschland) überschichtet. Im Anschluss an eine 20-minütige Zentrifugation bei 2000 rpm und 20°C (Allegra X-15R, Beckmann Coulter, München, Deutschland) konnte der Leukozytenrasen auf der oberen Grenze der Ficollschicht abgenommen und in ein 15 ml Falcon-Tube überführt werden. Zweimaliges Waschen mit 15 ml PBS entfernte vorhandene Ficoll-Reste. Nach Dekantieren wurden die isolierten Zellen mit PBS auf ein definiertes Volumen von 1 ml aufgefüllt. 10 μl der so gewonnenen Leukozytenfraktion wurden in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß (Sarstedt AG und Co., Nümbrecht, Deutschland) überführt und mit 990 μl 0,05-prozentigem Trypan-Blau (Biochrom AG, Berlin, Deutschland) gefärbt. Die Bestimmung der Zellzahl pro ml Eluat erfolgte manuell mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer (eine gezählte Zelle entsprach in der verwendeten Verdünnung einer Million Zellen pro ml). Die Zellsuspension wurde bis zur Weiterverarbeitung bei 4°C gelagert. Zu konservierende Zellen wurden im Verhältnis 1:1 mit 10 % fetalem Kälberserum (Biochrom AG, Berlin, Deutschland) und Dimethylsulfoxid (DMSO, Sigma, Deisenhofen, Deutschland) in 1,8 ml Cryoröhrchen (Nunc Cryo TubeTM Vials, Wiesbaden, Deutschland) bei -80°C bis zur weiteren Verarbeitung gelagert.

3.8.2 Durchflusszytometrische Analyse

Die Durchflusszytometrie ist ein Verfahren, bei dem Zellen aufgrund ihrer Größe, Granularität und Färbung mit fluoreszierenden Farbstoffen unterschieden werden. Die in Lösung befindlichen Zellen werden durch eine Kapillare einzeln an einem Laserstrahl

Fluoreszenzimpulse werden gemessen. Anhand des Vorwärtsstreulichts (FSC, Forward Scatter) werden Zellen anhand ihrer Größe unterschieden. Das Seitwärtsstreulicht (SSC, Side Scatter) stellt ein Maß für die Granularität der Zellen dar. Diese beiden Parameter ermöglichen eine gute Differenzierung der Leukozyten von anderen mononukleären Zellen oder Zelltrümmern. Zur weitergehenden Unterscheidung werden die Zellen mit antikörpergebundenen Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Durch den Einsatz unterschiedlicher Farbstoffe sowie Laser unterschiedlicher Wellenlänge kann man mehrere Oberflächenantigene in einer Probe bestimmen (157).

Je 200.000 PBMC wurden in FACS-Röhrchen mit Rundboden (Sarstedt, Nürmbrecht, Deutschland) überführt und vor dem ersten Färbeschritt mit 15 μl porzinem Serum (Biochrom AG, Berlin, Deutschland) bei 4°C für 10 Minuten inkubiert. Dadurch wurden unspezifische Bindungsstellen geblockt. Für Antikörperfärbungen, bei denen der Antikörper nicht mit seinem Fluoreszenzfarbstoff als Konjugat vorlag, erfolgte die Färbung mit antigenspezifischen Primär- und Sekundärantikörpern in zwei aufeinanderfolgenden Schritten. Der Primärantikörper wurde spezifisch für das zu charakterisierende Oberflächenantigen der Zelle gewählt. Der gewählte Sekundärantikörper entsprach in seiner Spezifität dem Ig-Subtyp des verwendeten Primärantikörpers. Jeder Färbeschritt beinhaltete eine 20 minütige Inkubation bei 4°C unter Lichtausschluss. Ungebundene Antikörper wurden nach Waschen mit 1,5 ml PBS und vierminütiger Zentrifugation bei 1600 rpm und 4°C mit dem Überstand dekantiert.

3.8.3 Verwendete Antikörper

Das Markieren von Zelloberflächenstrukturen durch spezifische Antikörper, welche wiederum mit bestimmten Farbstoffen markiert sind, macht es möglich, verschiedene Zell- und Zellsubpopulationen durchflusszytometrisch zu differenzieren und so den immunologischen Phänotyp zu charakterisieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Lymphozyten des peripheren Bluts mit Hilfe verschiedener Oberflächenantigene charakterisiert. Da CD3 auf allen T-Zellen vorkommt, wurde ein entsprechender Antikörper verwendet, um diese Zellen sichtbar zu machen. CD4 besitzt als spezifischer Rezeptor für MHC II Moleküle eine Schlüsselfunktion in der Antigenerkennung durch T-Helferzellen. CD8 ist Teil des spezifischen Rezeptors der zytotoxischen T-Zelle für MHC I Moleküle. Ein Marker für aktivierte T-Lymphozyten ist CD25, die α-Kette des IL-2 Rezeptors, welcher erst nach erfolgreicher Antigenerkennung

(158). Folgende Antikörper fanden Verwendung:

• CD3ε mAb, Klon: PPT3, mouse anti-pig, FITC-konjugiert (Abcam, Cambridge, UK)

• CD25 mAb, Klon: PGBL25A, mouse anti-pig (Kingfisher Biotech, MN, USA)

• CD4a mAb, Klon: 74-12-4, mouse anti-pig, FITC-konjugiert (Southern Biotech, AL, USA)

• CD8a mAb, Klon: 76-2-11, mouse anti-pig, PE- konjugiert (Abcam, Cambridge, UK)

Da CD25 mAb nicht mit seinem Farbstoff als Konjugat erhältlich war, wurde er mit folgendem Sekundärantikörper gefärbt:

• R-Phycoerythrin-(PE) konjugierter rat anti-mouse IgG1 mAb, Klon: A85-1 (BD Pharmingen, San Jose, CA, USA)

Die Induktionstherapie einiger Tiere erfolgte in diesem Experiment durch selbst produzierten anti-CD4 mAb (Klon 74-12-4) beziehungsweise anti-CD8 mAb (Klon 76-2-11). Um sicherzugehen, dass bei einem fehlenden Signal diese Zellen tatsächlich durch die vorangegangene Antikörpergabe aus dem Organismus eliminiert worden waren, und nicht nur die Bindungsstellen für die Antikörper schon besetzt waren, wurden die Zellen dieser Schweine zusätzlich mit einem jeweils unterschiedlichen Klon für CD4 bzw. CD8 Moleküle angefärbt:

• CD4a mAb, Klon: MIL-17, mouse anti-pig, FITC-konjugiert (AbD Serotech, Puchheim, Deutschland)

• CD8a mAb, Klon: MIL-12, mouse anti-pig, PE/Cy5-konjugiert (AbD Serotech, Puchheim, Deutschland)

In Tabelle 3.3 sind die Antikörper und deren verwendete Mengen aufgeführt. Einige Antikörper fanden in einer 1:10er Verdünnung Verwendung, der Sekundärantikörper war im Verhältnis 1:5 mit PBS verdünnt. Um ausschließen zu können, dass der Sekundärantikörper unspezifisch an die PBMC bindet, wurde eine Isotypkontrolle mitgeführt.

10 µl IgG1 PE

Tabelle 3.3: BEISPIEL FÜR EIN FÄRBEPROTOKOLL ZUR DURCHFLUSS-ZYTOMETRISCHEN ANALYSE. Nach jedem Färbeschritt erfolgte ein Waschschritt mit 1,5 ml PBS. Tube (Röhrchen) 1 beinhaltet die Isotypkontrolle des Sekundärantikörpers für CD25.

Die Datenauswertung erfolgte mit Hilfe der Software FACSDiva (BD, New Jersey, USA) und Windows XP. Zur Ermittlung der absoluten Zellzahl wurde der durch FACSDiva ermittelte prozentuale Anteil der analysierten Lymphozytensubpopulationen in Bezug gesetzt zur absoluten Lymphozytenzahl aus dem Differentialblutbild.

3.9 Untersuchungen zum Spenderzellchimärismus

Zum Nachweis Y-chromosomaler Spenderlymphozyten im peripheren Blut des Empfängers wurde eine SybrGreen R Real Time Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) durchgeführt. Des Weiteren wurde mithilfe der RT-PCR der Anteil Y-chromosomaler DNA in den Spenderlungen sowie in den rechten autologen Lungen zum Zeitpunkt der elektiven Euthanasie bestimmt. Y-Chromosom-spezifische Sequenzen ermöglichen nach Transplantationen die Detektion verbleibender männlicher Zellen in einem weiblichen Empfängerorganismus (159). Da für die Durchführung der Real Time PCR die Proben gepoolt wurden und die Messung erst nach Versuchsende stattfand, wurden zunächst, wie unter 3.8.1 beschrieben, von jedem Tier an den Kontrolltagen (siehe Abb. 3.3), 1x10⁶ PBMC gewonnenen und die Zellen in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß (Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Deutschland) bei -80°C als Pellet eingefroren. Auch die Lungengewebeproben wurden als etwa 0,8 cm³ große Biopsien bei -80°C kryokonserviert. Die spätere chromatographische Isolation der dsDNA (Doppelstrang-DNA) erfolgte gemäß Herstellerangaben mit dem NucleoSpin Tissue Kit (Machery&Nagel, Düren, Deutschland). Zur Bestimmung von Reinheit und Konzentration der DNA Lösungen wurde deren optische Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 260 und 280 nm photometrisch bestimmt (Eppendorf Bio-Photometer No.

pro Reaktionsansatz 100 ng dsDNA benötigt wurden, wurde zur Vereinfachung die Konzentration direkt auf 100 ng/10 μl eingestellt. Zum Nachweis Y-chromosomaler dsDNA wurde ein Primerpaar verwendet, das eine 185 Basenpaare (bp) lange, Eberspezifische Sequenz (Male Specific Repeat, MSR) auf dem Y-Chromosom detektiert:

Male Specific Repeat (MSR)

5’ - CCA TCG GCC ATT GTT TTC CTG TTC A - 3’

5’ - CCT CTG TGC CCA CCT GCT CTC TAC A - 3’

Zur Quantifizierung und Qualitätskontrolle der dsDNA wurde ein 184 bp langes Intron aus dem porzinen S100C Gen amplifiziert. Zur relativen Quantifizierung wurde die Menge Y-chromosomaler DNA auf den S100C Gehalt in derselben Probe bezogen. Folgendes Primerpaar wurde verwendet:

S 100C

5’ - ATG CTG GAA GGG ACG GTA ACA ACA - 3’

5’ - GCT CAG CTG CTG TCT TTC ACT CGT - 3’

Alle Primer wurden von der Firma Invitrogen life technologies (Paisley, Großbritannien) synthetisiert und in einer Endkonzentration von 10 pmol/μl eingesetzt. Alle Reaktionen erfolgten im Zweifachansatz. Zur Minimierung von Pipettierfehlern wurde aus IQ^TM SYBR^®Green Supermix (BIORAD, Hercules, CA, USA), Wasser und den beiden Primerpaaren im Parallelansatz ein Mastermix vorgemischt.

Ein Reaktionsansatz setzte sich wie folgt zusammen:

Anzahl der benötigten Reaktionen n zu ermitteln wurde eine Verdünnungsreihe aus rein männlicher dsDNA in folgenden Verdünnungsstufen erstellt: 100 %, 50 %, 20 %, 10 %, 1 %, 10^-1 %, 10^-2 %, 10^-3 %. Diese wurden in der anschließenden PCR als Template eingesetzt. Anhand der erstellten

bestimmt. Abb. 3.5 zeigt eine so ermittelte Standardeichkurve.

Abb. 3.5: BIORAD ICYCLER-SOFTWARE^TM ERMITTELTE STANDARDEICHKURVE FÜR DEN MSR-PRIMER. Punkte in Blau stellen den definierten Standard dar, entlang der Y-Achse sind die Verdünnungsstufen angetragen (10^-3 bis 10²). Auf der daraus resultierenden Regressionsgeraden sind die analysierten Werte der vorher unbekannten Proben (Unknowns) in Rot angesiedelt.

Die optimalen PCR-Bedingungen wurden von Bianca Kruse im Rahmen ihrer Dissertation zu diesem Thema ermittelt (142). Nach der PCR-Reaktion erfolgte die Auswertung unter Benutzung der BIORAD iCycler-Software^TM Version 3.1 (BIORAD, Hercules, CA, USA).

Das Mittel der durch die Software analysierten Ausgangskonzentration (Starting Quantity = SQ Mean) des Housekeepinggens S100C, sowie des nachzuweisenden MSR, wurde mit Excel zueinander in Bezug gesetzt. Der daraus resultierende Mittelwert der Positivkontrollen wurde als 100% angenommen und die Ergebnisse der zu messenden Proben darauf bezogen.

3.10 Gewinnung monoklonaler Antikörper für die Induktionstherapie

Die Kultivierung der Hybridoma-Zelllinien ATCC^® HB-147^™ (für den CD4 mAb 74-12-4), sowie ATCC^® HB-143^™ (für den CD8 mAb 76-2-11), welche die Antikörper exprimierten und sezernierten, erfolgte in Zellkulturflaschen für Suspensionszellen (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) unter sterilen Bedingungen in serumfreiem ISF-1 Medium (Biochrom AG, Berlin, Deutschland) in einem Brutschrank (Modell MCO-20AIC, SANYO Electric Biomedical Co., Ltd., Osaka, Japan) bei 37°C, 5 % CO2 und 100 % Luftfeuchtigkeit. Alle drei Tage bzw. bei Verfärbung des Mediums wurde die Suspension in ein 50 ml Falcon (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) überführt und bei 1500 rpm vier Minuten lang abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde gedrittelt, erneut in Zellkulturflaschen mit Medium überführt und weiterhin

Vakuumfilter mit einer Porengröße von 0,22 µm (TPP, Trasadingen, Schweiz) sterilfiltriert und im Verhältnis 1:1 mit einem Bindungspuffer (20 mM Natriumphosphat, pH 7; Merck, Darmstadt, Deutschland) versetzt. Eine definierte Menge dieses Gemisches wurde dann mit Hilfe eines Hochleistungsflüssigkeitschromatographen (HPLC; Äkta Prime Plus, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) durch eine Säule geleitet, welche mit einer Protein G-haltigen Gelmatrix gefüllt war (HiTrap Protein G HP, ebenfalls GE Healthcare). Dabei banden die Immunglobuline an das Protein G und wurden zurückgehalten, während die restliche Flüssigkeit abgeleitet wurde. Mithilfe eines Elutionspuffers (0,1 M Glycin-HCl, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland), dessen pH-Wert sich im sauren Bereich (2,0-2,8) befand, wurden anschließend die Immunglobuline vom Protein G gelöst und ausgewaschen.

Zur Schonung der Antikörper war in den Auswurfröhrchen für das Eluat 1 M Tris-Puffer (Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland) vorgelegt, sodass der saure Elutionspuffer auf einen pH von 7 abgepuffert wurde. Nach erneuter Sterilfiltration des Eluats wurde aus dem Pool einer Tagesproduktion jeweils ein Aliquot zur Quantifizierung abgenommen und mittels Bradford Assay (Quick Start^TM Bradford Dye Reagent, Bio-Rad Laboratories, CA, USA) photometrisch bei OD 595 nm gemessen. Abhängig von der Produktivität der Hybridoma-Zellen und dem daraus resultierenden Ausgangsgehalt an Antikörpern im Überstand, schwankte der gemessene Proteingehalt zwischen 0,1 und 0,4 mg/ml. Bis zu ihrer Verwendung wurden die gewonnenen Antikörper bei -20°C gelagert.

Bevor sie den Tieren verabreicht wurden, wurde die komplette Produktion gepoolt, der pH-Wert mit Hilfe von 2 molarer Natronlauge (TitriPUR^®, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) an einem pH-Meter (Labor-pH-Meter 765, Knick, Berlin, Deutschland) auf 7,35 eingestellt und ein letztes Mal sterilfiltriert.

3.10.1 Qualitätskontrolle der gewonnenen Antikörper

Da die Gewinnung der Antikörper unter Laborbedingungen (S2 Gen-Labor, keine Reinräume)

Da die Gewinnung der Antikörper unter Laborbedingungen (S2 Gen-Labor, keine Reinräume)

Im Dokument Untersuchung alternativer zytoreaktiver Protokolle in der Induktion von Transplantationstoleranz bei porziner allogener Lungentransplantation (Seite 56-0)