Versuchsgruppen

Im Rahmen dieser Arbeit wurde anhand von porzinisierten Mäusen der Effekt der vorgezogenen Induktionstherapie auf das Verhalten der alloreaktiven Zellen des Empfänger-Minipigs auf das Spenderantigen untersucht. Zum einen wurde das histologische Schicksal der Bronchi, welche mit PBMC aus nicht-vorbehandelten (naїven) Empfänger-Minipigs rekonstituiert wurden (Gruppe naїve PBMC), verglichen mit den Bronchi aus Mäusen, die PBMC aus mit Antikörpern vorbehandelten Empfänger-Minipigs (Gruppe geprimte PBMC) erhielten. Zudem wurde eine Kontrollgruppe, mit Mäusen welche keine PBMC sondern physiologische Kochsalzlösung (negative Kontrollgruppe) erhalten hatten, angelegt.

Ein weiterer Mechanismus, der in diesem Setup beleuchtet wurde, war der direkte sowie indirekte Einfluss der anti-CD4- sowie anti-CD8-Antikörper, welcher einigen der Schweine als Induktionstherapie verabreicht wurde, auf das Transplantat. Für diese Untersuchungen wurden vier weitere Gruppen gebildet: Die Gruppe CD4 mAb erhielt 60 µg anti-CD4 mAb ohne PBMC, der Gruppe CD8 mAb wurde 60 µg anti-CD8 mAb verabreicht. Die Gruppe naïve PBMC+CD4 mAb erhielt zusammen mit den alloreaktiven PBMC 60 µg anti-CD4 mAb, die Gruppe naïve PBMC+CD8 mAb entsprechend 60 µg anti-CD8 mAb zusammen mit PBMC. Tabelle 3.4 zeigt eine Übersicht der Gruppen.

Gruppe Protokoll / Applikation von: Anzahl der Tiere

naїve PBMC PBMC aus naïven Minipigs 4

geprimte PBMC PBMC aus vorbehandelten Minipigs 2 negative Kontrolle Physiologische Kochsalzlösung 12

CD4 mAb anti-CD4 mAb 4

CD8 mAb anti-CD8 mAb 3

naїve PBMC + CD4 mAb PBMC + anti-CD4 mAb 4

naїve PBMC + CD8 mAb PBMC + anti-CD8 mAb 4

Tabelle 3.4: AUFSTELLUNG DER PORZINISIERTEN MÄUSE NACH BEHANDLUNGSPROTOKOLL.

3.12 Detektion von Zytokinen im Serum von Minipigs und Mäusen

Zu den unter 3.6.1 beschriebenen Kontrollzeitpunkten wurde von den Minipigs unter anderem Serum für die Untersuchung auf spezifische Zytokine abgenommen. Außerdem wurde aus den unter 3.11 beschriebenen ‚porzinisierten Mäusen‘ am Tag der Sektion (28 Tage nach BronchusTx) Serum für diese Untersuchungen asserviert. Die Messung der Zytokine erfolgte in Zusammenarbeit mit Frau Professorin C. Falk, Institut für Transplantationsimmunologie der MHH, anhand eines Luminex® 200^TM Systems (Luminex Corporation, Austin, Texas, USA). Dazu wurden 80 µl der zu untersuchenden Probe zusammen mit 80 µl Sample Diluent (Bio-Rad Laboratories, München, Deutschland) in eine 96-Well Rundboden-Platte (Greiner, Frickenhausen, Deutschland) pipettiert. Vor dem Messen wurden in jedes Well mit Farbcodes markierte Beads gegeben. Diese Beads sind an Antikörper gekoppelt, welche für das zu detektierende Zytokin spezifisch sind. Gebundene Zytokine werden anschließend durch einen PE-gelabelten Capture-Antikörper sichtbar gemacht.

Abb. 3.10: BEISPIEL EINES BEAD-ZYTOKIN-ANTIKÖRPER-KOMPLEXES. An den mit

Antikörper gekoppelt ist, bindet das entsprechende Zytokin, welches dann durch einen fluoreszierenden Zweit-Antikörper sichtbar gemacht wird.

Das Luminex® 200^TM kann pro Durchlauf bis zu 100 Zytokine messen. Ein erster Laser detektiert den Farbcode des Beads und ordnet ihn so dem entsprechenden Zytokin zu. Ein zweiter Laser liest die Fluoreszenz aus. Da nur ein Fluoreszenzsignal abgegeben wird wenn an das Bead das entsprechende Zytokin mit PE-gelabeltem Capture-Antikörper gebunden hat, lassen sich so Rückschlüsse auf das Vorkommen des Zytokins in der zu untersuchenden Probe ziehen.

In den hier beschriebenen Experimenten kamen ein Bio-Plex Pro™ Human Cytokine 21-plex Assay (IL-1α, IL-2Rα, IL-3, IL-12(p40), IL-16, IL-18, CTACK, GRO-α, HGF, IFN-α2, LIF, MCP-3, M-CSF, MIF, MIG, β-NGF, SCF, SCGF-β, SDF-1a, TNF-β, TRAIL zuzüglich ICAM und VCAM) und ein Bio-Plex Pro™ Human Cytokine 27-plex Assay (1, ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12(p70), IL-13, IL-15, IL-17, Eotaxin, FGF Basic, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, IP-10, MCP-1 (MCAF), MIP-1α, MIP-1β, PDGF-BB, RANTES, TNF-α, VEGF, alles Bio-Rad Laboratories, München, Deutschland) zum Einsatz.

Da diese Kits Human-spezifisch und für Schweine-Zytokine nur kreuzreaktiv sind, wurde erst in der Auswertung festgestellt, welche Antikörper mit Minipig-Zytokinen kreuzreaktiv waren.

Die Standardkurven und Konzentrationen wurden durch den Bio-Plex Manager 6.0 errechnet.

3.13 Statistik

Die Versuchsergebnisse werden in den Tabellen und Abbildungen allgemein als arithmetische Mittelwerte (xˉ ) mit entsprechender Standardabweichung (SD) oder entsprechendem Standardfehler der Mittelwerte (SEM), angegeben. Dabei kennzeichnet n die Anzahl der für die Versuche herangezogenen Tiere. Die Berechnung der Mittelwerte, Standardabweichungen und Standardfehler der Mittelwerte, die graphische Darstellung sowie die statistische Auswertung der Ergebnisse erfolgte mit dem Programm GraphPad Prism (GraphPad Prism Version 6.04 for Windows, GraphPad Software Inc., San Diego, CA 92121, USA, www.graphpad.com). Da die Daten größtenteils nicht normalverteilt waren, erfolgte der Mittelwertvergleich zwischen den Gruppen an einzelnen Tagen mittels one way ANOVA, ergänzt durch den Dunns post hoc Test für multiple Vergleiche. Analog dazu erfolgte der Vergleich von gepaarten Datensätzen mittels two way ANOVA, ergänzt durch Turkeys post

Definition:

p > 0.05 nicht signifikant (n.s.) p* = 0.01 bis 0.05 signifikant

p** = 0.001 bis 0.01 hoch signifikant p^*** ≤ 0.001 höchst signifikant.

4 Ergebnisse

4.1 Auswahl der Tiere

Aus dem bestehenden Schweinekontingent von 47 transplantierten Schweinen standen nach Ausschluss der Tiere, die nicht aufgrund einer Transplantatabstoßung elektiv getötet worden waren, 34 Tiere für weitergehende Untersuchungen zur Verfügung. Gründe die zum Ausschluss führten, waren konkret das Versterben eines Tieres innerhalb der ersten 28 postoperativen Tage, wenn ihr Tod nicht mit dem angewandten Protokoll in Verbindung gebracht werden konnte. Kam es zu einem späteren Zeitpunkt zum akzidentiellen Tod eines Empfängertieres, so wurde abhängig vom letzten Röntgenbild und der abschließenden histologischen Untersuchung entschieden, ob das entsprechende Tier aufgrund der Eindeutigkeit dieser Ergebnisse, in Zusammenhang mit dem zeitlichen Abstand zur Transplantation mit einer hohen Wahrscheinlichkeit den Abstoßern oder den langzeitüberlebenden Tieren zugeordnet werden, und somit trotzdem mit eingeschlossen werden konnte. Der Übersicht halber sind in Tabelle 4.1 nur die für diese Arbeit verwendeten Tiere aufgeführt.

Tabelle 4.1: AUFLISTUNG DER IN DIESER ARBEIT VERWENDETEN TIERE mit Tier- ID, jeweilig angewendetem Behandlungs-Protokoll, Überlebenstage mit Besonderheiten (PCMV=Porzines Cytomegalie Virus), histologischem sowie röntgenologischem Grading zum Todeszeitpunkt (HAR= Hyperakute Abstoßung), SLA I Mismatchstellen und Zellzahl der

Probe vor.

4.2 Transplantatüberleben

In älteren Untersuchungen in unserem Minipigmodell konnte gezeigt werden, dass es nach dem Absetzen der pharmakologischen Immunsuppression, und in Abwesenheit anderer immunsuppressiver Protokollbestandteile, etwa 14 bis 42 Tage dauert bis die Tiere ihr Transplantat abstoßen. Folglich wurde bei Tieren, die bis zum 120. postoperativen Tag keine Anzeichen der Abstoßung zeigten, dem jeweils verwendeten Protokoll ein protolerogener Effekt zugeschrieben. Umso länger keine Abstoßung beobachtet werden konnte, desto höher wurde der Erfolg beurteilt. Da für Tiere, welche nie ein Zeichen einer Transplantatabstoßung zeigten, der Zeitpunkt für die elektive Euthanasie willkürlich gewählt wurde (zum Teil jenseits POD 800), wurde in dieser Arbeit der postoperative Tag 328 als jener Tag definiert, an dem das Versuchsziel einer langfristigen Transplantattoleranz als erreicht galt. Tabelle 4.2 zeigt eine Übersicht des Transplantatüberlebens in den jeweiligen Gruppen. Da in Gruppe IRR+SpTx POD 0 mehr als 50 % der Tiere das Versuchsziel erreichten, also schließlich elektiv getötet wurden, ohne Zeichen der Abstoßung zu zeigen, konnte für diese Gruppe kein medianes Überleben berechnet werden (‚undefined‘). Aus diesem Grund ist zusätzlich das durchschnittliche Überleben (xˉ ) ± Standardfehler (SD) berechnet worden. Abbildung 4.1 stellt die Verteilung der Überlebenstage der einzelnen Tiere dar.

Tabelle 4.2: ÜBERSICHT ÜBER DAS TRANSPLANTATÜBERLEBEN:

Abb. 4.1: VERTEILUNG DER TIERE HINSICHTLICH IHRES TRANSPLANTATÜBERLEBENS. Die Boxplots zeigen den Todeszeitpunkt / den Zeitpunkt der elektiven Euthanasie der einzelnen Minipigs. Die Säulendiagramme der perioperativ mit Splenozyten behandelten Tiere sind hellgrün hinterlegt, die der vorbehandelten Tiere rot. Sie visualisieren das resultierende durchschnittliche Überleben in Tagen, mit ihrem Standardfehler (SD) in grau. Anhand des Dunns post hoc test (one way ANOVA) sind statistisch keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen messbar.

Da in dieser Arbeit der Erfolg der Induktion mit Bestrahlung (IRR) verglichen werden sollte mit dem Erfolg einer Induktionstherapie durch anti-T-Lymphozyten-spezifische monoklonale Antikörper (mAb), wurde zunächst das Überleben dieser beiden Gruppen, zusammen mit den entsprechenden Kontrollgruppen zu den untersuchten Zeitpunkten POD -28 und POD 0 miteinander verglichen (Abb. 4.2 A+B). Bei den Tieren welche schon 28 Tage vor der Transplantation induziert worden waren, lässt sich zwischen beiden induzierten Gruppen kein signifikanter Unterschied im Transplantatüberleben feststellen. Bis zum postoperativen Tag 266 hatten alle Schweine dieser Gruppen ihre Lungen abgestoßen. Es fällt allerdings auf, dass die dazugehörige Kontrollgruppe mit zwei Schweinen, welche ihr Transplantat bis zum Versuchsende nicht abstießen, ein sichtbar besseres Überleben zeigte (Abb 4.2 A). Anders verhielt es sich mit der Induktion an POD 0. Während alle Tiere der mAb-Gruppe ihr Transplantat bis zum POD 121 abstießen, wurden >50 % der IRR-Gruppe zu sogenannten Langzeitüberlebern. Hier hatten auch in der entsprechenden Kontrollgruppe alle Minipigs ihre transplantierten Lungen bis zum postoperativen Tag 121 abgestoßen (Abb. 4.2 B).

zusammengefasst und hinsichtlich ihres Transplantatüberlebens mit den beiden durch Antikörper induzierten Gruppen verglichen. Tiere, welche einem Induktionsprotokoll mit monoklonalen Antikörpern unterzogen worden waren, stießen ihre Lungen signifikant früher ab als solche, die präoperativ bestrahlt worden waren (p= 0,02, Abb. 4.2 C). Außerdem wurde insgesamt der Erfolg einer vorgezogenen Induktionstherapie (IRR bzw. mAb POD -28) verglichen mit derselben Induktion im direkten perioperativen Zeitraum (IRR bzw. mAb POD 0, Abb. 4.2 D). Hier konnte beobachtet werden dass Tiere, welche eine vorgezogene Induktionstherapie erhalten hatten, insgesamt ein früheres Transplantatversagen zeigten als solche, die ihre Induktion perioperativ erhielten, auch wenn der Unterschied statistisch mit p=0,066 knapp nicht signifikant war. Fünf Tiere aus der Gruppe mAb+SpTx POD -28 sowie zwei Tiere aus der KoGru SpTx POD -28 stießen ihre Lungen sogar hyperakut ab.

Abb. 4.2: ÜBERLEBENSKURVEN DER MIT BESTRAHLUNG ODER ANTIKÖRPERN INDUZIERTEN GRUPPEN IM VERGLEICH. Abbildung A+B vergleichen die unterschiedliche Induktion zum selben Zeitpunkt. In Abbildung C werden alle mit Bestrahlung induzierten Tiere mit allen Antikörper-induzierten Tieren verglichen, unabhängig vom Zeitpunkt der Induktion. Abbildung D zeigt den Einfluss des Induktionszeitpunkts, unabhängig

rank (Mantel-Cox)Test herangezogen.

4.3 Röntgenologische Befunde

Die Bewertung der Röntgenbilder erfolgte, wie unter 3.6.2 beschrieben, anhand einer Skala von 0 (vollständige seitengleiche Belüftung) bis 4 (homogene Verschattung der linken Lunge bei unveränderter rechter Lunge). Sieben Tage nach der Transplantation zeigten die Röntgenaufnahmen des Thorax bei allen Tieren leichte bis mäßige homogene (L1-3) Verschattungen des Transplantats. Zu diesem Zeitpunkt können derartige Veränderungen zwar einerseits gelegentlich noch auf postoperative Veränderungen zurückzuführen sein und müssen daher nicht zwangsläufig als Zeichen einer Abstoßung bewertet werden (161).

Andererseits jedoch kommen leichte akute Abstoßungen um den siebten postoperativen Tag nach Lungentransplantation häufig vor und sind einer Kortisonstoßtherapie in der Regel gut zugänglich. Tiere mit einem Röntgenscore von L2 oder L3 am POD 7 wurden daher mit einem 3-tägigen i.v. Kortisonstoß von 250 mg Methylprednisolon/d behandelt. Bis zum POD 28 waren die Lungen aller Tiere wieder nahezu seitengleich belüftet. Die rechten Lungen waren bei Abstoßern sowie langzeitüberlebenden Tieren zu allen Zeitpunkten vollständig und homogen belüftet. Abb. 4.3 Reihe A zeigt den typischen röntgenologischen Verlauf eines langzeitüberlebenden Tieres. Während am POD 7 die linke Lunge mit L2 bewertet werden musste, hatte sie sich bis zum postoperativen Tag 28 fast vollständig erholt (L1). In den folgenden Röntgenkontrollen bis zum Tag 614 (Tag der elektiven Euthanasie) zeigte die linke Lunge stets denselben Belüftungsgrad wie die rechte Lunge (L0). In Reihe B ist der Verlauf eines abstoßenden Tieres dargestellt. Im Unterschied zu langzeitüberlebenden Tieren verschatteten sich bei diesen Tieren die linken Lungen nach Absetzen der pharmakologischen Immunsuppression (POD 28) progredient, bis sie eine homogene Infiltration aufwiesen (L3, Zeitpunkt der elektiven Euthanasie, hier POD 121).

Eine Ausnahme bildeten die Tiere #313883 sowie #313729. Diese Schweine zeigten etwa 15 Tage post transplantationem Symptome einer Dyspnoe. Abbildung 4.3 Reihe C zeigt die Röntgenbilder des Minipigs #313883 an POD 7 sowie POD 17. Hier ist neben einer diffusen Verschattung der linken Lunge (L1) auch eine fokale Infiltration der rechten Lunge zu erkennen, was im verwendeten Versuchsaufbau als suggestiv für einen pulmonalen Infekt gewertet wurde. In einer Multiplex-PCR (IVD GmbH, Hannover, Deutschland) von Lungenbiopsien dieser Tiere konnte porzines Zytomegalievirus (PCMV) sequenziert werden.

Abb. 4.3: REPRÄSENTATIVE RÖNTGENBILDER AUSGEWÄHLTER TIERE In Reihe A sind die Röntgenbilder der postoperativen Tage 7, 28 und 614 des langzeitüberlebenden Tieres #108146 dargestellt. Reihe B zeigt die Bilder des Abstoßers #214207 an den Tagen 7, 28 und 121. Die Verschattung der linken Lunge beider Tiere am POD 7 wurde als passagere akute Abstossung gewertet, welche mit Kortisonstoßtherapie behandelt wurde. An Tag 28 waren die linken Lungen wieder deutlich transparenter. Während die linke Lunge des langzeitüberlebenden Tieres #108146 an POD 614 immer noch genauso gut belüftet war wie dessen rechte Lunge, war in #214207 an Tag 121 (Tag der elektiven Euthanasie) die linke Lunge komplett verschattet. Reihe C zeigt die Bilder des Tieres # 313883 an POD 7 und POD 17 (2 Tage vor der elektiven Euthanasie). Im Unterschied zu den anderen Tieren sind hier auch Verschattungen in der rechten Lunge zu erkennen.

Die bei der Autopsie gewonnenen Lungenproben wurden im Anschluss an Formalinfixierung und H/E-Färbung nach den unter 3.6.6 beschriebenen Kriterien der ISHLT beurteilt. Die Organschnitte der rechten Lungen waren, sowohl bei Tieren die ihre linke (transplantierte) Lunge tolerierten, als auch bei Tieren welche die linke Lunge abgestoßen hatten, am Tag der Tötung histologisch ohne pathologischen Befund. Während die linken Lungen der Abstoßer deutliche vaskuläre und/oder alveoläre Infiltrate mononukleärer Zellen zeigten, die als milde bis schwere akute Abstoßungen (A2-A4) eingestuft wurden, waren die histologischen Präparate der Langzeitüberleber ohne Abstoßungszeichen (A0-A1). Abb. 4.4 Reihe A zeigt H/E-gefärbte Paraffinschnitte der jeweils rechten und linken Lunge eines langzeitüberlebenden Tieres (#301983, beide Seiten A0). In Abb. 4.4 Reihe B und C sind die rechten unveränderten Lungen zweier Abstoßer abgebildet, sowie deren abgestoßene linke Lungen (#214307: A2, #214301: A4).

Eine Besonderheit stellte das Tier #216042 dar, welches erst am POD 266 röntgenologisch eine Abstoßung zeigte und in der Folge euthanasiert wurde. Das Lungentransplantat dieses Tieres wies neben agonal bedingten Veränderungen multifokale bis diffuse Entzündungszellinfiltrate auf und es waren perivaskulär Lymphozyten zu finden. Fokal waren Nekrosen an den Gefäßwänden mit Lymphozyten, Makrophagen und neutrophilen Granulozyten zu erkennen. Darüber hinaus wies das Präparat eine starke Fibrosierung auf, welche für einen chronisch-regenerativen Prozess spricht. Aus diesem Grund wurde diese Lunge als chronisch abgestoßene Lunge eingestuft. Eine klassische Bronchiolitis obliterans in Form einer subepithelialen Fibroproliferation der Bronchiolen war allerdings nicht zu erkennen.

Die histologischen Präparate der beiden Tiere #313729 sowie #313883, welche aufgrund hochgradiger Dyspnoe schon am POD 19 bzw. 20 euthanasiert werden mussten, wiesen lediglich Veränderungen auf, welche auf ein agonales Herz-Kreislaufversagen zurück zu führen waren und wurden somit mit A0 bewertet.

Exemplarisch für die Tiere bei denen histologisch eine hyperakute Abstoßungsreaktion diagnostiziert wurde, ist in Abb. 4.4 Reihe D ein Stück der linken Lunge des Tieres #216078 abgebildet, welches vier Stunden nach Transplantation und Reperfusion der Lunge entnommen wurde. Multifokal sind hier neutrophile Granulozyten zu erkennen und es sind diffus Erythrozyten ins Lungenparenchym ausgetreten. Außerdem sind beginnende Alveolarwandnekrosen zu erkennen, die dafür sprechen, dass hyperakut Gewebe zugrunde geht.

Abb. 4.4 A-D: H/E-GEFÄRBTE PARAFFINSCHNITTE der rechten (autologen) Lunge sowie der linken (transplantierten) Lunge eines langzeitüberlebenden Tieres am Tag der elektiven Euthanasie am POD 622 (Reihe A, rechter Lungenmittellappen sowie linker

Lungenmittellappen A0, linker Lungenoberlappen A2) und #214301 (Reihe C, rechter Lungenoberlappen A0, linker Lungenoberlappen A4) zum jeweiligen Abstoßungszeitpunkt am POD 71 bzw. 72. Bei Tier #214301 sind neben mononukleären Zellinfiltraten auch hochgradige Parenchymnekrosen und Hämorrhagien zu erkennen. Reihe D zeigt den hyperakut abgestoßenen linken Lungenoberlappen des Tieres #216078 (Vergrößerung x40).

4.5 Auswertung der Differentialblutbilder 4.5.1 Leukozyten

Sowohl bei den nicht vorbehandelten, als auch bei den vorbehandelten Tieren war nach Antigenkontakt ein Anstieg der absoluten Leukozytenzahl (Giga/Liter = G/l) im peripheren Blut zu erkennen.

Bei den perioperativ mit Splenozyten behandelten Tieren (Abb. 4.5 A) fiel auf, dass die Tiere aus der Kontrollgruppe eine Stunde nach Reperfusion der Lunge sowie eine Stunde nach SpTx, im Gegensatz zu den mit Antikörpern oder Bestrahlung konditionierten Tieren, einen deutlich höheren Anstieg der Leukozyten zeigten (Ausgangswert: 5,4 G/l, 1h SpTx: 19,4 G/l).

Zu den mit Antikörpern behandelten Tieren, welche im unmittelbaren Zeitraum nach Antikörpergabe zunächst einen geringgradigen Abfall der Leukozyten von 4,4 G/l auf 2 G/l zeigten, war der Unterschied sogar statistisch signifikant (p*= 0,05). Schon ab dem postoperativen Tag 1 allerdings war in der mAb-Gruppe ein rapider Anstieg der Leukozyten mit einem Peak an POD 5 (13 G/l) zu verzeichnen. Somit verhielten sich die mit Antikörper behandelten Tiere ab dem POD 3 sehr ähnlich zur Kontrollgruppe, während die bestrahlten Tiere, mit einem Niveau von etwa 2 G/l im Zeitraum POD 3 bis POD 28, signifikant unter diesen beiden Gruppen lagen. Nach Beendigung der chemischen Immunsuppression war in allen Gruppen wieder eine steigende Tendenz der Leukozyten zu erkennen. Die mit Bestrahlung behandelten Tiere erreichten allerdings bis zum POD 120 nicht wieder ihr Ausgangsniveau und obwohl in der Kontrollgruppe der Anstieg am deutlichsten zu erkennen war, ist dieser nicht statistisch signifikant.

Bei den mit Splenozyten vorbehandelten Gruppen (Abb. 4.6 A) zeigten Tiere aus der Kontrollgruppe nach SpTx (POD -27) einen Anstieg der Leukozyten von 4,8 auf 9,4 G/l. Sie erreichten bis zum POD 0 wieder ihren Ausgangswert, stiegen aber in den ersten drei postoperativen Tagen wieder auf 10,1 G/l an und hielten sich dort etwa bis zum POD 28. Im Gegensatz zu den Tieren, welche ihren Antikörper perioperativ erhielten, war bei den vorbehandelten Tieren 24 Stunden nach mAb-Gabe kein Abfall der Leukozyten zu sehen, im

ein Wert von 11,5 G/l erreicht. Auch in dieser Gruppe sanken die Leukozyten bis zum Tag der Transplantation auf ihren Ausgangswert zurück. Nach Reperfusion der Lunge und bis zum postoperativen Tag 5 zeigten sie allerdings einen akzelerierten Anstieg bis auf 16,0 G/l, der sich ab POD 14 bei etwa 6,5 G/l einpendelte. Insgesamt verhielten sich die Tiere, welche mit Antikörpern und Splenozyten vorbehandelt worden waren, in Bezug auf die Leukozytenzahl sehr ähnlich zur ihrer Kontrollgruppe. Analog zu den Tieren die an POD 0 bestrahlt wurden, zeigten die Tiere der Gruppe IRR+SpTx POD -28 vierundzwanzig Stunden nach der Bestrahlung einen deutlichen Abfall der Leukozyten (von 7,2 auf 2,1 G/l), stiegen nach Antigenkontakt (SpTx) aber initial wieder fast bis auf ihren Ausgangswert an, um dann am POD 0 mit 1,2 G/l ihr niedrigstes Niveau zu erreichen. Bis zum POD 70 erreichten sie wieder ihren Ausgangswert. Insgesamt unterschieden sich die Tiere der Gruppe IRR+SpTx POD -28 hinsichtlich ihrer Leukozytenzahl im peripheren Blut vom Zeitpunkt der Induktion bis hin zum Ende der pharmakologischen Immunsupression an POD 28 signifikant von den Tieren sowohl der bestrahlten, als auch der Kontrollgruppe.

4.5.2 Lymphozyten

Den Verläufen aller perioperativ behandelten Tiere (Abb 4.5 B) war gemein, dass bis eine Stunde nach SpTx zunächst in allen Tieren die Lymphozytenzahl im peripheren Blut abfiel.

Der stärkste Abfall war hier in der IRR Gruppe zu erkennen (Ausgangslevel vor IRR: 3,4 G/l, 1h SpTx: 0,4 G/l, unterschied zur Kontrollgruppe bis einschließlich POD 1: p*= 0,05); in der mAb Gruppe und der Kontrollgruppe halbierte sich die Zahl der zirkulierenden Lymphozyten lediglich (Ausgangswert: 3 G/l, 1hSpTx: 1,5 G/l). An POD 3 war bei den Tieren dieser Gruppen ein starker Anstieg über das Ausgangslevel hinaus auf 3,4 G/l (mAb Gruppe) bzw.

5,5 G/l (Kontrollgruppe) zu sehen. Auch in der IRR Gruppe stiegen an POD 3 die Lymphozyten wieder an, hier allerdings deutlich moderater, mit 1,1 G/l wurde der Ausgangswert nicht wieder erreicht. Wie auch schon bei den Leukozyten beobachtet, fanden die Lymphozyten in den bestrahlten Tieren bis zum POD 120 nicht auf ihr Ausgangslevel zurück. Die mAb Gruppe und die Kontrollgruppe blieben bis zum postoperativen Tag 28 etwa auf ihrem an POD 3 erreichten Niveau. Auch hier lagen über den gesamten beobachteten Verlauf die Lymphozytenzahlen der bestrahlten Tiere signifikant unter denen der Kontrollgruppe, die Antikörpergruppe verhielt sich intermediär.

Während in der IRR+SpTx POD -28 Gruppe nach der Bestrahlung die Lymphozyten stark abfielen (von 4,4 auf 0,6 G/l) und auch die Splenozytentransfusion keinen transienten Anstieg

ein minimaler Abfall von 3,1 /l auf 3 G/l und nach SpTx ein starker Anstieg auf 6,5 G/l zu sehen (Abb. 4.6 B). An POD -21 war dann wieder das Ausgangsniveau erreicht, welches bis zur Transplantation gehalten wurde. Die Kontrolltiere zeigten nach SpTx einen geringen Abfall der Lymphozyten und an POD -26 einen Anstieg. Auch sie befanden sich zum Zeitpunkt der LungenTx wieder bei ihrem Ausgangsniveau. Im präoperativen Zeitraum lagen die Lymphozytenzahlen der durch Bestrahlung induzierten Tiere signifikant unter denen der

ein minimaler Abfall von 3,1 /l auf 3 G/l und nach SpTx ein starker Anstieg auf 6,5 G/l zu sehen (Abb. 4.6 B). An POD -21 war dann wieder das Ausgangsniveau erreicht, welches bis zur Transplantation gehalten wurde. Die Kontrolltiere zeigten nach SpTx einen geringen Abfall der Lymphozyten und an POD -26 einen Anstieg. Auch sie befanden sich zum Zeitpunkt der LungenTx wieder bei ihrem Ausgangsniveau. Im präoperativen Zeitraum lagen die Lymphozytenzahlen der durch Bestrahlung induzierten Tiere signifikant unter denen der