Lipopolysaccharidnachweis in den aufgereinigten Antikörpern

4.8 Antikörper

4.8.1 Lipopolysaccharidnachweis in den aufgereinigten Antikörpern

Trotz regelmäßiger Spülungen des Hochleistungsflüssigkeitschromatographen mit Salzsäure und Natronlauge nach Herstellerinstruktionen, wurden mikrobiologisch im gewonnenen Eluat vor der anschließenden Sterilfiltration immer wieder bakterielle Kontaminationen festgestellt.

Unter ihnen befanden sich auch die Gram-negativen Endotoxinbildner Pseudomonas sp.. Aus diesem Grund wurde wiederholt ein Endotoxin-ELISA mit dem produzierten Antikörper-Endprodukt, so wie es den Tieren appliziert wurde, durchgeführt. Obwohl dieses (nach verschiedenen Sterilfitrationsschritten) mikrobiologisch als steril bewertet wurde, konnten mithilfe des EndoLISA^®-Kits Lipopolysaccharide nachgewiesen werden. Der Gehalt schwankte zu verschiedenen Messzeitpunkten zwischen 13 bis 62417 EU/ml.

Zum Nachweis überschüssiger anti-CD4 und/oder anti-CD8-Antikörper im peripheren Blut der Tiere, welche mit ebendiesem Antikörper induziert worden waren, wurde in regelmäßigen Abständen nach der Antikörpergabe Serum entnommen. PBMC eines naïven Minipigs wurden mit diesem Serum inkubiert. Nach Zweitfärbung mit dem entsprechenden, an FITC gekoppelten IgG Isotyp, wurde durchflusszytometrisch auf die An- oder Abwesenheit eines zu detektierenden Fluoreszenzsignals geachtet. Dabei war festzustellen, dass sowohl in der mitgeführten Isotypkontrolle, als auch zum Zeitpunkt POD -28 (vor Antikörpergabe), kein Fluoreszenzsignal detektiert werden konnte. Vom Zeitpunkt POD -27 (24 Stunden nach Antikörpergabe) bis POD -20 (acht Tage nach Antikörpergabe) war, nach der Inkubation mit Serum von Tieren welche nur CD4 mAb bekommen hatten, bei etwa 30 % der sich im Lymphozytengate befindlichen Zellen ein positives Fluoreszenzsignal zu sehen. Bei dem Tier

#214207, welches CD4- und CD8 mAb erhalten hatte, waren entsprechend bis zu 54 % FITC-positive Zellen zu detektieren. Allerdings zeigten hier am Tag acht nach Antikörpergabe nur noch knapp 26 % der Zellen ein positives Signal. Da es sich hierbei um eine rein qualitative Analyse handelte, kann keine Aussage zum genauen Gehalt an überschüssigem Antikörper im peripheren Blut getroffen werden. Wohl aber steht fest, dass für mindestens acht Tage nach einmaliger intravenöser Antikörperadministration in einer Dosierung von 1mg/kg KG für alle zirkulierenden Lymphozyten ausreichend Antikörper für die Bindung zur Verfügung stand.

Abb. 4.12 zeigt die Bilder der durchflusszytometrischen Analyse des Tieres #214207 (welches anti-CD4 und -CD8 mAb erhalten hatte) und des Tieres #214301 stellvertretend für alle analysierten Tiere, die nur anti-CD4 mAb erhalten hatten.

Abb. 4.12: FACS-BASIERTE DETEKTION VON ÜBERSCHÜSSIGEM ANTIKÖRPER IM SERUM. Im linken Block à drei Bildern pro Reihe ist das Tier #214207 abgebildet; der rechte Block zeigt Tier 214301. Das erste Bild jeder Reihe zeigt die Lymphozytenpopulation, im zweiten Bild sind die mit Antikörper besetzten Zellen (in blau) als Dotplot gegen den Side Scatter aufgetragen. Bild drei zeigt das entsprechende Histogramm. Hier ist der prozentuale Anteil der im FITC-Kanal detektierten Zellen (zweiter Peak) aufgeführt. Jede Reihe steht für einen gemessenen Zeitpunkt.

Um unterscheiden zu können, ob die verabreichten Antikörper auf ihre Zielzellen eine depletierende oder lediglich eine maskierende Wirkung haben, wurden die nach der in vitro Bebrütung geernteten PBMC des Antikörperplattenstimulationsassays für die durchflusszytometrische Analyse zum einen mit demselben CD4- (74-12-4) bzw. anti-CD8- (76-2-11) Klon (und dem daran gekoppelten fluoreszierenden Farbstoff) gefärbt, mit dem sie zuvor behandelt worden waren. Des Weiteren wurden die Zellen mit einem alternativen anti-CD4- (MIL-17) bzw. CD8- (MIL-12) spezifischen Klon, der idealerweise an ein anderes Epitop der T-Zellen binden sollte, für die Durchflusszytometrie sichtbar gemacht.

Hierdurch sollte verhindert werden, dass man bei einem fehlenden oder reduzierten Fluoreszenzsignal fälschlicherweise von einer Depletion der entsprechenden Zellen ausging, wenngleich eigentlich nur die Bindungsstelle des entsprechenden Epitops schon besetzt war.

Eine weitere Kontrolle hierfür stellte die Färbung der CD3⁺ Zellen dar. Im Falle einer tatsächlichen Depletion von T-Helferzellen oder zytotoxischen T-Zellen wäre auch eine relative Reduktion aller CD3⁺ T-Zellen zu erwarten. Außerdem sollte anhand des Verhaltens der CD4⁺CD25^high bzw. CD4⁺CD25^low Zellen ein Rückschluss auf den Aktivierungsstatus der T-Zellen nach Konfrontation mit den Antikörpern gezogen werden. Aufgrund der geringen Stichprobengrößen war es nicht möglich, diesen Assay statistisch abzusichern, er dient lediglich dazu einen qualitativen Hinweis auf die Wirkung der Antikörper zu geben.

Da sich bei den Ergebnissen der durchflusszytometrischen Analyse die Ansätze mit Zugabe von Interleukin-2 sehr ähnlich zu denen ohne verhielten und nicht konsequent in die eine oder andere Richtung abwichen, konnte gefolgert werden, dass eine zusätzliche Stimulation der T-Zellen durch IL-2 nicht notwendig war. Deshalb wurden in der Auswertung die Ergebnisse dieser beiden Ansätze zusammengefasst. Da die Ergebnisse der Negativkontrollen (nur PBMC, PBMC+F(ab´)2 und PBMC+F(ab´)2+Isotypkontrolle) untereinander äußerst homogen waren, wurden sie zusammengefasst und insgesamt als Negativkontrolle verwendet.

Die Auswertung der durchflusszytometrischen Analyse (schematische Darstellung als Balkendiagramm, Abb. 4.13 A) ergab, dass im Mittel 69 % der nach Bebrütung geernteten PBMC in den Negativkontrollen CD3⁺ T-Zellen waren. In den Wells welche mit anti-CD4 mAb beimpft worden waren, waren nach der Bebrütung im Mittel 10 % weniger CD3⁺ Zellen zu finden als in der Negativkontrolle, in den mit anti-CD8 mAb behandelten Wells sogar 13

% weniger. In den mit anti-CD4 mAb bebrüteten Wells reduzierte sich das Fluoreszenzsignal für den CD4-Klon 74-12-4 gegenüber der Negativkontrolle im Mittel um 9 %, für den Klon MIL-17 sogar um 12 %. Auch in den mit anti-CD8 mAb inkubierten Wells war das Signal für

Abb. 4.13 B). Offensichtlich schienen also die anti-CD8 Antikörper auch einen Einfluss auf CD4⁺ Zellen zu haben, möglicherweise durch Depletierung von, bei Schweinen regelmäßig vorkommenden, CD4⁺/CD8⁺ doppelt positiven T-Zellen (162). Das Fluoreszenzsignal für CD8⁺ Zellen zeigte in den mit anti-CD8 mAb versetzten Wells für den Klon 76-2-11 erwartungsgemäß eine Verminderung um 22 %, beim Färben mit dem Klon MIL-12 war immer noch eine Verringerung um 18 % gegenüber der Negativkontrolle festzustellen. Hier schien der Einfluss des anti-CD4mAb auf die CD8⁺ Zellen deutlich geringer zu sein, in den mit anti-CD4 mAb bebrüteten Wells reduzierte sich das Fluoreszenzsignal für den Klon MIL-12 um lediglich 2 %. Zwar war für den Klon 76-2-11 im Mittel eine Verringerung des Signals um 14 % zu erkennen, da sich dieses Ergebnis aber lediglich aus 2 Ansätzen zusammensetzte und ein großer Standardfehler abzulesen ist, könnte es sich hierbei auch um eine Messungenauigkeit handeln (Abb. 4.13 C). Aufgrund der starken Verminderung der CD4⁺ Zellen in allen mit Antikörpern bebrüteten Ansätzen war eine Evaluierung der CD4⁺CD25^high bzw. CD4⁺CD25^low Zellen nicht möglich.

Abb. 4.13 A-C: AUSWERTUNG DER DURCHFLUSSZYTOMETRISCHEN ANALYSE DER PBMC AUS DEM ANTIKÖPERPLATTENSTIMULATIONSASSAY ALS BALKENDIAGRAMM. Die Y-Achse quantifiziert prozentual den jeweils gemessenen Zelltyp, entlang der X-Achse sind die miteinander verglichenen Reaktionsansätze aufgetragen. In grau die zusammengefassten Negativkontrollen (NegKo) aus insgesamt acht Ansätzen, in rot PBMC die mit den hergestellten anti-CD4-Antikörpern inkubiert worden waren, mit anti-CD8-Antikörpern inkubierte Wells sind in grün dargestellt (zusammengesetzt aus jeweils zwei Ansätzen, einmal mit und einmal ohne IL-2). Die über den Balken angegebenen Prozentwerte zeigen die Reduzierung des gemessenen Zelltyps gegenüber der jeweiligen Negativkontrolle.

Anhand von immundefizienten NRG-Mäusen, welche mit PBMC der Empfängerminipigs rekonstituiert worden waren (‚porziniserte Mäuse‘), wurde die Auswirkung der verwendeten Behandlungsprotokolle auf das Transplantat noch einmal verifiziert. Dafür wurde den Mäusen ein Stück Bronchus des Spenderminipigs unter die Haut implantiert, nach 28 Tagen wieder explantiert und aus verschiedenen histologischen Merkmalen ein ‚Rejection Score‘ gebildet, welcher als Maß für den Schweregrad der Abstoßung herangezogen wurde. Je schwerwiegender sich die Abstoßung des Bronchus-Stücks histologisch darstellte, desto höher war der resultierende Rejection Score.

Im Balkendiagramm (Abb. 4.14) ist zu erkennen, dass in der negativen Kotrollgruppe leichte morphologische Veränderungen zu erkennen waren, welche im Mittel in einem Rejection Score von 1,7 mündeten. Diese Veränderungen wurden als unspezifische Hintergrundaktivität eingestuft und der mittlere Score der übrigen Gruppen daran gemessen. Bei Mäusen, welche nur CD4 mAb oder CD8 mAb und keine allogenen PBMC erhalten hatten, war der Rejection Score des Bronchus nach Explantation sogar geringgradig kleiner als in der negativen Kontrollgruppe. Erwartungsgemäß war der Rejection Score in Mäusen, welche mit alloreaktiven naïven PBMC rekonstituiert worden waren, höher als in den negativen Kontrollen (um 0,5 Punkte). Analog zur akzelerierten Abstoßung der transplantierten Lungen, welche in Minipigs die mit Splenozyten vorbehandelt worden waren zu beobachten war, zeigten die Bronchi aus den Mäusen, welche mit PBMC aus Minipigs rekonstituiert worden waren, die durch die vorgezogene Antikörper-Induktionstherapie schon einmal Antigenkontakt hatten (geprimte PBMC), einen deutlich höheren Abstoßungs-Score (3,3 Punkte). Interessanterweise waren auch in diesem trans vivo Modell die zusammen mit den alloreaktiven PBMC verabreichten anti-CD4- und anti-CD8- Antikörper nicht dazu in der Lage, die durch die Zellen getriggerte Abstoßung zu verhindern oder zu vermindern. Der Rejection Score in der naïve PBMC+CD8mAb Gruppe war mit 2,1 Punkten quasi identisch mit dem Score in der naïven PBMC Gruppe, der Rejection Score der naïve PBMC+CD4mAb Gruppe lag mit 2,6 Punkten sogar noch darüber. Anhand einer one-way ANOVA für nicht parametrische Tests konnten keine statistischen Signifikanzen ermittelt werden, was wohl den kleinen Stichprobengrößen zulasten gelegt werden muss.

Abb. 4.14: HISTOLOGISCHE QUANTIFIZIERUNG DES NACH 28 TAGEN EXPLANTIERTEN BRONCHUS AUS DEN PORZINISIERTEN MÄUSEN. Der ‚Rejection Score‘ setzt sich zusammen aus dem Epithelverlust der Bronchien, der Infiltration des Bronchus mit Lymphozyten bzw. Plasmazellen und dem luminalen Verschluss des Bronchus aufgrund von bindegewebigen Veränderungen.

4.10 Expression von Zytokinen im Serum

Es stellte sich heraus, dass ein Großteil der in den humanen Bio-Plex Pro™ Assays beinhalteten Antikörper nicht mit Minipig-Zytokinen kreuzreagierte. Es konnten entweder keine bzw. nur lückenhaft Werte ermittelt werden, oder die Ergebnisse waren nicht in einen plausiblen Kontext zu bringen. Für die Zytokine IL-10, IL-17, IFN-γ sowie IP-10 (CXCL10) konnten allerdings Werte ermittelt werden. Die durch den Bio-Plex Manager 6.0 errechneten Werte sind in pg/ml angegeben. Die dargestellten Ergebnisse dienen lediglich dazu einen Trend in der Zytokinexpression zu zeigen, da die Stichprobengrößen in einigen Parametern zu gering waren, um sie statistisch absichern zu können.

4.10.1 Analyse des Maus-Serums aus dem trans vivo Modell

Aus dem Kollektiv der gesammelten Maus-Seren standen letztendlich, außer aus der Gruppe geprimte PBMC, von allen Gruppen genügend Proben zur weitergehenden Untersuchung zur Verfügung, wenngleich nicht in jeder Gruppe alle Proben messbar waren. In Abb. 4.15 A-D

entsprechenden Balken angegeben. Da all diese Proben in ein und demselben Durchlauf gemessen worden waren, waren die ermittelten absoluten Konzentrationen uneingeschränkt untereinander vergleichbar. Bei allen vier der analysierten Zytokine war die Expression im Serum von Mäusen, die keine Antikörper erhalten hatten (negative Kontrollgruppe sowie naïve PBMC), am geringsten. Interessanterweise war der Zytokinspiegel in Tieren die mit naïven allogenen PBMC rekonstituiert worden waren hier sogar geringgradig niedriger als in der negativen Kontrollgruppe. In Mäusen welche zwar anti-CD8 mAb erhalten hatten, jedoch nicht mit porzinen Zellen rekonstituiert worden waren (Gruppe CD8 mAb), war die Zytokinkonzentration im Serum annähernd gleich wie in der negativen Kontrolle. In der Gruppe CD4 mAb jedoch war in allen Parametern ein Anstieg zu erkennen, der etwa dem der Gruppe naïve PBMC+CD8mAb entsprach. Eine deutlich vermehrte Zytokin-Expression gegenüber der negativen Kontrolle war in der Gruppe naïve PBMC+CD4mAb zu erkennen.

Abb. 4.15 A-D: ABSOLUTE ZYTOKIN-EXPRESSION IM SERUM POZINISIERTER MÄUSE. Tiere der in schwarzen Balken dargestellten Gruppen wurden mit porzinen allogenen PBMC rekonstituiert, die Tiere der in grauen Balken dargestellten Kontrollgruppen erhielten anstatt Zellen physiologische Kochsalzlösung. Entlang der X-Achse ist aufgetragen, welche Gruppen zusätzlich am Tag der Bronchusverpflanzung noch monoklonale Antikörper erhielten.

Die Auswertung der Minipig-Seren gestaltete sich methodisch aufwendig, da die Experimente über den Zeitraum einiger Jahre hinweg stattfanden und folglich die Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten auf unterschiedlich Platten gemessen worden waren. Das Problem hierbei lag darin, dass die ermittelten Standardkurven aus verschiedenen Messungen voneinander abwichen. Somit waren die absoluten Konzentrationen aus verschiedenen Messungen untereinander nicht ohne weiteres vergleichbar. Um dieses Problem zu lösen, wurde der Mittelwert des ‚Null-Zeitpunkts‘, also der Zeitpunkt zu welchem die Tiere weder medikamentös, noch durch Bestrahlung oder mit Spenderantigen behandelt worden waren, gleich 100 % gesetzt. Bei den perioperativ induzierten Tieren handelte es sich dabei um den POD 0, bei Tieren mit vorgezogener Induktion analog um POD -28. Die folgenden Messzeitpunkte spiegeln also keine absoluten Werte wider, sondern sind als relative Entwicklung gegenüber dem Null-Zeitpunkt zu betrachten. Da die Tiere bis zum postoperativen Tag 28 eine pharmakologische Immunsuppression erhielten, schien es sinnvoll dem Tag 0 den postoperativen Tag 70 gegenüber zu stellen, zu diesem Zeitpunkt konnte davon ausgegangen werden, dass die Tiere ihre Immunkompetenz zurück erlangt hatten und gegebenenfalls auf die Spenderlunge reagieren würden. Dieser Annahme lag die Beobachtung im gewählten experimentellen Modell zugrunde, dass bei Kontrollexperimenten ohne erfolgreiche Induktion von Transplantationstoleranz regelmäßig um den Zeitpunkt POD 70 die allogene Lunge abgestoßen wird. Bei den präoperativ mit Spenderantigen konfrontierten Tieren kamen neben dem Null-Zeitpunkt an POD -28 und dem POD 70 noch der POD 0 hinzu.

Da in einigen Gruppen die Serumproben nur sehr unvollständig auffindbar waren, sind im Folgenden nur die beiden Gruppen miteinander verglichen worden, die in Bezug auf das mediane Überleben ihres Transplantates das längste (IRR+SpTx POD 0, über die Hälfte der Tiere stießen die Lunge nie ab), und das kürzeste (mAb+SpTx POD-28 Gruppe, bei welcher das mediane Überleben bei lediglich 14 Tagen lag) aufwiesen. Hier jedoch ist der Unterschied in der relativen Entwicklung der Zytokin-Expression eindrücklich nachzuvollziehen (Abb.

4.16 A-D). Während in der IRR+SpTx POD 0 Gruppe bei keinem der hier analysierten Zytokine ein nennenswerter Unterschied zwischen POD 0 und POD 70 zu erkennen ist, stieg in der mAb+SpTx POD-28 Gruppe die Expression nach Antikörperverabreichung und Antigenkontakt an POD -28 bis zum POD 0 in allen Parametern stark an. Da für die Messung der Zytokin-Konzentration an POD 70 nur Proben von zwei Minipigs zur Verfügung standen und die Ergebnisse eine große Abweichung aufwiesen, sind sie mit Vorsicht zu betrachten. Im

Trend zu beobachten war, aber kaum von der an POD 0.

Abb. 4.16 A-D: RELATIVE ZYTOKIN-EXPRESSION IM SERUM VON MINIPIGS. Die relative Entwicklung der Zytokin-Konzentration nach Konfrontation mit dem Spenderantigen in der Gruppe IRR+SpTx POD 0 zu den Zeitpunkten POD 0 und POD 70 wurde der Gruppe mAb+SpTx POD -28 zu den Zeitpunkten POD -28, POD 0 und POD 70 gegenüber gestellt.

5 Diskussion

5.1 Experimentelles Design

5.1.1 Inkompatibilität der genetischen Phänotypen

Ziel der im Rahmen dieses Großtiermodells durchgeführten Untersuchungen war es, unter allogenen immunologischen Voraussetzungen eine spezifische Toleranz des Empfängers gegenüber dem Spender-Haupthistokompatibilitätskomplex zu schaffen. Ein verlängertes Transplantatüberleben sollte dem protolerogenen Effekt des herangezogenen Induktionsprotokolls zuzuschreiben sein und nicht auf einer zufälligen Übereinstimmung der Oberflächenantigene von Spender und Empfänger beruhen. In den für diese Experimente ausgewählten Spender/Empfängerpaaren wurde prospektiv nur eine SLA I-Typisierung durchgeführt, welche im Wesentlichen serologisch erfolgen konnte. Eine retrospektive Überprüfung der Diversität im SLA II Lokus wurde auf ausgewählte langzeitüberlebende Empfänger und deren Spender beschränkt, da hierfür eine Sequenzierung des SLA-DQ Lokus notwendig war. Die langzeitüberlebenden Tiere #97204, #92567 und #73259 wurden exemplarisch auf die SLA II Inkompatibilität mit ihrem Spender hin untersucht. Diese Tiere wiesen alle eine Diversität in mindestens einem Nukleotid auf. Der Verzicht auf die routinemäßige Sequenzierung des SLA II Lokus folgte vor allem praktischen Erwägungen.

Zum einen stellte im Jahre 2006 die Gruppe um Sahara et al. fest, dass im porzinen Lungentransplantationsmodell die antigene Bedeutung von MHC II für die Transplantatabstoßung geringer ist, als die von MHC I (38). Zum anderen ergaben Untersuchungen des SLA II Lokus aus vorangegangenen Experimenten der eigenen Arbeitsgruppe bereits, dass der Grad der Auszucht dieser Schweine offensichtlich so hoch ist, dass bei keinem der überprüften Spender/Empfängerpaare eine hundertprozentige Übereinstimmung gefunden werden konnte (89). Diese Erkenntnisse und die Tatsache dass in einem Großteil der Tiere eine Abstoßung des Transplantates stattfand, welche ja auf eine MHC Inkompatibilität schließen lässt, ließen den zusätzlichen Aufwand für eine routinemäßige prospektive Untersuchung des SLA II Lokus als unnötig erscheinen.

5.1.2 Wahl des im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Induktionsprotokolls

Die Erzeugung von Toleranz gegenüber einem MHC-inkompatiblen, transplantierten Organ ist eine Thematik, welche weltweit eine Vielzahl von Arbeitsgruppen beschäftigt. Trotz jahrzehntelanger Bemühungen wurde bisher kaum ein Protokoll beschrieben, welches diese Vision in zuverlässiger Weise erfüllt. Entweder scheiterten die untersuchten Protokolle an der

Einsatz in der klinischen Transplantation fragwürdig wäre. So ist es im Großtier-Lungentransplantationsmodell unserer Arbeitsgruppe bereits gelungen, durch eine perioperative nicht-myeloablative Bestrahlung, in Verbindung mit einer Infusion von Spendersplenozyten recht zuverlässig eine andauernde Toleranz gegenüber der transplantierten Lunge in Abwesenheit von pharmakologischer Immunsuppression zu induzieren (9). Allerdings wird davon ausgegangen, dass die Nebenwirkungen der Bestrahlung für eine Umsetzung dieses Protokolls in der Klinik hinderlich wären. Dennoch wurde durch die Entwicklung dieses Protokolls der Grundstein für die weiterführenden Arbeiten unserer Forschungsgruppe gelegt. Es wird spekuliert, dass das Schaffen einer Nische durch die Eliminierung alloreaktiver Empfängerzellen zum Zeitpunkt der Übertragung von Spendergewebe in den Empfängermechanismus, insbesondere wenn zusätzlich zu den aus der Spenderlunge ausgeschwemmten Zellen noch Spendersplenozyten verabreicht wurden, ein Mechanismus sein kann, der in diesem Modell zu einer spenderspezifischen Toleranz führt.

Seither wird in unserer Gruppe nach einem Ersatz für Bestrahlung zur suffizienten aber verträglicheren Eliminierung alloreaktiver Zellen gesucht. Wie eingangs unter 2.7.3 beschrieben, führte in einem Nagermodell die Administration eines depletierenden anti-CD4-Antikörpers in Kombination mit Donor-Antigen 28 Tage vor der Transplantation von allogenen Herzen zu einer Toleranz gegenüber dem Transplantat (147,163). Für das Überleben des Transplantates waren residuale CD4⁺ Zellen, welche der Depletion entkommen waren und die sich aller Wahrscheinlichkeit nach zu einer regulatorischen Subpopulation ausdifferenziert hatten, essentiell. Deshalb wurde angenommen, dass ein nicht-depletierender CD4-Antikörper noch erfolgreicher sein könnte. Darauf konnte gezeigt werden, dass sich durch die einmalige Administration eines nicht-depletierenden Antikörpers, gefolgt von einer spenderspezifischen Splenozyteninfusion, eine unendliche Toleranz gegenüber allogenen Rattenherzen erzeugen ließ (164). Die gezielte Depletierung/Einschränkung der Funktionalität von Empfängerlymphozyten erschien uns ein geeigneter Ansatz. Auch die zeitliche Varianz, eine Toleranzinduktion schon 28 Tage vor der Transplantation zu initiieren, stellt im Setting der Lebendlungenspende eine interessante Option dar. Indem Manipulationen schon in einigem zeitlichen Abstand vor der eigentlichen Transplantation vorgenommen werden, fallen deren mögliche Nebenwirkungen nicht in den unmittelbaren Zeitraum der Operation und entzerren so die Belastung für den Patienten. Wie bereits erwähnt stellt die Translation eines im Nagermodel erfolgreich durchgeführten Protokolls ins Großtiermodell einen kritischen, aber sehr wichtigen Schritt dar. Sowohl immunologisch als auch physiologisch sind Schweine

Nagermodellen getesteten Protokollen im Großtiermodell ist also unumgänglich. Auch aufgrund der inzwischen verfügbaren unterschiedlichen genetischen Stämme haben sich Schweine als geeignetes präklinisches Großtiermodell etabliert (165). Das im Rahmen dieser Arbeit untersuchte potentielle Toleranzinduktionsprotokoll entstand also aus der Verknüpfung des in der Arbeitsgruppe von K.J. Wood erarbeiteten Nagermodells, in welchem die gezielte Eliminierung von T-Helferzellen während der Exposition von Donor-Antigen erfolgreich eine Immunantwort gegen das Transplantat verhindern konnte, mit dem in unserer Arbeitsgruppe etablierten Protokoll, welches nach demselben Mechanismus, allerdings anhand einer globalen Eliminierung alloreaktiver Zellen durch Bestrahlung, eine Toleranz erzielen konnte.

Im Dokument Untersuchung alternativer zytoreaktiver Protokolle in der Induktion von Transplantationstoleranz bei porziner allogener Lungentransplantation (Seite 104-0)