Nachweis von überschüssigen Antikörpern im peripheren Blut

Da die ausreichende, zu verabreichende Menge der selbst produzierten Antikörper auf Schätzungen bzw. den wenigen dazu vorhandenen Veröffentlichungen beruhte (148), wurde im Anschluss an die Experimente das Serum der Tiere vor sowie bis zu 10 Tage nach Verabreichung der Antikörper, auf sich darin befindliche, freie Antikörper untersucht. Dazu wurden jeweils 100 µl Serum der Tiere #214207, #214301, #216042 und #216108 zu den Zeitpunkten POD -28 (vor Antikörpergabe), POD -27 (24 Stunden nach mAb-Gabe), POD-26 (2 Tage nach nach mAb-Gabe), POD -24 (4 Tage nach mAb-Gabe), POD -22 (6 Tage nach mAb-Gabe), POD -20 (8 Tage nach mAb-Gabe) sowie POD -18 (10 Tage nach mAb-Gabe) mit 2 x 10⁵ PBMC eines naïven Minipigs für 20 Minuten bei 4°C unter Lichtausschluss in einem Rundboden FACS-Röhrchen (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) inkubiert. Die Zellen waren zuvor wie unter 3.8.1 beschrieben aus heparinisiertem Vollblut isoliert und unspezifische Bindungsstellen mit porzinem Serum (Biochrom AG, Berlin, Deutschland) geblockt worden. Nach einem Waschschritt mit PBS (Invitrogen Limited, Paisley, Schottland) wurde den Zellen der an den Farbstoff FITC gekoppelte Isotyp des im Serum vermuteten Antikörpers hinzugefügt. Für Tiere, welchen nur CD4 mAb verabreicht wurde, war das Rat Anti-Mouse IgG2b, Klon 12-3 (BD Pharmingen, San Jose, CA, USA). Für Tier #214207, welches zusätzlich CD8 mAb erhalten hatte, wurden die Zellen außerdem mit dem Isotyp Anti-Mouse IgG2a, Klon R19-15 (ebenfalls BD) bei 4°C für 20 Minuten unter Lichtausschluss inkubiert. Pro Röhrchen wurden 10 µl des Isotyps in einer 1:10 Verdünnung

mit dem Isotyp ohne vorherige Inkubation mit Serum) mitgeführt. Im Anschluss an einen letzten Waschschritt wurden die Zellen durchflusszytometrisch untersucht. Da der FITC-gekoppelte Isotyp nur an den CD4 bzw. CD8 mAb bindet, konnte nur im Falle einer vorherigen Antikörperbindung an die Zellen im FACS ein positives Fluoreszenzsignal detektiert werden. Somit lieferte dieser Test eine qualitative Aussage über das Vorhandensein von freiem CD4 bzw. CD8 mAb im untersuchten Serum. Abb. 3.7 zeigt wie es zu solch einem positiven Signal kommen konnte.

Abb. 3.7: BINDUNG VON FREIEM MONOKLONALEN CD4 ANTIKÖRPER AN SEINE SPEZIFISCHE BINDUNGSSTELLE AUF DER MINIPIG-ZELLE. In einem zweiten Schritt wurde der für die Fc-Region des CD4 mAb spezifische Zweitantikörper, konjugiert an einen Fluoreszenzfarbstoff, hinzugegeben. Dieser band nun an CD4 mAb und konnte anschließend durch seinen Farbstoff FITC durchflusszytometrisch sichtbar gemacht werden.

3.10.3 Effekt der verabreichten Antikörper auf mononukleäre Zellen in vitro

Um die Wirkung der generierten Antikörper in vitro überprüfen und nachvollziehen zu können, wurde ein Antikörperplattenstimulationsassay durchgeführt. Dazu wurde eine 96-Well Rundbodenplatte (Greiner, Frickenhausen, Deutschland) über Nacht bei 4°C mit 0,16 µg/Well Goat F(ab´)2 Fragment anti-Maus IgG (Beckman Coulter, FL, USA) inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit PBS (Invitrogen Limited, Paisley, Schottland) wurden im Dreifachansatz jeweils 0,8 µg der in den Versuchen eingesetzten anti-CD4 bzw. anti-CD8 Antikörper in die mit F(ab´)2 Fragment benetzten Wells gegeben und für mindestens 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Um später unspezifische Reaktionen von spezifischen

Dreifachansatz) angelegt. Die benötigten PBMC wurden, wie unter 3.8.1 beschrieben, aus dem Blut eines noch nicht behandelten Göttinger Minipigs isoliert und in Zellkulturmedium (RPMI 1640 mit 2 mM L-Glutamin, GIBCO life technologies, Carlsbad, CA, USA) mit 1 % Fetalem Bovinen Serum (Biochrom, Berlin, Deutschland) auf eine Konzentration von 1x10⁶ PBMC pro ml Medium eingestellt. Anschließend wurden in jedes Well 200 µl (≙ 2x10⁵ Zellen/Well) der Zellsuspension überführt. Als Negativkontrollen dienten ein Ansatz mit F(ab´)2 Fragment und PBMC ohne Zweitantikörper, sowie ein weiterer Ansatz, bei dem die PBMC in Wells pipettiert wurden, die zuvor nicht mit F(ab´)2 Fragment inkubiert worden waren. Derselbe Ansatz wurde unter Zusatz von 2 U/Well rekombinantem porzinem IL-2 (Biosource, Camarillo, CA, USA) ein weiteres Mal pipettiert. Dadurch sollten falls nötig die T-Zellen zusätzlich stimuliert werden. Abb. 3.8 zeigt das hier verwendete Pipettierschema.

Folgende Isotypkontrollen fanden Verwendung:

• Purified Mouse IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody, Klon: MPC-173 (BioLegend, CA, USA), für anti-CD8 mAb 76-2-11

• Purified Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody, Klon: MPC-11 (BioLegend, CA, USA), für anti-CD4 mAb 74-12-4

Für die nächsten 48 Stunden wurde die so fertiggestellte Platte in einen Brutschrank verbracht und bei 37°C, 5 % CO2 und einer Luftfeuchtigkeit von 100 % bebrütet. Um mikrobiellem Befall vorzubeugen befand sich die Platte während der gesamten Zeit in einer sterilen Metallkiste. Nach 24 Stunden wurde aus jedem Well 100 µl Überstand abgenommen und durch den Zusatz von 100 µl frischem Medium substituiert. Nach 48 Stunden wurden schließlich die PBMC geerntet, die Dreifachansätze gepoolt und durchflusszytometrisch nach dem unter 3.8.3 beschriebenen Protokoll untersucht.

Abb.3.8: PLATTENBELEGUNG DES ANTIKÖRPERPLATTENSTIMULATIONS-ASSAYS IN EINER 96-WELL RUNDBODENPLATTE MIT DECKEL. Zum Schutz vor Verdunstung wurden die sich am Rand befindlichen Wells mit PBS befüllt.

3.11 In Vivo Untersuchung der immunologischen Mechanismen anhand von porzinisierten Mäusen

Um das Schicksal der transplantierten Lungen in den Miniaturschweinen mechanistisch besser untersuchen zu können, ließen wir in einem adoptiven Transfer-Modell den Versuch parallel noch einmal „in kleiner“ ablaufen. Dazu wurde ein kleines Stück Bronchus der rechten, nicht verwendeten Lunge des Spender-Minipigs subkutan in die linke Halsunterseite einer NOD.rag^-/^-γc^-/^- (NRG) Maus transplantiert. Die heterotope Verpflanzung von Bronchus in Mäuse eignet sich gut für immunologische Studien, da sie relativ einfach durchzuführen ist und histopathologische Veränderungen, die denen der Bronchiolitis obliterans von Lungentransplantaten ähneln, sich innerhalb weniger Wochen entwickeln. NRG Mäuse besitzen keine funktionellen murinen B-, T- oder NK-Zellen, zeigen aber normalerweise eine gute Integration von xenogenen PBMC (127). Noch am selben Tag wurden die Mäuse mit 5 x 10⁶ PBMC der Empfänger-Minipigs rekonstituiert, welche wie bereits unter 3.8.1 beschrieben durch Dichtegradientenzentrifugation aus heparinisertem Vollblut gewonnen und anschließend intraperitoneal in die Mäuse appliziert worden waren. Auf diese Weise interagierten in einem lebenden Organismus dieselben alloreaktiven Zellen mit demselben Antigen, wie im entsprechenden Miniaturschweinexperiment (Abbildung 3.9). Nach 28 Tagen wurden die Mäuse euthanasiert, die Bronchi isoliert und nach Färbung mit H/E sowie EvG (Elastika van Gieson) histologisch beurteilt. Die Interpretation erfolgte anhand eines von A.

entwickelten Scores (160), der 1997 veröffentlicht wurde, und eine Klassifikation der histologischen Charakteristika darstellt, die bei der obliterativen Bronchiolitis in jenem Modell gefunden werden. Diese Klassifikation umfasst zum einen den Epithelverlust der luftführenden Wege (0= keine Veränderungen, 1= <25 % Verlust des auskleidenden Epithels, 2= 25-50 % Verlust des auskleidenden Epithels, 3= 50-75 % Verlust des auskleidenden Epithels, 4= >75 % Verlust des auskleidenden Epithels), zum anderen wird die Infiltration des Bronchus mit Lymphozyten bzw. Plasmazellen bewertet (0= keine Veränderungen, 1= wenige perivaskuläre Infiltrate, 2= perivaskuläre Infiltrate unter Einbezug der meisten Gefäße mit Verbindung zum angrenzenden Bindegewebe, 3= diffuse geringgradige bis mittelgradige panmurale Infiltrationen, 4= diffuse hochgradige Infiltration mit einer auffälligen subepithelialen und intraepithelialen Komponente). Darüber hinaus wird der luminale Verschluss des Bronchus aufgrund von bindegewebigen Veränderungen mit in die Klassifikation einbezogen (0= keine Veränderungen, 1= <25 % obliteriert, 2= 25-50 % Obliteration, 3= 50-75 % Obliteration, 4= >75 % Obliteration). Aus diesen drei Bewertungsmerkmalen wurde anschließend für jeden Schnitt der Mittelwert gebildet und als sogenannter „Rejection Score“ verwendet. Darüber hinaus wurde am Tag der elektiven Euthanasie Serum aus den Mäusen gewonnen und für weitergehende Untersuchungen, wie die Bestimmung von spezifischen Zytokinen, zunächst bei -80°C konserviert.

Abb. 3.9: AUFBAU DES ADOPTIVEN TRANSFER-MODELLS. Am Tag der LungenTx der Minipigs wurden in NOD.rag^-/^-γc^-/^- (NRG)-Mäuse ein Stück Bronchus aus der rechten Lunge des Spender-Minipigs transplantiert und die Mäuse mit PBMC der entsprechenden Empfänger-Minipigs rekonstituiert. 28 Tage später wurde der Bronchus explantiert und auf seine histologischen Veränderungen hin untersucht.

Die Behandlung der Tiere erfolgte nach den Grundsätzen des Deutschen Tierschutzgesetzes.

Die Genehmigung zur Durchführung der Tierversuche wurde nach § 8 des Tierschutzgesetzes in der Fassung der Bekanntmachung vom 18. Mai 2006 (BGBl. I S. 1206, 1313), zuletzt geändert durch Art. 20 des Gesetzes vom 9. Dezember 2010 (BGBl. I S. 1934, 1940f) in der derzeit geltenden Fassung am 10.08.2012 für den Zeitraum vom 22.05.2013 bis zum 21.05.2016 vom Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit erteilt (Aktenzeichen: 33.9-42502-04-13/1142).

3.11.2 Versuchsgruppen

Im Rahmen dieser Arbeit wurde anhand von porzinisierten Mäusen der Effekt der vorgezogenen Induktionstherapie auf das Verhalten der alloreaktiven Zellen des Empfänger-Minipigs auf das Spenderantigen untersucht. Zum einen wurde das histologische Schicksal der Bronchi, welche mit PBMC aus nicht-vorbehandelten (naїven) Empfänger-Minipigs rekonstituiert wurden (Gruppe naїve PBMC), verglichen mit den Bronchi aus Mäusen, die PBMC aus mit Antikörpern vorbehandelten Empfänger-Minipigs (Gruppe geprimte PBMC) erhielten. Zudem wurde eine Kontrollgruppe, mit Mäusen welche keine PBMC sondern physiologische Kochsalzlösung (negative Kontrollgruppe) erhalten hatten, angelegt.

Ein weiterer Mechanismus, der in diesem Setup beleuchtet wurde, war der direkte sowie indirekte Einfluss der anti-CD4- sowie anti-CD8-Antikörper, welcher einigen der Schweine als Induktionstherapie verabreicht wurde, auf das Transplantat. Für diese Untersuchungen wurden vier weitere Gruppen gebildet: Die Gruppe CD4 mAb erhielt 60 µg anti-CD4 mAb ohne PBMC, der Gruppe CD8 mAb wurde 60 µg anti-CD8 mAb verabreicht. Die Gruppe naïve PBMC+CD4 mAb erhielt zusammen mit den alloreaktiven PBMC 60 µg anti-CD4 mAb, die Gruppe naïve PBMC+CD8 mAb entsprechend 60 µg anti-CD8 mAb zusammen mit PBMC. Tabelle 3.4 zeigt eine Übersicht der Gruppen.

Gruppe Protokoll / Applikation von: Anzahl der Tiere

naїve PBMC PBMC aus naïven Minipigs 4

geprimte PBMC PBMC aus vorbehandelten Minipigs 2 negative Kontrolle Physiologische Kochsalzlösung 12

CD4 mAb anti-CD4 mAb 4

CD8 mAb anti-CD8 mAb 3

naїve PBMC + CD4 mAb PBMC + anti-CD4 mAb 4

naїve PBMC + CD8 mAb PBMC + anti-CD8 mAb 4

Tabelle 3.4: AUFSTELLUNG DER PORZINISIERTEN MÄUSE NACH BEHANDLUNGSPROTOKOLL.

3.12 Detektion von Zytokinen im Serum von Minipigs und Mäusen

Zu den unter 3.6.1 beschriebenen Kontrollzeitpunkten wurde von den Minipigs unter anderem Serum für die Untersuchung auf spezifische Zytokine abgenommen. Außerdem wurde aus den unter 3.11 beschriebenen ‚porzinisierten Mäusen‘ am Tag der Sektion (28 Tage nach BronchusTx) Serum für diese Untersuchungen asserviert. Die Messung der Zytokine erfolgte in Zusammenarbeit mit Frau Professorin C. Falk, Institut für Transplantationsimmunologie der MHH, anhand eines Luminex® 200^TM Systems (Luminex Corporation, Austin, Texas, USA). Dazu wurden 80 µl der zu untersuchenden Probe zusammen mit 80 µl Sample Diluent (Bio-Rad Laboratories, München, Deutschland) in eine 96-Well Rundboden-Platte (Greiner, Frickenhausen, Deutschland) pipettiert. Vor dem Messen wurden in jedes Well mit Farbcodes markierte Beads gegeben. Diese Beads sind an Antikörper gekoppelt, welche für das zu detektierende Zytokin spezifisch sind. Gebundene Zytokine werden anschließend durch einen PE-gelabelten Capture-Antikörper sichtbar gemacht.

Abb. 3.10: BEISPIEL EINES BEAD-ZYTOKIN-ANTIKÖRPER-KOMPLEXES. An den mit

Antikörper gekoppelt ist, bindet das entsprechende Zytokin, welches dann durch einen fluoreszierenden Zweit-Antikörper sichtbar gemacht wird.

Das Luminex® 200^TM kann pro Durchlauf bis zu 100 Zytokine messen. Ein erster Laser detektiert den Farbcode des Beads und ordnet ihn so dem entsprechenden Zytokin zu. Ein zweiter Laser liest die Fluoreszenz aus. Da nur ein Fluoreszenzsignal abgegeben wird wenn an das Bead das entsprechende Zytokin mit PE-gelabeltem Capture-Antikörper gebunden hat, lassen sich so Rückschlüsse auf das Vorkommen des Zytokins in der zu untersuchenden Probe ziehen.

In den hier beschriebenen Experimenten kamen ein Bio-Plex Pro™ Human Cytokine 21-plex Assay (IL-1α, IL-2Rα, IL-3, IL-12(p40), IL-16, IL-18, CTACK, GRO-α, HGF, IFN-α2, LIF, MCP-3, M-CSF, MIF, MIG, β-NGF, SCF, SCGF-β, SDF-1a, TNF-β, TRAIL zuzüglich ICAM und VCAM) und ein Bio-Plex Pro™ Human Cytokine 27-plex Assay (1, ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12(p70), IL-13, IL-15, IL-17, Eotaxin, FGF Basic, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, IP-10, MCP-1 (MCAF), MIP-1α, MIP-1β, PDGF-BB, RANTES, TNF-α, VEGF, alles Bio-Rad Laboratories, München, Deutschland) zum Einsatz.

Da diese Kits Human-spezifisch und für Schweine-Zytokine nur kreuzreaktiv sind, wurde erst in der Auswertung festgestellt, welche Antikörper mit Minipig-Zytokinen kreuzreaktiv waren.

Die Standardkurven und Konzentrationen wurden durch den Bio-Plex Manager 6.0 errechnet.

3.13 Statistik

Die Versuchsergebnisse werden in den Tabellen und Abbildungen allgemein als arithmetische Mittelwerte (xˉ ) mit entsprechender Standardabweichung (SD) oder entsprechendem Standardfehler der Mittelwerte (SEM), angegeben. Dabei kennzeichnet n die Anzahl der für die Versuche herangezogenen Tiere. Die Berechnung der Mittelwerte, Standardabweichungen und Standardfehler der Mittelwerte, die graphische Darstellung sowie die statistische Auswertung der Ergebnisse erfolgte mit dem Programm GraphPad Prism (GraphPad Prism Version 6.04 for Windows, GraphPad Software Inc., San Diego, CA 92121, USA, www.graphpad.com). Da die Daten größtenteils nicht normalverteilt waren, erfolgte der Mittelwertvergleich zwischen den Gruppen an einzelnen Tagen mittels one way ANOVA, ergänzt durch den Dunns post hoc Test für multiple Vergleiche. Analog dazu erfolgte der Vergleich von gepaarten Datensätzen mittels two way ANOVA, ergänzt durch Turkeys post

Definition:

p > 0.05 nicht signifikant (n.s.) p* = 0.01 bis 0.05 signifikant

p** = 0.001 bis 0.01 hoch signifikant p^*** ≤ 0.001 höchst signifikant.

4 Ergebnisse

4.1 Auswahl der Tiere

Aus dem bestehenden Schweinekontingent von 47 transplantierten Schweinen standen nach Ausschluss der Tiere, die nicht aufgrund einer Transplantatabstoßung elektiv getötet worden waren, 34 Tiere für weitergehende Untersuchungen zur Verfügung. Gründe die zum Ausschluss führten, waren konkret das Versterben eines Tieres innerhalb der ersten 28 postoperativen Tage, wenn ihr Tod nicht mit dem angewandten Protokoll in Verbindung gebracht werden konnte. Kam es zu einem späteren Zeitpunkt zum akzidentiellen Tod eines Empfängertieres, so wurde abhängig vom letzten Röntgenbild und der abschließenden histologischen Untersuchung entschieden, ob das entsprechende Tier aufgrund der Eindeutigkeit dieser Ergebnisse, in Zusammenhang mit dem zeitlichen Abstand zur Transplantation mit einer hohen Wahrscheinlichkeit den Abstoßern oder den langzeitüberlebenden Tieren zugeordnet werden, und somit trotzdem mit eingeschlossen werden konnte. Der Übersicht halber sind in Tabelle 4.1 nur die für diese Arbeit verwendeten Tiere aufgeführt.

Tabelle 4.1: AUFLISTUNG DER IN DIESER ARBEIT VERWENDETEN TIERE mit Tier- ID, jeweilig angewendetem Behandlungs-Protokoll, Überlebenstage mit Besonderheiten (PCMV=Porzines Cytomegalie Virus), histologischem sowie röntgenologischem Grading zum Todeszeitpunkt (HAR= Hyperakute Abstoßung), SLA I Mismatchstellen und Zellzahl der

Probe vor.

4.2 Transplantatüberleben

In älteren Untersuchungen in unserem Minipigmodell konnte gezeigt werden, dass es nach dem Absetzen der pharmakologischen Immunsuppression, und in Abwesenheit anderer immunsuppressiver Protokollbestandteile, etwa 14 bis 42 Tage dauert bis die Tiere ihr Transplantat abstoßen. Folglich wurde bei Tieren, die bis zum 120. postoperativen Tag keine Anzeichen der Abstoßung zeigten, dem jeweils verwendeten Protokoll ein protolerogener Effekt zugeschrieben. Umso länger keine Abstoßung beobachtet werden konnte, desto höher wurde der Erfolg beurteilt. Da für Tiere, welche nie ein Zeichen einer Transplantatabstoßung zeigten, der Zeitpunkt für die elektive Euthanasie willkürlich gewählt wurde (zum Teil jenseits POD 800), wurde in dieser Arbeit der postoperative Tag 328 als jener Tag definiert, an dem das Versuchsziel einer langfristigen Transplantattoleranz als erreicht galt. Tabelle 4.2 zeigt eine Übersicht des Transplantatüberlebens in den jeweiligen Gruppen. Da in Gruppe IRR+SpTx POD 0 mehr als 50 % der Tiere das Versuchsziel erreichten, also schließlich elektiv getötet wurden, ohne Zeichen der Abstoßung zu zeigen, konnte für diese Gruppe kein medianes Überleben berechnet werden (‚undefined‘). Aus diesem Grund ist zusätzlich das durchschnittliche Überleben (xˉ ) ± Standardfehler (SD) berechnet worden. Abbildung 4.1 stellt die Verteilung der Überlebenstage der einzelnen Tiere dar.

Tabelle 4.2: ÜBERSICHT ÜBER DAS TRANSPLANTATÜBERLEBEN:

Abb. 4.1: VERTEILUNG DER TIERE HINSICHTLICH IHRES TRANSPLANTATÜBERLEBENS. Die Boxplots zeigen den Todeszeitpunkt / den Zeitpunkt der elektiven Euthanasie der einzelnen Minipigs. Die Säulendiagramme der perioperativ mit Splenozyten behandelten Tiere sind hellgrün hinterlegt, die der vorbehandelten Tiere rot. Sie visualisieren das resultierende durchschnittliche Überleben in Tagen, mit ihrem Standardfehler (SD) in grau. Anhand des Dunns post hoc test (one way ANOVA) sind statistisch keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen messbar.

Da in dieser Arbeit der Erfolg der Induktion mit Bestrahlung (IRR) verglichen werden sollte mit dem Erfolg einer Induktionstherapie durch anti-T-Lymphozyten-spezifische monoklonale Antikörper (mAb), wurde zunächst das Überleben dieser beiden Gruppen, zusammen mit den entsprechenden Kontrollgruppen zu den untersuchten Zeitpunkten POD -28 und POD 0 miteinander verglichen (Abb. 4.2 A+B). Bei den Tieren welche schon 28 Tage vor der Transplantation induziert worden waren, lässt sich zwischen beiden induzierten Gruppen kein signifikanter Unterschied im Transplantatüberleben feststellen. Bis zum postoperativen Tag 266 hatten alle Schweine dieser Gruppen ihre Lungen abgestoßen. Es fällt allerdings auf, dass die dazugehörige Kontrollgruppe mit zwei Schweinen, welche ihr Transplantat bis zum Versuchsende nicht abstießen, ein sichtbar besseres Überleben zeigte (Abb 4.2 A). Anders verhielt es sich mit der Induktion an POD 0. Während alle Tiere der mAb-Gruppe ihr Transplantat bis zum POD 121 abstießen, wurden >50 % der IRR-Gruppe zu sogenannten Langzeitüberlebern. Hier hatten auch in der entsprechenden Kontrollgruppe alle Minipigs ihre transplantierten Lungen bis zum postoperativen Tag 121 abgestoßen (Abb. 4.2 B).

zusammengefasst und hinsichtlich ihres Transplantatüberlebens mit den beiden durch Antikörper induzierten Gruppen verglichen. Tiere, welche einem Induktionsprotokoll mit monoklonalen Antikörpern unterzogen worden waren, stießen ihre Lungen signifikant früher ab als solche, die präoperativ bestrahlt worden waren (p= 0,02, Abb. 4.2 C). Außerdem wurde insgesamt der Erfolg einer vorgezogenen Induktionstherapie (IRR bzw. mAb POD -28) verglichen mit derselben Induktion im direkten perioperativen Zeitraum (IRR bzw. mAb POD 0, Abb. 4.2 D). Hier konnte beobachtet werden dass Tiere, welche eine vorgezogene Induktionstherapie erhalten hatten, insgesamt ein früheres Transplantatversagen zeigten als solche, die ihre Induktion perioperativ erhielten, auch wenn der Unterschied statistisch mit p=0,066 knapp nicht signifikant war. Fünf Tiere aus der Gruppe mAb+SpTx POD -28 sowie zwei Tiere aus der KoGru SpTx POD -28 stießen ihre Lungen sogar hyperakut ab.

Abb. 4.2: ÜBERLEBENSKURVEN DER MIT BESTRAHLUNG ODER ANTIKÖRPERN INDUZIERTEN GRUPPEN IM VERGLEICH. Abbildung A+B vergleichen die unterschiedliche Induktion zum selben Zeitpunkt. In Abbildung C werden alle mit Bestrahlung induzierten Tiere mit allen Antikörper-induzierten Tieren verglichen, unabhängig vom Zeitpunkt der Induktion. Abbildung D zeigt den Einfluss des Induktionszeitpunkts, unabhängig

rank (Mantel-Cox)Test herangezogen.

4.3 Röntgenologische Befunde

Die Bewertung der Röntgenbilder erfolgte, wie unter 3.6.2 beschrieben, anhand einer Skala von 0 (vollständige seitengleiche Belüftung) bis 4 (homogene Verschattung der linken Lunge bei unveränderter rechter Lunge). Sieben Tage nach der Transplantation zeigten die Röntgenaufnahmen des Thorax bei allen Tieren leichte bis mäßige homogene (L1-3) Verschattungen des Transplantats. Zu diesem Zeitpunkt können derartige Veränderungen zwar einerseits gelegentlich noch auf postoperative Veränderungen zurückzuführen sein und müssen daher nicht zwangsläufig als Zeichen einer Abstoßung bewertet werden (161).

Andererseits jedoch kommen leichte akute Abstoßungen um den siebten postoperativen Tag nach Lungentransplantation häufig vor und sind einer Kortisonstoßtherapie in der Regel gut zugänglich. Tiere mit einem Röntgenscore von L2 oder L3 am POD 7 wurden daher mit einem 3-tägigen i.v. Kortisonstoß von 250 mg Methylprednisolon/d behandelt. Bis zum POD 28 waren die Lungen aller Tiere wieder nahezu seitengleich belüftet. Die rechten Lungen waren bei Abstoßern sowie langzeitüberlebenden Tieren zu allen Zeitpunkten vollständig und homogen belüftet. Abb. 4.3 Reihe A zeigt den typischen röntgenologischen Verlauf eines langzeitüberlebenden Tieres. Während am POD 7 die linke Lunge mit L2 bewertet werden musste, hatte sie sich bis zum postoperativen Tag 28 fast vollständig erholt (L1). In den folgenden Röntgenkontrollen bis zum Tag 614 (Tag der elektiven Euthanasie) zeigte die linke Lunge stets denselben Belüftungsgrad wie die rechte Lunge (L0). In Reihe B ist der Verlauf eines abstoßenden Tieres dargestellt. Im Unterschied zu langzeitüberlebenden Tieren verschatteten sich bei diesen Tieren die linken Lungen nach Absetzen der pharmakologischen Immunsuppression (POD 28) progredient, bis sie eine homogene Infiltration aufwiesen (L3, Zeitpunkt der elektiven Euthanasie, hier POD 121).

Eine Ausnahme bildeten die Tiere #313883 sowie #313729. Diese Schweine zeigten etwa 15 Tage post transplantationem Symptome einer Dyspnoe. Abbildung 4.3 Reihe C zeigt die Röntgenbilder des Minipigs #313883 an POD 7 sowie POD 17. Hier ist neben einer diffusen Verschattung der linken Lunge (L1) auch eine fokale Infiltration der rechten Lunge zu erkennen, was im verwendeten Versuchsaufbau als suggestiv für einen pulmonalen Infekt gewertet wurde. In einer Multiplex-PCR (IVD GmbH, Hannover, Deutschland) von Lungenbiopsien dieser Tiere konnte porzines Zytomegalievirus (PCMV) sequenziert werden.

Abb. 4.3: REPRÄSENTATIVE RÖNTGENBILDER AUSGEWÄHLTER TIERE In Reihe A sind die Röntgenbilder der postoperativen Tage 7, 28 und 614 des langzeitüberlebenden Tieres #108146 dargestellt. Reihe B zeigt die Bilder des Abstoßers #214207 an den Tagen 7, 28 und 121. Die Verschattung der linken Lunge beider Tiere am POD 7 wurde als passagere akute Abstossung gewertet, welche mit Kortisonstoßtherapie behandelt wurde. An Tag 28 waren die linken Lungen wieder deutlich transparenter. Während die linke Lunge des langzeitüberlebenden Tieres #108146 an POD 614 immer noch genauso gut belüftet war wie dessen rechte Lunge, war in #214207 an Tag 121 (Tag der elektiven Euthanasie) die linke Lunge komplett verschattet. Reihe C zeigt die Bilder des Tieres # 313883 an POD 7 und POD 17 (2 Tage vor der elektiven Euthanasie). Im Unterschied zu den anderen Tieren sind hier auch Verschattungen in der rechten Lunge zu erkennen.