Versuchstiere der Klinik für Rinder, Tierärztliche Hochschule Hannover

Zur Gewinnung der Blutproben für die In-vitro-Versuche wurden Kühe der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (Aktenzeichen 33.19-42502-05-17A176) (9.3.3) verwendet. Dabei handelt es sich um zehn weibliche Tiere der Rasse „Deutsche Holstein“ mit einem Durchschnittsalter von 7,5 Jahren. Über den Zeitraum der Versuche hat sich dabei die Gruppenzusammensetzung geändert. Die Kühe waren zum Zeitpunkt der Blutprobengewinnung klinisch gesund und nicht tragend. Da die Tiere von der Klinik nicht für Fortpflanzungszwecke verwendet werden, befanden sie sich während des Entstehens dieser Arbeit nicht in Laktation.

41 3.2.2 Blutentnahme bei den Versuchstieren

Die Blutentnahme erfolgte steril aus der rechten oder linken Vena jugularis externa unter Zuhilfenahme einer Staukette nach Witte (9.3.1). Die Tiere waren dabei im Fressgitter mittels eines Halfters fixiert. Zur Blutentnahme wurde das Vacutainer®-System (9.3.1) verwendet und das Blut in Natrium-Heparin-Röhrchen (9.3.1) mit einem Fassungsvermögen von 10 ml überführt und sofort geschwenkt. Alle im Folgenden beschriebenen Zentrifugationsschritte wurden, sofern nicht anders erwähnt, in einer auf 4 °C gekühlten Zentrifuge durchgeführt.

3.2.3 Separation neutrophiler Granulozyten aus dem peripheren Blut

Das Blut aus je zwei 10 ml Natrium-Heparin-(NaHep)-Röhrchen (3.2.2) wurden vollständig in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen (9.3) überführt, und mit 40 ml PBS (phosphate buffered saline, PBS) (9.3.5) auf 50 ml Gesamtvolumen aufgefüllt. In einem zweiten Zentrifugenröhrchen wurden 15 ml Lymphozytenseparationsmedium® (Ficoll 1,077 g/ml) (9.3.5) vorgelegt und mit dem zuvor hergestellten Blut-PBS-Gemisch überschichtet. Es folgte ein Zentrifugationsschritt bei 1000 x g für 30 Min. und 10 °C ohne Bremse (9.1). Im Anschluss wurde der Überstand, bestehend aus Separationsmedium, einer über dem Medium liegenden Interphase (mononukleäre Zellen und Thrombozyten) und Plasma mit Hilfe einer 10 ml Pipette (9.3.2) abgenommen. Das Zellpellet, welches Erythrozyten, Thrombozyten und Granulozyten enthielt, wurde resuspendiert. Es folgte die erste hypotone Lyse, die der Entfernung der Erythrozyten aus dem Pellet diente. Dafür wurden 15 ml destilliertes Wasser (A. dest) (9.3.5) zu dem resuspendierten Pellet gegeben, für 10 Sek. geschwenkt und im Anschluss mit 15 ml doppelt konzentriertem PBS (2 x PBS) (9.3.5) isoton ausgeglichen. Die Probe wurde bei 500 x g für 10 Min. zentrifugiert, der Überstand abgegossen und das Zellpellet resuspendiert. Es folgte eine schematisch gleiche zweite hypotone Lyse mit dem Ziel, die Thrombozyten zu entfernen. Die Probe wurde bei 250 x g für 10 Min. zentrifugiert, der Überstand erneut abgegossen und die Zellen mit 50 ml PBS gewaschen (120 x g, 10 Min.) Abschließend wurde der Überstand verworfen, das aufgereinigte Pellet resuspendiert und die gewonnenen Zellen in 5 ml RPMI-Medium aufgenommen und die Reinheit und Vitalität der nPMN durchflusszytometrisch erfasst (3.3.1). Anschließend wurden die Zellen zentrifugiert (500 x g, 5 Min., 4 °C) und in RPMI- oder AU-Medium (9.3.5) ohne Zusatz von Penicillin und Streptomycin aufgenommen. Da das fetale Kälberserum, welches im R10F-Medium enthalten ist, unterschiedliche Proteine und

42

Wachstumsfaktoren enthält, deren Zusammensetzung variiert, wurde im Falle der neutrophilen Granulozyten RPMI-Medium ohne Zusatz von Serum verwendet. So wurde das Medium auf seine Bestandteile hin standardisiert.

3.2.4 Separation von mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut

Für die Separation der mononukleären Zellen (mononuclear cells, MNC) wurde das Blut aus den NaHep-Röhrchen (3.2.2) in einem Verhältnis von 1 : 2 in 50 ml Zentrifugenröhrchen mit PBS verdünnt. In einem weiteren Zentrifugenröhrchen wurden 15 ml des Lymphozytenseparationsmedium® (Ficoll 1,077 g/ml) vorgelegt und mit dem verdünnten Blut überschichtet. Um die Zellen anhand ihrer Dichte aufzutrennen, folgte ein Zentrifugationsschritt bei 1000 x g für 30 Min. und 10 °C ohne Bremse. Im Anschluss wurde die Interphase, die sich zwischen dem Plasma und dem Separationsmedium befand, mit Hilfe einer 10 ml Pipette abgenommen, in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt und zentrifugiert (500 x g, 10 Min., 4 °C, mit Bremse). Im Anschluss wurde der zellfreie Überstand entfernt und, sofern kontaminierende Erythrozyten vorhanden waren, eine hypotone Lyse angeschlossen.

Dafür wurden 20 ml A. dest hinzugegeben und der Falcon für 10 Sek. geschwenkt. Danach wurden die Zellen mit 20 ml doppelt-konzentriertem PBS gemischt und erneut zentrifugiert (250 x g, 10 Min, 4 °C, mit Bremse). Gegebenenfalls wurde die hyptone Lyse einmal wiederholt. Im nächsten Schritt wurden die Zellen in PBS gewaschen (125 x g, 10 Min, 4° C, mit Bremse) und anschließend in 3 ml MACS Puffer (9.3.5) aufgenommen.

3.2.5 Zellseparation mittels Magnetic acivated cell sorting (MACS)

Die Zellseparation mittels magnetic activated cell sorting (MACS) basiert auf der Bindung eines Komplexes an das korrespondierende Epitop einer Zelle. Der Komplex besteht dabei aus magnetischen Kügelchen (beads) und einem Antikörper. Die beads-markierten Zellen werden nach der Bindung in ein magnetisches Feld verbracht. Durch einen Spülvorgang können nun die nicht-markierten Zellpopulationen entfernt (Depletion) und die Zielzellen nach Entfernung des Magnetfeldes und Pufferzugabe mit Hilfe eines Stempels gewonnen werden (Eluat). In der vorliegenden Arbeit wurde eine einphasige, direkte Markierung der Zielzellen mit anti-CD14-MicroBeads (9.3.3) mit einer anschließenden positiven Selektion (Eluat, beads-gekoppelte Zellen) durchgeführt.

43 Einphasen-MACS

Nach der Separation der MNC aus peripherem Blut (3.2.4) wurden diese in 3 ml MACS-Puffer aufgenommen und zur Aggregatentfernung über einen 30 µm Präseparations-Filter (9.3.2) gegeben, welcher anschließend zweimalig mit 5 ml MACS-Puffer gespült wurde. Anschließend wurden 100 µl der Zellsuspension in 100 µl Propidiumiodid-Lösung (PI) überführt und die Vitalität und Reinheit der Zellen durchflusszytometrisch bestimmt (3.3.1). Daraufhin wurden die Zellen zentrifugiert (400 x g, 10 Min., 4 °C) und in je 90 µl MACS-Puffer pro 1 x 10⁷ MNC resuspendiert. Zu den resuspendierten Zellen wurden zusätzlich je 10 µl anti-CD14-MicroBeads pro 1 x 10⁷ Zellen gegeben. Nach 30-minütiger Inkubation auf Eis wurden die überschüssigen anti-CD14-MicroBeads durch Zugabe von 10 ml MACS-Puffer und anschließende Zentrifugation (400 x g, 10 Min., 4 °C) entfernt. Das Pellet wurde nach Verwerfen des Überstandes in 3 ml MACS-Puffer aufgenommen und die Zellen der magnetischen Zellseparation unterzogen. Hierfür wurde eine LS-MACS-Separationssäule (9.3.2) in die Quadro-MACS-Station (9.3.2) eingesetzt und mit 3 ml MACS-Puffer gespült. Die Quadro-MACS-Station enthält einen Magnet, sodass die anti-CD14-markierten Monozyten innerhalb der Separationssäule im Magnetfeld zurückgehalten wurden. Die mit anti-CD14-MicroBeads-markierten mononukleären Zellen wurden in die Separationssäule gegeben und in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen (9.3.2) aufgefangen. Anschließend wurde die Säule dreimal mit MACS-Puffer gespült, um die nicht-markierten Zellen, bestehend aus Lymphozyten und nicht-klassischen Monozyten, zu depletieren (Negativselektion). In der Folge wurde zur Gewinnung der im Magnetfeld innerhalb der Säule gehaltenen CD14-positiven Monozyten zunächst die Säule aus dem Magnetfeld (Quadro-MACS-Station) entfernt und in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen gestellt. Mittels 5 ml MACS-Puffer und unter Zuhilfenahme eines Stempels wurden die CD14-positive Monozyten aus der Säule herausgewaschen (Eluat). Die Reinheit und Vitalität von Eluat und Depletion wurde durchflusszytometrisch erfasst (3.3.1), die Monozyten zentrifugiert (400 x g, 10 Min., 4 °C), in R10F⁺-Medium aufgenommen und auf 2,5 x 10⁵ Monozyten/ml eingestellt. Für experimentelle Ansätze mit Mycoplasma bovis wurden die Zellen in R10F-Medium ohne Zusatz von Penicillin und Streptomycin aufgenommen.

44 3.3 Bestimmung der Zellzahl und Zellvitalität

3.3.1 Durchflusszytometrische Zellbestimmung

Die durchflusszytometrische Erfassung der Zellzahl und -vitalität von neutrophilen Granulozyten (nPMN), mononukleären Zellen (mononuclear cells, MNC), Monocyte-derived Macrophages (MdM) oder Makrophagen der RAW-Zelllinie erfolgte nach Zusatz einer Propidiumiodid-Lösung (PI) (9.3.5) zu den Zellen. In dieser Arbeit wurde eine Lösung aus 4 µg Propidiumiodid (9.3.3) pro ml PBS verwendet. Es handelt sich dabei um ein Fluorochrom, welches in der Lage, ist die perforierte Zellmembran von toten Zellen, jedoch nicht die intakte Membran von lebenden Zellen zu durchdringen. Beim Eindringen in eine tote Zelle interkaliert PI mit Nukleinsäuren, beispielsweise mit der DNS im Zellkern, was zu einer Erhöhung der Fluoreszenzintensität führt. Dadurch kann PI zur Diskriminierung der Zellvitalität verwendet werden. So wurden nicht-vitale Zellen, also PI-positive Zellen, mittels des Fluoreszenzkanals 3 (FL3) dargestellt und durch Setzen eines Fensters in der BD Accuri™ C6 Software (9.2) für die weitere Auswertung ausgeschlossen. Jeweils 100 μl der zuvor hergestellten Zellsuspension (3.2.3) wurden mit 100 μl PI versetzt. Es erfolgte die durchflusszytometrische Erfassung der vitalen Zellen/ μl.

Die obig beschriebene Erfassung von toten Zellen gibt keinen Aufschluss über die Form des Zelltodes (Apoptose, Nekrose oder, im Falle der Neutrophilen, NETose). Zur genaueren Bestimmung von Apoptose und Nekrose wurde mittels eines weiteren Fluorochroms gearbeitet.

Dies wird in 3.8, sowie in 3.9 näher erläutert.

3.3.2 Bestimmung der Zellzahl mittels der Bürker Zählkammer

Im Falle der Embryonic-bovine-lung (EBL)-Zellen (9.3.4) wurde die Zellzählung mittels der Bürker-Zählkammer (9.3.2) durchgeführt. Dafür wurde zunächst eine Vitalfärbung mit dem Azofarbstoff Trypanblau (9.3.3) durchgeführt. Diese Substanz wird ausschließlich von abgestorbenen oder perforierten Zellen aufgenommen, welche sich folglich lichtmikroskopisch deutlich sichtbar dunkelblau färben. Für die Färbung wurde die zuvor hergestellten Zellsuspension (3.5) in einem Verhältnis von 1 : 3 mit Trypanblau gemischt. 10 μl der Zell-Trypanblau-Mischung wurden in eine Bürker Zählkammer gegeben und es erfolgte die

45

lichtmikroskopische Auszählung vitaler Zellen in drei Großquadraten mit der 40er Vergrößerung. Es gilt, unter Berücksichtigung des Zählkammer-Verdünnungsfaktors (10⁴):

ℎ = 3 ß × 10 × 3

3.4 Durchflusszytometrie

Die durchflusszytometrische Erfassung von Zellen erfolgte mit dem BD Accuri^™ C6 Flow Cytometer (9.1). Es verfügt über zwei Laser mit den Anregungswellenlängen von 488 nm (blau) und 640 nm (rot), sowie vier Fluoreszenzdetektoren mit optischen Filtern, die eine Messung von unterschiedlichen Fluoreszenzen (FL1 bis FL4, Tabelle 1) zulassen. Im Zuge der Messung entsteht Streulicht an Partikeln und Zellen, welches mittels zwei Lichtstreuungsdetektoren erfasst wird.

Das parallel zur Richtung des Auftretens erfasste Streulicht ist ein Maß für die relative Größe der gemessenen Partikel und Zellen (Vorwärtsstreulicht, Forward Scatter, FSC), das orthogonal auftretende Streulicht wird als Seitwärtsstreulicht (Side Scatter, SSC) bezeichnet und dient als Maß für die Zellgranularität. Die Auswertung der Daten erfolgt, sofern nicht anders erwähnt, mittels der BD Accuri™ C6 Software.

Sofern nicht anders erwähnt, wurden alle Messungen mit einem Schwellenwert (Threshold) von 80 000 und einer Messgeschwindigkeit von 66 µl/Min. (Einstellung „fast“) durchgeführt, wobei ein Minimum von 10 000 Ereignissen (events) erfasst wurde.

Tabelle 1: Fluoreszenzkanäle des BD Accuri™ C6 Flow Cytometer

Kanal Exitationsminimum Exitationsmaximum Fluoreszenz Fluorochrom

FL1 495 nm 520 nm grün-gelb FITC

FL2 495 nm 578 nm orange-rot PE

FL3 530 nm 615 nm rot PI, PE/Cy5

FL4 650 nm 668 nm dunkelrot AlexaFluor647

In dieser Arbeit verwendet: FITC, AlexaFluor647, Rhodamin 123, PI

FITC = Fluoresceinisothiocyanat, PE = Phycoerythrin, PI = Propidiumiodid, PE/Cy5 = Phycoerythrin/Cyanin5

46 3.4.1 Bildung reaktiver Sauerstoffspezies

Reaktive Sauerstoffspezies (Reactive oxygen species, ROS) beschreiben als Überbegriff reaktive Moleküle und freie Radikale, die aus molekularem Sauerstoff entstehen und der Erregerabwehr, aber auch der Signaltransduktion dienen. Die Darstellung der ROS geschieht anhand des nicht-fluoreszierenden Dihydrorhodamin 123 (DHR123) (9.3.3), welches passiv in die Zelle diffundiert. Durch ROS wie Peroxide, Peroxynitrite und Hydrogenperoxid wird DHR123 zu dem grün fluoreszierenden Rhodamin 123 oxidiert, welches in den Mitochondrien akkumuliert.

Die entstehende Fluoreszenz wird durchflusszytometrisch im Fluoreszenzkanal 1 (FL1) erfassbar (Emmisionsmaximum 507-527 nm) und bildet somit ein Maß für die Sauerstoffmetabolisierung. Die In-vitro-Stimulation von neutrophilen Granulozyten mit Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) (9.3.3) diente dabei der Quantifizierung der Bildungskapazität von ROS. Für die Messung der ROS-Produktion wurden neutrophile Granulozyten aus heparinisiertem Vollblut separiert und auf 6 x 10⁶ Zellen/ml eingestellt (3.3.1). Je nach Versuchsaufbau wurden die Zellen teilweise zunächst im Rahmen anderer In-vitro-Versuche verschiedenen Stimuli ausgesetzt. Der Bedarf an Reagenzien zur Durchführung der ROS ist in der Tabelle 2 zusammengefasst.

Tabelle 2: Reagenzien für eine ROS

Reagenz Ansatz

nPMN-Zellsuspension 6 x 10⁶ Zellen/ml (3.2.3)

DHR-Percoll 1,5 μg/ml DHR123 (9 μl DHR + 8,91 ml isotones Percoll (9.3.3)) PMA (0 und 400 nM) a) 40 μl PMA-Stocklösung (1 mM) + 960 μl

RPMI-Medium = 40 000 nM

b) Verdünnung aus a): 10 µl PMA + 990 µl RPMI-Medium= 400 nM

DHR123 = Dihydrorhodamin 123, PMA = Phorbol-12-myristat-13-acetat

In einer 96-Well-Rundbodenplatte (9.3.2) wurden 100 μl des DHR-Percolls (9.3.5) vorgelegt und 50 μl der PMA-Verdünnung, sowie 50 μl der Zellsuspension hinzugegeben. Nach einer Durchmischung mittels Plattenrüttler folgte eine dreißigminütige Inkubation bei 37 °C und 5%

CO2 im Brutschrank. Im Anschluss wurde die 96-Well -Platte direkt auf Eis verbracht, um dem

47

Adhärieren der Zellen vorzubeugen. Durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren wurden die Proben durchmischt und in 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße mit 100 μl PI überführt. Es erfolgte die durchflusszytometrische Erfassung der ROS.

3.4.2 Membranimmunfluoresenz

Die Membranimmunfluoresenz (MIF) dient dem Nachweis und der Charakterisierung exprimierter Oberflächenstrukturen mittels Fluorochrom-markierten Antikörpern. Sofern der primäre Antikörper dabei direkt Fluorochrom-markiert ist, spricht man von einer direkten MIF.

Ist hingegen der primäre Antikörper unmarkiert, wurde dieser mittels eines sekundären, Fluorochrom-gekoppelten Antikörpers, der spezifisch an den Primärantikörper bindet, sichtbar gemacht und es handelt sich um eine indirekte MIF.

Es wurden monoklonale Antikörper verwendet, die wie in Tabelle 3 beschrieben vorverdünnt wurden. Der unmarkierte Antikörper CH138A wurde mit einem FITC-markierten Sekundärantikörper (Ziege-anti-Maus-IgG + IgM-FITC-Antikörper, Verdünnung 1 : 100) nachgewiesen.

Tabelle 3: Auswahl der Antikörper für die MIF mit neutrophilen Granulozyten.

CD = Cluster of differentiation, FITC = Fluoresceinisothiocyanat

Vor Versuchsbeginn wurde der MIF-Puffer (9.3.5) auf Eis gelagert. Für den Nachweis oben genannter Oberflächenmoleküle auf neutrophilen Granulozyten erfolgt zunächst eine Separation der Zellen aus heparinisiertem Vollblut (3.2.3) und ein Einstellen der Zellzahl auf 5 x 10⁶ Zellen/ml (3.3.1). Je nach Versuchsaufbau wurden die Zellen teilweise im Rahmen anderer In-vitro-Versuche zunächst verschiedenen Stimuli ausgesetzt. 100 µL der

Antikörper Konjugat Klon Isotyp Verdünnung final

Hersteller/

Artikelnummer CH138A unmarkiert CH138A IgM 1 : 50 Kingfisher/

WS0608B-100

CD11b FITC CC126 IgG2b 1 : 30 Bio-Rad/

MCA1425F CD62L AlexaFluor647 FMC46 IgG2b 1 : 50 Bio-Rad/

MCA1076A647

48

Zellsuspension wurden in eine 96-Well-Rundbodenplatte vorgelegt und für 3 Min. bei 350 x g in einer Plattenzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen im Plattenrüttler (9.1) aufgerüttelt. Sofern vorab eine Stimulation stattgefunden hat, folgte zusätzlich ein Waschschritt der Zellen mit 150 μl MIF-Puffer und eine erneute Zentrifugation für 3 Min. bei 350 x g. Im Anschluss wurden 30 µL der Antikörperverdünnung/Well hinzu gegeben und die Rundbodenplatte erneut auf dem Plattenrüttler durchmischt. Es folgte eine Inkubation für 30 Min. auf Eis im Kühlschrank. Danach wurden zwei gleiche Waschschritte durchgeführt: 150 µL MIF-Puffer wurde zu den inkubierten Zellen gegeben, mittels Plattenrüttler durchmischt und für 3 Min. bei 350 x g zentrifugiert, der Überstand verworfen und die Zellen erneut aufgerüttelt. Im Falle der direkt markierten primären Antikörper wurden die Zellen in 100 µL MIF-Puffer resuspendiert und in 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße mit 100 μl PI überführt. Es erfolgte die durchflusszytometrische Erfassung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) (3.4). Handelte es sich um nicht direkt markierte Antikörper, wurden auf das aufgerüttelte Zellpellet 30 μl des entsprechenden Sekundär-Antikörpers gegeben und beides mittels Plattenrüttler durchmischt. Es folgte eine Inkubation für 30 Min.

auf Eis im Kühlschrank. Im Anschluss wurden die Zellen wie im Falle der direkt markierten Antikörper zweimal mit MIF-Puffer gewaschen, in 100 µl MIF-Puffer resuspendiert und in 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße mit 100 μl PI überführt. Abschließend erfolgte eine durchflusszytometrische Erfassung und Auswertung der Daten.

3.4.3 Transwell-Migration von neutrophilen Granulozyten in vitro

Zunächst wurden neutrophile Granulozyten aus heparinisiertem Vollblut separiert (3.2.3) und die Zellsuspension auf 5 x 10⁶ nPMN/ml eingestellt. Je nach Versuchsaufbau wurden die Zellen teilweise zunächst im Rahmen anderer In-vitro-Versuche verschiedenen Stimuli ausgesetzt.

Anschließend wurde in die Vertiefungen des unteren Teils (= Lower Well) einer 10-Well-Chemotaxiskammer 300 µL eines Stimulus oder die Positivkontrolle (boCXCL8 in einer finalen Konzentration von 100 ng/ml, Verdünnungsansatz: 100 μl boCXCL8 1 μg/ml + 900 μl RPMI-Medium) vorgelegt, durch die die neutrophilen Granulozyten im weiteren Verlauf chemotaktisch angezogen wurden. Der Stimulus bzw. die Kontrolle wurden mit 150 µL 100%

isotonen Percoll (9.3.3) mittels einer Kapillarspitze (9.3.2) unterschichtet, sodass einem Adhärieren der migrierten neutrophilen Granulozyten vorgebeugt wurde und diese oberhalb des Percolls verblieben. Da das Fassungsvermögen des Lower Wells 400 µL beträgt, entstand ein

49

Meniskus, der ein luftblasenfreies Aufbringen einer Porenmembran (Polycarbonatmembran) (9.3.2) ermöglichte. Anschließend wurde eine Silikondichtung (9.3.2) aufgelegt und der obere Teil der Kammer (Upper Well, UW) aufgesetzt und mit 6 Schraubenmuttern (9.3.2) fixiert.

200 µL der zuvor hergestellten Zellsuspension wurden in das Upper Well gegeben. Daraufhin folgte eine Inkubation in der Chemotaxiskammer für 2 Stdn. bei 37°C, 5% CO2 im Brutschrank.

Damit für weitere Verarbeitungen und für weitere Versuche genügend transmigrierte neutrophile Granulozyten vorhanden waren, wurden je nach Versuchsaufbau Mehrfachansätze der Proben durchgeführt. Nach der Inkubation wurde zunächst die Zellsuspension aus dem Upper Well abpipettiert und in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt, bei Mehrfachansätzen wurden die Suspensionen vereinigt. Die Chemotaxiskammer wurde durch Entfernen der Schraubenmuttern, des oberen Kammerteils, der Silikondichtung und der Porenmembran eröffnet. Daraufhin wurde der Inhalt des Lower Wells abpipettiert und in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt, wobei auch in diesem Fall Mehrfachansätze vereinigt wurden. Für die Zellen des Upper Well und des Lower Well folgte eine Zentrifugation bei 500 x g für 5 min und eine Resuspension der Zellen in 1 ml RPMI. Je 100 µL wurden im Anschluss in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß mit je 100 µL PI überführt und durchflusszytometrisch erfasst und gezählt (3.3.13.4). Zur Erfassung der Transmigrationsrate der nPMN wurde folgende Berechnung verwendet:

ℎ

( ℎ !! + ℎ )× 100

Sofern die transmigrierten nPMN noch für weitere Versuche verwendet werden sollten, wurden diese erneut bei 500 x g für 5 min zentrifugiert und das Pellet in der für weitere Versuche benötigten Menge RPMI Medium resuspendiert.

3.5 Kultivierung von Embryonic Bovine Lung Cells (EBL-Zellen)

Die EBL-Zelllinie (zur Verfügung gestellt durch das Institut für Mikrobiologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover) (9.3.4) wurde im Brutschrank bei 37 °C und 5 % CO2 in Zellkulturflaschen mit 75 cm² (9.3) unter Zusatz von 15 ml EBL-Medium (9.3.5) kultiviert.

Regelmäßig wurden die Zellen in einem Invertmikroskop (9.1) auf mögliche Kontaminationen und ihre Konfluenz hin überprüft. Bei einer Konfluenz von 90 % wurden die Zellen passagiert.

50

Dazu wurden EBL-Spülmedium (9.3.5) und Accutase (9.3.3) in einem Wasserbad (9.1) für 30 Min. auf 37 °C erwärmt. Das verbrauchte EBL-Medium wurde aus der Zellkulturflache durch Abkippen verworfen und die Zellen zur Entfernung des fetalen Kälberserums zweimal mit 10 ml EBL-Spülmedium gewaschen. Anschließend wurden die Zellen mittels 5 ml Accutase über 5 Min. abgelöst. Danach noch anhaftende Zellen wurden durch vorsichtiges Klopfen der Zellkulturflache gelöst und die Accutase durch Zugabe von 10 ml EBL-Medium inaktiviert. Die Zellsuspension wurde in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen überführt und zentrifugiert (300 x g, 10 Min, 4 °C), der Überstand verworfen und das Zellpellet in 5 ml EBL-Medium resuspendiert. 500 µl der Zellsuspension wurden in eine Zellkulturflasche ausgesät und auf das Volumen von 15 ml mit EBL-Medium aufgefüllt.

Für experimentelle Ansätze erfolgte die Anzucht der EBL-Zellen in einer 24-Well-Flachbodenplatten (9.3). Dazu wurden 20 µl der Zellsuspension im Verhältnis von 1 : 3 mit Trypanblau versetzt und in einer Bürker-Zählkammer gezählt. Es wurden 0,5 x 10⁶ Zellen/Well ausgesät und das Volumen auf 1 ml/Well mit EBL-Medium aufgefüllt. Für experimentelle Ansätze mit M. bovis wurden die EBL-Zellen in EBL-Medium ohne Zusatz von Penicillin und Streptomycin kultiviert.

3.5.1 In-vitro-Stimulation von EBL-Zellen

Um lösliche Mediatoren, die durch Epithelzellen produziert wurden, für weitere experimentelle Ansätze zu gewinnen, wurden die EBL-Zellen zunächst wie in 3.5 beschrieben von der Zellkulturflasche abgelöst. In eine 24-Well Flachbodenplatten wurden je 0,5 x 10⁶ Zellen/Well in EBL-Medium eingesät und mit LPS (finale Konzentration 1 µg/ml) (9.3.3), LAMPs (finale Konzentration: 1 µg/ml) oder M. bovis (10 MOI) für 24 Stdn. stimuliert. Im Anschluss wurde der Überstand in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt, bei 3000 x g für 5 Min. zentrifugiert und der zellfreie Überstand in ein weiteres Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt, welches bis zur weiteren Verwendung bei – 20 °C eingefroren wurde.

51 3.5.2 Einfrieren und Auftauen von EBL-Zellen

Zum Einfrieren der Zellen wurden sie bei einer Konfluenz von 90 % aus der Zellkulturflasche abgelöst. Dazu wurde zunächst das Medium der EBL-Zellen durch Abkippen verworfen und die Zellen zweimalig mit 10 ml vorgewärmten EBL-Spülmedium gespült. Durch Zugabe von 5 ml Accutase wurden die Zellen über 5 min im Brutschrank (37 °C, 5 % CO2) abgelöst. Noch anhaftende Zellen wurden im Anschluss durch vorsichtiges Klopfen gelöst und die Accutase durch Zugabe von 10 ml EBL-Medium inaktiviert. Nach Überführung der Zellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen wurde die Zellsuspension zentrifugiert (10 Min., 300 x g, 4 °C), der Überstand verworfen und die Zellen in 5 ml EBL-Medium resuspendiert. Zur Bestimmung der Vitalität der EBL-Zellen wurden 20 µl der Suspension in einem Verhältnis von 1 : 3 mit Trypanblau versetzt und in einer Bürker-Zählkammer gezählt (3.3.2). Nach einer erneuten Zentrifugation (10 Min., 300 x g, 4 °C) wurden die Zellen in EBL-Gefriermedium (9.3.5) resuspendiert und auf 3 x 10⁶ Zellen/ml eingestellt. Jeweils 1 ml der Zellsuspension wurde in ein Kryoröhrchen (9.3.2) überführt und bei -80 °C in einem Gefrierbehältnis über Nacht um 1 °C/Min. heruntergekühlt. Die Lagerung der EBL-Zellen erfolgte bei -80 °C.

Um die EBL-Zellen aufzutauen, wurden zunächst 15 ml EBL-Medium, das zuvor über 30 Min.

im Wasserbad auf 37 °C erwärmt wurde, in eine Zellkulturflasche vorgelegt. Das Kryoröhrchen mit den gefrorenen EBL-Zellen wurde bis zum vollständigen Auftauen in den Handflächen gerollt, um die durch vermehrte Wärme verstärkte Toxizität des umgebenden DMSO (Dimethylsulfoxid) minimal zu halten. 10 ml des vorgewärmten EBL Mediums wurden in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen vorgelegt und die aufgetauten EBL Zellen hinzugegeben. Zur Entfernung des DMSO wurden die Zellen zentrifugiert (300 x g, 10 Min, 4°C), der Überstand verworfen und die Zellen in 1 ml EBL-Medium resuspendiert und in die vorbereitete

im Wasserbad auf 37 °C erwärmt wurde, in eine Zellkulturflasche vorgelegt. Das Kryoröhrchen mit den gefrorenen EBL-Zellen wurde bis zum vollständigen Auftauen in den Handflächen gerollt, um die durch vermehrte Wärme verstärkte Toxizität des umgebenden DMSO (Dimethylsulfoxid) minimal zu halten. 10 ml des vorgewärmten EBL Mediums wurden in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen vorgelegt und die aufgetauten EBL Zellen hinzugegeben. Zur Entfernung des DMSO wurden die Zellen zentrifugiert (300 x g, 10 Min, 4°C), der Überstand verworfen und die Zellen in 1 ml EBL-Medium resuspendiert und in die vorbereitete

Im Dokument Direkte und indirekte Modulation boviner neutrophiler Granulozyten und deren Interaktion mit Monozyten durch Mycoplasma bovis (Seite 40-0)