moduliert, wurde zunächst ein Protokoll zur Generierung spontan-apoptotischer nPMN entwickelt.
3.9.1 Einfluss der Serumkonzentration und der Zelldichte auf die spontane Apoptose von neutrophilen Granulozyten
Um den Einfluss der Dosis fetalen Kälberserums (fetal calf serum, FCS) und der Zellkonzentration auf die Menge apoptotischer Zellen zu beurteilen, wurden neutrophile Granulozyten aus heparinisiertem Blut separiert (3.2.3) und auf eine Zellzahl von 0,25; 0,5 oder 1,0 x 106 nPMN in je 2 ml Medium eingestellt (3.3.1). Zu diesem Medium wurde fetales Kälberserum in den Konzentrationen 0, 0,1, 1 und 10 Vol.-% titriert. 2 ml der Zellsuspension wurden in eine 12-Well-Flachbodenplatte (9.3.2) gegeben und bei 37 °C, 5 % CO2 für 24 Stdn.
inkubiert. Im Anschluss an diese Inkubation wurden die Flachbodenplatten bei 500 x g für 5 min bei Raumtemperatur in einer Plattenzentrifuge zentrifugiert und der Überstand durch Abpipettieren verworfen. Nach der Zugabe von 200 µl Accutase pro Well wurden die Zellen für 3 Min. im Brutschrank (37 °C, 5 % CO2) inkubiert und die Accutase mit 800 µl R10F-Medium ausgeglichen. Daraufhin wurden die Zellen durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen überführt.
Zur Darstellung der Apoptose der nPMN wurden die Zellen mittels Propidiumiodid und fluoreszenz-konjungierten Annexin V gefärbt und die Apoptose durchflusszytometrisch überprüft. Annexin V ist ein zelluläres Protein, das kalziumabhängig an Phosphatidylserin, welches zu Beginn der Apoptose durch Veränderungen der Zellmembranstruktur auf die Oberfläche der Plasmamembran transloziert wird, bindet und so der Detektion von Apoptose dient. Dafür wurden die Zellen zunächst bei 500 x g für 5 Min. bei Raumtemperatur (RT) zentrifugiert, in 1 ml PBS resuspendiert und gewaschen (500 x g, 5 Min., RT). Nachfolgend wurde der Überstand verworfen und die nPMN in Annexin-Bindungs-Puffer (9.3.5), welcher das für die Bindung an Phosphatidylserin essentielle Kalzium enthält, resuspendiert. Dabei wurden für je 1 x 106 eingesäte nPMN 100 µl Annexin-Bindungs-Puffer und 5 µl Alexa Fluor 647-konjungiertes Annexin (9.3.3) verwendet. Es folgte eine Inkubation von 15 Min. bei Raumtemperatur unter Lichtausschluss, in deren Anschluss 100 µl der Zellesuspension in ein
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Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt wurden. Nach Zugabe von 100 µl PI erfolgte die Beurteilung der Zellen durchflusszytometrisch wie in Abbildung 1 dargestellt. Durch die Kombination von Propidiumiodid und Annexin V wird eine zuverlässige Unterscheidung von vitalen, apoptotischen und nekrotischen Zellen ermöglicht. Dadurch, dass PI nur in Zellen mit durchlässiger Membran dringt, können PI-positive und Annexin-V-positive Zellen als nekrotisch betrachtet werden. Vitale Zellen sind daher Annexin-V-negativ und PI-negativ, apoptotische Zellen sind Annexin-V-positiv und PI-negativ. Es wurde die Anzahl (events/µl) apoptotischer nPMN (Apoptoseindex) bzw. die Anzahl nekrotischer nPMN (Nekroseindex) relativ zu der Anzahl vitaler nPMN betrachtet.
Abbildung 1: Gating-Strategie zur durchflusszytometrischen Analyse apoptotischer neutrophiler Granulozyten
A) Polymorphkernige Leukozyten (Region: „PMN“) wurden im Dichteplot (FSC-A/SSC-A) identifiziert. B) Darstellung der polymorphkernigen Leukozyten im Dichteplot (FL-1-A/SSC-A) und Identifikation der nicht-autofluoreszierenden, FL1-negativen neutrophilen Granulozyten (Region:
„nPMN“). C) Darstellung der neutrophilen Granulozyten im Dichteplot (FL-4-A/FL-3-A) und Identifikation vitaler (PI-, Annexin V-, Quadrant „V“), apoptotischer (PI-, Annexin V+, Quadrant „A“) und nekrotischer (PI+, Annexin V+, Quadrant „N“) neutrophiler Granulozyten nach Setzen eines Quadranten und Erfassung der absoluten Zahl neutrophiler Granulozyten in events/µl der einzelnen Quadranten.
3.9.2 Einfluss der Inkubationszeit auf die Apoptose von neutrophilen Granulozyten Für die Darstellung des Einflusses der Inkubationszeit auf die Menge spontan-apoptotischer Neutrophiler wurden separierte nPMN (3.2.3) auf 0,5 x 106 in 2 ml in RPMI + 0,1 Vol.-% FCS, im Folgenden als Apoptose-unterstützendes-Medium (AU-Medium) (9.3.5) bezeichnet, eingestellt (3.3.1). 2 ml der Zellsuspension wurden in eine 12-Well-Flachbodenplatte gegeben und bei 37 °C, 5 % CO2 für 24 oder 48 Stdn. inkubiert. Es folgte das Ablösen und Färben der
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Zellen wie in 3.9.1 beschrieben. Anschließend wurden die nPMN durchflusszytometrisch erfasst (3.3.1) und die Anzahl (events/µl) apoptotischer nPMN wurde relativ zu der Anzahl vitaler nPMN betrachtet.
3.9.3 Mikroskopische Darstellung der APO-nPMN24
Um die Induktion spontan-apoptotischer nPMN zu verifizieren, wurden separierte nPMN (3.2.3) auf 0,5 x 106 in 2 ml in AU-Medium eingestellt (3.3.1). 2 ml der Zellsuspension wurden in eine 12-Well-Flachbodenplatte gegeben und bei 37 °C, 5 % CO2 für 24 Stdn. inkubiert. Die Zahl eingesäter Wells richtete sich dabei nach der für weitere Experimente benötigten Menge apoptotischer nPMN. Im Anschluss wurden die Zellen wie in 3.9.1 beschrieben abgelöst, Mehrfachansätze vereinigt und mit Annexin V gefärbt. Die so generierten apoptotischen nPMN, im Folgenden als APO-nPMN24 bezeichnet, wurden durchflusszytometrisch auf ihre Apoptose hin kontrolliert (Abbildung 1). Das hier beschriebene Vorgehen diente der Generierung von APO-nPMN24 für weitere experimentelle Ansätze, wobei die Zellen nur verwendet wurden, sofern eine Apoptoserate von mindestens 60 % bestand. Die APO-nPMN24 sowie auch bisher ungefärbte vitale nPMN (VIT-nPMN) wurden mittels einer Membranimmunfluoreszenz (3.4.2) gefärbt. Dafür wurde ein für bovine neutrophile Granulozyten spezifischer unkonjungierten Maus-anti-bovine-CH138A-Antikörper (finale Verdünnung 1 : 50) (9.3.3) verwendet, welcher durch einen sekundären Ziege-anti-Maus-IgG + IgM-FITC-Antikörper (finale Verdünnung: 1 : 100) (9.3.3) markiert wurde.
Anschließend wurden die Zellen in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und bei 500 x g für 5 Min. zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen in 30 µl RPMI-Medium aufgenommen. 7 µl der Zellsuspension wurden auf einen Objektträger (9.3.2) verbracht und mittels Ölimmersion in einer 1000-fachen Vergrößerung fluoreszenzmikroskopisch (3.11) analysiert.
3.9.4 In-vitro-Apoptose von Neutrophilen unter Einfluss von M. bovis
Um den Einfluss von M. bovis auf das Apoptoseverhalten spontan-apoptotischer nPMN im Rahmen des entwickelten Apoptoseprotokolls zu untersuchen, wurde mit separierten nPMN (3.2.3) unter Zugabe von 10 MOI M. bovis eine spontanen Apoptose wie in 3.9.3 beschrieben durchgeführt. Anschließend erfolgte die durchflusszytometrische Erfassung der Apoptose durch Betrachtung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) der PI- und Annexin
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Fluoreszenz der neutrophilen Granulozyten. Diese Form der Auswertung wurde gewählt, da im Rahmen dieses Versuches keine klare Unterteilung der unterschiedlich fluoreszierenden Populationen wie in 3.9.3 möglich war. Zusätzlich wurde die Anzahl (events/µl) von nPMN, myeloiden und lymphoiden Zellen, welche mit M. bovis stimuliert wurden, relativ zu der Anzahl der jeweiligen Zellpopulation ohne Erreger betrachtet.
3.10 Efferozytose apoptotischer nPMN durch unterschiedliche Makrophagen