4.4 Modulation des Zelltodes von neutrophilen Granulozyten durch M. bovis
4.5.2 Modulation der Efferozytose durch M. bovis
Nachdem das experimentelle Vorgehen einer In-vitro-Efferozytose mit RAW-Zellen als Modellmakrophagen etabliert wurde, sollte der Einfluss von M. bovis auf die Efferozytose unter zusätzlicher Verwendung von Monocyte-derived-Macrophages (MdM) als bovines Modell untersucht werden.
Modulation der morphologischen Eigenschaften von Makrophagen im Zuge der Efferozytose Um zu beurteilen, inwieweit Mykoplasmen das Efferozytoseverhalten verschiedener Modellmakrophagen beeinflussen, wurde zunächst der Frage nachgegangen, ob ein Einfluss auf die Größe der Makrophagen nach der Efferozytose besteht. Dafür wurden verschiedene Modellmakrophagen (RAW-Zellen, D1-MdM, M1-MdM und M2-MdM) mit Mycoplasma bovis stimuliert und im Anschluss mit APO-nPMN24 ko-kultiviert. Es folgte die durchflusszytometrische Erfassung der mittleren Größe (forward scatter, FSC) zu unterschiedlichen Zeitpunkten (3.4).
101
Abbildung 22: Zellgröße der verschiedenen Modellmakrophagen nach Efferozytose apoptotischer nPMN unter Einfluss von M. bovis.
Makrophagen der Zelllinie RAW 264.7 (RAW, A) wurden für 30 Min., D1-MdM (B), M1-MdM (C) und M2-MdM (D) hingegen von Beginn der Differenzierung an mit M. bovis ko-kultiviert. Aus separierten neutrophilen Granulozyten (nPMN) wurden APO-nPMN24 generiert und diese mit den Modellmakrophagen ko-inkubiert. Im Anschluss wurde der mittlere Forward Scatter (FSC) als Maß für die relative Größe der vitalen Zellen durchflusszytometrisch direkt nach Zugabe (0) sowie eine Std. (1) und 24 Stdn. (24) nach Beginn der Ko-kultivierung erfasst (n = 6 für A, B und n = 4 für C, D, Mittelwerte + SEM). Signifikante Unterschiede zwischen Medium und M. bovis (dargestellt über den Balken), sowie Unterschiede zwischen den einzelnen Zeitpunkten innerhalb einer Gruppe (dargestellt über den Klammern) wurden mittels zweifacher ANOVA und Sidak‘s Multiple Comparisons Test auf Signifikanz geprüft (* = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001). M. bovis = Mycoplasma bovis;
102
Alle Modellmakrophagen zeigten, unabhängig von einer Ko-Kultivierung mit M. bovis, eine hochsignifikante Größenzunahme nach 24 Stdn. der Kultivierung verglichen mit dem Zeitpunkt 0 (Abbildung 22). Im Falle der RAW-Zellen (Abbildung 22, A) sowie der M2-MdM (Abbildung 22, D) stellte sich bereits nach einer Stunde ein signifikant gesteigerter FSC dar. Die Größe von D1-MdM, die in Anwesenheit von M. bovis differenziert wurden, war sowohl nach einer Stdn.
(p = 0,03) wie auch nach 24 Stdn. (p = 0,04) geringgradig signifikant höher als in den Ansätzen ohne Zusatz von M. bovis. Im Falle der M2-MdM zeigte sich ein signifikanter Unterschied des FSCs zum Zeitpunkt 0 und nach 24 Stdn durch die Differenzierung in Anwesenheit von M.
bovis (p = 0,04). Stimulationsansätze mit M. bovis unterscheiden sich nicht signifikant in ihrem Effekt auf den FSC von M1-MdM oder RAW-Zellen.
Um zu überprüfen, ob die Veränderungen der Zellgröße im Zuge der Efferozytose auch mit einer Beeinflussung der Komplexität der unterschiedlichen Modellmakrophagen durch M.
bovis einhergehen, wurde die Modellmakrophagen mit Mycoplasma bovis stimuliert und im Anschluss mit APO-nPMN24 ko-kultiviert. Es folgte die durchflusszytometrische Erfassung der mittleren Komplexität (side scatter, SSC) zu unterschiedlichen Zeitpunkten (3.4).
103
Abbildung 23: Seitwärtsstreulicht der verschiedenen Modellmakrophagen nach Efferozytose apoptotischer nPMN unter Einfluss von M. bovis.
Makrophagen der Zelllinie RAW 264.7 (RAW, A) wurden für 30 Min., D1-MdM (B), M1-MdM (C) und M2-MdM (D) hingegen von Beginn der Differenzierung an, mit M. bovis stimuliert. Aus heparinisiertem Vollblut separierte neutrophile Granulozyten (nPMN) wurden APO-nPMN24 hergestellt und diese mit den Modellmakrophagen ko-inkubiert. Im Anschluss wurde der mittlere Side Scatter (SSC) als Maß für die relative Komplexität der vitalen Zellen durchflusszytometrisch direkt nach Zugabe (0), sowie eine Std. (1) und 24 Stdn. (24) nach Beginn der Ko-Kultivierung erfasst (n = 6 für A, B und n = 4 für C, D, Mittelwerte + SEM). Signifikante Unterschiede zwischen Medium und M. bovis (dargestellt über den Balken) sowie Unterschiede zwischen den einzelnen Zeitpunkten innerhalb einer Gruppe (dargestellt über den Klammern) wurden mittels zweifacher ANOVA und Tukey‘s Multiple Comparisons Test auf Signifikanz geprüft (* = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001). M. bovis = Mycoplasma bovis;
MdM = Monocyte-derived Macrophages.
Gegenüber dem Zeitpunkt 0 führten alle Kulturbedingungen, unabhängig von einer Stimulation mit M. bovis, zu einer hochsignifikanten Erhöhung der Komplexität der RAW-Zellen bzw. der MdM nach 24 Stdn. in Ko-Kultur (Abbildung 23). Zusätzlich zeigten RAW-Zellen (Abbildung
A) RAW
SSC
Zeit nach Beginn der Ko-Kultivierung (Stdn.)
B) D1-Mdm
Zeit nach Beginn der Ko-Kultivierung (Stdn.)
SSC
C) M1-Mdm D) M2-Mdm
SSC
Zeit nach Beginn der Ko-Kultivierung (Stdn.)
SSC
Zeit nach Beginn der Ko-Kultivierung (Stdn.)
*
104
23, A) eine gering-signifikante, D1-MdM (Abbildung 23, B) hingegen eine hochsignifikante Steigerung des SSC bereits nach einer Stunde Ko-Kultivierung mit APO-nPMN24. Die Stimulation mit M. bovis verursachte verglichen mit der Mediumkontrolle (Medium) eine geringgradig signifikante Steigerung des Seitwärtsstreulichts zu allen Zeitpunkten im Falle der RAW-Zellen (p = 0,02), eine mittelgradig signifikante Steigerung nach 24 Stdn. bei D1-MdM (p = 0,004) und hochgradige Steigerungen des SSCs der M2-MdM (Abbildung 23, D) nach einer, wie auch nach 24 Stdn. (p < 0,001) Ko-Kultivierung. Die Komplexität der M1-MdM (Abbildung 23, C) zeigte keine signifikante Beeinflussung durch M. bovis.
Modulation der Efferozytose durch RAW-Zellen
Um zu beurteilen, ob Mykoplasmen einen Einfluss auf das Efferozytoseverhalten von Makrophagen haben, wurden zunächst RAW-Zellen als Modellmakrophagen mit Mycoplasma bovis stimuliert und im Anschluss mit APO-nPMN24 ko-kultiviert. Es folgte die durchflusszytometrische Erfassung der mittleren Fluoreszenzintensität der RAW-Zellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten (3.4), sowie die fluoreszenzmikroskopische Betrachtung (3.11) der Makrophagen.
105
Abbildung 24: Efferozytose apoptotischer neutrophiler Granulozyten durch RAW-Zellen unter Einfluss von M. bovis.
106
Aus separierten neutrophilen Granulozyten (nPMN) wurden APO-nPMN24 hergestellt, wobei das externalisierte Phosphatidylserin der Zellen mit Alexa Fluor® 647-Annexin V nachgewiesen wurde (3.9.1). Zellen der Zelllinie RAW 264.7 (RAW) wurden für 30 Min. mit M. bovis stimuliert. Anschließend folgte eine Ko-Kultivierung der APO-nPMN24 mit den Makrophagen für 0,5; 1; 1,5 und 24 Stdn. Als Mediumkontrolle diente ein Ansatz ohne die Zugabe von M. bovis, für die Negativkontrolle wurde Natriumazid (NaN3) hinzugegeben Es folgte die durchflusszytometrische Betrachtung der mittleren Fluoreszenzintensität der ungefärbten RAW-Zellen als Maß für die Aufnahme fluoreszenzmarkierter APO-nPMN24 (n = 6, Mittelwert ± SEM). Signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen Ansätzen zu den verschiedenen Zeitpunkten wurden mittels zweifacher ANOVA und Tukey‘s Multiple Comparisons Test bestimmt (* = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001) (A). Zusätzlich erfolgte die fluoreszenzmikroskopische Erfassung (3.11) der RAW-Zellen (B). Dargestellt sind exemplarisch die Zellen eines Tieres nach 120 Min. Ko-Inkubation. ROT: Phosphatidylserin auf apoptotischen nPMN (Annexin V-Alexa Fluor® 647, Exzitation 650 nM, Emission 668 nM). b: Hellfeld, d: Dunkelfeld, f:
Fusionierte Darstellung, 1000-fache Vergrößerung, Ölimmersion. Skala= 10 µm, MFI = mittlere Fluoreszenzintensität; M. bovis = Mycoplasma bovis
Die Ko-Inkubation der APO-nPMN24 mit den RAW-Zellen führte unter Einfluss von Natriumazid unabhängig vom Zeitpunkt zu keinem signifikanten Anstieg der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) der RAW-Zellen (Abbildung 24, A). Dahingegen unterschied sich eine Ko-Inkubation in Medium nach 1,5 Stdn. mittelgradig und nach 24 Stdn. hochgradig signifikant von dem Natriumazid-Ansatz. Unter Einfluss von M. bovis war die MFI bereits nach einer Stunde geringgradig und nach 1,5 Stdn. und 24 Stdn. hochgradig signifikant gesteigert, verglichen mit einer Ko-Inkubation unter Natriumazid-Einfluss. Nach 24 Stdn. Ko-Inkubation unterschied sich die MFI M. bovis-stimulierter RAW-Zellen geringgradig signifikant von der Mediumkontrolle. Nach 0,5 Stdn. Ko-Inkubation zeigte sich kein signifikanter Unterschied zwischen den Ansätzen. Fluoreszenzmikroskopisch zeigten die RAW-Zellen unabhängig von einem Einfluss durch M. bovis rot-fluoreszierende Fragmente, deren Vorkommen sich auf den intrazellulären Raum beschränkt (Abbildung 24, B). RAW-Zellen, die mit M. bovis stimuliert wurden, wiesen eine deutlich höhere Fragmentzahl als die Mediumkontrolle auf.
Modulation der Efferozytose von D1-MdM, M1-MdM und M2-MdM
Nachdem M. bovis einen Einfluss auf die Efferozytose muriner RAW-Zellen aufwies, sollte der Frage nachgegangen werden, inwieweit die Mykoplasmen die Efferozytose apoptotischer nPMN durch primäre bovine MdM beeinflussen. Dafür wurden unterschiedlich polarisierte bovine Makrophagen (D1-MdM, M1-MdM und M2-MdM) mit Mycoplasma bovis stimuliert und im Anschluss mit fluoreszenzmarkierten APO-nPMN24 ko-kultiviert. Es folgte die durchflusszytometrische Erfassung der mittleren Fluoreszenzintensität der MdM zu unterschiedlichen Zeitpunkten (3.4), sowie die fluoreszenzmikroskopische Betrachtung (3.11).
107
**
* * *
B) D1-Mdm
1b
2b
1d
2d
1f
2f
M . b o v is M e d iu m M o d u la ti o n s -I n d e x
Zeit nach Beginn der Ko-Kultivierung (Stdn.)
A) Modulations-Index
108
109
Abbildung 25: Efferozytose apoptotischer neutrophiler Granulozyten durch MdM unter Einfluss von M. bovis.
D1-MdM, M1-MdM und M2-MdM wurden von Beginn ihrer Differenzierung an mit M. bovis stimuliert.
Aus separierten neutrophilen Granulozyten (nPMN) wurden APO-nPMN24 hergestellt, wobei das externalisierte Phosphatidylserin der Zellen mit Alexa Fluor® 647-Annexin V nachgewiesen wurde (3.9.1). Die APO-nPMN24 wurden mit den verschiedenen Monocyte-derived-Macrophages für 0,5, 1, 1,5 und 24 Stdn. ko-inkubiert. Im Anschluss wurde jeweils die mittlere Fluoreszenzintensität der ungefärbten MdM als Maß für die Aufnahme fluoreszenzmarkierter APO-nPMN24 verwendet, sowie absolute Zahl der MdM in Kultur mit M. bovis-stimulierten nPMN relativ zur Zahl der MdM in Ko-Kultur mit nicht-stimulierten nPMN (Modulations-Index, A) betrachtet (n = 4, Mittelwerte ± SEM).
Signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen MdM zu den einzelnen Zeitpunkten wurden mittels zweifacher ANOVA und Tukey‘s Multiple Comparisons Test bestimmt (* = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001) (A). Zusätzlich erfolgte die fluoreszenz-mikroskopische Erfassung (3.11) der D1-MdM (B), M1-MdM (C), und M2-MdM (D). Dargestellt sind jeweils exemplarisch die MdM eines Tieres mit und ohne Einfluss von M. bovis nach 240 Min. Ko-Inkubation. ROT: Phosphatidylserin auf apoptotischen nPMN (Annexin V-Alexa Fluor® 647, Exzitation 650 nM, Emission 668 nM), b: Hellfeld, d: Dunkelfeld, f: Fusionierte Darstellung, 1000-fache Vergrößerung, Ölimmersion. Skala = 10 µm, M. bovis = Mycoplasma bovis; MdM = Monocyte-derived Macrophages.
M1-Mdm erreichten zu keinem der untersuchten Zeitpunkte einen Modulations-Index > 1, während M2- und D1-MdM durchgehend einen Index > 1 aufwiesen (Abbildung 25, Abbildung 18A). Dabei unterschieden sich M1-MdM mittelgradig signifikant (p = 0,0043) gegenüber M2-MdM und geringgradig signifikant gegenüber D1-M2-MdM (p = 0,03) nach einer Ko-Inkubation von 0,5 Stdn. Nach einer Stunde, wie auch nach 1,5 Stdn. Ko-Inkubation wiesen D1-MdM eine geringgradige Signifikanz gegenüber M1-MdM auf, während nach 24 Stdn. Ko-Inkubation keine signifikanten Unterschiede zwischen den MdM feststellbar waren.
Fluoreszenzmikroskopisch zeigten D1-MdM, M1-MdM sowie M2-MdM unabhängig von einem Einfluss durch M. bovis rot-fluoreszierende Fragmente, deren Vorkommen sich auf den intrazellulären Raum beschränkt. Zwischen den einzelnen MdM, wie auch zwischen dem Medium-Ansatz und der Zugabe von M. bovis waren deutliche Unterschiede in der Menge in der Menge der intrazellulären Fragmente festzustellen. So wiesen M2-MdM gegenüber M1- und D1-MdM eine deutlich höhere Fragmentmenge auf. Unter Einfluss von M. bovis zeigten M2-MdM, wie auch D1-MdM eine erhöhte Menge an fluoreszierenden Fragmenten gegenüber der Mediumkontrolle, während M1-MdM hingegen eine verminderte Menge aufwiesen.
Modulation der Efferozytose-induzierten Lipidmediatorproduktion durch M. bovis
In dieser Arbeit wurden stellvertretend für die Fülle der Bestandteile des Resolutoms Lipoxin A4 (LXA4) und Prostaglandin E2 (PGE2) exemplarisch für den Einfluss von LAMPs auf die
110
Lipidmediatorproduktion untersucht. Da in Vorversuchen ein Einfluss des fetalen Kälberserums im Kulturmedium auf die Ergebnisse der ELISAs festgestellt wurde, wurde die Efferozytose in Panserin durchgeführt. Da auf die Verwendung des AU-Mediums für die Herstellung der APO-nPMN24 (3.9) nicht verzichtet werden konnte, wurde hierfür eine gesonderte Kontrolle mitgeführt. Es wurden nicht-polarisierte bovine MdM mit Mycoplasma bovis stimuliert und im Anschluss mit fluoreszenzmarkierten APO-nPMN24 ko-kultiviert. Mit den Überständen der Ko-Kultivierung wurde ein kompetitiver Lipoxin A4-ELISA und ein Double-Antibody-Sandwich-ELISA für Prostaglandin E2 durchgeführt (3.12).
Abbildung 26: Efferozytose-induzierte Produktion von Lipoxin A4 und Prostaglandin E2.
Bovine MdM wurden von Beginn ihrer nicht-gelenkten Differenzierung an mit LAMPs stimuliert. Aus separierten neutrophilen Granulozyten (nPMN) wurden APO-nPMN24 hergestellt, wobei das externalisierte Phosphatidylserin der Zellen mit Alexa Fluor® 647-Annexin V nachgewiesen wurde (3.9.1). Die APO-nPMN24 wurden mit den verschiedenen Monocyte-derived-Macrophages für 24 Stdn.
ko-inkubiert. Im Anschluss wurden die zellfreien Überstände gewonnen und ein Lipoxin A4 (LXA4) –
A)
111
(A und B) und ein Prostaglandin E2 (PGE2) - ELISA (C und D) durchgeführt und die jeweiligen optischen Dichten (ODs) photometrisch erfasst. Die Efferozytose der Zellen wurde durchflusszytometrisch überprüft (3.10.1). Als Kontrollen wurden die Überstände der APO-nPMN24 und des AU-Mediums (A, C) einerseits und die MdM-Überstände, Panserin-Medium sowie Überstände der Efferozytose ohne Vorstimulation mit LAMPs (B, D) andererseits verwendet (n = 4, Mittelwerte ± SEM). Signifikante Unterschiede zwischen den ODs wurden im Falle von A und C mittels eines gepaarten t-Tests und im Falle von B und D mittels zweifacher ANOVA und Tukey‘s Multiple Comparisons Test bestimmt (* = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001). Im Falle von C und D wurden Bereiche außerhalb des Messbereiches grau hinterlegt, LAMPs = Lipid-associated membraneproteins, LXA4 = Lipoxin A4, MdM = Monocyte-derived Macrophages, PGE2 = Prostaglandin E2.
Unabhängig von dem Einfluss der LAMPs zeigte die Efferozytose eine gegenüber den MdM mittelgradig (p = 0,002) und gegenüber Panserin-Medium hochgradig (p < 0,001) gesteigerte Lipoxin A4-Produktion (Abbildung 26, B). Die Efferozytose unter Einfluss der LAMPs induzierte keine signifikant gesteigerte LXA4-Freistzung gegenüber der Efferozytose in Medium. Es bestand kein signifikanter Unterschied zwischen der LXA4-Menge in AU-Medium und in Überständen nach Apoptose der nPMN (A).
Im Falle der Prostaglandin E2 -Messungen konnten die Daten für die APO-nPMN24 und das AU-Medium aufgrund des Einflusses von fetalen Kälberserum im Medium und ihrer daraus resultierenden Lage außerhalb des Messbereichs des ELISAs nicht zur Auswertung herangezogen werden (Abbildung 26, A). Mit ca. 500 pg/ml produzierten MdM die höchste Menge an PGE2. Dies unterschied sich mittelgradig signifikant (p = 0,006) gegenüber der Panserin-Mediumkontrolle und geringgradig signifikant gegenüber der Efferozytose unabhängig von der Stimulation mit LAMPs. Die PGE2-Produktion im Rahmen der Efferozytose stellt sich mit 200 pg/ml PGE2 basal dar. Die Zugabe von LAMPs hat keinen signifikanten Einfluss auf die Efferozytose.
112 5
Diskussion
Derzeit bestehen keine ausreichend wirksamen Prophylaxe- oder Therapiemaßnahmen gegen die weltweit auftretenden Infektionen von Rindern mit Mycoplasma bovis (PFUTZNER u.
SACHSE 1996; F.P. MAUNSELL et al. 2011; NICHOLAS et al. 2016). Dies resultiert zum Teil aus dem unvollständigen Verständnis der Interaktion des bovinen Immunsystems mit diesem Pathogen. So existiert derzeit nur ein lückenhaftes Wissen über die pathophysiologischen Zusammenhänge einzelner Immunzellen mit dem Erreger und mögliche dysregulierte inflammatorische Prozesse. Daher war ein wesentlicher Aspekt dieser Arbeit die Betrachtung der Interaktion von M. bovis mit dem angeborenen Immunsystem. In besonderen Fokus standen dabei neutrophile Granulozyten als früh in das infizierte Gewebe einwandernde Immunzellen. Grundlegend dafür war die in vorherigen Studien erfolgte Beobachtung, dass im Rahmen einer Infektion mit M. bovis eine massive Ansammlung von neutrophilen Granulozyten am Infektionsort stattfindet, zeitgleich aber eine mangelnde Erregerbeseitigung mit konsekutiven inflammatorischen Lungenläsionen vorliegt (ADEGBOYE et al. 1995;
RODRÍGUEZ et al. 1996). Bisherige Forschungen zur Interaktion von neutrophilen Granulozyten mit M. bovis konzentrierten sich vor allem auf eine direkte Modulation von Zellfunktionen wie der Phagozytose (ALABDULLAH et al. 2015) oder der Freisetzung von NETs (GONDAIRA et al. 2017) durch den Erreger.
In der vorliegenden Arbeit wurden neue Konzepte in der Wechselbeziehung zwischen M. bovis und neutrophilen Granulozyten betrachtet und erforscht. Dabei wurde zunächst parallel zur derzeitigen Forschung überprüft, inwieweit der in dieser Arbeit verwendete Erregerstamm
„PG45“ eine direkte Modulation der neutrophilen Granulozyten bewirkt. Eine solche Zellmodulation wurde anhand von morphologischen, phänotypischen und funktionellen Aspekten beurteilt. Um eine mögliche indirekte Beeinflussung der nPMN noch vor Erreichen des Infektionsortes zu beurteilen, wurde untersucht, ob das Sekretom alveolärer Epithelzellen nach Interaktion mit M. bovis einen modulativen Effekt auf die neutrophilen Granulozyten und ihre Funktionsweise hat. Darüber hinaus wurde mittels eines Chemotaxis-Assays der direkte und indirekte Einfluss des Erregers auf den Transmigrationsprozess als weitere Fragestellung dieser Arbeit untersucht. Da bereits andere Immunzellen, wie bovine Monozyten, Makrophagen und Lymphozyten, ausführlich zu ihrem Apoptoseverhalten unter Einfluss von M. bovis untersucht wurden (MULONGO et al. 2014; SULEMAN et al. 2016, VANDEN BUSH u.
113
ROSENBUSCH 2002), wurde im nächsten Schritt der Frage nachgegangen, inwieweit der Erreger die Apoptose der neutrophilen Granulozyten beeinflusst. Voraussetzung hierfür war die Entwicklung und Prüfung eines in dieser Arbeit vorgestellten Protokolls zur Produktion spontan apoptotischer nPMN. In früheren Untersuchungen wurde gezeigt, dass der Entzündungsverlauf durch die Efferozytose apoptotischer neutrophiler Granulozyten maßgeblich beeinflusst wird (SERHAN 2017). Für das Verständnis des chronischen Verlaufsbildes von M. bovis-verursachten Erkrankungen wurde daher die Efferozytose spontan-apoptotischer nPMN durch verschiedene Makrophagentypen untersucht.