Die durchflusszytometrische Erfassung von Zellen erfolgte mit dem BD Accuri™ C6 Flow Cytometer (9.1). Es verfügt über zwei Laser mit den Anregungswellenlängen von 488 nm (blau) und 640 nm (rot), sowie vier Fluoreszenzdetektoren mit optischen Filtern, die eine Messung von unterschiedlichen Fluoreszenzen (FL1 bis FL4, Tabelle 1) zulassen. Im Zuge der Messung entsteht Streulicht an Partikeln und Zellen, welches mittels zwei Lichtstreuungsdetektoren erfasst wird.
Das parallel zur Richtung des Auftretens erfasste Streulicht ist ein Maß für die relative Größe der gemessenen Partikel und Zellen (Vorwärtsstreulicht, Forward Scatter, FSC), das orthogonal auftretende Streulicht wird als Seitwärtsstreulicht (Side Scatter, SSC) bezeichnet und dient als Maß für die Zellgranularität. Die Auswertung der Daten erfolgt, sofern nicht anders erwähnt, mittels der BD Accuri™ C6 Software.
Sofern nicht anders erwähnt, wurden alle Messungen mit einem Schwellenwert (Threshold) von 80 000 und einer Messgeschwindigkeit von 66 µl/Min. (Einstellung „fast“) durchgeführt, wobei ein Minimum von 10 000 Ereignissen (events) erfasst wurde.
Tabelle 1: Fluoreszenzkanäle des BD Accuri™ C6 Flow Cytometer
Kanal Exitationsminimum Exitationsmaximum Fluoreszenz Fluorochrom
FL1 495 nm 520 nm grün-gelb FITC
FL2 495 nm 578 nm orange-rot PE
FL3 530 nm 615 nm rot PI, PE/Cy5
FL4 650 nm 668 nm dunkelrot AlexaFluor647
In dieser Arbeit verwendet: FITC, AlexaFluor647, Rhodamin 123, PI
FITC = Fluoresceinisothiocyanat, PE = Phycoerythrin, PI = Propidiumiodid, PE/Cy5 = Phycoerythrin/Cyanin5
46 3.4.1 Bildung reaktiver Sauerstoffspezies
Reaktive Sauerstoffspezies (Reactive oxygen species, ROS) beschreiben als Überbegriff reaktive Moleküle und freie Radikale, die aus molekularem Sauerstoff entstehen und der Erregerabwehr, aber auch der Signaltransduktion dienen. Die Darstellung der ROS geschieht anhand des nicht-fluoreszierenden Dihydrorhodamin 123 (DHR123) (9.3.3), welches passiv in die Zelle diffundiert. Durch ROS wie Peroxide, Peroxynitrite und Hydrogenperoxid wird DHR123 zu dem grün fluoreszierenden Rhodamin 123 oxidiert, welches in den Mitochondrien akkumuliert.
Die entstehende Fluoreszenz wird durchflusszytometrisch im Fluoreszenzkanal 1 (FL1) erfassbar (Emmisionsmaximum 507-527 nm) und bildet somit ein Maß für die Sauerstoffmetabolisierung. Die In-vitro-Stimulation von neutrophilen Granulozyten mit Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) (9.3.3) diente dabei der Quantifizierung der Bildungskapazität von ROS. Für die Messung der ROS-Produktion wurden neutrophile Granulozyten aus heparinisiertem Vollblut separiert und auf 6 x 106 Zellen/ml eingestellt (3.3.1). Je nach Versuchsaufbau wurden die Zellen teilweise zunächst im Rahmen anderer In-vitro-Versuche verschiedenen Stimuli ausgesetzt. Der Bedarf an Reagenzien zur Durchführung der ROS ist in der Tabelle 2 zusammengefasst.
Tabelle 2: Reagenzien für eine ROS
Reagenz Ansatz
nPMN-Zellsuspension 6 x 106 Zellen/ml (3.2.3)
DHR-Percoll 1,5 μg/ml DHR123 (9 μl DHR + 8,91 ml isotones Percoll (9.3.3)) PMA (0 und 400 nM) a) 40 μl PMA-Stocklösung (1 mM) + 960 μl
RPMI-Medium = 40 000 nM
b) Verdünnung aus a): 10 µl PMA + 990 µl RPMI-Medium= 400 nM
DHR123 = Dihydrorhodamin 123, PMA = Phorbol-12-myristat-13-acetat
In einer 96-Well-Rundbodenplatte (9.3.2) wurden 100 μl des DHR-Percolls (9.3.5) vorgelegt und 50 μl der PMA-Verdünnung, sowie 50 μl der Zellsuspension hinzugegeben. Nach einer Durchmischung mittels Plattenrüttler folgte eine dreißigminütige Inkubation bei 37 °C und 5%
CO2 im Brutschrank. Im Anschluss wurde die 96-Well -Platte direkt auf Eis verbracht, um dem
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Adhärieren der Zellen vorzubeugen. Durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren wurden die Proben durchmischt und in 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße mit 100 μl PI überführt. Es erfolgte die durchflusszytometrische Erfassung der ROS.
3.4.2 Membranimmunfluoresenz
Die Membranimmunfluoresenz (MIF) dient dem Nachweis und der Charakterisierung exprimierter Oberflächenstrukturen mittels Fluorochrom-markierten Antikörpern. Sofern der primäre Antikörper dabei direkt Fluorochrom-markiert ist, spricht man von einer direkten MIF.
Ist hingegen der primäre Antikörper unmarkiert, wurde dieser mittels eines sekundären, Fluorochrom-gekoppelten Antikörpers, der spezifisch an den Primärantikörper bindet, sichtbar gemacht und es handelt sich um eine indirekte MIF.
Es wurden monoklonale Antikörper verwendet, die wie in Tabelle 3 beschrieben vorverdünnt wurden. Der unmarkierte Antikörper CH138A wurde mit einem FITC-markierten Sekundärantikörper (Ziege-anti-Maus-IgG + IgM-FITC-Antikörper, Verdünnung 1 : 100) nachgewiesen.
Tabelle 3: Auswahl der Antikörper für die MIF mit neutrophilen Granulozyten.
CD = Cluster of differentiation, FITC = Fluoresceinisothiocyanat
Vor Versuchsbeginn wurde der MIF-Puffer (9.3.5) auf Eis gelagert. Für den Nachweis oben genannter Oberflächenmoleküle auf neutrophilen Granulozyten erfolgt zunächst eine Separation der Zellen aus heparinisiertem Vollblut (3.2.3) und ein Einstellen der Zellzahl auf 5 x 106 Zellen/ml (3.3.1). Je nach Versuchsaufbau wurden die Zellen teilweise im Rahmen anderer In-vitro-Versuche zunächst verschiedenen Stimuli ausgesetzt. 100 µL der
Antikörper Konjugat Klon Isotyp Verdünnung final
Hersteller/
Artikelnummer CH138A unmarkiert CH138A IgM 1 : 50 Kingfisher/
WS0608B-100
CD11b FITC CC126 IgG2b 1 : 30 Bio-Rad/
MCA1425F CD62L AlexaFluor647 FMC46 IgG2b 1 : 50 Bio-Rad/
MCA1076A647
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Zellsuspension wurden in eine 96-Well-Rundbodenplatte vorgelegt und für 3 Min. bei 350 x g in einer Plattenzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen im Plattenrüttler (9.1) aufgerüttelt. Sofern vorab eine Stimulation stattgefunden hat, folgte zusätzlich ein Waschschritt der Zellen mit 150 μl MIF-Puffer und eine erneute Zentrifugation für 3 Min. bei 350 x g. Im Anschluss wurden 30 µL der Antikörperverdünnung/Well hinzu gegeben und die Rundbodenplatte erneut auf dem Plattenrüttler durchmischt. Es folgte eine Inkubation für 30 Min. auf Eis im Kühlschrank. Danach wurden zwei gleiche Waschschritte durchgeführt: 150 µL MIF-Puffer wurde zu den inkubierten Zellen gegeben, mittels Plattenrüttler durchmischt und für 3 Min. bei 350 x g zentrifugiert, der Überstand verworfen und die Zellen erneut aufgerüttelt. Im Falle der direkt markierten primären Antikörper wurden die Zellen in 100 µL MIF-Puffer resuspendiert und in 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße mit 100 μl PI überführt. Es erfolgte die durchflusszytometrische Erfassung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) (3.4). Handelte es sich um nicht direkt markierte Antikörper, wurden auf das aufgerüttelte Zellpellet 30 μl des entsprechenden Sekundär-Antikörpers gegeben und beides mittels Plattenrüttler durchmischt. Es folgte eine Inkubation für 30 Min.
auf Eis im Kühlschrank. Im Anschluss wurden die Zellen wie im Falle der direkt markierten Antikörper zweimal mit MIF-Puffer gewaschen, in 100 µl MIF-Puffer resuspendiert und in 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße mit 100 μl PI überführt. Abschließend erfolgte eine durchflusszytometrische Erfassung und Auswertung der Daten.
3.4.3 Transwell-Migration von neutrophilen Granulozyten in vitro
Zunächst wurden neutrophile Granulozyten aus heparinisiertem Vollblut separiert (3.2.3) und die Zellsuspension auf 5 x 106 nPMN/ml eingestellt. Je nach Versuchsaufbau wurden die Zellen teilweise zunächst im Rahmen anderer In-vitro-Versuche verschiedenen Stimuli ausgesetzt.
Anschließend wurde in die Vertiefungen des unteren Teils (= Lower Well) einer 10-Well-Chemotaxiskammer 300 µL eines Stimulus oder die Positivkontrolle (boCXCL8 in einer finalen Konzentration von 100 ng/ml, Verdünnungsansatz: 100 μl boCXCL8 1 μg/ml + 900 μl RPMI-Medium) vorgelegt, durch die die neutrophilen Granulozyten im weiteren Verlauf chemotaktisch angezogen wurden. Der Stimulus bzw. die Kontrolle wurden mit 150 µL 100%
isotonen Percoll (9.3.3) mittels einer Kapillarspitze (9.3.2) unterschichtet, sodass einem Adhärieren der migrierten neutrophilen Granulozyten vorgebeugt wurde und diese oberhalb des Percolls verblieben. Da das Fassungsvermögen des Lower Wells 400 µL beträgt, entstand ein
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Meniskus, der ein luftblasenfreies Aufbringen einer Porenmembran (Polycarbonatmembran) (9.3.2) ermöglichte. Anschließend wurde eine Silikondichtung (9.3.2) aufgelegt und der obere Teil der Kammer (Upper Well, UW) aufgesetzt und mit 6 Schraubenmuttern (9.3.2) fixiert.
200 µL der zuvor hergestellten Zellsuspension wurden in das Upper Well gegeben. Daraufhin folgte eine Inkubation in der Chemotaxiskammer für 2 Stdn. bei 37°C, 5% CO2 im Brutschrank.
Damit für weitere Verarbeitungen und für weitere Versuche genügend transmigrierte neutrophile Granulozyten vorhanden waren, wurden je nach Versuchsaufbau Mehrfachansätze der Proben durchgeführt. Nach der Inkubation wurde zunächst die Zellsuspension aus dem Upper Well abpipettiert und in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt, bei Mehrfachansätzen wurden die Suspensionen vereinigt. Die Chemotaxiskammer wurde durch Entfernen der Schraubenmuttern, des oberen Kammerteils, der Silikondichtung und der Porenmembran eröffnet. Daraufhin wurde der Inhalt des Lower Wells abpipettiert und in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt, wobei auch in diesem Fall Mehrfachansätze vereinigt wurden. Für die Zellen des Upper Well und des Lower Well folgte eine Zentrifugation bei 500 x g für 5 min und eine Resuspension der Zellen in 1 ml RPMI. Je 100 µL wurden im Anschluss in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß mit je 100 µL PI überführt und durchflusszytometrisch erfasst und gezählt (3.3.13.4). Zur Erfassung der Transmigrationsrate der nPMN wurde folgende Berechnung verwendet:
ℎ
( ℎ !! + ℎ )× 100
Sofern die transmigrierten nPMN noch für weitere Versuche verwendet werden sollten, wurden diese erneut bei 500 x g für 5 min zentrifugiert und das Pellet in der für weitere Versuche benötigten Menge RPMI Medium resuspendiert.