Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Um herauszufinden, ob die Lipid-assoziierten Oberflächenproteine von M. bovis (LAMPs) die Efferozytose-induzierte Freisetzung resolutionsfördernder Mediatoren wie Prostaglandin E2

(PGE2) und Lipoxin A4 (LXA4) beeinflussen, wurde für die Messung von LXA4 ein kompetitiver ELISA und für PGE2 ein Double-Antibody-Sandwich (DAS)-ELISA verwendet.

Als Probengrundlagen dienen die im Rahmen der Efferozytose gewonnenen Zellkulturüberstände in Panserin+ (3.10).

Das ELISA-Verfahren dient der quantitativen Bestimmung antigener Strukturen. Der kompetitive ELISA basiert auf einer Konkurrenz der Metaboliten im Kulturüberstand mit dem zugegebenen Enzym-konjungierten Protein um die Bindung an den primären Antikörper. Da

Reflektor Filter

das konjungierte Enzym einen Farbumschlag verursacht, ist die im Verlauf produzierte Farbmenge invers zu der LXA4-Menge in der Probe. Bei dem DAS-ELISA wird das zu testende Antigen ebenfalls durch einen primären Antikörper gebunden, jedoch wird hier ein zweiter enzymgekoppelter Antikörper zur Detektion verwendet, wodurch sich das Antigen mittig zwischen den Antikörpern befindet. Folglich korrelieren bei dem DAS-ELISA die Farbintensität und die Menge des Antigens positiv miteinander.

Beide ELISAs wurde nach Herstellerangaben durchgeführt. Im Falle von LXA4 wurden dafür 100 µl des Standards, bzw. der Proben, sowie 100 µl PBS als Leerkontrolle, 100 µl R0,1F und Panserin+-Medium als Mediumkontrolle in die Plattenvertiefungen einer Mikrotiter-ELISA-Platte (9.3.3) pipettiert. In der Mikrotiterplatte wurde bereits durch den Hersteller ein polyklonaler anti-LXA4-Antikörper, der der Erfassung des LXA4 dient, gebunden. Anhand der Leerkontrolle können später unspezifische Bindungen ausgeschlossen werden. Da es sich bei den Proben um Zellkulturüberstände (3.10) handelte, wurden die Proben im nächsten Schritt mit 10 µl einer Ausgleichslösung ausbalanciert. Anschließend wurden 50 µl eines Konjugates, bestehend aus dem Enzym Peroxidase und Lipoxin A4, zu allen Wells außer der Leerkontrolle pipettiert, die ELISA-Platte abgedeckt und für eine Stunde bei 37 °C inkubiert. Dabei konkurrieren das LXA4 des Konjugates und das LXA4 in den Proben um die limitierte Zahl an Primärantikörpern. Es folgten fünf Waschschritte mit der verdünnten Waschpufferlösung (300µl/Well) (9.3.5) und anschließendem Ausklopfen auf Vliespapier als manuelles Trocknen der Platte. Dies diente der Entfernung von LXA4, das nicht durch den primären Antikörper gebunden wurde. Nach dem manuellen Trocknen der Platte wurden 50 µl des "Substrates A"

und 50 µl des "Substrates B" in jedes Well gegeben und die Platte abgedeckt bei 37 °C für 20 Min. inkubiert. Im Verlauf der Inkubationszeit konnte das "Substrat A", bestehend aus Wasserstoffperoxid durch das Enzym Peroxidase umgesetzt werden. Das "Substrat B" enthält das farblose Chromogen TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine), wodurch gleichzeitig mit der Substratumsetzung eine Farbentwicklung von farblos zu blau entstand. Um die Reaktion zu stoppen, wurden anschließend 50 µl einer Stop-Lösung, bestehend aus 1 N Schwefelsäure in jede Vertiefung gegeben, wodurch ein Farbumschlag von blau zu gelb entstand. Es erfolgte die Erfassung der optischen Dichte (Optical Density, OD) bei 450 nM mittels eines Plattenphotometers (9.1). Für die Auswertung wurde zunächst die optische Dichte der Leerkontrolle von den ODs der Proben- und Standardverdünnungen, ausgenommen des

"Standard 0", subtrahiert. Anschließend wurde mittels der Software GraphPad Prism 7.00 (9.2) eine Standardkurve interpoliert und eine vierparametrische logistische Regression generiert.

Die so interpolierten Werte konnten daraufhin zur statistischen Auswertung (3.13) herangezogen werden.

Im Falle des PGE2-ELISAs wurden zunächst Verdünnungen des Standards (1 : 100), des Enzym-Konjugates (1 : 100) und des Farbreagenz (1 : 9) nach Herstellerangaben mittels der mitgelieferten Verdünnungsmedien durchgeführt. Im Anschluss wurden 100 µl der Proben bzw. der bereits für LXA4 beschriebenen Kontrollen in die Vertiefungen der Mikrotiter-ELISA-Platte (9.3.3) gegeben. Dabei ist bereits ein boviner, monoklonaler PGE2-Antikörper als Primärantikörper durch den Hersteller an die Platte gebunden. Es folgte eine 90-minütige Inkubation unter Abdeckung der Platte bei 37 °C im Brutschrank, der sich zwei manuelle Waschschritte mit der verdünnten Waschpufferlösung (300 µl/Well) und Ausklopfen auf Vliespapier anschlossen. Daraufhin wurden 100 µl des polyklonalen, Biotin-markierten Detektionsantiköpers hinzugegeben und die Platte abgedeckt für weitere 60 Min. bei 37 °C inkubiert. Nach weiteren dreimaligem Waschen der Platte erfolgte die Zugabe von 100 µl des Enzymkonjugates, bestehend aus Avidin-Peroxidase, und eine 30-minütige Inkubation bei 37 °C unter Abdeckung. Die Bindung des sekundären Avidin-konjungierten Antikörpers an den ungekoppelten biotinylierten Detektions-Antikörpers katalysiert im nächsten Schritt die enzymatische Farbreaktion. Abschließend erfolgten fünf weitere manuelle Waschschritte mit nachfolgender Zugabe von 100 µl der zuvor verdünnten Farbreagenz, welche ebenfalls TMB enthält. Nach einer Inkubationszeit von 20 Min. wurde die Farbumschlagsreaktion durch Zugabe von 100 µl der "Farbreagenz C", bestehend aus 1 N Schwefelsäure, gestoppt. Es erfolgte die Erfassung der OD bei 450 nM mittels eines Plattenphotometers. Für die Auswertung wurde zunächst die Leerkontrolle von den Proben und Standards subtrahiert. Die Standardkurve wurde mittels der Software GraphPad Prism 7.00 (9.2) interpoliert und eine Hyperbel generiert. Die so interpolierten Werte konnten daraufhin zur statistischen Auswertung (3.13) herangezogen werden.

65 3.13 Statistische Auswertung

Die Versuche wurden entsprechend der in den Einzelexperimenten angegebenen Häufigkeiten durchgeführt. Die statistische Auswertung und grafische Darstellung von Ergebnissen erfolgte mit der Software GraphPad Prism 7.0 (9.2). Die in dieser Arbeit durchgeführten Versuche basieren auf einer Beeinflussung von einem Messwert in einer Stichprobe und einem bestimmten Messwert in einer anderen Stichprobe und können daher als „abhängigen Stichproben“ respektive „verbundene Stichproben“ betrachtet werden.

Mittels des Kolmogorov-Smirnov Tests wurden alle Daten auf Normaltverteilung hin überprüft und durch Mittelwert und Standardfehler des Mittelwertes (standard error of the mean, SEM) beschrieben und dargestellt. Um zu analysieren, ob sich der Mittelwert zweier abhängiger Stichproben unterscheidet, wurde ein t-Test durchgeführt. Da im Falle dieser Arbeit verbundene Stichproben vorliegen, wurde ein gepaarter t-Test gewählt.

Bei der statistischen Auswertung von mehr als zwei verbundenen Stichproben wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse mit Messwiederholung (repeated measures one-way ANOVA) durchgeführt, um zu testen, ob sich die Mittelwerte mehrerer abhängiger Stichproben unterscheiden, die durch einkategoriale unabhängige Variablen definiert werden. Anschließend wurden Post-hoc-Tests mit paarweisen Mittelwertvergleichen angeschlossen, um herauszufinden, welche Mittelwerte sich signifikant voneinander unterscheiden. Um alle Stichproben mit einer Kontrollmessung zu vergleichen, wurde der Dunnett Multiple Comparison Test verwendet, zum Vergleich der Stichproben untereinander der Tukey's Multiple Comparisons Test. Sofern zweikategoriale unabhängige Variablen vorlagen, wurde eine spezielle zweifaktorielle Varianzanalyse durchgeführt (repeated measures two-way ANOVA) und Sidak's Multiple Comparisons Test als Post-hoc-Test angeschlossen.

Im Falle eines vermuteten Zusammenhangs zwischen der Funktion einer Zellgruppe zu dem Vorkommen einer anderen Zellgruppe in der Suspension wurde eine Korrelation durchgeführt.

Die quantitative Analyse der linearen Beziehung dieser zwei stetigen Variablen wurde folglich mit der Korrelation nach Pearson berechnet.

Die Festlegung der Signifikanzniveaus ist der Tabelle 5 zu entnehmen.

66 Tabelle 5: Einteilung des Signifikanzniveaus

Bezeichnung Symbol Signifikanzbereich

nicht signifikant n.s. p > 0,05

geringgradig signifikant * p ≤ 0,05

mittelgradig signifikant ** p ≤ 0,01

hochgradig signifikant *** p ≤ 0,001

67 4

Ergebnisse

4.1 Direkte modulatorische Eigenschaften von Mycoplasma bovis

4.1.1 Modulation der morphologischen Eigenschaften neutrophiler Granulozyten Durch eine 30-minütige Stimulation von neutrophilen Granulozyten (nPMN) mit Mycoplasma bovis (M. bovis) oder seine Lipid-assoziierte-Membranproteinen (LAMPs) sollte der Frage nachgegangen werden, ob der Erreger bzw. seine Membranproteine die morphologischen Eigenschaften der nPMN direkt moduliert. Dafür wurde die mittlere Größe (forward scatter, FSC) und die Komplexität (side scatter, SSC) der nPMN im Anschluss an die Stimulation durchflusszytometrisch (3.3.1) erfasst.

Abbildung 2: Zellgröße und -komplexität neutrophiler Granulozyten unter direktem Einfluss von M. bovis oder LAMPs.

Neutrophile Granulozyten (nPMN) aus heparinisiertem Vollblut wurden mit Mycoplasma bovis (M.

bovis), Lipid-assoziierte-Membranproteinen (LAMPs) oder RPMI-Medium (Medium) für 30 Min.

stimuliert. Im Anschluss wurden der mittlere Forward Scatter (FSC, A) als Maß für die Größe sowie der mittlere Side Scatter (SSC, B) als Maß für die Komplexität der vitalen Zellen durchflusszytometrisch erfasst (n = 6, Mittelwerte + SEM). Unterschiede zu der Kontrolle mit RPMI-Medium (Medium) wurden mittels einfacher ANOVA und Dunnett‘s Multiple Comparisons Test auf Signifikanz geprüft (*

= p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ ,001); LAMPs = Lipid-assoziierte-Membranproteine; M.

bovis = Mycoplasma bovis.

Verglichen mit der Mediumkontrolle (Medium) führte die Stimulation mit Mycoplasma bovis zu einer signifikanten Verringerung des FSC (p = 0,0057) (Abbildung 2, A), jedoch zu keinem signifikanten Unterschied des SSC (Abbildung 2, B). Mit LAMPs stimulierte nPMN

unterschieden sich weder in ihrer Größe noch in ihrer Komplexität von der Mediumkontrolle (p >0,05).

4.1.2 Modulation der phänotypischen Eigenschaften neutrophiler Granulozyten

Um der Frage nachzugehen, ob die morphologischen Veränderungen von nPMN durch Mykoplasmen auch mit phänotypischen Veränderungen, wie einer modulierten Expression von Oberflächenmolekülen, einhergehen, wurden nPMN für 30 Min. mit Mycoplasma bovis oder LAMPs inkubiert. Im Anschluss wurde die Expression von CD62L, CD11b und CH138A der nPMN durchflusszytometrisch bestimmt.

Abbildung 3: CD62L-, CD11b- und CH138A-Expression durch neutrophile Granulozyten unter direktem Einfluss von M. bovis oder LAMPs.

Neutrophile Granulozyten (nPMN) aus heparinisiertem Vollblut wurden mit Mycoplasma bovis oder LAMPs inkubiert (30 Min.). Anschließend wurde eine Membranimmunfluoreszenz (MIF) (3.4.2) der nPMN mit ausgewählten Antikörpern durchgeführt, welche die Oberflächenmoleküle CD62L (A), CD11b (B), sowie die CH138A-Zielstruktur (C) markieren. Als Kontrolle wurden nPMN mit

RPMI-A) CD62L B) CD11b

MFI MFI

MFI

C) CH138A

Medium (Medium) inkubiert. Es erfolgte unmittelbar die durchflusszytometrische Erfassung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) vitaler nPMN (n = 6, Minimum bis Maximum mit Median).

Signifikante Unterschiede zu der Kontrolle mit RPMI-Medium (Medium) wurden mittels einfacher ANOVA und Dunnett‘s Multiple Comparisons Test bestimmt (* = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001). CD = cluster of differentiation; LAMPs = Lipid-assoziierte-Membranproteine;

M. bovis = Mycoplasma bovis.

Im Vergleich zur Mediumkontrolle führte eine Stimulation mit Mycoplasma bovis zu einer signifikanten Reduktion der CD62L-Expression auf nPMN (p = 0,0012) (Abbildung 3, A). Eine Stimulation der Zellen mit LAMPs führte zu keiner Beeinflussung der CD62L-Expression. Die Expression von CD11b und CH138A (Abbildung 3, B, C) auf neutrophilen Granulozyten wurde weder durch eine Stimulation mit M. bovis noch durch eine Stimulation mit LAMPs signifikant beeinflusst.

4.1.3 Modulation der funktionellen Eigenschaften neutrophiler Granulozyten

Die In-vitro-Stimulation von neutrophilen Granulozyten mit Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) in den finalen Konzentrationen 0 und 100 nM diente der Quantifizierung der Bildungskapazität von reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS).

Um zu überprüfen, inwieweit Mycoplasma bovis (M. bovis) und seine Lipid-assoziierte-Membranproteine (LAMPs) einen direkten Einfluss auf die ROS-Bildungskapazität von neutrophilen Granulozyten (nPMN) haben, wurden nPMN für 30 Min. mit M. bovis oder LAMPs stimuliert und die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies durchflusszytometrisch erfasst.

Abbildung 4 : Bildungskapazität reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) neutrophiler Granulozyten unter direktem Einfluss von M. bovis oder LAMPs.

A) 0 nM PMA B) 100 nM PMA

Neutrophile Granulozyten (nPMN) aus heparinisiertem Vollblut wurden 30 Min. mit Mycoplasma bovis (M. bovis) oder mit Lipid-assoziierten Membranproteinen (LAMPs) inkubiert (A) und vergleichend zusätzlich mit Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) in der finalen Konzentration 100 nM (B) stimuliert. Daraufhin wurde die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies durchflusszytometrisch erfasst (n = 6, Mittelwerte + SEM). Als Kontrolle wurden nPMN mit einer zu den Ansätzen äquivalenten Menge RPMI-Medium inkubiert (Medium). Unterschiede zu der Mediumkontrolle wurden mittels einfacher ANOVA und Dunnett's Multiple Comparisons Test auf Signifikanz geprüft (* = p ≤ 0,05, **

= p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001). LAMPs = Lipid-assoziierte-Membranproteine; MFI = Mittlere Fluoreszenzintensität; M. bovis = Mycoplasma bovis.

Mit M. bovis stimulierte nPMN führten zu einer mittelgradig signifikant (p = 0,0016) (Abbildung 4, A) und bei zusätzlicher Stimulation mit PMA (Abbildung 4, B) zu einer hochgradig signifikant verminderten ROS-Produktion im Vergleich zur Mediumkontrolle (p = 0,0005). Eine Stimulation der nPMN mit LAMPs hatte keinen Einfluss auf die ROS-Bildungskapazität.

4.2 Modulatorische Eigenschaften von Epithelzellüberständen

Bereits seit 1990 ist bekannt, dass die Verbreitung von M. bovis durch Tierkontakt zu asymptomatischen Carrier-Tieren, die in eine gesunde Rinderherde eingebracht werden, stattfindet und einer der Hauptinfektionswege dabei über den Respirationstrakt verläuft (PFUTZNER u. SACHSE 1996). Folglich sind Lungenepithelzellen eine der ersten Kontaktpunkte des Erregers mit dem Immunsystem des Rindes. Daher stellt sich die Frage, ob die Epithelzellen nach Interaktion mit M. bovis ein verändertes Spektrum an löslichen Mediatoren sezernieren, die zu einer Modulation der neutrophilen Granulozyten führen.

4.2.1 Modulation der morphologischen Eigenschaften neutrophiler Granulozyten Um zunächst der Frage nachzugehen, ob neutrophile Granulozyten (nPMN) durch Epithelzell-Überstände in ihren morphologischen Eigenschaften moduliert werden, wurden Embryonic bovine lung cells (EBL) mit Lipopolysacchariden (LPS), Lipid-assoziierte-Membranproteine (LAMPs) oder Mycoplasma bovis (M. bovis) für 24 Stdn. stimuliert und die entstandenen Überstände mit nPMN inkubiert. Es folgte die durchflusszytometrische Erfassung der mittleren Größe (forward scatter, FSC) und der Komplexität (side scatter, SSC) (3.3.1).

Abbildung 5: Zellgröße und -komplexität neutrophiler Granulozyten unter Einfluss von Epithelzellüberständen.

Embryonic bovine lung cells (EBL) wurden mit Mycoplasma bovis, LPS und LAMPs für 24 Stdn.

inkubiert und die Zellüberstände gewonnen. Neutrophile Granulozyten (nPMN) aus heparinisiertem Vollblut wurden 30 Min. mit den Zellüberständen ko-inkubiert. Kontrollen bestanden in nPMN, die in EBL-Kulturmedium (Medium) sowie in Überständen von nicht stimulierten EBL-Zellen (EBL-Medium) inkubiert wurden. Im Anschluss wurden der mittlere Forward Scatter (FSC, A) als Maß für die Größe sowie der mittlere Side Scatter (SSC, B) als Maß für die Komplexität der vitalen Zellen durchflusszytometrisch erfasst (n = 6, Mittelwerte + SEM). Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mittels einfacher ANOVA und Tukey‘s Multiple Comparisons Test auf Signifikanz geprüft (* = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001). LPS = Lipopolysaccharid; LAMPs = Lipid-assoziierte-Membranproteine; M. bovis = Mycoplasma bovis.

Reines EBL-Kulturmedium und Überstände nicht-stimulierter EBL-Zellen unterschieden sich nicht signifikant in ihrer Wirkung auf den FSC und den SSC der nPMN (Abbildung 5, A, B).

Die Größe und Komplexität von nPMN nach Inkubation mit Kulturüberständen M. bovis-stimulierter EBL-Zellen unterschied sich signifikant von der Kulturmedium-Kontrolle, nicht jedoch von den Überständen nicht-stimulierter EBL-Zellen. LPS- oder LAMPs-stimulierte EBL-Zellen induzierten keine Überstände, welche den FSC oder den SSC der nPMN signifikant änderten.

A) Zellgröße B) Zellkomplexität

FSC SSC

EBL-Überstand EBL-Überstand

4.2.2 Modulation der phänotypischen Eigenschaften neutrophiler Granulozyten Einfluss von Epithelzellüberständen auf die phänotypischen Eigenschaften der nPMN Zur Klärung der Fragestellung, ob Epithelzellüberstände einen Einfluss auf den Phänotyp von nPMN haben, wurden EBL-Zellen mit LPS, LAMPs oder Mycoplasma bovis inkubiert (24 Stdn.) und die Überstände zur Stimulation von nPMN verwendet. Daraufhin wurde die Expressionen von CD62L, CD11b und CH138A der nPMN durchflusszytometrisch bestimmt.

Abbildung 6: CD62L-, CD11b- und CH138A-Expression von nPMN unter dem Einfluss von Epithelzellüberständen.

Embryonic bovine lung cells (EBL) wurden mit Mycoplasma bovis, LPS oder LAMPs inkubiert (24 Stdn.) und die Zellüberstände gewonnen. Neutrophile Granulozyten aus heparinisiertem Vollblut

A) CD62L B) CD11b

MFI MFI

MFI

C) CH138A

EBL-Überstand EBL-Überstand

EBL-Überstand Medium

boCXCL-8 EB

L-Medium M. bovis

LPS LA

MPs 5000

10000 15000 20000

wurden mit den Zellüberständen 30 Min. ko-inkubiert. Anschließend wurde eine Membranimmunfluoreszenz (MIF) (3.4.2) der nPMN mit ausgewählten Antikörpern durchgeführt, welche die Oberflächenmoleküle CD62L (A), CD11b (B), sowie die CH138A-Zielstruktur (C) markieren. Kontrollen bestanden in nPMN, die mit EBL-Kulturmedium (Medium), boCXCL-8 (100 ng/ml EBL-Medium) oder stimulusfreien Epithelzellüberständen (EBL-Medium) ko-inkubiert wurden. Es erfolgte unmittelbar die durchflusszytometrische Erfassung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) vitaler nPMN (n = 6, Minimum bis Maximum mit Median). Signifikante Unterschiede zwischen den Ansätzen wurden mittels einfacher ANOVA und Tukey‘s Multiple Comparisons Test bestimmt (* = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001). BoCXCL-8 = bovines rekombinantes CXCL-8, CD = cluster of differentiation; LPS = Lipopolysaccharid; LAMPs = Lipid-assoziierte-Membranproteine; MFI = mittlere Fluoreszenzintensität; M. bovis = Mycoplasma bovis.

Bereits die Ko-Inkubation mit stimulusfreien Epithelzellüberständen zeigte eine geringgeradig signifikante Beeinflussung der Expression von CD62L (p = 0,0418) (Abbildung 6, A) gegenüber der Mediumkontrolle (Medium). Die Expression von CD62L war durch eine Stimulation mit M.-bovis-Überständen mittelgradig signifikant höher als in Anwesenheit der Mediumkontrolle (p = 0,0026) oder boCXCL-8 (p = 0,0021) und geringgeradig höher als in Anwesenheit von stimulusfreien Epithelzellüberständen (p = 0,0187). Dagegen unterschied sich die Expression von CD11b und CH138A (Abbildung 6, B, C) neutrophiler Granulozyten, die mit Epithelzellüberständen stimuliert wurden, weder signifikant gegenüber der Mediumkontrolle, noch gegenüber nPMN, die mit boCXCL-8 stimuliert wurden. Weder die Expression von CD11b, noch von CH138A konnte durch M.-bovis-Überstände signifikant beeinflusst werden.

Phänotypische Eigenschaften von nPMN nach Epithelzellüberstand-induzierter Transmigration

Weiterhin wurde geprüft, ob eine EBL-Kulturüberstand-induzierte In-vitro-Transmigration die Expression verschiedener Oberflächenmoleküle moduliert. Dazu wurden die Epithelzell-Überstände als chemotaktischer Stimulus für eine In-vitro-Transmigration verwendet und die transmigrierten nPMN bezüglich ihrer Expression von CD62L, CD11b und CH138A durchflusszytometrisch analysiert.

Abbildung 7: CD62L-, CD11b- und CH138A-Expression von nPMN nach In-vitro-Transmigration anhand von Epithelzellüberständen.

Embryonic bovine lung cells (EBL) wurden mit Mycoplasma bovis, LPS oder LAMPs inkubiert (24 Stdn.) und die Zellüberstände gewonnen. Aus heparinisiertem Vollblut wurden neutrophile Granulozyten separiert und einer durch die Zellüberstände induzierten In-vitro-Transmigration unterzogen. Anschließend wurde eine Membranimmunfluoreszenz (MIF) (3.4.2) der transmigrierten nPMN mit ausgewählten Antikörpern durchgeführt, welche die Oberflächenmoleküle CD62L (A), CD11b (B) sowie die CH138A-Zielstruktur (C) markierten. Kontrollen bestanden in nPMN, die nicht transmigrierten (nPMN), sowie nPMN, die entlang von EBL-Medium (Medium), boCXCL-8 (100 ng/ml, gelöst in EBL-Medium) oder stimulusfreien Epithelzellüberständen (EBL-Medium) transmigrierten. Es erfolgte unmittelbar die durchflusszytometrisch Erfassung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) vitaler nPMN (n = 6, Minimum bis Maximum mit Median). Signifikante Unterschiede zwischen den Ansätzen wurden mittels einfacher ANOVA und Tukey‘s Multiple Comparisons Test bestimmt, wobei der Vergleich zu nicht-transmigrierten PMN direkt über den

A) CD62L B) CD11b

einzelnen Box-Plots dargestellt wurde (* = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001). BoCXCL-8 = bovines rekombinantes CXCL-BoCXCL-8, CD = cluster of differentiation; LPS = Lipopolysaccharid;

LAMPs = Lipid-assoziierte-Membranproteine; MFI = mittlere Fluoreszenzintensität; M. bovis = Mycoplasma bovis.

Eine Transmigration mit EBL-Medium (Medium) (p = 0,0303) sowie mit boCXCL-8 (p = 0,0255) als Chemotaktikum verursachten eine geringgradig signifikante Abnahme der CD62L-Expression (Abbildung 7, A) von nPMN gegenüber nicht-transmigrierten nPMN.

Dagegen unterschieden sich die auf EBL-Kulturüberständen hin migrierten nPMN im Vergleich zu den Kontrollansätzen nicht in ihrer CD62L-Expression (p > 0,05). Zwischen den nicht-transmigrierten nPMN sowie anderen Kontrollansätzen und den entlang von EBL-Kulturüberständen transmigrierten nPMN gab es keinen signifikanten Unterschied hinsichtlich der CD11b-Expression (p > 0,05) (Abbildung 7, B). Unter stimulusfreien Überständen (p = 0,0133) sowie unter LPS-generierten Überständen (p = 0,01) gewanderte nPMN zeigten eine signifikant höhere Expression der CH138A-Oberflächenstruktur als nicht gewanderte nPMN (Abbildung 7, C). Unter Einfluss von M.-bovis-Kulturüberständen transmigrierte nPMN wiesen eine geringgradig signifikant höhere (p = 0,0267) gegenüber nicht-transmigrierten nPMN und eine mittelgradig signifikant höhere CH138A-Expression gegenüber Medium-induziert (p = 0,0053) oder boCXCL-8-Medium-induziert (p = 0,0045) gewanderten nPMN auf. Dabei unterschieden sich die unter M.-bovis-Kulturüberständen transmigrierten nPMN nicht signifikant gegenüber auf stimulusfreien Überständen transmigrierten nPMN.

4.2.3 Modulation der funktionellen Eigenschaften neutrophiler Granulozyten ROS-Bildungskapazität unter Einfluss von Epithelzell-Überständen

Um den Einfluss der Epithelzellüberstände auf die ROS-Bildungskapazität von nPMN zu untersuchen, wurden Embryonic bovine lung cells (EBL) mit LPS, LAMPs oder Mycoplasma bovis stimuliert (24 Stdn.) und die entstandenen Überstände für 30 Min. mit nPMN inkubiert.

Die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies wurde durchflusszytometrisch erfasst.

Abbildung 8: Bildungskapazität reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) neutrophiler Granulozyten unter Einfluss von Epithelzellüberständen.

Embryonic bovine lung cells (EBL) wurden mit Mycoplasma bovis, LPS oder LAMPs inkubiert (24 Stdn.) und die Zellüberstände gewonnen. Aus heparinisiertem Vollblut wurden neutrophile Granulozyten separiert und anschließend für 30 Min. mit den Kulturüberständen inkubiert (A) und vergleichend zusätzlich mit Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) in der finalen Konzentration 100 nM (B) stimuliert. Anschließend wurde die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies durchflusszytometrisch erfasst (n = 6, Mittelwerte + SEM). Kontrollen bestanden in nPMN, die in EBL-Medium inkubierten (Medium), sowie in Überständen von EBL-Zellen, denen kein Stimulus zugesetzt wurde (EBL Medium). Unterschiede zwischen den einzelnen Ansätzen wurden mittels einfacher ANOVA und Tukey's Multiple Comparisons Test auf Signifikanz geprüft, wobei der Vergleich zur Mediumkontrolle direkt über den einzelnen Balken dargestellt wurde (* = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001).

LPS = Lipopolysaccharid; LAMPs = Lipid-assoziierte-Membranproteine; MFI = Mittlere Fluoreszenzintensität; M. bovis = Mycoplasma bovis.

Die mit stimulusfreien Überständen ko-inkubierten nPMN führten zu einer geringgradig (Abbildung 8, A) (p = 0,017) und bei zusätzlicher Stimulation mit PMA (Abbildung 8, B) zu einer mittelgradig signifikant (p = 0,0052) vermehrten ROS-Produktion im Vergleich zur Mediumkontrolle. Unter dem Einfluss von M.-bovis-Kulturüberständen bildeten nPMN unabhängig von einer Stimulation mit PMA hochgradig signifikant mehr ROS (p = 0,0008) als unstimulierte nPMN, wobei die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) sich verdoppelte. Die ROS-Bildung von mit LAMPs-Kulturüberständen stimulierten nPMN zeigte ohne (p = 0,0026) sowie mit (p = 0,0029) PMA eine mittelgradige Signifikanz gegenüber unstimulierten nPMN.

LPS-Kulturüberstände führten alleine zu keiner signifikant veränderten ROS-Produktion, die Zugabe von PMA bewirkte eine geringgradig signifikant gesteigerte ROS-Produktion im

A) 0 nM PMA B) 100 nM PMA

Vergleich zu unstimulierten nPMN (p = 0,0155). Zusätzlich zeigte sich, dass LAMPs-generierte Überstände eine höhere ROS Produktion aufweisen als M.-bovis-Überstände (p = 0,0181). Die ROS-Produktion der mittels LPS, LAMPs oder M. bovis-generierten Überstände unterscheidet sich, unabhängig von PMA, nicht signifikant zu den Überständen, denen kein Stimulus zugesetzt wurde.

ROS-Bildungskapazität nach Epithelzellüberstand-induzierter Transmigration

Im Folgenden wurde geprüft, ob eine In-vitro-Transmigration der nPMN entlang der Epithelzellüberstände eine funktionelle Modulation im Sinne einer veränderten ROS-Bildungskapazität bewirkt. Dafür wurden die Epithelzellüberstände als chemotaktischer Stimulus für eine In-vitro-Transmigration verwendet und die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies der transmigrierten nPMN im Anschluss durchflusszytometrisch erfasst.

Abbildung 9: Bildungskapazität reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) neutrophiler Granulozyten nach In-vitro-Transmigration anhand von Epithelzell- Überständen.

A) 0 nM PMA

B) 100 nM PMA

MFIMFI

EBL-Überstand

Embryonic bovine lung cells (EBL) wurden mit Mycoplasma bovis, LPS oder LAMPs inkubiert (24 Stdn.) und die Zellüberstände gewonnen. Aus heparinisiertem Vollblut wurden neutrophile Granulozyten separiert und einer durch die Zellüberstände induzierten In-vitro-Transmigration

Im Dokument Direkte und indirekte Modulation boviner neutrophiler Granulozyten und deren Interaktion mit Monozyten durch Mycoplasma bovis (Seite 62-0)