BD Accuri™ C6 Software, Version 1.0.264.21 Becton, Dickison Biosciences GraphPad Prism 7.00 (vom 31.03.2016) GraphPad Software Inc., San Diego
(USA)
Tecan i-control, Version 3.7 Tecan trading AG, Schweiz
Software "ZEN" Zeiss, Oberkochen
185
Heidelberger Verlängerungen Fresenius Kabi AG, Bad Homberg Staukette nach Witte Eickemeyer, Tuttlingen
Vacutainer® Multiple Sample Luer Adapters Becton Dickinson, Heidelberg Vacutainer® Natrium-Heparin-Blutröhrchen,
10 ml (170 IU)
Becton Dickinson, Heidelberg
Vacutainer® System, Halter Becton Dickinson, Heidelberg 9.3.2 Laborbedarf
Cell Star Tubes (15 ml/50 ml) Greiner Bio-One International GmbH, Kremsmünster (Österreich)
Chemotaxiskammer, 10-Well, mit
Silikonabdichtung und Schraubenmuttern
Neuro Probe, Gaithersburg, USA
Combitip 2,5 ml, 5,0 ml Eppendorf, Hamburg
Cryoröhrchen, 2,0 ml, steril, PP Kisker Biotech GmbH & Co. KG, Steinfurt
Deckgläser Omnilab, Bremen
Einmal-Filter, Celluloseacetat Membrane, 0,2 µm, steril
Renner, Darmstadt
Einmalhandschuhe, Nobaglove-Nitril NOBA Versrandmittel Danz GmbH, Wetter Eismaschine UBE 30-10 Ziegra, Isernhagen
Eppendorf-Reaktionsgefäß 1,5 ml Nerbe plus GmbH, Winsen/Luhe Fluoreszenz-Mikroskop AXIO Imager M2
186 -Plan Apochromat 100x/ 1,4 Oil M27
Objektiv
Immersionsöl Zeiss, Oberkochen
Kapillarspitzen, 200 µl, Rundkopf Biozym Scientific GmbH, Oldendorf Laborflasche mit Gewinde 500 ml VWR International GmbH, Hannover LS-Säulen, Separation Columns MACS Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch
Gladbach
Objektträger Omnilab, Bremen
Parafilm Landgraf Laborsysteme, Langenhagen
Pipettenspitzen 10 µl Kisker BioTech GmbH, Steinfurt Pipettenspitzen 1000 µl Greiner Bio-One International GmbH,
Kremsmünster (Österreich) Pipettenspitzen 200 µl Sarstedt AG & Co., Nümbrecht Polycarbonat Membran, 3 µm Poren,
25 x 80mm
Neuro Probe, Inc., Gaithersburg (USA) Pre-Separation Filters, 30 µm MACS Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch
Gladbach serologische Pipetten, 10 ml, 25 ml, steril Sarstedt AG & Co., Nümbrecht Zellkultur Flasche 75 cm2, Filterkappe Sarstedt AG & Co., Nümbrecht Zellkulturplatte, 12-Well -Flachboden, mit
Zellschaber, steril Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
187 9.3.3 Reagenzien und Kits
Accutase
®
-Lösung, steril filtiert Merck KGaA, Darmstadt Annexin V, Alexa Fluor 647-konjungiert ThermoFisher, DarmstadtAnti-CD14-MicroBeads, human, 2 ml MACS Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach
Bovines Serumalbumin (Fraktion V) Merck KGaA, Darmstadt Dihydrorhodamine 123 (DHR) Biomol GmbH, Hamburg
Dimethylsulfoxid (DMSO) Fisher Scienific, New Hampshire (USA) Di-Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Merck KGaA, Darmstadt
EDTA (Ethylendiamine-tetraacetic acid) Merck KGaA, Darmstadt ELISA Kit “Bovine Lipoxin A4”
Katalog-Nr. AMS.E11L0275
ELISA Kit “Bovine Prostaglandin E2” Katalog-Nr. MBS2609655
AMS Biotechnology, Frankfurt
MyBioSource, Inc., San Diego, Vertrieb durch: BIOZOL Diagnostika Vertrieb GmbH, Eching
Ethanol 641, absolut, vergällt CG Chemikalien, Laatzen Fetales Kälberserum (FCS), Virus-,
Endotoxin und Mykoplasmen getestet, steril filtiert
Biochrom, Berlin
HEPES (1603) Merck KGaA, Darmstadt
Kaliumchlorid (KCl), kristallin Biochrom, Berlin
Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) Merck KGaA, Darmstadt Kalziumchlorid (CaCl2) Carl Roth GmbH, Karlsruhe Lipopolysaccharid von Escherichia coli
Serotyp o55:B5
Merck KGaA, Darmstadt
188 Lymphocytes separation media
®
(spezifisches Gewicht: 1,077 g/ml), steril filtiert
Capricorn Scientific GmbH, Ebsdorfergrund
Natriumazid (NaN3), 10 %ig Merck KGaA, Darmstadt
Natriumchlorid (NaCl) Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Natriumhydroxid-Plätzchen Merck KGaA, Darmstadt
Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) Biomol GmbH, Hamburg Propidiumiodid (Calbiochem
®
) Merck KGaA, Darmstadt Rekombinantes bovines CXCL8189 Antikörper
Alle Antikörper wurden in PBS verdünnt und bei 4 °C gelagert.
Hu, human; mo, mouse; bo, bovine; 1) Sekundärantikörper;
Versuchstiere
Zur Blutentnahme wurden klinisch gesunde, weibliche Tiere der Rasse „Deutsch Schwarzbunte“, Typ Holstein-Friesian verwendet zugehörig (AZ 33.19-42502-05-17A176).
Die Tiere sind zugehörig zu der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover und waren im Durschnitt 7,5 Jahre alt.
9.3.4 Biologische Materialien
Mycoplasma bovis, Stamm PG45 Prof. Renate Rosengarten, Mycoplasma Biosafety Services GmbH, Wien
(Österreich) Die Lagerung der Mykoplasmen erfolgte bei -80° C.
Eukaryotische Zellen
EBL-Zellen Dr. Jochen Meens, Institut für
Mikrobiologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
RAW-Zellen Cell Lines Service, Eppelheim
Die Zellen wurden bei -80° C unter Zusatz von 25 Vol.-% FCS und 10 Vol.-% DMSO gelagert.
Antikörper Konjugat Spezifität Verdünnung final
Hersteller/
Artikelnummer Anti-boCH138A unmarkiert Maus, monoklonal,
IgM
190 9.3.5 Lösungen, Puffer und Kulturmedien
Die Lagerung der Puffer, Lösungen und Kulturmedien erfolgte, sofern nicht anders beschrieben bei 4°C
Puffer und Lösungen für die Zellseparation
LYMPHOZYTENSEPERATIONSMEDIUM®
Das Lymphozytenseparationsmediums® ist eine isotone und wässrige Lösung, die aus einem hochmolekularen Zucker mit einem Zusatz des Röntgenkristallmittels Isopaque und Natriumdiatrizoat besteht. Es besitzt eine Dichte von 1,077 g/ml bei 10°C und wurde unverdünnt zur Zellseparation eingesetzt.
PHOSPHATGEPUFFERTE SALZLÖSUNG (PBS)
NaCl 8 g
KCl 1,24 g
Na2HPO4 0,2 g
KH2PO4 0,2 g
Aqua tridest. ad 1000 ml
Nach Abwiegen wurden die Chemikalien in Aqua tridest. gelöst und der pH-Wert unter Zuhilfenahme von 1 N NaOH auf 7,4 eingestellt.
DOPPELT KONZENTRIERTE PHOSPHATGEPUFFERTE SALZLÖSUNG (2 X PBS)
NaCl 16 g
KCl 2,48 g
Na2HPO4 0,4 g
KH2PO4 0,4 g
Aqua tridest. ad 1000 ml
Nach Abwiegen wurden die Chemikalien in Aqua tridest. gelöst und der pH-Wert unter Zuhilfenahme von 1 N NaOH auf 7,4 eingestellt.
EDTA-STAMMLÖSUNG (0,5 MOL/L)
EDTA x 2 H2O 16,8 g
NaOH-Plätzchen 5,6 g
Aqua dest. ad 50 ml
191
Danach erfolgte die Einstellung des pH-Wertes der Lösung auf 7,5 unter Zuhilfenahme von 3 N HCl und das Auffüllen mit A. dest auf 100 ml. Vor Gebrauch wurde die Lösung mit einem 0,2 μm Filter steril filtriert.
MACS-PUFFER
Bovines SerumalbuminFraktion V (BSA)
5 g
EDTA-Stammlösung (0,5 mol/l) 4 ml
PBS ad 1000 ml
Vor Verwendung wurde die Lösung mit einem 0,2 μm Filter steril filtiert.
Zellkulturmedien und Zusätze
Für die Kultivierung von Leukozyten, RAW-Zellen und EBL-Zellen wurden verschiedene Medien verwendet. Zur Bereitstellung von Nährstoff-, Hormon- und Wachstumsfaktoren wurde einigen Kulturmedien fetales Kälberserum zugesetzt, dies wurde durch den Zusatz von „10F“
gekennzeichnet. Sofern zusätzlich Penicillin-Streptomycin verwendet wurde, erfolgte die zusätzliche Bezeichnung mit einem „+“.
APOPTOSEUNTERSTÜTZENDES (AU) MEDIUM (RPMI-1640-MEDIUM MIT 0,1 VOL.-%
FETALEM KÄLBERSERUM)
RPMI-1640-Medium 500 ml
Fetales Kälberserum 500 µl
EBL-GEFRIERMEDIUM
R10F+ 6,5 ml
Dimethylsulfoxid (=DMSO) 1,0 ml
FKS 2,5 ml
EBL-SPÜLMEDIUM
RPMI-1640-Medium 500 ml
Penicillin + Streptomycin 5,0 ml
192 EBL-MEDIUM
RPMI-1640-Medium 500 ml
Fetales Kälberserum 50 ml
Penicillin + Streptomycin 5,0 ml
L-Glutamin 5,0 ml
nichtessentielle Aminosäuren 5,0 ml PANSERIN+
Panserin-Medium 500 ml
Penicillin + Streptomycin 5,0 ml R0+(RPMI-1640-MEDIUM)
RPMI-1640-Medium 500 ml
Penicillin-Streptomycin 10 Mg
R10F+(RPMI-1640-MEDIUM MIT 10 VOL.-% FETALEM KÄLBERSERUM)
RPMI-1640-Medium 500 ml
Fetales Kälberserum 50 ml
Penicillin-Streptomycin 10 mg
Puffer und Lösungen für die Durchflusszytometrie
ANNEXIN-BINDUNGS-PUFFER
HEPES 10 mM
NaCl 140 mM
CaCl2 2,5 mM
Danach erfolgte die Einstellung des pH-Wertes der Lösung auf 7,4 mit NaOH MIF-PUFFER
Bovines SerumalbuminFraktion V (BSA)
2,5 g
NaN3 0,05 g
PBS ad 500 ml
193
PROPIDIUMIODID-STAMMLÖSUNG
Die aliquotierte Stammlösung (100 μg/ml) wurde bei -20 °C gelagert. Zur Anfärbung toter Zellen wurde die Stammlösung mit PBS auf eine Endkonzentration von 4 μg/ml gebracht:
Propidiumiodid-Stammlösung (100 μg/ml)
1 ml
PBS ad 25 Ml
TRÄGERFLÜSSIGKEIT (SHEATH)
Als Trägerflüssigkeit für die durchflusszytometrische Messung wurde PBS mit 0,1 mg/ml NaN3 verwendet.
Lösungen für die ELISA Durchführung ELISA-WASCHLÖSUNG
Waschlösungskonzentrat 10 ml
A. dest 990 ml
9.4 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Fluoreszenzkanäle des BD Accuri™ C6 Flow Cytometer... 45
Tabelle 2: Reagenzien für eine ROS ... 46
Tabelle 3: Auswahl der Antikörper für die MIF mit neutrophilen Granulozyten. ... 47
Tabelle 4: Filtersets des AXIO Imager M2 Mikroskops ... 62
Tabelle 5: Einteilung des Signifikanzniveaus ... 66
194 9.5 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Gating-Strategie zur durchflusszytometrischen Analyse apoptotischer neutrophiler Granulozyten ... 57 Abbildung 2: Zellgröße und -komplexität neutrophiler Granulozyten unter direktem Einfluss von M. bovis oder LAMPs. ... 67 Abbildung 3: CD62L-, CD11b- und CH138A-Expression durch neutrophile Granulozyten unter direktem Einfluss von M. bovis oder LAMPs. ... 68 Abbildung 4 : Bildungskapazität reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) neutrophiler Granulozyten unter direktem Einfluss von M. bovis oder LAMPs. ... 69 Abbildung 5: Zellgröße und -komplexität neutrophiler Granulozyten unter Einfluss von Epithelzellüberständen. ... 71 Abbildung 6: CD62L-, CD11b- und CH138A-Expression von nPMN unter dem Einfluss von Epithelzellüberständen. ... 72 Abbildung 7: CD62L-, CD11b- und CH138A-Expression von nPMN nach In-vitro-Transmigration anhand von Epithelzellüberständen. ... 74 Abbildung 8: Bildungskapazität reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) neutrophiler Granulozyten unter Einfluss von Epithelzellüberständen. ... 76 Abbildung 9: Bildungskapazität reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) neutrophiler Granulozyten nach In-vitro-Transmigration anhand von Epithelzell- Überständen. ... 78 Abbildung 10: Transmigrationsraten neutrophiler Granulozyten nach Epithelzell-induzierter In-vitro-Migration. ... 80 Abbildung 11: CD62L-, CD11b- und CH138A-Expression neutrophiler Granulozyten nach In-vitro-Migration unter Einfluss von M. bovis. ... 82 Abbildung 12: CD62L-, CD11b- und CH138A-Expression transmigrierter neutrophiler Granulozyten unter Einfluss von M. bovis. ... 84 Abbildung 13: ROS-Bildungskapazität neutrophiler Granulozyten nach In-vitro-Migration unter Einfluss von M. bovis. ... 85 Abbildung 14: ROS-Bildungskapazität transmigrierter neutrophiler Granulozyten unter Einfluss von M. bovis ... 86 Abbildung 15: Transmigrationsraten neutrophiler Granulozyten nach In-vitro-Migration unter Einfluss von M. bovis. ... 87
195
Abbildung 16: Absolute Zahl PI-negativer neutrophiler Granulozyten unter Einfluss von M.
bovis. ... 88 Abbildung 17: Apoptose- und Nekrose-Index neutrophiler Granulozyten unter Verwendung verschiedener Serumkonzentrationen und Zelldichten. ... 90 Abbildung 18: Apoptoseindex neutrophiler Granulozyten unter Verwendung verschiedener Inkubationszeiten sowie Fluoreszenzmikroskopie von APO-nPMN24. ... 92 Abbildung 19: Apoptose von neutrophilen Granulozyten unter Einfluss von M. bovis. ... 95 Abbildung 20: Efferozytose apoptotischer neutrophiler Granulozyten (APO-nPMN24) durch RAW-Zellen. ... 97 Abbildung 21: Efferozytose apoptotischer neutrophiler Granulozyten (APO-nPMN24) durch RAW-Zellen unter Verwendung von Natriumazid im Zeitverlauf. ... 99 Abbildung 22: Zellgröße der verschiedenen Modellmakrophagen nach Efferozytose apoptotischer nPMN unter Einfluss von M. bovis. ... 101 Abbildung 23: Seitwärtsstreulicht der verschiedenen Modellmakrophagen nach Efferozytose apoptotischer nPMN unter Einfluss von M. bovis. ... 103 Abbildung 24: Efferozytose apoptotischer neutrophiler Granulozyten durch RAW-Zellen unter Einfluss von M. bovis. ... 105 Abbildung 25: Efferozytose apoptotischer neutrophiler Granulozyten durch MdM unter Einfluss von M. bovis. ... 109 Abbildung 26: Efferozytose-induzierte Produktion von Lipoxin A4 und Prostaglandin E2. . 110
196 9.6 Abkürzungsverzeichnis
°C Grad Celsius
2 x PBS doppelt konzentriertes PBS
A. dest Aqua destillata (=destilliertes Wasser) ANOVA Analysis of variance (Varianzanalyse)
APO-nPMN24 spontan-apoptotische bovine neutrophile Granulozyten AU-Medium Apoptose-unterstützendes-Medium
AZ Aktenzeichen
BBE-Zellen primäre bovine bronchiale Epithelzellen BLAD bovinen Leukozyten-Adhäsions-Defizienz bMEC bovine Euterepithelzelllinie
bo rekombinates bovines bzw. beziehungsweise
CAM cell adhesion molecules, Zelladhäsionsmoleküle
CCL Chemokin-Ligand mit zwei Cysteinmolekülen in Folge CD Cluster of differentiation
cm2 Quadratzentimeter CO2 Kohlenstoffdioxid
CR complement receptor, Komplementrezeptor
CXCL -Chemokin-Ligand mit zwei Cysteinmolekülen, die durch eine beliebige Aminosäure getrennt werden
D1- day 1-, Tag 1-
DAS-ELISA Double-Antibody-Sandwich-ELISA DHR123 Dihydrorhodamin 123
DMSO Dimethylsulfoxid DNS Desoxyribonukleinsäure E. coli Escherichia coli
EBL-Zellen embryonic bovine lung cells, embryonische bovine Lungenzellen EBTr-Zellen embryonale, bovine Trachealzellen
ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay EPS extrazelluläre polymere Substanz
197 et al. et alii (lateinisch: und andere) FCS fetal calf serum, fetales Kälberserum FITC Fluoresceinisothiocyanat
FL Messkanal des Durchflusszytometers für emittierte Fluoreszenz FSC Forward Scatter, Vorwärtsstreulicht
g Gramm
G-CSF granulocyte-colony stimulating factor, Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor
GM-CSF granulocyte macrophage colony-stimulating factor, Granulozyten-Monozyten-Kolonie-stimulierender Faktor
H2O2 Hydrogenperoxid
ICAM-1 intercellular adhesion molecule-1
IFN Interferon
Ig Immunglobulin
IL Interleukin
JAM- A junctional adhesion molecule A
LAMPs Lipid-associated-membrane-proteins, Lipid-assoziierten Membranproteine Leu-CAM leukocyte cell adhesion molecules
LPS Lipopolysaccharide LTB4 Leukotrien B4
LXA4 Lipoxin A4
M. bovis Mycoplasma bovis Mac-1 macrophage-1
MACS magnetic activated cell sorting, magnetische Zellseparation
M-CSF macrophage colony-stimulating factor, Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor
MDBK bovine Nierenepithelzelllinien
MdM Monocyte derived Macrophages, aus Monozyten gereifte Makrophagen MHC major histocompatibility complex, Haupthistokompatibilitätskomplex MIF Membranimmunfluoresenz
Min. Minuten
ml Milliliter
198 MLCK myosin light chain kinase
MNC mononuclear cells, Mononukleäre Zellen
MOI Multiplicity of infection, Multiplizität der Infektion mRNA messenger ribonucleinacid, Boten-Ribonukleinsäure
n = die Anzahl der Einzelbeobachtungen zur Berechnung des Mittelwertes n.s. nicht signifikant
NaHep Natrium-Heparin
NaN3 Natriumazid
nd non detectable
NETs neutrophil extracellular traps, neutrophile extrazelluläre Fallen NF nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells NK-Zellen Natürliche Killerzellen
nm nanometer
NO Nitric oxide, Stickstoffmonoxid
nPMN neutrophilic polymorpho-nuclear granulocytes, Neutrophile Granulozyten O2- Superoxidanionen
OCl– Hypochlorit
OD Optical Density, optische Dichte
OH Hydroxylradikale
OI– Hypoiodit
p = Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Ähnlichkeitsanalyse zweier Datengruppen PAF platelet activating factor
PAMPs pathogen-associated molecular pattern, Pathogen-assoziierte molekulare Muster
PBS Phosphate Buffered Saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) PCR polymerase chain reaction, Polymerasekettenreaktion
PE Phycoerythrin
PE/Cy5 Phycoerythrin/Cyanin5
PECAM1 platelet / endothelial cell adhesion molecule 1 PGE2 Prostaglandin E2
PI Propidiumiodid-Lösung
199 PMA Phorbol-12-myristat-13-acetat PMN Polymorphkernige Leukozyten
PUFAs poly-unsaturated fatty acids, mehrfach ungesättigte Fettsäuren ROS reactive oxygen species, reaktive Sauerstoffspezies
RT Raumtemperatur
S. aureus Staphylococcus aureus
SEM standard error of the mean, Standardfehler des Mittelwertes sLex sialyl Lewis x, Epithelzellligand
sog. sogenannt
SPMs specialized pro-resolving mediators SSC Side Scatter, Seitwärtsstreulicht
Stdn. Stunden
TEM Transmissions-Elektron-Mikroskopie TLR Toll-like-Rezeptoren
TMB 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine TNF Tumornekrosefaktor
TRAIL TNF-related apoptosis-inducing ligand
TRAMP TNF receptor-related apoptosis-mediating protein UV-Strahlung ultraviolette Strahlung
UW Upper Well
VIT-nPMN vitale nPMN Vol.-% Volumenprozent
Vsps variabel surface proteins, variable Oberflächenproteine VVOs vesikulo-vakuoläre Organellen
x g multipliziert mit der Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/s2)
μl Mikroliter
200
Danksagungen
Als Abschluss meiner Dissertation möchte ich mich herzlich bei den Menschen bedanken, die mich während dieser Zeit unterstützt haben und die Promotion erst ermöglichten:
Herrn Prof. Dr. Hans-Joachim Schuberth danke ich für die Möglichkeit meine Dissertation in seiner Arbeitsgruppe anfertigen zu können. Sie waren ein wundervoller Betreuer, der immer ein offenes Ohr hatte und mich nie mit einem Problem alleine ließ. Besonders schätze ich neben den konstruktiven Gesprächen vor allem Ihre fachliche Begeisterung, die sehr ansteckend ist.
Herzlichen Dank!
Herrn Dr. Meens und Frau Prof. Dr. Rosengarten möchte ich für die Bereitstellung der Mykoplasmen und LAMPs danken.
Udo Raabe, Silke Schönberg und Sonja Cordex danke ich einerseits für die laborbezogene Unterstützung. Eure Geduld bei Fragestellungen, Wünschen oder auftretenden Problemen ist unbeschreiblich. Andererseits habt ihr durch tolle Gespräche die oft langen Inkubationszeiten deutlich schöner gemacht.
Jutta Parker danke ich als guter Seele der Immunologie für Ihr immer offenes Ohr und Herz.
Es war schön immer willkommen zu sein für ein ablenkendes Gespräch oder bei Momenten der Verzweiflung.
Meinen Kollegen Maria Feierabend, Michelle Tillmanns, Matheus Fernandes Werner, Lisa-Marie-Schünemann und Eileen Schultz gilt besonderer Dank. Neben dem tollen fachlichen Austausch habt ihr eine besonders schöne Arbeitsumgebung geschaffen und mich sehr unterstützt, so dass jeder kleinste Tiefpunkt schnell überwunden wurde. Danke für eure Zeit, das gemeinsame Lachen und gemeinsame Hundespaziergänge.
Ohne meine fleißigen Korrekturleser Lisa Marie Schünemann und Eileen Schultz wäre so manches Komma auf eine wilde Reise gegangen und so mancher Tippfehler unentdeckt geblieben. Danke für eure intensiven lateinisch-grammatikalischen Verbesserungen und Adlersaugen!
Michel Heimes möchte ich danken für die Gelassenheit und Geduld mich auch an schwierigen Tagen zu unterstützen und die Doktorarbeit zu vergessen. Danke dass du an meiner Seite bist!
Meinen Eltern Wiebke und Rudolf danke ich für all die Unterstützung auf meinen Wegen und bei der Verwirklichung meiner Pläne, egal wie verrückt sie sind.