Untersuchungen zur stadienspezifischen Aktivität einzelner Teilzonen des Markergenlocus GOT-C

Bei den Vorexperimenten zur Klärung der optimalen physikochemischen Elektrophoresebedingungen wurde beobachtet, daß in GOT-Zymogrammen aus Embryo- und Makrogametophytengewebe unge-keimter Samen eine Aktivität der Zonen 3 und 4 regelmäßig fehlte. Außerdem schien die Aktivität (Farbintensität) der Zone 5 im Makrogametophyt mit Fortschreiten des Keimstadiums abzunehmen, diejenige des Embryos hingegen stieg offensichtlich gleichzeitig an. Diese Beobachtungen führten zu der Hypothese einer stadienspezifischen, untereinander unabhängigen Aktivität der Teilzonen GOT-CI, GOT-CII und GOT-CIII.

Zur systematischen Überprüfung der Hypothese wurde bei dem über Saatgut repräsentierten Provenien-zen in zusätzlichen Protokollen zu den Hauptuntersuchungen der vorliegenden Arbeit die Länge der Radicula von analysierten Embryonen notiert sowie anschließend die GOT-Zymogramme mit einem Laser densitometrisch⁸⁰ vermessen. Dabei ging man von folgenden Voraussetzungen aus:

a) Die Längenzunahme der Radicula ist ein meßbares Merkmal, welches die Entwicklung des Keimlings widerspiegelt.

b) Die im Densitogramm feststellbaren Färbeintensitäten sind meßbare Merkmale für die umgesetzte Menge des Enzym-Substrates und somit Merkmale für die Aktivität des be-treffenden Isoenzyms.

Ausschließlich Gewebepaarungen, welche über eine homozygote Allelausstattung⁸¹ am Genlocus GOT-C verfügten, gelangten zur Auswertung. Der an dieser Stelle verwendete Datensatz umfaßt Messungen an insgesamt 129 Gewebepaaren (Emryo / Makrogametophyt) aus neun Elektrophoreseläufen. Gewertet wurde die Laserextinktion (Peakhöhe) abzüglich der Hintergrundfärbung des Geles. Durchschnittlich 12 Merkmalsklassen der Keimlingsentwicklung (Länge der Radicula in „cm“) fanden Berücksichtigung pro Stichprobe. Die Klassenbesetzung war unterschiedlich (vgl. Anhang A.II-3a-d). Die Mittelwerte der Laser-Extinktion wurden für die entsprechenden Radicula-Längen ermittelt, um der natürlichen Streu-ung der KeimlingsentwicklStreu-ung RechnStreu-ung zu tragen. Die AbbildStreu-ungen 5-5 und 5-6 zeigen Trends der

80 Zur Methode vgl. Kap. 3.2.3.; Abbildung A.I-3 zeigt Beispiele von Densitogrammen.

81 Allel GOT-C4

Aktivität unterschiedlicher Teilzonen von GOT-C am Beispiel der Stichprobe S05/S03.⁸² Dargestellt sind die Mittelwerte der Extinktion der Laser-Lichtquelle über der jeweiligen Länge der Radicula. Im Makrogametophytengewebe nimmt die Akti

Abb. 5-5: Entwicklungsabhängigkeit der Aktivität einzelner Teilzonen von GOT-C im Makrogametophyten

⁸³

Abb. 5-6: Entwicklungsabhängigkeit der Aktivität einzelner Teilzonen von GOT-C im Embryo

⁷⁸

82 Ökotyp: nördl. Inlandsdouglasie. Ergänzt durch 12 Gewebepaare aus S03.

83 Die Angabe der Radicula-Länge erfolgt in "cm". Weitere Erläuterungen im Text. Beide Abbildungen wurden im Rahmen einer Posterpräsentation auf dem ISTA Kongress 1994 (Wageningen) vorgestellt.

Tab. 5-2: Rang-Korrelationskoeffizienten [rs] zwischen Iso-zymaktivität am Genlocus GOT-C (mittlere Ex-tinktions-Werte) und Länge der Radicula beim Makrogametophyten.*

Teilzone des Provenienz

Mendelgens S04 S05, S03 S08

(südl. Inland) (nördl. Inland) (Küste) GOT-C^I +0,6897 (0,01) +0,6153 (0,025) +0,7085 (0,05)

GOT-C^II - +0,3653 (0,10)

-GOT-C^III -0,3399 (-) -0,5523 (0,05) -0,2371 (-)

vität von GOT-CIII GOT-CI zu. In beiden Geweben ist der Verlauf der Aktivität von CII schwach positiv mit der Keim-lingsentwicklung korreliert.

Rang-Korrelationskoeffizienten nach SPEARMAN charakterisieren die entwicklungsabhängige Aktivität der drei Teilzonen von GOT-C für mehrere Provenienzen. Der Zusammenhang zwischen

Aktivitätszu-Tab. 5-3: Rang-Korrelationskoeffizienten [rs] zwischen

-GOT-C^III -0,5190 (0,05) -0,3895 (0,10) -0,0698 (-) Erläuterungen:

*) Signifikanzniveau (P) in Klammern (Werte aus SACHS 1996, Tab. 103)

nahme von GOT-CI

Die Untersuchung von Embryonen (Tab. 5-3) ergab für die südliche Inlandspopulation S04 ein abwei-chendes Ergebnis mit sehr schwach negativ korrelierter Aktivität in der Zone GOT-CI und einer deutli-chen, negativen Korrelation zwischen der GOT-CIII-Menge und der Länge der Radicula. Bei den übri-gen Provenienzen wurden positive Korrelationen für GOT-CI und schwach bis sehr schwach negative für GOT-CIII gefunden. Für einen Teil der Fälle sind auch diese Ergebnisse statistisch gesichert. An der Teilzone GOT-CII konnte für den Makrogametophyten der nördlichen Inlandsprovenienzen ein stati-stisch gesicherter Wert ermittelt werden. Bei den übrigen Populationen war das vorhandene Datenmate-rial zu gering.

Tab. 5-4:

Unabhängigkeit der Aktivität der Teilzonen GOT-C^I und GOT-C^III untereinander*

Gewebe Provenienz

S04 S08

Embryo <1x10^-7 2x10^-5

Makroga-metophyt

<1x10^-6 2x10^-3

Tab. 5-5:

Unabhängigkeit von GOT-C-Teilzonen der Population S05 / S03 untereinander*

Gewebe Teilzone

C^I C^II

Embryo C^III <1x10^-9 <1x10^-9 C^II <1x10^-9 -

Makroga-metophyt

C^III <1x10^-9 <1x10^-9

C^II 5x10^-4

-Erläuterungen: *) Signifikanzniveau (P) der Ablehnung von H0 für den Wilcoxon-Test f. Paardifferenzen. (vgl. Kap. 3.2.2.)

Mit dem Wilcoxon-Test für Paardifferenzen wurde geprüft, ob die Einzelwerte der Laser-Extinktion zweier Teilzonen aus einer gemeinsamen Grundgesamtheit stammen. Diese Hypothese konnte aus-nahmslos verworfen werden. Die Aktivität der einzelnen Teilzonen von GOT-C wird offensichtlich völ-lig unabhängig voneinander gesteuert. Wie die Tabellen 5-4 und 5-5 verdeutlichen, ist dieses Ergebnis auf hochsignifikantem Niveau gesichert.

5.1.1.3. Diskussion

Die von ADAMS und Kollegen (1990) beobachtete, gewebespezifische Ausprägung der GOT-Zymogramme konnte in den für die vorliegende Arbeit durchgeführten Experimenten als verfahrensbe-dingt geklärt werden. Bereits in einer früheren Arbeit hat GOTTLIEB auf die tatsächliche Gefahr ver-fahrensbedingter Ergebnisse bei GOT hingewiesen (ders. 1981, S.12). Somit findet sich diese Proble-matik bei der Arbeit mit unterschiedlichen Kulturpflanzen und ist keineswegs auf die Douglasie be-schränkt.

Als gewebespezifisch ist lediglich die geringere Aktivität von GOT-C im Embryo- und Knospengewebe festzuhalten, welche durch die densitometrischen Messungen quantifiziert wurde. Diese Beobachtung

kann nicht auf die Konzentration des jeweiligen Gewebes im Extraktionspuffer zurückgeführt werden, denn zum einen wurde eine geringere Menge des Extraktionspuffers bei den fraglichen Gewebearten verwendet, um annähernd ähnliche Konzentrationen zu erreichen. Zum anderen wurde neben steigenden Aktivitäten in der Teilzone GOT-CI gleichzeitig überwiegend abnehmende Aktivitätstendenzen in dem Teilbereich GOT-CIII festgestellt. Darüberhinaus weist das stabile Aktivitätsniveau von GOT-B, das in unterschiedlichen Gewebearten und verschiedenen Entwicklungsstufen des Keimlings beobachtet werden kann (KLUMPP et al. in Vorbereitung), ebenfalls auf eine gewebespezifische Aktivität von GOT-C. Im übrigen fällt auf, daß der kleine Datensatz aus der Population S04 (38 Gewebepaare) nur in der Katego-rie der jeweils deutlichsten Änderung der Enzymaktivität (Makrogametophyt: C^I; Embryo C^III, vgl. Tab.

A.II-3a) statistisch gesicherte Ergebnisse generiert. Der größte Datensatz, derjenige von S05/S03 (56 Gewebepaare), ermöglicht die bessere statistische Absicherung der Ergebnisse. Die Schwierigkeit, über verschiedene Elektrophoreseläufe hinweg eine Vergleichbarkeit der einzelnen Gel-Färbungen in ihrer Gesamtintensität sicherzustellen, setzt hier einer Ausweitung des Datensatzes Grenzen.

Die stadienspezifische Komponente in der Ausprägung von GOT-Zymogrammen war bislang nur für die Gemeine Kiefer und die Schwarzfichte bekannt. RUDIN & EKBERG (1978, S.4) berichteten über eine auffallend schwächere Färbung der Genloci B und C aus ungekeimtem Saatgut der erstgenannten Baumart. BOYLE & MORGENSTERN (1985) erwähnten eine mangelnde Aktivität des B-Locus bei Em-bryonen der Schwarzfichte⁸⁴. Für die Douglasie konnte dagegen in der vorliegenden Arbeit nur für den Markergenlocus GOT-C und dort nur für die Teilzonen GOT-CI und CII eine fehlende Aktivität bei unter Dormanz stehendem Saatgut festgestellt werden (Kap. 5.1.1.2.). CONKLE (1992) berichtet allge-mein von einer schwächeren Aktivität der B-Zone bei Koniferen, welche mit zunehmendem Keimungs-fortschritt zunimmt. Diesbezügliche Messungen wurden vom Verfasser an der Douglasie durchgeführt, sie müssen aus Platzgründen an anderer Stelle publiziert werden.

Bei Pflanzen der Gattungen Panicum, Lolium, Pisum und Phaseolus sind entwicklungsspezifische Ak-tivitäten des Aminotransferasesystems mittels analytisch-chemischer Methoden studiert worden. Eine Übersicht hierzu gaben WIGHTMAN und FOREST (1978, S. 1456 ff.).

Obwohl sich bei einer Reihe von Koniferen der dritte Markergenlocus als Mehrfachbandenmuster schon im haploiden Gewebe präsentiert, gab es bislang wenige Ansätze, diese Besonderheit zu klären. Bei Pinus silvestris (1978), bei Pinus rigida (GURIES & LEDIG 1978), bei Picea abies (LUNDKVIST

1979, RUDIN & EKBERG 1978, POULSEN et al. 1983), bei Picea glauca (KING & DANCIK 1983) sowie bei Abies alba (KONNERT 1992) werden beispielsweise zwei Banden im haploiden Gewebe beschrieben, die stets gleichsinnig variierten. Ein dreigliedriges Muster für Makrogametophytengewebe wurde außer bei der Douglasie auch bei Pinus taeda (ADAMS & JOLY 1980), bei Calocedrus decurrens (HARRY

1986) und bei Sequoiadendron giganteum (FINS & LIBBY 1982) gefunden. Auch bei krautigen Pflanzen wird über dieses Phänomen berichtet (zur Übersicht vgl. WENDEL & WEEDEN 1990).

Während GURIES & LEDIG (1978) als Erklärung noch die Alternativen ein kontrollierender Genlocus bzw. zwei eng benachbarte Genloci in den Raum stellten, ging LUNDKVIST (1979) bei der Fichte von zwei getrennten Genloci aus und bemühte evolutionäre Mechanismen, um die Übereinstimmung zu an-deren Forschungsergebnissen herzustellen. POULSEN und Kollegen stellten wenige Jahre später (die-selben, 1983) für die Fichte die Regulation durch zwei Loci bzw. die Existenz von intergenischen Hy-bridbanden zum Markergenlocus GOT-B zur Diskussion. Einzig HARRY zählte neben einer Steuerung durch ein und denselben Markergenlocus auch die Steuerung durch eng benachbart liegende, durch

84 Bei Picea mariana sind nur zwei Genloci für GOT bekannt (vgl. Kap. 2.3.1.).

Genverdopplung entstandene Loci auf und spekulierte darüberhinaus, ob diese 3-fach Bänderung von GOT-C bei der Flußzeder nicht das Ergebnis einer posttranslationalen oder posttranscriptionalen Modi-fikation sein könnte (ders. 1986, S. 263). Neben einer posttranslationalen ModiModi-fikation wird von ande-ren Autoande-ren allerdings auch eine Modifikation in vitro in Betracht gezogen (vgl. WENDEL & WEEDEN

1990, S. 38).

Die Tatsache, daß die Variation aller drei GOT-C-Zonen bei der Douglasie gleichsinnig verläuft und bislang von keinem Autoren eine Abweichung hiervon registriert wurde, legt die Erklärung nahe, alle drei Zonen werden von ein und demselben Mendelgen (= GOT-C) gesteuert. Für diese Annahme spre-chen auch die Segregationsanalysen von ADAMS und Kollegen (1990). Da die bekannten Variationen dieses Merkmals durch die jeweils schnellsten (GOT-CI) bzw. langsamsten Banden (GOT-CIII) alleine hinreichend und unverwechselbar charakterisiert sind, genügt es nur eine der beiden Zonen für be-stimmte Experimente zu beobachten. Außerdem ist dadurch auch die Analyse ungekeimten Saatgutes ohne weiteres möglich.⁸⁵

Die untereinander unabhängige und sich mit dem Entwicklungszustand des Keimlings ändernde Aktivi-tät der einzelnen Teilzonen von GOT-C spricht gegen eine in vitro Modifikation und weist auf die Be-teiligung von mindestens zwei weiteren, selbständigen Steuereinheiten in der (genetischen) Regulation hin:

Am wahrscheinlichsten erscheint das Modell einer Steuerung des Proteinaufbaues durch ein Struktur-gen, welches den Bau der "langsamsten"⁸⁶ Allozyme, das sind diejenigen der Zone GOT-CIII, steuert.

Aus dieser Ursprungsform werden dann posttranslational durch Proteolyse (Abspaltungen) zwei weite-re Formen, die Allozyme der Zonen CI und CII erzeugt, welche für Spezialaufgaben, vielleicht für den Transport durch Membranen, benötigt werden. Mit diesem Modell erklärt sich sowohl die gleichgerich-tete Variation aller drei Teilzonen von GOT-C als auch die Variationsbreite der Wandergeschwindig-keiten untereinander (vgl. ADAMS et al. 1990), da sich bei gleicher Schnittstelle in der Primärstruktur aus verschiedenen Proteinformen durchaus unterschiedliche Quotienten⁸⁷ aus Ladung und Durchmesser der Folgeprodukte ergeben können.

Ob eine derartige, posttranslationale Modifikation über zusätzliche Strukturgene oder über eine Pro-duktkette gesteuert werden, vermag die Allgemeine Genetik heute noch nicht zu sagen (STRICKBERGER

1988, S. 611 ff.). Im vorliegenden Fall sind beide Lösungen zunächst gleichermaßen mit den Ergebnis-sen vereinbar. NachgewieErgebnis-sen wurde die posttranslationale "Zurechtstutzung" von Proteinen beispiels-weise bei Ribulosebiphosphat-Carboxylase und den Hauptproteinen aus dem Chlorophyll - a,b - Kom-plex II (zur Übersicht vgl. RICHTER 1988, S. 535). Für einige andere Enzymsysteme ist im Unterschied zu den vorstehenden Überlegungen die Anlagerung von kleinen Molekülen (z.B. Phosphorelierung) nachgewiesen (zur Übersicht vgl. WEEDEN & WENDEL 1990, S. 60). Eine solche Ursache posttransla-tional erzeugter Mobilitätsänderung bleibt auf grund der damit verbundenen Vergrößerung des Molekü-les deshalb außer Betracht, weil der langsamste Isoenzymphänotyp im Ruhestadium von Saatgut alleine nachweisbar ist und somit eine Verkleinerung der Modifikationsprodukte wahrscheinlicher ist.

Nicht haltbar ist die Hypothese, drei eng gekoppelte Genloci würden die parallel variierenden 3-fach Muster erzeugen. Im Laufe der Phylogenese der Douglasie hätten sich zumindest einige wenige ver-schiedenartige Gene an den Teilzonen des Mendel-Genlocus GOT-C entwickeln müssen, deren

85 Die Wahl eines geeigneten Trennpuffersystemes ist zu beachten (vgl. Kap. 5.1.1.1.).

86 (weil größten und mit geringerer Ladung)

87 Die Wandergeschwindigkeit eines beliebigen Körpers im elektrischen Feld ist proportional zu dem Quotien-ten aus seiner elektr. Ladung q und seinem Durchmesser d.

peltes Auftreten Rückschlüsse auf eine genetische Kontrolle der genannten Art zugelassen hätten. Eine untereinander abgestimmte Reihenfolge der physikochemischen Eigenschaften aller drei Teilzonen könnte jedoch für die Viabilität entscheidend sein und daher eine Selektionskraft bilden, welche das Entstehen verschiedenartiger Gene an gekoppelten Loci unterdrückt. In dem oben genannten Zusam-menhang ist dieser Einwand nicht überzeugend, wenn die am Mendelgen GOT-C beobachteten, hetero-zygoten Merkmalsträger berücksichtigt werden, welche dann über heterodimere Proteine verfügen.

Die dritte, von HARRY (1986) in Erwägung gezogene Möglichkeit, die der posttranscriptionalen Modi-fikation, ist wenig plausibel. Unter einem solchen Vorgang versteht man bekanntlich die Reifung der Messenger-RNA, durch welche deren Funktionsfähigkeit erst hergestellt wird (RICHTER 1988, S. 502).

Auch hier sind Modifikationen bekannt, die von einer "Bauanleitung" zu mehreren, unterschiedlichen Formen von Proteinen führen. Allerdings weiß man bisher nur von unterschiedlichen Spleiß-Wegen in unterschiedlichen Organen und nicht, wie im Falle von GOT-C bei Douglasie, in unterschiedlichen Or-ganellen ein und desselben Organs. Außerdem führen posttranscriptionale Modifikationen nicht selten zu zwar verwandten, aber doch funktionsverschiedenen Polypeptiden, wie das Beispiel der Peptidhor-mone⁸⁸ Calcitonin und CGRP zeigt (vgl. SUZUKI et al. 1991, S. 297).

5.1.1.4. Zusammenfassung

Das Enzymsystem GOT wird bei der Douglasie von drei Genloci gesteuert. Gewebespezifische Ausprä-gungen der Zymogramme für Makrogametophyt- Embryo- und Apicalmeristemgewebe sind im engeren Sinn nicht zu beobachten. Unter suboptimalen Laborbedingungen können verfahrensbedingt Änderun-gen in den Zymogrammen auftreten, die vor allem den Genlocus GOT-B und das Knospengewebe be-treffen. Der Genlocus GOT-C stellt einen Mendel-Genlocus dar, dessen Produkte (CIII) offensichtlich posttranslational zu zwei kleineren Formvarianten (CII, CI) dieses Isoenzyms abgeändert werden. Die Aktivitäten der drei unterschiedlichen Isoenzyme von GOT-C sind untereinander unabhängig und zeigen im Makrogametophyten- sowie im Embryogewebe einen entwicklungspezifischen Verlauf. Embryo- und Knospengewebe weisen schwächere Aktivitäten von GOT-C auf als Makrogametophytengewebe.

88 Aus der gleichen "Bauvorlage" (Primärtranscript) entstehen bei Säugern in der Schilddrüse Calcitonin und im Hypothalamus CGRP (SUZUKI et al 1991, S. 297).

Im Dokument Untersuchungen zur Genökologie der Douglasie (Pseudotsuga menziesii [Mirb.] Franco). (Seite 105-112)