Valin
Erläuterungen:
Es bedeuten: leere Felder - keine Färbung; „+-„ - schwache Färbung, + bis ++++ - deutliche bis kräftige Färbung.
Angaben in Klammern bedeuten unregelmäßige Färbung. Weitere Erläuterungen im Text.
im Zymogramm einnehmen. Über eine gewebespezifische Aminopeptidaseaktivität wird auch im Ma-krogametophyten von Zea mays berichtet (OTT & SCANDALIOS 1976). Die Gegenwart von Aminopepti-dasen im Speichergewebe von Saatgut ist zwar mehrfach festgestellt worden, erste Modellvorstellungen über die Einbindung von Aminopeptidasen im Aminosäurenstoffwechsel des Saatgutes wurden aufge-stellt (BEWLEY & BLACK 1994), ihre genaue Rolle beim Keimungsvorgang ist jedoch noch wenig ge-klärt (RICHTER 1988).
Eine im Vergleich zu Mais nur schwache Färbungsaktivität von Endopeptidasen wurde in den unter-suchten Gewebetypen der Douglasie festgestellt. Offensichtlich liegen im unterunter-suchten Douglasiengewe-be grundlegend anders aufgebaute Endopeptidasen vor, was aus der geringen Substratumsatzrate und der deutlich geringeren Wandergeschwindigkeit folgt. Der Schluß auf eine geringere Gesamtaktivität dieses Enzymkomplexes im untersuchten Douglasiengewebe scheint verfrüht. Hier sind weitere Unter-suchungen notwendig. Im übrigen scheiden Endopetidasen mit dieser Untersuchung als eigentliche Pep-tidase, welche die Aktivität von LAP in den Zymogrammen überlagern und so deren Interpretation stö-ren, aus.
Die untersuchten Substrate der Exopeptidasen stammen aus der Gruppe der Aminosäuren mit hydro-phoben Seitenketten bzw. aus der Gruppe der basischen Aminosäuren (Lysin, Arginin). Entsprechend ihrer Grundeigenschaften zeigt sich ein ähnliches Eignungspotential als Substrat für die Aminopeptida-sen einzelner Markergenloci (Tab. 5-9). Wie schon für Zea mays von OTT & SCANDALIOS (1976) ge-zeigt wurde, bilden die basischen Aminosäuren Lysin und Arginin zusammen mit dem einfach gebauten Alanin eine Gruppe, welche besonders von „langsamen“ Aminopeptidasen als Substrat erkannt werden können. Im Gegensatz zu Mais (OTT & SCANDALIOS 1976), ist die in der vorliegenden Arbeit in der
„Zone D“ gefundene Aminopeptidase jedoch nicht spezifisch für Endopermgewebe. Bei der Douglasie findet sich eine makrogametophytenspezifische Aminopeptidase in der schnellsten Zymogramm-Zone, welche deshalb mit AMP-En bezeichnet wurde. Dieses Enzym hat offensichtlich eine hohe Affinität für Alanin als Substrat; denn Alanin ermöglicht eine regelmäßige Darstellung (Abb. 5-15), während bei Leucin eine unregelmäßige Färbung zu beobachten ist, die dann allerdings kräftig ausfallen kann (Abb.
5-14). Sehr leicht kann bei einer Unkenntnis dieser Tatsache der Eindruck von Doppelbanden als Pro-dukte des Genortes LAP-A aus haploidem Gewebe enstehen (Abb. 5-12: Paar 13 und 15 v.r.). In dem dort abgebildeten Zymogramm sind die Gewebepaare sechs bis fünfzehn, von rechts gelesen, alle aus Saatgut eines Baumes, nämlich Baum 24 in Bestand B06. Wie das Zymogramm der dazugehörigen Knospe (Abb. 5-14, links außen) zeigt, verfügt der Baum Nr. 24 über eine heterozygot kodierte Enzy-mausstattung am Genort LAP-A und segregiert im Makrogametophytengewebe normal (s. auch Abb. 5-18). Wertet man die vergleichsweise leicht schwächere Färbung der oberen Bande als Indiz für das Vorliegen eines „langsamen“ Allozymes des vermuteten Genortes AMP-En, welches hier über eine identische Wandergeschwindigkeit verfügt als das LAP-A Allozym Nr 2, so kann eine Quelle der Fehlinterpretationen weitgehend vermieden werden, welche von ADAMS und Kollegen anlässlich miß-lungener Segregationsanalysen beschrieben worden waren (ADAMS et al. 1990). Wie bereits von OTT und SCANDALIOS für Zea mays empfohlen (ibid. 1978), kann auch bei der Douglasie die Herstellung von Arginin-, Leucin- und Alanin-Zymogrammen aus identischen Präparaten in besonderen Fällen zur Klärung der Allozym-Ausstattung beitragen. Aus praktischen und ökonomischen Gründen sollte zumin-dest die ergänzende Herstellung von Alanin-Zymogrammen zum Standardverfahren gehören, um eine bessere Interpretation von LAP-A zu ermöglichen. Der Genort LAP-B läßt sich bei der Douglasie mit-tels Leucin-Färbung ausreichend sicher bestimmen.
Für die Weißkiefer beschreibt HERTEL (1997) ebenfalls fünf Zonen für Aminopeptidasen wobei die Leucin-Färbung eine ausreichend klare Darstellung von LAP ermöglicht. Nicht so die Färbung mittels
Alanin, welche alle fünf AMP-Zonen erscheinen läßt, z.T. überlappend. KONNERT (1995) beschreibt vier Genloci für die Weißtanne und schlägt das Kürzel AP als Bezeichnung vor.
Die International Union of Biochemistry klassifiziert heute eine Cytosol-Aminopeptidase (EC 3.4.11.1.), früher als LAP bezeichnet und eine Microsom-Aminopeptidase (EC 3.4.11.2.), unter welcher Alanin-Aminopeptidase (ehemals EC 3.4.11.12.) subsummiert (Anonymus 1984). Arginin-Alanin-Aminopeptidase (EC 3.4.11.6.) wird beschrieben als aktiv bei L-Arginin bzw. L-Lysin (Anonymus 1984). Im vorliegenden Fall bleibt festzustellen, daß die Isoenzyme des vermuteten Genortes AMP-C (bisher LAP-2) sowohl mit dem Substrat Arginin bzw. Alanin eine kräftige Färbung bewirkt. Ferner erlaubt die kräftige Leucin-Färbung der Zone AMP-A den Schluß, hier handele es sich um die Allozyme des Genortes LAP, der bisher als LAP-1 bekannt ist. Hier sind dringend weitere biochemische Untersuchungen notwendig, um die subzellulare Lokalisation der fünf beobachteten Aminopeptidasen bei der Douglasie zu klären und eventuell eine genauere Namensgebung durchzuführen. Bis dahin wird vorgeschlagen, OTT &
SCANDALIOS 1978 folgend, die Bezeichnung Aminopeptidasen mit dem Kürzel AMP unter Hinweis auf alle drei EC-Nummern zu verwenden. Die vorgeschlagenen Benennung der beobachteten Zonen sollte unter dem Hinweis vermuteter Genorte erfolgen, da bislang genetische Analysen nur für die Zonen AMP-A und AMP-C vorliegen (ADAMS et al. 1990).
5.1.4. Die Zymogramme des Enzymsystemes 6-PGDH.
Die überwiegende Mehrheit der Analysen zu vorliegender Arbeit wurden mit dem Trenn-Puffersystem
„C“ durchgeführt (vgl. Tab. 3-6). Dabei konnte bei dem Enzymsystem 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase eine stark färbende Zone gefunden werden (Abb. 5-22), deren heterozygote Individuen dreifach gebänderte Muster92 aufwiesen, wie sie bei anderen Autoren beschrieben sind (EL-KASSABY et al. 1982, ADAMS et al. 1990). Sofern diese Zone „A“ aus schnell wandernden Allozymen bestand, wur-de dahinter eine schwächer färbenwur-de Zone sichtbar, welche über dünne Banwur-den verfügte. In dieser „B“
Zone fanden sich jeweils zwei paarweise angeordnete Banden, welche selten variierten (Abb. 5-22). Die Zone „B“ wurde in der vorliegenden Arbeit nicht ausgewertet.
Wie bereits ADAMS und Kollegen berichten (ibid. 1990), sind die Zymogramme der Gewebetypen Makrogametophyt, Embryo und Knospenmeristem problemlos vergleichbar, da die unterschiedlichen Allozyme mit einer jeweils identischen Relation der Wandergeschwindigkeit in allen drei Geweben auf-treten (s. a. Abb. 5-23).
Die Arbeitsgruppen um W.T. Adams bzw. um Y. El-Kassaby arbeiten bei der Darstellung von 6-PGDH mit unterschiedlichen physikochemischen Bedingungen. Erstgenannte Gruppe verwendet ein Morpholin-Citrat Puffersystem (ADAMS et al. 1990), die zweitgenannte Gruppe benutzt ein Tris-Citrat Puffersy-stem (EL-KASSABY et al. 1982). Das in der vorliegenden Arbeit verwendete Tris-Citrat Puffersystem unterscheidet sich hinsichtlich des gewählten pH-Bereiches sowie der molaren Konzentration von der bei EL-KASSABY und Kollegen genannten Rezeptur (ibid. 1982) und gestattet eine weite Auftrennung der Allozyme. Die Vergleichbarkeit der Zymogramme wurde daher in gesonderten Experimenten überprüft.
92 Hinweis auf funktionell dimere Struktur, vgl. Kap. 2.3.2.
Er M Er M...
Abb. 5-22: 6-PGDH-Zymogramm (Provenienz S25, Lauf 09.8.90) aus Makrogametophyten (M) und Embryogewebe (Er);
Trennung : Puffersystem C (Tris-Citrat).
Kn02 Er M21 Kn21 Er M02..
Abb. 5-23: 6-PGDH-Zymogramm (Population B06, Lauf 29.4.91) aus Makrogametophyten- (M), Embryo- (Er) und webe;
Trennung : Puffersystem C (Tris-Citrat).
Tab. 5-10: Die Isoenzyme des Systems 6-PGDH
4. Tris-Citro.-Puffersyst. (C), vgl. Tab. 3-5* Häufigstes Allozym (Allel)
fett gedruckte Zahlen verweisen auf direkte Vergleiche
Literatur:
(1) EL-KASSABY et al. 1982 (2) ADAMS et al. 1990
Die Abbildungen 5-24 und 5-25 zeigen ein Beispiel aus der Serie der Vergleichsanalysen. Untersucht werden insgesamt 15 Samenkörner aus ein und derselben Präparation, jeweils aufgetragen in der Rei-henfolge: Embryo / Makrogametophyt (v.l.n.r.). Die ersten 12 Gewebepaarungen stammen aus der Pro-be S26 und die letzten drei aus S27. Das Ergebnis ist verblüffend: während die Auftrennung mittels des Tris-Citrat-Pufersystemes (TC) zwei Allozyme nachweist , finden sich in dem mittels Morpholin-Citrat (MC) hergestellten Zymogramm deren drei!! Die drei Gewebepaarungen aus S27, einer Küstenpopulati-on, repräsentieren das Allel 6-PGDH-A4 (rm= 100). Ihre Position bleibt bei der Auftrennung mittels Morpholin-Citrat unverändert, während fast alle der vermuteten 6-PGDH-A4 Allele aus der TC-Auftrennung nun als 6-PGDH-A2 erscheinen. Die Paare 1, 4, 9 und 10 zeigen nun Allelkombinationen unter Beteiligung von 6-PGDH-A2, wovon bei zweien ein mischerbiger Embryo in der TC-Auftrennung nicht erkennbar war. Die Zahl der heterozygoten Embryonen erhöht sich dadurch übrigens um 40% (!) in diesem Zymogramm.
Die weiteren Analysen ergaben, daß von dieser methodenspezifischen Ausprägung der Zymogramme hauptsächlich die „schnellen“ Elektromorphen 6-PGDH-A1, A2 sowie die häufigste Variante A4 be-troffen sind. An dieser Stelle kann außerdem bereits darauf verwiesen werden, daß der Unterschied po-pulationsspezifisch ist und nur Inlandsprovenienzen betrifft, sowohl aus dem nördlichen als auch südli-chen Teilareal. Weist eine TC-Auftrennung für Inlandsprovenienzen auf die Trägeschaft des Allels A4, so kann die MC-Auftrennung in einer tatsächlichen Trägerschaft des Alleles A2 resultieren und zwar reinerbig oder mischerbig mit A4! Weist eine TC-Auftrennung für Inlandsprovenienzen auf die Träge-schaft des Allels A2, so wird die MC-Auftrennung in einer tatsächlichen TrägerTräge-schaft des Alleles A1 resultieren und zwar in der nämlichen Besetzung des betreffenden Locus! Träger des Alleles A3 konnten in den vergleichenden Experimenten nicht berücksichtigt werden. Daraus folgt im wesentlichen, daß eine TC-Auftrennung die Gegenwart des Alleles A4 bei Inlandspopulationen überschätzt, diejenige des Alle-les A2 unterschätzt. Der Anteil der Heterozygoten wird bei Inlandspopulationen ebenfalls durch eine TC-Auftrennung unterschätzt. Die Existenz der betroffenen Allele A2 und A4 wurde mittels
Er M ...