S2*2 Für die Douglasie gilt
III. Bestände von Alt-Douglasien aus dem badischen Raum
Code Forstamt Bezeichnung Lage Höhe Pflanzen-
Proben-alter7 größe4
Waldbesitzer8 Waldort Ö.L. N.Br.
Distr. Abt. [o, '] [o,'] [m ü.N.N.] [Jahre] [Anzahl]
B01 Müllheim Sulzburg I 24 07 45 47 50 730-780 83 30
B02 Kandern Kandern I 03 07 39 47 44 30
B03 Staufen Münstertal X 01 07 49 47 52 770-800 75-85 30+20
B04 Freiburg Freiburg I 03 07 52 47 59 430-470 80-100 31
B05 Freiburg Freiburg V 15 07 54 48 00 310-350 70-100 30
B06 Heidelberg Heidelberg I 25 08 43 49 24 270-330 90-100 30
B07 Müllheim Britzingen XVIII 09 07 41 47 49 520 70-100 30
Anmerkungen zu den Tabellen 3-1 bis 3-3 (Fortsetzung):
5. - Die Saatgutproben stammen aus: TZ - einem Teilgebiet einer Zone mZ - zwei Zonen mTZ - mehreren Teilgebieten einer. Zone G - einem Gebiet Z - einer "seed zone"
6. - Anbauorte : A - Rastatt; B - Steinheim; C - Freiburg.
7. - Alter der Pflanzen zum Zeitpunkt der Knospenernte 1990.
8. - Stadt bzw. Gemeinde
konnten, war bei den über 70jährigen Douglasienbeständen der Einsatz von Schrotflinten60 erneut not-wendig. Die Zweige wurden in Plastikbeuteln verpackt transportiert und in einem Kühlraum bei -4 oC maximal 24 h zwischengelagert. Anschließend wurden kleine, mit Knospen besetzte Stücke der Zweige nach Erntebäumen getrennt in flüssigem Stickstoff (-196 oC) über 24 - 48 Stunden schockge-frostet. Die weitere Lagerung erfolgte in Gefriertruhen herkömmlicher Bauart bei -24oC.
Einzelstammnachkommenschaften wurden am 8. September 1990 von acht Bäumen des Bestandes
"Heidelberg I.25" genommen (Tab. 3-4). Hierzu wurden zwischen 4 und 10 Zapfen von jedem Baum geschossen und anschließend bei Zimmertemperatur getrocknet. Das auf diese Weise geklengte Saatgut wurde bei -24 oC bis zur Analyse eingelagert. Für die vorliegende Untersuchung fand das Saatgut von fünf Bäumen Berücksichtigung, um die Zymogramme von Embryo, Makrogametophyt und Apicalmeri-stem vergleichen zu können bzw. um in Einzelfällen Isozym-Phänotypen auf ihre Eigenschaft als Gen-marker zu prüfen (vgl. Kap. 4.1). Wie die nebenstehende Tabelle 3-4 zeigt, waren beachtliche Hohl-kornanteile mit durchschnittlich 62% sowie Schäden durch Insekten (durschnittlich 14 %) und Pilze (durchschnittlich 1%) zu registrieren. Lediglich zwischen 0% und 33% - im Mittel 23% - des Saatgutes waren keimfähig.
Abb. 3-3: Formen der Endknospe bei der Douglasie, schematisch.
Die Beurteilung der Knospenmorphologie wurde während der Präparation zur Tiefgefrierlagerung vor-genommen. Gestalt und Oberfläche der Endknospen von Zweigen erster bzw. zweiter Ordnung wurde an Hand typisierter Charakteristika festgehalten. Die Form wurde hierbei vier Typen zugeordnet, wie sie in Abbildung 3-3 dargestellt sind. Zur Auswertung wurden die beiden Formtypen gedrungen-eiförmig und gedrungen-kegelförmig zu einem Haupttyp „gedrungen“ zusammengefaßt, so daß in weiterer Folge drei Haupttypen unterschieden werden. Bei den Farbtypen wurden vier Dunkelstufen61 des Farbtones Braun unterschieden, Farbtafeln standen nicht zur Verfügung. Tabelle A.II-1 im Anhang der vorliegenden Arbeit zeigt am Beispiel des Bestandes B04 (Stadtwald Freiburg I, 03) den Aufbau des entsprechenden Datenblattes.
60 Kaliber 12, Schrotstärken: 3,5 und 4,0 mm (Fabrikat Rottweil Jagd).
61Zu den Begriffen vgl. Dt. Normenausschuß Farbe 1980
Tab. 3-4: Einzelbaumnachkommenschaften aus dem Bestand Nr. B06 (Heidelberg I.25), gewonnen im Herbst 1990.
Baum-Nr. Zapfen Samen-Ausbeute
Samen (analysiert)
[Zahl] [Zahl]
voll
[Zahl] [%]hohl
[Zahl] [%]Insekten
[Zahl] [%]Pilze
[Zahl] [%]∑
∑
[Zahl]
2 6 165 35 33 47 44 21 20 3 3 106 6 4 57 3 5 48 84 6 11 - 57 19 5 15 1 7 9 60 4 26 1 7 15
19a 1 10 - 10 100 - - 10
19b 7 14 1 7 10 71 3 21 - 14
21 6 43 13 30 19 44 11 26 - 43
24 6 280 42 27 106 67 10 6 - 158
∩
∩ 5 83,4 13,4 25 35,6 60 7,9 14 0,6 1 57,5
∑
∑
35 584 94 23 249 62 55 14 4 1 403
3.1.2. Stichprobengröße
Um eine Vergleichbarkeit der eigenen Ergebnisse mit denen von LI (1986) bezüglich der Erfassungs-wahrscheinlichkeit allelischer Strukturen zu gewährleisten, wurden bei Saatgutproben je 45 Korn unter-sucht. Bei den Knospenproben gelangten je 30 Individuen zur Analyse. Davon abweichend konnte für die Provenienz K09 nur noch 27 Individuen in den Versuchsfeldern von Steinheim gefunden werden, während die Provenienzen K07, K10 und K11 (Tab. 3-2) sowie der Bestand B03 (Tab. 3-3) in den vor-liegenden Stichproben durch eine leicht höhere Individuenzahl repräsentiert sind.
In der Literatur findet sich eine Reihe von Arbeiten, welche sich mit der Aussagekraft von Stichproben bei Isoenzymanalysen beschäftigen. GREGORIUS (1980), beispielsweise, stellte statistische Berech-nungen über die Wahrscheinlichkeit an, mindestens ein Allel in einer Stichprobe nicht zu finden, das in einer bestimmten Häufigkeitsgruppe einer unendlichen Population vertreten ist. EL-KASSABY (1983) führte Simulationen von Stichproben in einer endlichen Population am Beispiel eines 42jährigen Douglasienbestandes aus British Columbia durch.
Wie GREGORIUS (1980, S. 649) ausgeführt hat, beträgt bei einer Stichprobengröße von 39 Individuen die Irrtumswahrscheinlichkeit, das Vorkommen seltener Allele, d.h. solcher mit einer durchschnittlichen Häufigkeit von α≥0.2, richtig einzuschätzen, lediglich σ = 0.001. Allele mit einer durchschnittlichen Häufigkeit von α≥0.1 würden in ihrem Anteil an der jeweiligen Population nur bei einer Stichproben-größe von 51 Korn mit der Wahrscheinlichkeit von P = 0.95 verläßlich erfaßt werden (ibid.). Demge-genüber folgt aus den Simulationsläufen von EL-KASSABY & SZIKLAI (1983), daß der Anteil sehr seltener Allele (Häufigkeit α≤ 0.05) mit einer Wahrscheinlichkeit von 95% richtig bestimmt wird, wenn die Stichprobengröße mindestens 30 Individuen beträgt. EL-KASSABY & SZIKLAI fordern weiter eine Stichprobengröße von 35 bzw. 42 Bäumen, wenn der Anteil an allelischen Strukturen bestimmt werden soll bei a) seltenen Allelen (Häufigkeit 0.1 ≥α≤ 0.2) bzw. bei b) häufigen Allelen (Häufigkeit α∼∼ 0.5).
Allerdings unterliegen die beobachteten Anteilswerte allelischer Strukturen bereits ab einer Stichproben-größe von 30 Individuen deutlich geringeren Streuungen in den genannten Simulationsmodellen (ibid., S.351 ff.).
Die eingangs genannten und hier verwendeten Stichprobengrößen lassen somit eine Schätzung der alleli-schen Strukturen im vergleichbaren Bereich einer Irrtumswahrscheinlichkeit von σ~ 0.05 sowohl für die Saatgutproben (unendliche Population) als auch die „endlichen“ Populationen der in Baden-Württemberg wachsenden Douglasien zu. Aussagen über allelische Strukturen bewegen sich dadurch im vergleichbaren Wahrscheinlichkeitsbereich, wie in anderen Arbeiten (z.B. CHELIAK et. al. 1988, FADY
& CONKLE 1993, KONNERT 1992).
3.1.3. Zusätzliches Daten-Material
Neben den Daten, die aus eigenem Material gewonnen wurden, standen für die Modellentwicklung die allelischen Strukturen von 104 Provenienzen aus dem gesamten Verbreitungsgebiet der Douglasie zur Verfügung. Dieses Datenmaterial, von den Herrn P. LI und Prof. Adams (Corvallis, USA) freundli-cherweise zur Verfügung gestellt, wurde bereits an anderer Stelle beschrieben (LI 1986, LI & ADAMS
1989), so daß hier auf eine Auflistung der Stichproben verzichtet wird. Im Anhang "A.I" zu der vorlie-genden Arbeit ist jedoch die Übersichtskarte aus der Veröffentlichung von LI & ADAMS 1989 noch-mals wiedergegeben (Abb. A.I-1). In der genannten Arbeit wurde die Makrogametophyten von
durch-schnittlich 42 Samen pro Sammel-Stichprobe (74 Provenienzen) analysiert. Makrogametophyt und Em-bryo von durchschnittlich 40 Samen wurden bei Proben von geringer (x ≤ 15) oder unbekannter Zahl von Mutterbäumen untersucht (17 Provenienzen). Sofern die Proben über Samen einzelner Bäume re-präsentiert waren (13 Provenienzen), gelangten je zwei Makrogametophyten pro Baum zur Analyse (LI
& ADAMS 1989).
3.2. Methoden
3.2.1. Biochemische Methoden
Um die verschiedenen Enzymsysteme von Pseudotsuga menziesii darzustellen, wurde die Methode der Stärke-Gel-Elektrophorese gewählt. Hierbei werden in einem elektrischen Feld die Proteingemische eines Gewebehomogenats aufgetrennt. Dieser Trennvorgang beruht auf den unterschiedlichen Wander-geschwindigkeiten der Proteine im elektrischen Feld, welche auf die einzelnen Nettoladungen zurückzu-führen sind. Bei der Stärke-Gel-Elektrophorese wird zusätzlich ein Molekularsiebeffekt des Laufmedi-ums ausgenutzt. Durch enzymspezifische, histochemische Färbevorgänge werden anschließend die nach Größe und Ladung "sortierten" Proteinformen sichtbar gemacht. Ein solches "Flecken- (Banden-) Mu-ster" von Isoenzymen auf dem Laufmedium bezeichnet man als Zymogramm. (vgl. HATTEMER et al.
1993, S. 35 ff.)
Drei Gewebetypen wurden zu den Untersuchungen herangezogen: Makrogamtophyt, Embryo sowie das Apicalmeristem aus Knospen.
Eine aliquote Menge Saatgut wurde 30 h in Leitungswasser eingeweicht (OWSTON & STEIN 1974, S.
679) und anschließend auf feuchtem Filterpapier in Keimschalen ausgebreitet. Bei Zimmertemperatur gelagert, zeigten sich nach durchschnittlich 5 Tagen die Keimwurzeln in Längen von 3 bis 14 mm. Ma-krogametophyt und Embryo wurden herauspräpariert, mit 50 µl bzw. 25 µl eines Extraktionspuffers (s.
Tab. B3-5) versetzt und (separat) homogenisiert. Das Gewebehomogenat wurde auf Filterpapierplätt-chen aufgesaugt und anschließend paarweise nebeneinander, Embryo und Makrogametophyt aus dem entsprechenden Samenkorn, an der Startlinie im Stärkegel (Laufmedium) inseriert. Ungekeimtes Saatgut wurde für besondere Fragestellungen verwendet. Zur Analyse des Apicalmeristems wurden wahlweise 2-3 Triebknospen oder eine Blütenknospe (
` `
) zusammen mit dem Extraktionspuffer homogenisiert.Tab. 3-5: Verwendete Extraktionspuffer
Interne Gewebe Quelle Änderung
Bezeichn.
HP 01 Embryo, Makrogametophyt BERGMANNa) pH 7,5
HP 15 Apicalmeristem CHELIAK & PITEL 1984a pH 7,5 a) mündl. Mitt.: 0,1M TrisHCl-Puffer (mit PVP u. EDTA)
Als Laufmedium für die angewandte Horizontal-Gel-Elektrophorese diente ein Stärkegel aus hydroly-sierter Kartoffelstärke (Biomol Nr. 07378) in einer Konzentration von 12% (w/v) bei den Trennpuffer-systemen A) und B) bzw. in einer Konzentration von 13% bei den übrigen PufferTrennpuffer-systemen. Somit sind diese Gele als kleinporig einzustufen (WILLIAMS & WILSON 1984), was einen hohen Molekularsie-beffekt zur Folge hat. Einen Überblick über eingesetzten Trennpuffersysteme sowie die jeweiligen phy-sikalische Laufbedingungen gibt die nebenstehende Tabelle 3-6: