Trennpuffersysteme Quellen Gewebe physik. Bedingungen
3.2.2. Mathematisch-statistische Verfahren
Allgemeine statistische Analysen der Datensätze erfolgten mit den Programmen "SPSS 6.1" (Institut für Waldbau, Wien) und "SAS 6.0" (Universität Karlsruhe). Für spezielle statistische Auswertungen der Genetik wurden die Programme GSED, Vers. 1.1 (GILLET 1994), sowie POPGEN, Vers. 1.21 (YEH et al. 1997), verwendet. Eine Übersicht über die eingesetzten Verfahren der einzelnen Programme gibt die Tabelle 3-8. Die zu der vorliegenden Arbeit herangezogenen genetischen Parameter wurden eingangs (Kap. 2.1.3.) besprochen, so daß nachfolgende Ausführungen auf mathematische Aspekte beschränkt bleiben.
Der Vergleich empirisch ermittelter Häufigkeiten mit einer vermuteten Verteilung wurde mit dem Chi2-Anpassungstest geprüft. Dieser setzt lediglich nominalskalierte Daten voraus und ist somit für geneti-sche Merkmale anwendbar (KÖHLER et al. 1992). In Kapitel 5.1.5 wurde die Übereinstimmung der
beobachteten Segregation vermuteter Allele eines Genlocus mit der hypothetischen Mendel-Segregation62 (=Nullhypothese) auf einem Signifikanzniveau von P= 0,99 getestet.
Der Rang-Korrelationskoeffizient (rs) von Spearman prüft den Grad des stochastischen Zusammen-hangs zwischen zwei Variablen (SACHS 1992, WEBER 1978). Als nicht parametrischer Test setzt er eine zumindest ordinale Skalierung des Datenmaterials voraus, welches beliebig stetig verteilt sein kann. In der vorliegenden Arbeit wurde rs zur Bestimmung der Korrelation zwischen der Aktivität einzelner Iso-zym-Zonen des Enzymsystemes GOT und einem Parameter für den Entwicklungszustand des Keimlings verwendet (vgl. Kap. 5.1.1.). Geprüft wurde die Nullhypothese (H0), daß keine positive bzw. negative Korrelation, sondern Unabhängigkeit besteht (einseitige Fragestellung).
Die Prüfung paarig angeordneter (d.h. abhängiger) Beobachtungen auf Zugehörigkeit zu einer Grundge-samtheit wurde mit dem Wilcoxon-Test für Paardifferenzen vorgenommen. Er verlangt zwar keine normalverteilten Differenzen, testet jedoch solche fast ebenso scharf wie der t-Test (SACHS 1992, S.
410). Zur Klärung der Unabhängigkeit von Aktivitäten verschiedener Teilzonen im Zymogramm von GOT-C in Kap. 5.1.1. ff. wurde der Wilcoxon-Test herangezogen, da die entsprechenden Messungen stets an ein und derselben Gewebeprobe vorgenommen wurden. Geprüft wurde die Nullhypothese (H0), daß sich die mittleren Rangwerte der beiden Verteilungen nicht unterscheiden (zweiseitige Fragestel-lung).
Tab. 3-8: Verwendete Programme zur statistischen Datenauswertung
Fragestellung Kapitel Programm Operationen
Normalverteilung 4.3. SPSS Komolgorov-Smirnov
Enzymaktivität / Entw.,
Zusammenhänge 4.3. / 5.1.1. SPSS rs
Enzymaktivität / Entw. 5.1.1. SPSS Wilcoxon-Test f. Paardiff.
Referenzstrukturen 5.3. SPSS U-Test (Mann Whitney)
Mendel-Segregation 5.1.3. SPSS X2
Datenverdichtung 4.3. SPSS Faktorenanalyse: Varimax
Abstammungsrekonstr. 4.3. /5.4. SPSS Clusteranalyse (hierar.): euklid.Distanz.
d, νν, δδ, H
5.2. GSED G, X2, genet. Parameter (vgl. Kap. 2.1.3.) (Göttinger Schule: z.B. GILLET 1994, GREGORIUS & ROBERDS 1986)Homogenitätstests wurden zur Prüfung von Allelverteilungen herangezogen. Der G-Test nimmt das Verhältns zweier Wahrscheinlichkeiten zur Prüfung der Anpassung zwischen beobachteter und
62 vgl. Kap. 2.1.2.
teter Häufigkeit (WEBER 1976). Die Nullhypothese lautet folglich: die vorgefundene Allelverteilung zweier zu vergleichenden Populationen sind homogen. Der G-Test ist besonders bei kleinen Stichpro-bengrößen dem X2 Test vorzuziehen, da seine Prüfgröße in solchen Datenbereichen die bessere Anpas-sung an die X2 Verteilung besitzt.
Zum Vergleich der Mittelwerte der Häufigkeiten von Allelen in den Referenzstrukturen wurde ein nicht parametrischer Test, der U-Test nach Mann Whitney gewählt. Er gehört zu den Rangsummentests und sollte nicht bei zu kleinen Stichprobenzahlen Anwendung finden (KÖHLER et al. 1992).
Zur Bestimmung der Form der Verteilung des Datenmaterials wurde der Komolgorov-Smirnov-Test eingesetzt. Dieser setzt zwar strenggenommen eine stetige Verteilung voraus, kann aber bei diskreten Verteilungen Anwendung finden. Er wird daher zu den nicht-parametrischen Tests gezählt (BÜHL &
ZÖFEL 1996). Abweichungen von der Normalverteilung werden auch bei kleinen Stichprobenumfängen nachgewiesen (SACHS 1992).
Um eine größere Anzahl von z.T. abhängigen Merkmalen auf wenige, unabhängige Einflußgrößen (Faktoren) zu reduzieren, wird die Faktorenanalyse eingesetzt. Die herausgearbeiteten, möglichst ein-fachen Faktoren sollen die beobachteten Zusammenhänge weitgehend vollständig erklären und gut inter-pretierbar sein (HARTUNG & ELPELT 1989). In verschiedenen Arbeitsschritten werden die Daten trans-formiert, Korrelationskoeffizienten errechnet und damit Matrizen aufgestellt. Als Ergebnis stehen „Ei-genwerte“ von Faktoren fest, die durch „Eigenvektoren“ näher bestimmt sind. Elemente der Eigenvekto-ren sind die Faktorladungen, welche als Korrelationskoeffizienten zwischen den FaktoEigenvekto-ren und den be-treffenden Variablen verstanden werden können (BÜHL & ZÖFEL 1996). Es werden üblicherweise so-viele Faktoren extrahiert, wie Eigenwerte mit einem Wert größer 1 vorliegen. Im Falle der Operationen zur Abstammungsrekonstruktion mittels morphologischer Merkmale der Knospen (Kap. 4.3.) wurden stets soviele Faktoren extrahiert, daß damit kumulativ 100% der vorliegenden Varianzen erklärt werden konnten. Die Eigenwerte der zusätzlichen Faktoren lagen stets nahe 1, in einem Fall (Gesamter Daten-satz) bei 0,55. Die Faktoren wurden mit dem Verfahren der Hauptkomponentenanalyse unter Einsatz der Varimax-Methode erzeugt. Letztere ist eine Methode zur orthogonalen Rotation von Faktoren, die iterativ erfolgt (HARTUNG & ELPELT 1989). Bei den Operationen zu Kapitel 4.3. wurden jeweils 5 bzw.
6 Iterationen benötigt. Die resultierenden Faktoren der rotierten Faktor-Matrix wurden bei der Interpre-tation mit Bezeichnungen versehen und finden im jeweiligen Kapitel eine gesonderte Darstellung.
Die Clusteranalyse ist ein Instrument, um anhand vorgegebener Variablen eine Menge von Objekten zu strukturieren. Dabei sollen die gebildeten Klassen in sich homogen sein und sich von den anderen Klas-sen deutlich unterscheiden (Heterogentiät zwischen den KlasKlas-sen: HARTUNG & ELPELT 1989). Im Falle der Abstammungsrekonstruktion mittels morphologischer Merkmale (Kap. 4.3.) wurden als Eingangs-größen die transformierten Variablen der jeweils vorgelagerten Faktorenanalyse gewählt. Als Ähnlich-keitsmaß wurde der quadrierte Euklidische Abstand63 zwischen den Faktoren verwendet, das Fusionie-rungsverfahren erfolgte hierarchisch (BÜHL & ZÖFEL 1996). Die Ergebnisse der Clusteranalyse wurden als Dendrogramme dargestellt.
3.2.3. Dokumentation
Während die untersuchten Saatgutproben durch den Herkunftsschlüssel und die untersuchten Ver-suchspflanzen durch die Unterlagen der Provenienzversuche hinreichend charakterisiert sind, war es für
63Der Euklidische Raum ist ein n-dimensionaler, strukturierter Vektorraum (BRONSTEIN & SEMENDEJAJEV 1989).
Der n-dimensionale Charakter der künstlichen Variablen aus der Faktorenanalyse wird optimal ausgenützt.
die untersuchten Douglasien-Altbestände erforderlich, die Lage der beernteten Bäume auf Grobskizzen festzuhalten. Anhang A.I-2a zeigt eine solche Grobskizze zusammen mit Lage-Skizzen A.I-2b)-c) am Beispiel des Bestandes B03 ("Münstertal X.1"). Darüberhinaus erfolgte eine Numerierung mit gelber Farbe an den entsprechenden Bäumen. Die Nummern wurden in Brusthöhe auf der leicht entschuppten Borke so angebracht, daß sie von den Wegen nicht einsehbar sind, um die Waldbesucher nicht unnötig zu verunsichern.
Alle Endergebnisse (Zymogramme) wurden in Zeichenprotokollen festgehalten. Diese Zeichenprotokolle enthalten auch Angaben über die Wanderstrecke (in mm) von Banden und einem Frontmarker (Brom-Phenol-Blue, SERVA-Nr. 15375) sowie die daraus berechneten "rm"- und "rf"- Werte. Die letztge-nannten dienen zum Wiedererkennen von Banden unter gleichen oder veränderten physikochemischen Laborbedingungen. Beide Werte stellen Dezimalwerte dar, welche als Quotienten aus der Wanderstrek-ke einer fraglichen Bande und der WanderstrecWanderstrek-ke - entweder der häufigsten Bande eines Genlocus (→
rm
) oder des Frontmarkers (→rf
) - als Bezugs-Standard gebildet werden. Allerdings führt diese Stan-dardisierung keineswegs zu allgemeingültigen Werten, vielmehr handelt es sich um verfahrensspezifi-sche Charakteristika, die von Methode zu Methode schwanken können (vgl. Kap. 5.1. sowie CHELIAK &PITEL 1984a, S. 15 ff.).
Bei der Nomenklatur der einzelnen Isoenzyme wird üblicherweise für die "schnellsten" (anodischen) Markerloci die kleinste (arabische) Nummer vergeben, desgleichen gilt für die schnellsten Allozyme64 eines Markergenlocus. Die Nummer des Markergenlocus erscheint direkt hinter dem Kürzel für das Enzymsystem, die Nummer des Allozyms wird mit einem Bindestrich daran angehängt. Alternativ zu der Nummer der Allozyme wird deren "rm"-Wert angehängt. Unter Botanikern ist zunehmend die hoch-gestellte Schreibweise der "rm"-Werte, direkt hinter den Nummern der Loci zu registrieren (vgl. WERTH
et al. 1993). In Europa hingegen werden große lateinische Buchstaben zur Bezeichnung der Marker-genloci verwendet, die durch Bindestrich mit dem Kürzel für das Enzymsystem verbunden werden. Der Buchstabe "A" wird hierbei analog dem "schnellsten" Locus zugeordnet (ROTHE 1994). Die Nummern der Allozyme können direkt an die Buchstaben der Loci angehängt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde die europäische Schreibweise verwendet; Zymogramm-Teilzonen ein und desselben Mendelgen-Locus wurden mit hochgestellten römischen Zahlen bezeichnet.
Neben zeichnerischen Protokollen wurde eine Auswahl an Zymogrammen zusätzlich photographisch oder densitometrisch dokumentiert. Außerdem wurde eine Anzahl der Gele auf Filterpapier (Schleicher
& Schüll Nr. 2208; Ref.Nr. 342494) im Trockenschrank bei +37 oC (Umluft) getrocknet und mit Klar-sichtfolie eingebunden.
Die fotografischen Aufnahmen erfolgten mit einer Kamera vom Typ "LEICA-Flex SL", ausgestattet mit einem Objektiv "Makro-Elmarit-R" (60 mm), im Gegenlicht eines DIA-Betrachtungstisches, dessen Lichtquelle zwei 8 Watt Neonröhren bildeten. Als Filmmaterial wurde "FUJI Chrome (100 iso)" einge-setzt.
64 Zu beachten ist beim Literaturvergleich, daß in älteren Arbeiten oft die kleinste Nummer für die "langsamsten" (kathodi-schen) Allozyme eingesetzt wurden (vgl. HATTEMER et al. 1993, S. 96). Bei der Douglasien-Literatur gilt diese Fest-stellung für Arbeiten, die vor 1980 erschienen sind.
Für die Densitometrie65 stand ein Helium/Laser-Densitometer66 vom Typ "2222-020 UltroScan XL" der Firma Pharmacia LKB (Freiburg) mit passender Hard- und Software67 zur Verfügung. Der Laser-Densitometer besitzt ein Auflösevermögen von 40 µm sowie eine Fokusiertiefe bis zu 3 mm. Er konnte daher zum Vermessen der Wanderstrecken einzelner Banden ebenso wie zur Aktivitätsmessung der Iso-zym-Markerloci herangezogen werden, obwohl es sich um feuchte Stärkegel-Zymogramme mit einer Dicke von bis zu 2mm handelte (vgl. WESTERMEIER et al. 1988). In Einzelfällen wurde das hohe Auflö-severmögen des Densitometers zur Identifikation von Banden-Tripletts heterozygoter Merkmalsträger verwendet.
65 Bei der Densitometrie werden Lage und Extinktionswerte (Lichtabsorption) einer definierten Lichtquelle an verschiede-nen Punkten entlang einer Laufstrecke gemessen. Das Ergebnis ist ein Kurvendiagramm (Densitogramm).
66 Wellenlänge = 632,5 nm
67 Programm: GelScanXL Pharmacia LKB.