Proteinanalytische Methoden

Um zu untersuchen, ob M. bovis mit dem IFN-γ−Signaltransduktionsweg interferiert, wurden die Aktivierung von STAT1 (signaltransducer of activation and transcription 1) und PKC-α (Proteinkinase C-α) mittels Western-Blot analysiert. Dazu wurden bovine CD14-positive Monozyten wie unter 3.2.2.1 beschrieben aus dem Blut von Rindern isoliert und 2 x 10⁶ Zellen/Well in einer 6-Well-Zellkulturplatte (9.2.2) eingesät. Diese wurden über 48 Stdn. unter dem Einfluss von boGM-CSF (20 ng/ml) in An- oder Abwesenheit von M. bovis (MOI 10) in R10F-Medium im Brutschrank inkubiert.

3.8.1 Zellstimulation

Da das im R10F-Medium enthaltene fetale Kälberserum verschiedene Proteine wie Wachstumsfaktoren und Hormone enthält, deren Zusammensetzung variabel ist, wurden die Zellen einmal mit 2 ml serumfreien RPMI-Medium gewaschen, bevor sie über 4 Stdn. mit 3 ml serumfreien RPMI-Medium inkubiert wurden. Zur Stimulation wurden die Zellen für 15 Min. mit 20 ng/ml boIFN-γ oder 12 μl PBS im Brutschrank inkubiert. Nach der Stimulation wurde das Medium entfernt, die Zellen auf Eis gelegt, einmal mit 500 μl, 4 °C kaltem PBS gespült und im direkten Anschluss mit der Proteinextraktion (3.8.2) begonnen.

3.8.2 Proteinextraktion

Um das Protein aus den stimulierten Zellen zu extrahieren, wurden die Kulturen mit 70 μl Boehringer-Lysepuffer (9.2.6.4), welcher einen Firmen-spezifischen Phosphataseinhibitor-Mix (9.2.3) (finale Verdünnung: 1:100) enthielt, über 5 Min. inkubiert, mit einem Zellschaber abgelöst, in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß überführt und zentrifugiert (5 Min., 20 000 x g, 4 °C). Die Proteinmenge wurde mit dem DC Protein Assay (Bio-Rad, 9.2.3) bestimmt. Dazu wurden 20 μl der A´ Lösung (1000 μl Lösung A + 25 μl Lösung S) in einer 96-Well-Flachbodenplatte vorgelegt, bevor jeweils 2 μl der Proben oder zur

54

vergleichenden Betrachtung einer BSA-Standardkurve, 0, 1, 2, 3 und 4 μl einer BSA-Lösung (2 mg/ml) hinzupipettiert wurden. Anschließend wurden die Wells mit 200 μl Lösung B versetzt und über 5 Min. im Dunkeln gelagert. Die Absorption wurde mit einem Mikrotiterplatten-Filterphotometer gemessen und die Proteinmenge mithilfe der BSA-Standardkurve in einer Excel-Tabelle ermittelt. Die Proteinlysate wurden nun auf je 8 μg Protein pro 20 μl eingestellt. Dazu wurden die Proben mit jeweils 4 μl Laemmli-Puffer (4 x) (9.2.6.4), welcher beta-Mercaptoethanol und SDS (9.2.3) enthielt, versetzt und das Volumen mit Boehringer-Lysepuffer (9.2.6.4) auf 20 μl aufgefüllt. Die Proteine wurden nun über 5 Min. bei 95 °C in einem Blockthermostat (9.2.2) denaturiert und bei -20 °C gelagert.

3.8.3 SDS-Gelelektrophorese

Bei der SDS-Gelelektrophorese werden Proteine ihrem Molekulargewicht entsprechend aufgetrennt. Die während der Proteinextraktion erfolgte Denaturierung sorgt gemeinsam mit dem SDS, welches sich in einem bekannten Maße an die Proteine anlagert und so deren negative Ladung überdeckt, zur Auflösung der Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur. Die auf diese Weise linearisierten Proteine können nun in einem diskontinuierlichen Gel durch Anlegen einer Spannung entsprechend ihrer Größe aufgetrennt werden.

Zunächst wurde ein diskontinuierliches Gel, bestehend aus Sammel- und Trenngel gegossen.

Für die in dieser Arbeit detektierten Proteine wurde eine Acrylamidkonzentration von 12 % und eine Geldicke von 1,5 mm gewählt. Um das Gel nach unten hin abzudichten, wurde am unteren Rand des Trenngels ein Stopfgel (9.2.6.4) gegossen. Dann wurde die Gel-Gießapparatur einmal zu jeder Seite geschwenkt, um das Gel auch seitlich abzudichten. Nach dem Gießen des Trenngels (9.2.6.4) wurden Luftblasen durch Zugabe von 500 μl Isopropanol (9.2.3) entfernt.

Nach 13 Min. wurde das Isopropanol unter Zuhilfenahme eines Filters wieder entfernt. Danach wurde das Sammelgel (9.2.6.4) gegossen und ein 1,5 mm Kamm eingesetzt. Nachdem die Gele ausgehärtet waren, wurden sie in die Elektrophorese Apparatur von Bio-Rad (9.1) eingespannt und die Kammer mit 1 Liter (l) SDS-Laufpuffer (9.2.6.4) gefüllt. Dann wurden die Taschen zweimal mit 1 ml SDS-Laufpuffer gespült um Gelreste zu entfernen. Vor dem Auftragen der Proben wurden diese 2 bis 3 Min. bei 95 °C erhitzt und bei 17 000 x g für 10 Sek. zentrifugiert.

Pro Tasche wurden 20 μl der Proben oder 6 μl eines Proteinmarkers (9.2.3) aufgetragen.

Zunächst erfolgte das Einlaufen der Proben über 15 Min. bei 100 V. Dieser Schritt dient zur

55

Schaffung einer gleichmäßigen Lauffront der Proben. Dann traten die Proben in das Trenngel ein und wurden über 75 Min. ihrer Größe nach elektrophoretisch aufgetrennt.

3.8.4 Western-Blot

Durch Anlegen einer Spannung wurden die im Gel aufgetrennten Proteine mittels Tank-Blot-Verfahren (Wet-Blot) auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Dazu wurde das Gel aus der Elektrophoreseapparatur gewonnen, das Sammelgel abgetrennt und das Gel in Blot-Puffer (9.2.6.4) gebracht. Außerdem wurden zwei Schwämme, zwei Filter (1,0 mm), drei Filter (0,36 mm) und die Nitrozellulosemembran (0,45 mm, 9.2.2) in Blot-Puffer eingelegt. Diese wurden nach dem Sandwich-Verfahren in die Western-Blot Apparatur (Bio-Rad, 9.1) eingebracht: Auf das helle Kunststoffgitter (zeigt später zur roten Seite der Blot-Kassette, positiver Pol) wurden ein Schwamm, ein 1 mm Filter und ein 0,36 mm Filter aufgelegt.

Eventuelle Luftblasen wurden durch einmaliges Rollen mit einer 10 ml Pipette entfernt. Darauf folgten die Nitrozellulosemembran, das Gel, zwei 0,36 mm Filter und ein 1 mm Filter. Nun wurden eventuelle Luftblasen erneut durch Rollen mit einer weitlumigen Pipette entfernt, der zweite Schwamm aufgelegt und die Kunststoffgitter geschlossen. Die Gitter wurden nun so in die Blot-Kassette eingebracht, dass auf der Seite der schwarzen Blot-Kassette (schwarzes Kunststoffgitter, negativer Pol) das Gel und auf der roten Seite der Blot-Kassette (helles Kunststoffgitter, positiver Pol) die Nitrozellulosemembran lag. Nun wurde der Tank vollständig mit Blot-Puffer gefüllt. Um eine Überhitzung zu vermeiden wurde dem Tank noch ein Eisblock und zur Durchmischung des Puffers ein Rührfisch (9.1) zugefügt. Die anschließende Übertragung der Proteine aus dem Gel auf die Nitrozellulosemembran erfolgte über 1 Std. bei 100 V.

3.8.5 Immunoblot

Bei der Immunodetektion nach einem Western-Blot werden die nachzuweisenden Proteine durch Chemilumineszenz sichtbar gemacht. Die geblotteten Proteine werden mit einem Primärantikörper markiert. In einem zweiten Schritt werden gebundene Primärantikörper mit einem Sekundärantikörper nachgewiesen, der mit dem Enzym Meerrettich-Peroxidase (HRP, horseradish peroxidase) gekoppelt ist. Die Enzym-katalysierte Umsetzung des hinzugefügten Substrates (Luminophor) führt zur Freisetzung von elektromagnetischer

56

Strahlung im Bereich des ultravioletten und sichtbaren Lichts (Chemilumineszenz). Diese wird in einer Chemilumineszenz-Detektionseinheit erfasst. Lumineszierende Proteinbanden lassen sich Software-gestützt, densitometrisch (semiquantitativ) auswerten.

Zunächst wurde die Nitrozellulosemembran zur Rehydratation in voll-entsalztes-Wasser (VE-Wasser) eingelegt. Um eine gleichmäßige Benetzung der Membran zu gewährleisten wurden alle folgenden Schritte auf einem Schüttler (9.1) durchgeführt. Um unspezifische Proteinbindungsstellen zu blockieren, wurde die Membran für 60 Min. in ein kommerziell erhältliches, gereinigtes Frischkäseschälchen oder in einer vier rechteckige Wells umfassenden Nunclon® Zellkulturplatte (9.2.2) in 5 % Magermilchlösung (9.2.6.4) gebracht. Anschließend erfolgte die Inkubation mit dem Primärantikörper (pSTAT1 1:3000 und pPKC-α 1:10 000) welcher in 5 % Magermilchlösung angesetzt wurde (18 Stdn., 4 °C, auf einem Schüttler).

Danach wurde die Membran dreimal für 5 Min. in TBS-T (9.2.6.4) gespült und für 45 Min. mit 15 ml (bzw. 2,5 ml Nunclon® Zellkulturplatte) des Sekundärantikörpers (anti-Rabbit-IgG, HRP-gekoppelt, 1:3000, in 5 % Magermilchlösung) inkubiert. Danach wurde die Membran erneut zweimal für 5 Min. in TBS-T und einmal für 5 Min. in TBS (9.2.6.4) gespült. Für die Visualisierung der an die Proteine gebundenen Antikörper wurde das Signal West Dura Kit (Thermo Fisher, 9.2.3) nach Herstellerangabe verwendet. Die Detektion erfolgte in einer Fusion SL Chemilumineszenz-Detektionseinheit mit der Fusion Software von Vilber Lourmat (9.1).

57

Tab. 3: Für die Proteindetektion verwendete Antikörper Antikörper Hersteller

Um eventuelle Variabilitäten der Proteinkonzentration, welche während der Proteinextraktion, der SDS-Gelelektrophorese oder dem Western-Blot entstanden sein könnten, ausgleichen zu können, wurden die Proteine auf der Membran nochmals mit einem Antikörper markiert, der ein konstant, nicht-reguliert exprimiertes, zelluläres Protein erkennt (Housekeeper, in dieser Arbeit β-Aktin). Dazu wurde die Membran nach der Detektion über 45 Min. in Stripping-Puffer (9.2.6.4) inkubiert um die Antikörper zu entfernen, zweimal über 10 Min. mit TBS, zweimal über 10 Min. mit TBS-T gewaschen und über 60 Min. in eine 5 % Magermilchlösung verbracht.

Anschließend erfolgte die Markierung mit dem HRP-gekoppelten anti-β-Aktin-Antikörper in 5 % Magermilchlösung (Verdünnung 1:10 000) bei 4 °C über 18 Stdn. auf einem Schüttler. Am nächsten Tag wurde die Membran zweimal für 5 Min. mit TBS-T und einmal über 5 Min. mit TBS gespült und erneut mit dem Signal West Dura Kit (Thermo Fisher) und in einer Fusion SL Chemilumineszenz-Detektionseinheit mit der Fusion Software von Vilber Lourmat detektiert.

58 3.8.6 Densitometrische Auswertung

Die detektierten Banden wurden mittels der VisionCapt Software von Vilber Lourmat semiquantitativ (9.1) ausgewertet. Dazu wurden die Bandenstärken (STAT1, PKC-α) in Bezug zu den β-Aktin-Bandenstärken gesetzt (Normierung).