Interaktion von Mycoplasma bovis mit bovinen Monozyten-Subpopulationen
INAUGURAL–DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)
vorgelegt von Maria Feierabend
aus Berlin
Hannover 2019
Univ. Prof. Dr. med. vet. M. Hewicker-Trautwein Institut für Pathologie, Arbeitsgruppe Immunpathologie
1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. med. vet. H.-J. Schuberth
Univ. Prof. Dr. med. vet. M. Hewicker-Trautwein 2. Gutachter: Univ. Prof. Dr. med. vet. R. Goethe
Tag der mündlichen Prüfung: 07.05.2019
Meiner Familie in Liebe gewidmet
2. Literaturübersicht ... 3
2.1 Mycoplasma bovis ... 3
2.2 Mycoplasma bovis-verursachte Erkrankungen ... 3
2.3 Pathogenitätsfaktoren von Mycoplasma bovis ... 6
2.4 Wirts-Determinanten der Pathogenität von Mycoplasma bovis ... 10
2.5 Modulation von Immunzellen durch Mycoplasma bovis ... 12
2.5.1 Modulation von Lymphozyten ... 12
2.5.2 Modulation von neutrophilen Granulozyten ... 13
2.5.1 Modulation von Monozyten und Makrophagen ... 14
2.5.2 Modulation von intrazellulären Signaltransduktionswegen durch Mykoplasmen ... 14
2.6 Monozytäre Subpopulationen bei Mensch und Rind ... 16
2.7 Chemokinrezeptoren von Monozyten ... 20
2.8 In-vitro-Differenzierung von Makrophagen aus Monozyten ... 24
2.9 Bovine Modellmakrophagen ... 28
3. Methoden ... 31
3.1 Mykoplasmen ... 31
3.2 Gewinnung von Leukozyten und leukozytären Subpopulationen aus dem peripheren Blut ... 31
3.2.1 Gewinnung und Separation von mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut ... 31
3.2.2 Separation monozytärer Subpopulationen aus dem peripheren Blut ... 32
3.3 Bestimmung von Zellzahl und Zellvitalität ... 36
3.4 In-vitro-Generierung von Makrophagen aus Blutmonozyten ... 37
3.4.1 Differenzierung von Makrophagen unter dem Einfluss der Wachstumsfaktoren GM-CSF und M-CSF ... 37
3.4.2 Differenzierung von Makrophagen unter dem Einfluss der Wachstumsfaktoren GM-CSF, M-CSF und Mycoplasma bovis ... 39
3.4.4 Differenzierung verschiedener Monozyten-Subpopulationen unter dem
Einfluss von M. bovis und IFN-γ ... 41
3.5 Durchflusszytometrie ... 41
3.5.1 Membranimmunfluoreszenz ... 42
3.5.2 Durchflusszytometrische Bestimmung der intrazellulären Kalzium Konzentration ... 44
3.5.3 Phagozytose Assay ... 48
3.5.4 Generierung reaktiver Sauerstoffspezies ... 48
3.6 Messung der Stickoxid-Produktion boviner Makrophagen ... 50
3.7 Kultivierung von BoMac-Zellen ... 51
3.7.1 In-vitro-Stimulation von BoMac-Zellen ... 51
3.7.2 Einfrieren und Auftauen der BoMac-Zelllinie ... 52
3.8 Proteinanalytische Methoden ... 53
3.8.1 Zellstimulation ... 53
3.8.2 Proteinextraktion ... 53
3.8.3 SDS-Gelelektrophorese ... 54
3.8.4 Western-Blot ... 55
3.8.5 Immunoblot ... 55
3.8.6 Densitometrische Auswertung ... 58
3.9 Statistische Auswertung ... 58
4. Ergebnisse ... 60
4.1 Kalziumeinstrom-vermittelte Aktivierung boviner Monozyten ... 60
4.1.1 Effekte der Chemokine boCCL5, boCCL4 und boCX3CL1auf die Kalziumeinstrom-vermittelte Aktivierung boviner Monozyten ... 60
4.1.2 Beeinflussung des boCCL5-induzierten Kalzium-Einstroms in bovine Monozyten-Subpopulationen durch M. bovis ... 64
4.2 Phänotypische und morphologische Eigenschaften von BoMac-Zellen ... 68
Zellen ... 68
4.2.2 Beeinflussung der morphologischen und phänotypischen Eigenschaften von BoMac-Zellen durch M. bovis ... 73
4.3 Eigenschaften von in vitro polarisierten Makrophagen und deren Beeinflussung durch M. bovis ... 75
4.3.1 Morphologische Eigenschaften in vitro polarisierter Makrophagen ... 75
4.3.2 Phänotypische Eigenschaften von in vitro polarisierten Makrophagen ... 81
4.3.3 Funktionelle Eigenschaften von in vitro polarisierten Makrophagen und ihre Beeinflussung durch Mycoplasma bovis ... 92
4.4 M. bovis-vermittelte Modulation intrazellulärer Signalwege ... 101
5. Diskussion ... 103
5.1 Die Eignung der BoMac-Zelle als In-vitro-Modell für primäre bovine Makrophagen ist fraglich ... 104
5.2 boCCL4 und boCX3CL1 führen nicht zu einer Kalzium-Einstrom-vermittelten Aktivierung boviner Monozyten ... 107
5.2.1 Mycoplasma bovis moduliert den boCCL5-induzierten Kalziumeinstrom in bovinen Monozyten ... 110
5.3 boGM-CSF und boM-CSF gereifte Makrophagen unterscheiden sich in Phänotyp und Funktion ... 111
5.4 Mycoplasma bovis verändert den Phänotyp und die Funktion boviner Makrophagen ... 117
5.5 Ausblick ... 126
6. Zusammenfassung... 128
7. Summary ... 131
8. Literaturverzeichnis ... 133
9. Anhang ... 166
9.1 Geräte ... 166
9.2 Material ... 168
9.2.1 Klinikbedarf ... 168
9.2.4 Versuchstiere ... 176
9.2.5 Biologische Materialien ... 177
9.2.6 Lösungen, Puffer, Kulturmedien ... 178
9.3 Abbildungsverzeichnis ... 187
9.4 Tabellenverzeichnis ... 189
9.5 Abkürzungsverzeichnis ... 190
1
1. Einleitung und Zielsetzung
Mycoplasma (M.) bovis führt weltweit zu erheblichen ökonomischen Verlusten in der Rinderindustrie. Das Pathogen ist einer der wichtigsten Erreger der bovinen Mykoplasmose, welcher insbesondere Pneumonien und Arthritiden bei Kälbern und Mastitiden bei adulten Rindern hervorruft (THOMAS et al. 1986; PFUTZNER u. SACHSE 1996; NICHOLAS 2011).
Zurzeit steht keine effektive Methode zur Prophylaxe der durch M. bovis verursachten Erkrankungen zur Verfügung. Die Entwicklung wirksamer Prophylaktika war bisher nicht erfolgreich, da genauere Kenntnisse über Interaktionen des Immunsystems mit diesem Erreger vielfach noch im Dunkeln liegen. Als einen wichtigen Pathogenitätsfaktor besitzt M. bovis mehrere variable Oberflächenproteine, die dem Erreger eine ständige Änderung seines Phänotyps ermöglichen (BEHRENS et al. 1994; ROSENGARTEN et al. 1994). Dies resultiert in einer massiven Bildung nicht protektiver Antikörper von Seiten des adaptiven Immunsystems. Daher war ein wesentlicher Aspekt dieser Arbeit, die Interaktion von M. bovis mit den zentralen Steuerzellen des angeborenen Immunsystems, den während einer inflammatorischen Reaktion immigrierenden Monozyten, die vor Ort zu Makrophagen differenzieren, zu beleuchten. Die Differenzierung der Monozyten wird durch verschiedene Zytokine gesteuert. Abhängig von den anwesenden Stimuli können Makrophagen in klassisch-aktivierte (M1) Makrophagen (NATHAN et al. 1983) oder alternativ-aktivierte (M2) Makrophagen polarisiert werden (STEIN et al. 1992; GOERDT u. ORFANOS 1999; KITTAN et al. 2013). In dieser Arbeit wird die Polarisierung boviner Makrophagen durch die Wachstumsfaktoren GM-CSF und M-CSF untersucht. Die Effektivität der Immunabwehr ist abhängig von der Fähigkeit der Makrophagen ihren mit einer bestimmten Funktion einhergehenden Phänotyp als Reaktion auf die Anwesenheit von Pathogenen zu verändern (Makrophagenplastizität) (MALYSHEV u. MALYSHEV 2015). Im Rahmen dieser Arbeit soll daher geprüft werden, ob M. bovis die Polarisierung boviner Makrophagen moduliert, um angeborenen Immunmechanismen zu entgehen. Da Mykoplasmen als wichtiges Pathogen-assoziiertes molekulares Muster (PAMP) auf ihrer Zelloberfläche in hohem Maße Lipid-assoziierte Membranproteine (LAMPs) exprimieren (MUHLRADT et al. 1997; YOU et al. 2006) wird der Frage nachgegangen, ob die LAMPs denselben Effekt auf die Makrophagen haben wie die Mykoplasmen als Gesamtorganismen.
2
Periphere Blutmonozyten diverser Spezies können in verschiedene Subpopulationen mit unterschiedlichen phänotypischen und funktionellen Eigenschaften eingeteilt werden. Humane und bovine Monozyten lassen sich entsprechend ihrer Expression von CD14 und CD16 in klassische (CD14++CD16-), intermediäre (CD14++CD16+) und nicht-klassische (CD14+CD16++) Monozyten einteilen (ZIEGLER-HEITBROCK et al. 2010; HUSSEN et al.
2013). In früheren Arbeiten wurde gezeigt, dass die Zusammensetzung der Monozyten-Subpopulationen des Rindes mit der Häufigkeit an entzündlichen Erkrankungen korreliert (POMEROY et al. 2017). Welche Rolle die verschiedenen Monozyten- Subpopulationen spielen, um Pathogene wie M. bovis abzuwehren, ist nicht bekannt. Für das Verständnis der Pathogenese der durch M. bovis verursachten Erkrankungen wurde der Frage nachgegangen, ob M. bovis mit einer Monozyten-Subpopulation präferenziell interagiert. Ein weiteres Teilziel befasste sich mit der Frage, inwieweit sich die immortalisierte bovine Makrophagenzelllinie (BoMac, Bovine Macrophages) als Modellzelle für die Interaktion von M. bovis mit primären, differenzierten Makrophagen eignet. Die Untersuchungen dieser Arbeit folgen dem übergeordneten Ziel die Interaktionen des Erregers mit Zellen des angeborenen Immunsystems besser zu verstehen und daraus Erkenntnisse zu wirksameren prophylaktischen Strategien zu gewinnen.
3
2. Literaturübersicht
2.1 Mycoplasma bovis
M. bovis gehört zur Klasse der Mollikuten (Mollecutes), Ordnung der Mycoplasmatales, Familie der Mycoplasmataceae und zum Genus Mycoplasma. Diese Bakterien zeichnen sich durch das Fehlen einer Zellwand, ihr kleines Genom und ihre geringe Größe aus. Sie sind weit verbreitet und verursachen Erkrankungen sowohl in Menschen und Tieren als auch in Pflanzen.
Weiterhin sind Mykoplasmen in der Regel strikt wirtsspezifisch (RAZIN et al. 1998). Sie besiedeln hauptsächlich die Mukosa von Respirations-, Urogenital- und Magen-Darm-Trakt, aber auch Augen, Milchdrüse und Gelenke (RAZIN et al. 1998). M. bovis gilt als wichtigster Erreger der bovinen Mykoplasmose (siehe 2.2) und wurde erstmalig 1961 in den USA aus einem Rind mit klinischer Mastitis isoliert (HALE et al. 1962). 2011 wurde das erste vollständige Genom des M. bovis Stamms PG45 veröffentlicht (WISE et al. 2011). Trotzdem sind große Teile der Interaktion von M. bovis mit dem Immunsystem noch unbekannt. Bisher sind verschiedene Pathogenitätsfaktoren bekannt, durch die es M. bovis gelingt im Wirt zu persistieren (siehe 2.3) und mithilfe derer das Pathogen in der Lage ist die Immunantwort verschiedener Wirtszellen zu modulieren (siehe 2.5).
2.2 Mycoplasma bovis-verursachte Erkrankungen
M. bovis ruft insbesondere Pneumonien und Arthritiden bei Kälbern, aber auch Mastitiden bei adulten Rindern hervor (PFUTZNER u. SACHSE 1996). Zurzeit steht keine effektive Methode zur Vorbeugung und Therapie der durch M. bovis verursachten Erkrankungen zur Verfügung.
Die durch M. bovis verursachten Mastitiden (BENNETT u. JASPER 1977; PFUTZNER u.
SACHSE 1996) treten meist bei über 20 % der Tiere einer Herde, unabhängig vom Laktationsstadium auf und können auch trockenstehende Kühe betreffen. Kühe unmittelbar post partum und in der frühen Laktation gelten als besonders suszeptibel (BICKNELL et al.
1978; PFUTZNER u. SACHSE 1996). Die Inkubationszeit beträgt zwei bis sechs Tage, wobei die Erkrankungsdauer sich über mehrere Wochen erstreckt und oft von einer Persistenz des Erregers in der Herde gekennzeichnet ist (PFUTZNER u. SACHSE 1996). Der Erreger wird in der Herde auch durch asymptomatische Ausscheider verbreitet (PFUTZNER u. SACHSE
4
1996). Das pathologische Bild entspricht dem einer fibrinös-eitrigen Mastitis mit verkäsender Nekrose (BENNETT u. JASPER 1977; MAUNSELL et al. 2011). Bei der histopathologischen Untersuchung findet sich im Endstadium eine vollständige Fibrose der Alveolen, die einen Funktionsverlust der Milchdrüse zur Folge hat (BENNETT u. JASPER 1977). Neben M. bovis verursachen auch andere Mykoplasmen wie M. californicum, M. canadense, M. alkalenscens Mastitiden in Milchkühen (FOX 2012).
Bei Rindern aller Altersklassen und Nutzungsrichtungen, insbesondere aber bei Kälbern und Jungkälbern, führt M. bovis zu eitrig-nekrotisierenden Pneumonien und Arthritiden (PFUTZNER u. SACHSE 1996; CASWELL u. ARCHAMBAULT 2007; MAUNSELL et al.
2011). Die Übertragung findet bei Kälbern oft über die Aufnahme mit M. bovis infizierter Milch statt (MAUNSELL et al. 2011). Als weitere Übertragungswege von Kalb zu Kalb kommen sowohl direkter nasaler Kontakt als auch Aerosole infrage (MAUNSELL et al. 2011). Die Inkubationszeit beträgt etwa zwei bis sechs Tage. Das klinische Bild ist geprägt von Fieber, respiratorischen Symptomen und einer hochgradigen akuten Lahmheit infolge einer Polyarthritis (sogenanntes Pneumonie-Arthritis Syndrom). Als weiteres Indiz für eine durch Mykoplasmen verursachte Erkrankung gilt das fehlende Ansprechen auf eine Behandlung mit Antibiotika. Postmortal zeigt sich in der Lunge typischerweise eine verkäsend-nekrotisierende Entzündung mit multiplen, weißgelben, verkäsenden, bröckeligen Herden, welche von fibrotischem Gewebe umgeben sind (GAGEA et al. 2006; HERMEYER et al. 2012). Weitere mögliche makroskopische Bilder reichen von einer eitrigen Bronchopneumonie ohne Nekroseherde im akuten Stadium bis hin zu einer chronischen, eitrig-abszedierenden Pneumonie (ADEGBOYE et al. 1995; CASWELL u. ARCHAMBAULT 2007). Meist sind die Veränderungen in den kranialen und mittleren Lungenlappen zu finden (CASWELL u.
ARCHAMBAULT 2007). Histopathologisch sind die Areale verkäsender Nekrose von degenerierten neutrophilen Granulozyten, Makrophagen und einem äußeren Ring von Plasmazellen und Lymphozyten umgeben (RODRIGUEZ et al. 1996; GAGEA et al. 2006;
HERMEYER et al. 2012). Im umliegenden Gewebe finden sich Bronchioli mit nekrotischen Epithelzellen (HERMEYER et al. 2012). Immunhistologisch findet sich M. bovis-Antigen vor allem in der Peripherie der Nekrosen. Dabei kann das Antigen sowohl im Zytoplasma von Makrophagen und seltener von neutrophilen Granulozyten, als auch frei in den Nekroseherden lokalisiert werden (RODRIGUEZ et al. 1996; CASWELL u. ARCHAMBAULT 2007;
5
HERMEYER et al. 2012). Auch an der Oberfläche der bronchialen, bronchiolären und alveolären Epithelzellen (HERMEYER et al. 2012) sowie im Zytoplasma der Epithelzellen (RODRIGUEZ et al. 1996) findet sich M. bovis-Antigen. Da M. bovis auch aus Lungen klinisch gesunder Rinder isoliert wurde, ist der Nachweis von M. bovis immer im Zusammenhang mit den klinischen beziehungsweise pathologischen Befunden zu interpretieren (MAUNSELL et al. 2011). Weshalb einige Tiere den Erreger auch asymptomatisch tragen, ist bisher unklar.
Inwieweit bakterielle oder virale Co-Pathogene eine Rolle spielen, wird in verschiedenen Studien diskutiert (MAUNSELL et al. 2011). Als mögliche virale Co-Pathogene werden das Bovine Virus-Diarrhö Virus (BVDV) (SHAHRIAR et al. 2002; GAGEA et al. 2006) und das Bovine Herpesvirus-1 (BHV-1) (PRYSLIAK et al. 2011) diskutiert. M. bovis tritt häufig im Zusammenhang mit bakteriellen Mischinfektionen auf (MAUNSELL et al. 2011; NICHOLAS 2011). So werden Mannheimia haemolytica (GAGEA et al. 2006) oder Histophilus somni häufig (FULTON et al. 2009) aus betroffenen Lungenarealen isoliert. In endemisch mit M. bovis infizierten Holstein Friesian Kälbern wurde auch das Auftreten von M. bovis gemeinsam mit Pasteurella multocida beobachtet (STIPKOVITS et al. 2000).
Die durch M. bovis verursachte Arthritis tritt bei Tieren aller Altersklassen auf, wobei vorrangig Kälber und Milchkühe betroffen sind (STIPKOVITS et al. 1993; PFUTZNER u. SACHSE 1996; WILSON et al. 2007; MAUNSELL et al. 2011). Die fibrinös-eitrige, teils nekrotisierende Arthritis tritt im Zusammenhang mit einer Pneumonie oder Mastitis durch hämatogene Streuung des Erregers auf (MAUNSELL et al. 2011) und ist häufig auch mit einer Entzündung des periartikulären Gewebes assoziiert. So fand sich in einer Studie von Adegboye et al. im Jahre 1996 neben einer eitrigen Arthritis eine pyogranulomatöse Synovitis, Tenosynovitis und Bursitis in Mastkälbern (ADEGBOYE et al. 1996). Nach intraartikulärer Injektion von lebenden, aber nicht von inaktivierten M. bovis-Bakterien traten eine fibrinös-eitrige Arthritis, Synovitis und Tenosynovitis auf (RYAN et al. 1983).
Weiterhin wurde M. bovis in Zusammenhang mit dem Auftreten von Otitiden (HENDERSON u. MCCULLOUGH 1993), Konjunktivitiden, Meningitiden und Aborten (BYRNE et al. 1999) isoliert.
6
Therapie und Vorbeugung einer M. bovis-assoziierten Erkrankung
Da M. bovis keine Zellwand besitzt und keine Folsäure bildet, ist der Erreger resistent gegenüber β-Laktam-Antibiotika und Sulfonamiden (MAUNSELL et al. 2011). Weiterhin ist M. bovis resistent gegenüber Erythromycin (FRANCOZ et al. 2005). In vitro hemmen Antibiotika, welche in die Protein- oder DNA-Synthese eingreifen (Tetrazykline, Makrolide, Lincosamide, Florfenicol oder Fluoroquinolone), das Wachstum von M. bovis (FRANCOZ et al. 2005; ROSENBUSCH et al. 2005). An einer M. bovis-Infektion erkrankte Rinder sprechen nur schlecht auf eine antimikrobielle Therapie, sei es systemisch oder intramammär, an. Daher besteht die einzige Möglichkeit der Bekämpfung in der Absonderung oder Tötung erkrankter Tiere, um die weitere Ausbreitung im Bestand zu verhindern. Versuche, einen wirksamen Impfstoff zu entwickeln, waren bisher nicht erfolgreich. Zwar gibt es einige Firmen in den USA, welche Vakzinen herstellen, aber es gibt keine Daten, die deren Wirksamkeit belegen. In Europa ist bisher kein M. bovis-spezifischer Impfstoff kommerziell erhältlich (MAUNSELL et al. 2011). Es wird berichtet, dass der metaphylaktische Einsatz von Antibiotika in Kälbern, welche experimentell mit M. bovis infiziert wurden oder einem hohen Risiko ausgesetzt waren an einer M. bovis Infektion zu erkranken, zu höheren Gewichtszunahmen und einem besseren klinischen Status führen (GOURLAY et al. 1989; CATRY et al. 2008).
2.3 Pathogenitätsfaktoren von Mycoplasma bovis
Ob es zu einer klinisch manifesten Erkrankung kommt, ist abhängig von erregerspezifischen Faktoren einerseits und wirtsspezifischen Faktoren andererseits.
Dass erregerspezifische Faktoren eine Rolle spielen, zeigte sich nach einer Studie von Punyapornwithaya et al. im Jahre 2010: Die Autoren stellten fest, dass nur einer von vier in der Herde vorkommenden Bakterienstämmen Mastitis verursachte und schlussfolgerten daraus, dass dieser Stamm Virulenzfaktoren besitzt, der ihn von den anderen drei Stämmen unterscheidet und ihm eine Infektion der Milchdrüse ermöglicht (PUNYAPORNWITHAYA et al. 2010). Demgegenüber steht die Beobachtung, dass es keine genetischen Unterschiede zwischen M. bovis-Stämmen von an respiratorischen Symptomen erkrankten und nicht erkrankten Rindern gab (CASTILLO-ALCALA et al. 2012). Andererseits wiederum drückt sich die Relevanz der stammspezifischen Unterschiede durch einen besonders virulenten
7
Stamm in Österreich aus, der von an Mastitis, Pneumonie und Arthritis erkrankten Rindern auf Schweine übersprang (SPERGSER et al. 2013). Dies ist bis dato der einzige Bericht über eine natürliche Überwindung der Speziesbarriere durch M. bovis (SPERGSER et al. 2013). M. bovis gilt wie andere Mykoplasmenspezies als streng wirtsspezifisch. Der nordamerikanische Bison (Bison bison) ist ebenfalls suszeptibel für eine M. bovis-Infektion. Die klinischen Symptome entsprachen im Wesentlichen denen nach einer M. bovis-Infektion von Rindern, wobei der Krankheitsverlauf schwerer und die Mortalität höher (bis 45 %) waren (DYER et al. 2008;
JANARDHAN et al. 2010; SULEMAN et al. 2016).
M. bovis besitzt die Fähigkeit Schleimhäute zu besiedeln, in Gewebe einzudringen und dort, trotz einer Immunantwort des Wirtes zu persistieren (MAUNSELL et al. 2011). Als mögliche Pathogenitätsfaktoren besitzt M. bovis verschiedene Strukturen zur Adhärenz, Invasion, Immunmodulation, Biofilmbildung, Produktion von für den Wirt toxischen Metaboliten und zeigt antigenetische Variation (MAUNSELL et al. 2011).
Zur Adhärenz besitzt M. bovis die Oberflächenproteine Vpmax, ein variables Oberflächen Lipoprotein (ZOU et al. 2013), P26 (SACHSE et al. 1996) und P68 (LYSNYANSKY et al.
2008; ZHAO et al. 2017). Auch die variablen Oberflächenproteine (VspA, VspB, VspE, VspF) sollen an der Adhäsion beteiligt sein (SACHSE et al. 1996; SACHSE et al. 2000). Die oben genannten Adhärenzstudien bezogen sich hierbei auf die Adhärenz von M. bovis an eine embryonale bovine Lungen-Zelllinie (EBL-Zellen). Thomas et al. testeten auch die Adhärenz verschiedener M. bovis-Stämme an primäre, bovine, bronchiale Epithelzellen (BBE-Zellen) und stellten fest, dass die Adhäsionsrate von M. bovis an primäre BBE-Zellen geringer ist als an Zellen der EBL-Zelllinie. Weiterhin stellten die Autoren fest, dass die Adhäsionsrate mit verminderter Pathogenität des M. bovis-Stammes (z.B. PG45) und mit erhöhter Passage des Stammes im Labor sinkt (THOMAS et al. 2003a; THOMAS et al. 2003b). Außerdem besitzt M. bovis eine Reihe von Enzymen, die an der Adhäsion beteiligt sind: Song et al. entdeckten eine α-Enolase, welche durch Bindung an Plasminogen zu einer erhöhten Adhäsionsrate an EBL-Zellen führt (SONG et al. 2012). Wird Plasminogen an das Oberflächen-assoziierte Protein α-Enolase gebunden, erfolgt dessen Aktivierung zu Plasmin (BHATTACHARYA et al.
2012). Die Rekrutierung von Proteasen des Wirtes (wie Plasmin) hilft Bakterien die physischen Barrieren des Wirtes zu überwinden (BHATTACHARYA et al. 2012). Des Weiteren besitzt M. bovis eine NADH-Oxidase, welche neben der Fähigkeit der Reduktion von Sauerstoff zu
8
Wasserstoffperoxid ebenfalls an der Adhäsion von M. bovis an EBL-Zellen beteiligt sein soll (ZHAO et al. 2017). Guo et al. fanden ein Fibronektin-bindendes Enzym (TrMFo), welches als Adhäsin fungiert (GUO et al. 2017). Diese Enzyme binden an Fibronektin, welches als Brücke zu Integrinen auf den Wirtszellen dient und so die bakterielle Adhäsion erleichtert (JOH et al.
1999; SCHWARZ-LINEK et al. 2004).
M. bovis besitzt mehrere variable Oberflächenproteine (variable surface proteins, Vsps) (BEHRENS et al. 1994; POUMARAT et al. 1994). Die Vsps zeigen sowohl eine Größen-, als auch eine Phasenvariation, wobei die phänotypische Änderung der Vsps auch mit hochfrequenten, nicht koordinierten Veränderungen in der DNA des M. bovis-Chromosoms einhergeht (BEHRENS et al. 1994; LYSNYANSKY et al. 1999; LYSNYANSKY et al. 2001).
Die antigene Heterogenität steht nicht mit einem bestimmten M. bovis-Stamm, einer bestimmten Herkunft oder einem bestimmten Krankheitsverlauf in Verbindung (BURKI et al.
2015). Die Variation der Vsps, welche auch zwischen verschiedenen Subklonen eines Stammes variiert, kann durch die Anwesenheit eines komplementären Antikörpers beeinflusst werden.
Sowohl Antikörper von experimentell infizierten Kälbern als auch monoklonale Antikörper, die gegen ein M. bovis-Vsp gerichtet sind, führen zu einer Veränderung desselben (LE GRAND et al. 1996). Dadurch ist dem Erreger eine effektive Evasion der adaptiven Immunantwort möglich (LE GRAND et al. 1996; BURKI et al. 2015). So führt auch die Koexpression verschiedener Vsps (z.B. Vsp A, B, C) zur Entstehung verschiedener Oberflächenstrukturen mit spezifischen antigenen Eigenschaften (LYSNYANSKY et al. 1999). Die Variation der Vsps ist auch in vivo im Respirationstrakt experimentell infizierter Kälber zu beobachten (BUCHENAU et al. 2010).
In experimentell infizierten Kälbern wurde M. bovis-Antigen sowohl im Zytoplasma von Immunzellen (Makrophagen, neutrophile Granulozyten) als auch von epithelialen Zellen (Gallengangsepithel-, Nierenepithel-, bronchioläre Epithelzellen) und anderen Zelltypen wie Hepatozyten und Axonen des Nervus facialis nachgewiesen (ADEGBOYE et al. 1995;
RODRIGUEZ et al. 1996; MAEDA et al. 2003; KLEINSCHMIDT et al. 2013). Der von M. bovis genutzte Mechanismus der Invasion in die Epithelzellen, ist bisher weitgehend unbekannt. Erste In-Vitro-Untersuchungen an primären, bovinen, embryonalen Nasenmuschelepithelzellen deuten auf eine Aufnahme von M. bovis über nicht klassische Endozytose hin (BURKI et al. 2015). Elektronenmikroskopisch konnte M. bovis hingegen nicht
9
in den alveolären Epithelzellen des Euters dargestellt werden (STANARIUS et al. 1981).
In vitro konnte die Invasion von M. bovis in verschiedene Zelllinien (embryonale bovine Lungenzellen (EBL-Zellen), embryonale bovine Trachealzellen (EBTr-Zellen) nachgewiesen werden (SULEMAN et al. 2016). Weiterhin wurde M. bovis mittels Konfokaler Laser- Scanning-Mikroskopie in den verschiedenen Subpopulationen der mononukleären Immunzellen (T-Zellen, B-Zellen, Monozyten, natürliche Killerzellen (NK-Zellen), dendritische Zellen) sowie in Erythrozyten dargestellt (VAN DER MERWE et al. 2010).
Viele Bakterien können durch die Formation von Biofilmen im Wirt persistieren (DONLAN 2002). Ein Biofilm ist eine Ansammlung von Mikroorganismen, welche fest mit einer Oberfläche verbunden sind und sich in einer extrazellulären polymeren Substanz (EPS) befinden (DONLAN 2002). Die im Biofilm lebenden Organismen unterscheiden sich von den in Suspension befindlichen (planktonischen) Organismen durch eine vermehrte oder verminderte Expression verschiedener Gene, eine verminderte Wachstumsrate sowie der Produktion von EPS (DONLAN 2002). In chronischen Infektionen können Biofilme periodisch planktonische Bakterien freisetzen und so zu akuten Krankheitsausbrüchen führen (MCAULIFFE et al. 2006). Auch M. bovis ist in der Lage proliferative Biofilme zu formen, wobei die Fähigkeit zur Biofilmformation zwischen den Stämmen variiert (MCAULIFFE et al.
2006). Der in dieser Arbeit verwendete Stamm PG45 zeigt nur eine geringe Fähigkeit Biofilme zu formen (MCAULIFFE et al. 2006). Interessanterweise ist M. mycoides spp. mycoides, der Erreger der anzeigepflichtigen Lungenseuche der Rinder, nicht in der Lage Biofilme zu formen (MCAULIFFE et al. 2006). Die im Biofilm ansässigen Mykoplasmen sind weniger anfällig für Hitze und Austrocknung gegenüber planktonischen M. bovis, während sich die Suszeptibilität gegenüber Antibiotika nicht unterscheidet (MCAULIFFE et al. 2006). Die Abwesenheit einer Zellwand und das kleine Genom ließen lange Zeit den Trugschluss zu, dass Mykoplasmen kaum in der Lage seien in der Umwelt außerhalb ihres Wirtes zu überleben. M. bovis-Biofilme überleben überraschenderweise trotzdem über 30 Stunden auf Deckgläsern bei Raumtemperatur (MCAULIFFE et al. 2006).
Weiterhin ist M. bovis in der Lage für den Wirt toxische Metaboliten wie reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS), beispielsweise Wasserstoffperoxid (H2O2) zu generieren (KHAN et al. 2005; SCHOTT et al. 2014). Die Fähigkeit H2O2 zu bilden variiert stammspezifisch, wobei unklar ist, ob die Menge der H2O2-Produktion positiv mit der
10
Pathogenität der Stämme korreliert (KHAN et al. 2005). In einer Studie korrelierte die Höhe der H2O2-Produktion verschiedener Stämme jedoch nicht mit dem Schweregrad der histopathologischen Veränderungen in den Lungen von Kälbern (SCHOTT et al. 2014). Die Höhe der Passagezahl von M. bovis korreliert negativ mit dessen Fähigkeit H2O2 zu bilden (KHAN et al. 2005). M. bovis vermindert die ROS-Produktion in bovinen Leukozyten, wobei der Effekt stammspezifisch ist: Während drei von sechs getesteten Feldisolaten die ROS-Produktion in den Leukozyten verminderten, beeinflussten die zwei hochpassagierten Laborstämme (Jasper und Emmerson) die ROS-Produktion nicht (WIGGINS et al. 2011).
2.4 Wirts-Determinanten der Pathogenität von Mycoplasma bovis
Ob ein Pathogen zu einer klinisch manifesten Erkrankung führt, entscheidet sich oft schon auf der Ebene der Erkennung. Zur Pathogenerkennung sind Zellen mit verschiedenen Rezeptoren (PRRs, pattern recognition receptors) ausgestattet (AKIRA et al. 2006). Die Zellen können nur dann adäquat reagieren, wenn sie die passenden PRRs exprimieren. Dabei ist neben dem Vorhandensein des Rezeptors auch die Expressionsdichte und die Kombination verschiedener Rezeptoren ausschlaggebend (KAWAI u. AKIRA 2011). Die am besten untersuchten PRRs, welche ein großes Spektrum an Pathogen-assoziierten molekularen Mustern (pattern-associated molecular patterns, PAMPs) erkennen, sind die Gruppe der Toll-like-Rezeptoren (TLRs) (KAWAI u. AKIRA 2011). So werden in der Zellwand gram-negativer Bakterien vorkommende Lipopolysaccharide vor allem durch TLR4 erkannt, während die Peptidoglykane gram-positiver Bakterien durch TLR2 registriert werden (TAKEUCHI et al. 1999). Mykoplasmen gehören zur Klasse der Mollikuten und besitzen als solche keine Zellwand. Das Zytoplasma wird von einer Membran aus Lipoproteinen umgeben.
Muhlradt et al. isolierten 1997 aus Mycoplasma fermentans ein diacyliertes Lipoprotein, welches Makrophagen-stimulierende Eigenschaften besaß (macrophage-activating-lipopeptide-2, MALP-2) (MUHLRADT et al. 1997). Während die meisten bakteriellen Lipoproteine triacyliert sind, fehlt Mykoplasmen das N-acyl-Transferase-Gen, welches für die Entstehung triacylierter Proteine notwendig ist (FRASER et al. 1995; HIMMELREICH et al. 1996; SASAKI et al. 2002). Ob Mykoplasmen auch triacylierte Lipoproteine besitzen, steht zur Diskussion (JAN et al. 1996; SHIMIZU et al.
11
2007, 2008; NAKAYAMA et al. 2012). Di- und triacylierte Lipoproteine werden durch TLR2 erkannt (BOTOS et al. 2011). Dabei interagiert TLR2 mit TLR1 um triacylierte Lipoproteine zu erkennen, während TLR2 mit TLR6 diacylierte Lipoproteine erkennt (JIN et al. 2007b;
KANG et al. 2009). Für M. bovis ist bekannt, dass dessen LAMPs durch TLR2 erkannt werden und in embryonalen bovinen Lungenzellen-(EBL)-Zellen die Produktion von Interleukin-(IL)-1β induzieren (WANG et al. 2016).
Da intakte Mikroorganismen verschiedene PAMPs besitzen, werden neben den TLRs auch andere PRRs wie NOD-like Rezeptoren (nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors, NLRs) oder C-Typ-Lektin Rezeptoren (CLRs) aktiviert (KAWAI u.
AKIRA 2011). Inwieweit andere PRRs an der Erkennung von Mykoplasmen beteiligt sind, ist nicht bekannt.
Die Expression von TLRs kann durch verschiedene Faktoren wie durch eine peripartal entstehende negative Energiebilanz und folgender Mobilisation von nicht veresterten freien Fettsäuren (non esterified fatty acids, NEFA), Hormonen oder Stress beeinflusst werden. So erhöhen NEFAs die TLR-Expression in humanem Muskelgewebe (HUSSEY et al. 2014). Auch in laktierenden Kühen erhöht sich die Expression von TLR2 und TLR4 in polymorphkernigen Leukozyten (polymorphonuclear leucocytes, PMN) von Tieren, bei welchen eine negative Energiebilanz induziert wurde (MOYES et al. 2010). In Mäusen verändert sich die Expression verschiedener TLRs während der Trächtigkeit (TAKEUCHI et al. 2013). Der Polymorphismus von TLR-Genen kann die Empfänglichkeit für eine Erkrankung zwischen verschiedenen Spezies oder Rassen derselben Spezies erklären (JANN et al. 2008; JANN et al. 2009).
Der Einfluss von wirtsspezifischen Faktoren auf eine Erkrankung mit M. bovis drückt sich zum Beispiel darin aus, dass ein M. bovis Stamm, welcher von asymptomatischen Kühen isoliert wurde, in suszeptiblen Kühen eine klinisch manifeste Erkrankung verursacht (BOOTHBY et al. 1982). Als prädisponierende Faktoren für eine klinisch manifeste Erkrankung durch M. bovis gelten Stressoren wie Überbelegung des Stalls, Transporte oder Einstallung von Kälbern aus verschiedenen Herkunftsbetrieben. Alabdullah et al. beobachteten (2017) bei Dexamethason- behandelten Kälbern eine vermehrte Kolonisation des Nasopharynx mit M. bovis, welche mit pathogenhaltiger Milch getränkt wurden (ALABDULLAH et al. 2017). Die Autoren schlussfolgerten, dass eine mit M. bovis-assoziierte Erkrankung Folge einer Kombination aus
12
Immunsuppression durch Glukokortikoide beziehungsweise Stress und einer Immunmodulation durch M. bovis darstellt (ALABDULLAH et al. 2015). So wird auch die Phagozytoseleistung und Bildungskapazität reaktiver Sauerstoffspezies von mit M. bovis inkubierten neutrophilen Granulozyten durch Dexamethason vermehrt gehemmt (ALABDULLAH et al. 2018).
2.5 Modulation von Immunzellen durch Mycoplasma bovis
2.5.1 Modulation von Lymphozyten
M. bovis hemmt die Mitogen-induzierte Proliferation von peripheren Blutlymphozyten in vitro (FINCH et al. 1990; THOMAS et al. 1990). Vanden Bush und Rosenbusch et al. fanden heraus, dass M. bovis die Apoptoserate von Lymphozyten erhöht. Dieser Effekt konnte durch Zugabe eines Inhibitors prokaryotischer Protein-Produktion (Chloramphenicol) aufgehoben werden (VANDEN BUSH u. ROSENBUSCH 2002). 2004 gelang der Gruppe die Isolation eines von M. bovis produzierten lymphoinhibitorischen Peptids (VANDEN BUSH u. ROSENBUSCH 2004). Dagegen beobachteten Van der Merwe et al. keine Erhöhung der lymphozytären Apoptoserate durch M. bovis (VAN DER MERWE et al. 2010). Lymphozyten von mit M. bovis infizierten Rindern werden, gemessen an der CD25-Expression und einem Blastogenese-Assay, bei erneutem Antigenkontakt (hitzeinaktivierte M. bovis) stimuliert (VANDEN BUSH u.
ROSENBUSCH 2003). Dabei werden sowohl CD4-positive T-Zellen, CD8-positive T-Zellen als auch γδ-T-Zellen stimuliert (VANDEN BUSH u. ROSENBUSCH 2003). Die Zahl der Interferon-gamma-(IFN-γ)-produzierenden Lymphozyten war dabei genauso hoch oder niedriger als die der IL-4-produzierenden Lymphozyten. Nach der serologischen Analyse von M. bovis-infizierten Rindern zeigte sich ein Anstieg von Antigen-spezifischem Immunglobulin (Ig) G1, während nur wenig IgG2 produziert wurde (VANDEN BUSH u.
ROSENBUSCH 2003). M. bovis induzierte demnach eher eine Th-2-Antwort, die sich durch eine erhöhte IL-4- und geringe bis moderate IFN-γ-Produktion durch T-Lymphozyten sowie eine erhöhte, nicht-protektive, antigenspezifische IgG1-Antikörperbildung auszeichnete (ESTES et al. 1995; VANDEN BUSH u. ROSENBUSCH 2003).
13
2.5.2 Modulation von neutrophilen Granulozyten
Neutrophile Granulozyten sind die vorherrschenden phagozytierenden Zellen bei einer mit M. bovis-assoziierten Pneumonie (GAGEA et al. 2006; HERMEYER et al. 2012). M. bovis bewirkt in neutrophilen Granulozyten sowohl eine Veränderung ihrer phänotypischen als auch ihrer funktionellen Eigenschaften (JIMBO et al. 2017). Die phänotypischen Veränderungen umfassen eine Senkung der CD62L (L-Selektin) und eine Steigerung der CD40-, CD46- und CD86-Expression (JIMBO et al. 2017). Die Autoren vermuten, dass M. bovis durch die Senkung der CD62L-Expression, einem Adhäsionsmolekül, welches das Entlangrollen von Entzündungszellen am Endothel vermittelt (VON ANDRIAN et al. 1992; SIMON et al. 1995;
WITKO-SARSAT et al. 2000), die Extravasation von neutrophilen Granulozyten in das betroffene Entzündungsgebiet erschwert (JIMBO et al. 2017). Werden bovine neutrophile Granulozyten mit M. bovis inkubiert, führt dies nicht zu einer Steigerung ihrer antimikrobiellen Funktionen (THOMAS et al. 1991). M. bovis vermindert die effektive Abtötung von E. coli durch neutrophile Granulozyten (HOWARD u. TAYLOR 1983). Die Bildung toxischer reaktiver Sauerstoffspezies von bovinen neutrophilen Granulozyten wird sowohl durch lebende, als auch durch hitzeinaktivierte M. bovis vermindert (THOMAS et al. 1991).
Jimbo et al. fanden heraus, dass M. bovis in neutrophilen Granulozyten ebenfalls die Stickoxid-(NO)-Produktion hemmt und zu einer vermehrten Ausschüttung von proinflammatorischen Zytokinen wie Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α) und IL-12 führt. Des Weiteren scheint M. bovis die Apoptoserate von neutrophilen Granulozyten zu steigern (JIMBO et al. 2017). Obwohl berichtet wird, dass M. bovis die Degranulation von neutrophilen Granulozyten hemmt (FINCH et al. 1990), steigerte M. bovis die Elastase-Ausschüttung aus den sekundären Granula der neutrophilen Granulozyten in dem von Jimbo et al. (2017) durchgeführten Experiment. Die Inkubation von M. bovis und Glukokortikoiden hat einen additiven Effekt bezogen auf die Hemmung der Superoxidanion-Produktion und die Fähigkeit der neutrophilen Granulozyten E. coli- und opsonisierte M. bovis-Bakterien zu phagozytieren (ALABDULLAH et al. 2015; ALABDULLAH et al. 2018). Dabei unterscheiden sich die verschiedenen verwendeten M. bovis-Stämme in ihrer Fähigkeit der Abtötung durch neutrophile Granulozyten zu entgehen (ALABDULLAH et al. 2018). Weiterhin besitzt M. bovis eine Membrannuklease (Mnua) zur Degradation von neutrophilen extrazellulären Fallen (neutrophil extracellular traps) (GONDAIRA et al. 2017; MITIKU et al. 2018).
14
2.5.1 Modulation von Monozyten und Makrophagen
M. bovis vermindert die Apoptoserate in bovinen Monozyten (MULONGO et al. 2014) und bronchoalveolären Makrophagen (SULEMAN et al. 2016), auch in Anwesenheit des Apoptoseinduktors Staurosporin (MULONGO et al. 2014; SULEMAN et al. 2016), während es in neutrophilen Granulozyten die Apoptoserate steigert (JIMBO et al. 2017). In bovinen, aus CD14-positiven Monozyten generierten Makrophagen hemmt M. bovis die Produktion der proinflammatorischen Zytokine IFN-γ und TNF-α und steigert die Produktion des antiinflammatorischen Zytokins IL-10 (MULONGO et al. 2014), wohingegen mit M. bovis inkubierte neutrophile Granulozyten vermehrt die proinflammatorischen Zytokine TNF-α und IL-12 ausschütten (JIMBO et al. 2017). Im Gegensatz zu Mulongo et al. wiesen Van der Merwe et al. eine vermehrte Produktion von IFN-γ durch periphere mononukleäre Zellen nach (VAN DER MERWE et al. 2010, MULONGO et al. 2014). Auch einer Studie von Jungi et al. zufolge, steigert M. bovis die Produktion von TNF-α (und NO) in bovinen Alveolarmakrophagen, während die apathogene Mykoplasmenspezies M. bovirhinis nicht zu einer Steigerung der TNF-α-Produktion führt (JUNGI et al. 1996a). Inwieweit M. bovis die ROS-Produktion in bovinen Monozyten moduliert ist bisher nicht bekannt.
2.5.2 Modulation von intrazellulären Signaltransduktionswegen durch Mykoplasmen
Mykoplasmen interagieren primär über die Bindung an TLR2 und TLR6 und dadurch ausgelöste Signalwege mit der Wirtszelle. Die Bindung von mykoplasmalen Lipoproteinen von M. fermentans, M. salivarum und M. genitalium, M. penetrans an TLR2 und TLR6 kann über die Aktivierung von NFκB (nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells), zur Apoptose von monozytären und lymphoiden Zellen führen (ALIPRANTIS et al. 1999;
RAWADI et al. 1999; INTO et al. 2002; KARIN u. LIN 2002; INTO et al. 2004; ZENG et al.
2004; WU et al. 2008). Die durch Lipoproteine von M. fermentans herbeigeführte Apoptose transfizierter, humaner HEK293-Zellen und muriner RAW264.7-Zellen führt neben der durch MyD88 (Myeloid differentiation primary response 88)- und FADD (Fas-associated protein with death domain)-vermittelten Aktivierung von NFκB zur Aktivierung von ASK-1 (Apoptosis-signal-regulating kinase 1) und daraus folgenden Phosphorylierung von p38 MAPK (Mitogen-activated protein kinase) (GARCIA et al. 1998;
15
INTO et al. 2004; INTO u. SHIBATA 2005). Andererseits inhibiert M. fermentans die TNF-α-induzierte Apoptose in humanen myelomonozytären U937-Zellen, indem es die Aktivierung von Caspase 8 hemmt (GERLIC et al. 2007). Bei Caspasen handelt es sich um Enzyme, welche im Rahmen der Zellapoptose freigesetzt werden. Weiterhin führen Lipoproteine von M. fermentans durch eine Aktivierung von MAPK und Nrf2 (NF-E2 related factor 2) zu einer vermehrten Expression der Hämoxygenase 1, einem Enzym, welches antiapoptotische und zytoprotektive Eigenschaften besitzt (MA et al. 2013).
Da auch apathogene Mykoplasmenspezies Lipoproteine besitzen und auch TLR2-knock-out-Mäuse eine starke Entzündungsreaktion nach einer Infektion mit M. pulmonis zeigen, scheinen Mykoplasmen auch über andere Strukturen mit den Wirtszellen zu interagieren (SHIMIZU et al. 2014; SHIMIZU 2016). So sind einige Mykoplasmen in der Lage das Inflammasom zu aktivieren. Das Inflammasom ist ein im Zytosol von Makrophagen und neutrophilen Granulozyten vorkommender Proteinkomplex, welcher durch verschiedene Stimuli wie bakterielle Bestandteile (z.B. LAMPs) aktiviert werden kann. Daraus resultiert eine Aktivierung von Caspasen, welches durch proteolytische Spaltung ihrer Vorstufen zu einer Ausschüttung von IL-1β und IL-18 führt (MARTINON et al. 2002). Zu den durch ihre Lipoproteine das Inflammasom aktivierenden Mykoplasmen gehören M. salivarum und M. pneumoniae (BOSE et al. 2014; SUGIYAMA et al. 2016).
Inwieweit M. bovis intrazelluläre Signalwege in bovinen Monozyten beeinflusst, wurde bisher nur in einer Studie untersucht: Mittels eines Peptide-Kinome-Arrays wurden Signalwege des angeborenen Immunsystems von Monozyten identifiziert, welche sich in Anwesenheit von M. bovis verändern. Mittels Western-Blot wurde eine Aktivierung von NFκB festgestellt.
Weiterhin hemmt M. bovis die Aktivierung von Caspase 9, während es die Aktivierung von Caspase 6 und 3 nicht beeinflusst (MULONGO et al. 2014). M. bovis scheint weiterhin die Expression von SOCS1 (Supressor of cytokine signaling 1) zu fördern (MULONGO et al.
2014).
Weiterhin ist bekannt, dass M. bovis-LAMPs in EBL-Zellen durch Bindung an TLR2 zu einer Aktivierung des Adapterproteins MyD88 führt, welches in der Aktivierung von NFκB und folgenden IL1-β-Produktion resultiert (WANG et al. 2016).
16
2.6 Monozytäre Subpopulationen bei Mensch und Rind
Monozyten sind im Blut zirkulierende Leukozyten, welche sich nach Eintritt in das Gewebe in Makrophagen und dendritische Zellen weiterdifferenzieren können (AUFFRAY et al. 2009).
Die Monozyten im Blut entstehen aus Vorläuferzellen im Knochenmark und sind maßgeblich an der antimikrobiellen Abwehr beteiligt (SERBINA et al. 2008).
Periphere Blutmonozyten verschiedener Spezies können in unterschiedliche Subpopulationen mit jeweils spezifischen phänotypischen und funktionellen Eigenschaften eingeteilt werden.
Humane und bovine Monozyten werden entsprechend ihrer Membran-Expression des Lipopolysaccharid-Rezeptors CD14 und des FcγIII-Rezeptors CD16 in drei Subpopulationen eingeteilt: klassische (CD14++CD16-), intermediäre (CD14++CD16+) und nicht klassische (CD14+CD16++) Monozyten (PASSLICK et al. 1989; ANCUTA et al. 2003; ZIEGLER- HEITBROCK et al. 2010; HUSSEN et al. 2013).
Klassische Monozyten (cM, classical monocytes), stellen sowohl den Hauptanteil der humanen (ca. 85 %) als auch der bovinen Monozyten (ca. 89 %) dar (WONG et al. 2012; HUSSEN et al.
2013). Intermediäre Monozyten (intM, intermediate monocytes) stellen mit ca. 5 % den geringsten Anteil der humanen Monozyten dar, während der Anteil an nicht-klassischen Monozyten (ncM, non-classical monocytes) etwa 10 % der humanen Monozyten ausmachen (WONG et al. 2012). Bei Rindern liegen die Anteile von intermediären (intM) und nicht-klassischen Monozyten bei 5 bis 10 % (HUSSEN et al. 2013).
Morphologisch unterscheiden sich die bovinen cM und intM von den ncM, welche sich kleiner und granulärer als erstere darstellen (HUSSEN et al. 2013). Phänotypisch unterscheiden sich die bovinen Monozyten-Subpopulationen in ihrer Expression verschiedener myeloider Oberflächenmarker (HUSSEN et al. 2013). Die Expression von CD163 ist auf den cM am höchsten, während intM und ncM mehr CD172a exprimieren (HUSSEN et al. 2013). Die MHC-Klasse-II-Expression ist dagegen auf den intM am höchsten (HUSSEN et al. 2013). Die drei Monozyten-Subpopulationen unterscheiden sich weiterhin im Expressionsmuster verschiedener Adhäsionsmoleküle (HUSSEN u. SCHUBERTH 2017). So exprimieren cM vor allem L-Selektin (CD62L) und Mac1 (Macrophage-1 antigen, CD11b/CD18) (HUSSEN et al.
2013), während die Expression von PECAM-1 (platelet endothelial cell adhesion molecule-1) auf den bovinen intM und humanen ncM am höchsten ist (HUSSEN et al. 2013). PECAM-1
17
vermittelt die Adhäsion von Zellen und reguliert als solches die Transmigration von Leukozyten, weswegen die erhöhte Expression auf den bovinen intM auf ihre primäre Fähigkeit zur Transmigration hindeutet (HUSSEN et al. 2013; FENG et al. 2016). Die Integrine LFA1 (lymphocyte function-associated antigen-1, CD11a/CD18) und VLA-4 (very late antigen-4, CD49d) werden am meisten auf den bovinen ncM exprimiert. Daher ist es möglich, dass die bovinen ncM wie die humanen ncM entlang der Blutgefäße patrouillieren (HUSSEN et al. 2013; HUSSEN u. SCHUBERTH 2017).
Funktionell gibt es viele Gemeinsamkeiten mit den humanen Monozyten-Subpopulationen. So zeichnen sich sowohl humane als auch bovine cM durch ihre Fähigkeit zur Phagozytose und intM durch ihre Fähigkeit der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies und proinflammatorischer Zytokine aus (CROS et al. 2010; ZAWADA et al. 2011; HUSSEN et al. 2013). Insgesamt gehen die Reaktionen auf bakterielle Stimuli eher von den cM und intM aus (HUSSEN et al. 2013).
Während humanen ncM die Eigenschaft zugeschrieben wird entlang von Blutgefäßen zu patrouillieren (CROS et al. 2010), um bei Bedarf schnell in das entsprechende Gebiet zu transmigrieren (WONG et al. 2012), ist die Funktion der bovinen ncM noch nicht vollständig geklärt. Bovine ncM exprimieren nur wenig mRNA der Chemokine CXCL1 und CXCL8. Eine Stimulation mit Lipopolysachariden (LPS) führt nicht zu einer Erhöhung dieser beiden, als Chemoattraktoren für neutrophile Granulozyten fungierenden Gene (HUSSEN et al. 2013).
Daher spielen bovine ncM, im Gegensatz zu humanen ncM (AUFFRAY et al. 2007), für die frühe Migration von neutrophilen Granulozyten wahrscheinlich keine Rolle (HUSSEN et al.
2013).
Ob die drei Monozyten-Subpopulationen sich während der Entwicklung von einer Subpopulation in eine andere Subpopulation umdifferenzieren können, wird diskutiert (WEINER et al. 1994; ZIEGLER-HEITBROCK et al. 2010; HEINE et al. 2012). Die In-vitro-Stimulation von bovinen cM mit IFN-γ, einem T-Helfer-1-Zytokin, resultiert in einer Erhöhung der CD16-Expression, wodurch der Anteil an intM steigt (HUSSEN et al. 2013). Die Stimulation von intM mit IFN-γ induziert dagegen keine Erhöhung des Anteils an ncM. Eine Stimulation der cM mit den T-Helfer-2-Zytokinen IL-4 und IL-13, den proinflammatorischen Zytokinen IL-1β und TNF-α oder dem Chemokin CCL5 bedingt keine Änderung in der Zusammensetzung der monozytären Subpopulationen (HUSSEN et al. 2013). Dies unterstützt die Hypothese, dass Monozyten das Knochenmark als cM verlassen und sich im peripheren
18
Blut zu intM und ncM weiterdifferenzieren können (WEINER et al. 1994; ZIEGLER- HEITBROCK et al. 2010; HEINE et al. 2012).
Nach der Auswanderung von Monozyten aus den Blutgefäßen ins Gewebe differenzieren sie sich zu Makrophagen oder dendritischen Zellen (ROSS u. ODLAND 1968; ARDAVIN et al.
2001; JIN u. KRUTH 2016; POMEROY et al. 2016). Eine Genexpressionsanalyse von in vitro aus Monozyten gereiften Makrophagen gibt Hinweise darauf, dass aus verschiedenen Monozyten-Subpopulationen bestimmte Makrophagentypen werden. So wurde in Makrophagen, welche sich unter LPS Stimulation aus intM und cM entwickelten, die höchste Genexpression von TNF, IL1B, NOS2 (Nitric oxide synthase-2) und CXCL8 gemessen (HUSSEN et al. 2013). Das spricht für eine Differenzierung von cM und intM in eher proinflammatorische Makrophagen (HUSSEN et al. 2013). Die höchste Expression von ARG1 (Arginase 1) von aus ncM gereiften Makrophagen spricht dagegen für eine Differenzierung von ncM in eher antiinflammatorische Makrophagen (HUSSEN et al. 2013). Die Differenzierung von Monozyten in verschiedene Makrophagen-Subtypen kann weiterhin durch verschiedene Zytokine, Chemokine und Mikroorganismen beeinflusst werden (ROCA et al. 2009;
LAWRENCE u. NATOLI 2011; LIDDIARD et al. 2011; TUGAL et al. 2013). CCL5, ein Chemokin, welches unter anderem an der Rekrutierung von Monozyten in Entzündungsgebiete beteiligt ist (SCHALL et al. 1990), führt zur Differenzierung von CD14-positiven Monozyten in Makrophagen, mit einer verminderten Expression von CD14 und MHC-Klasse-II, aber einer erhöhten Expression von CD16. Allerdings reagieren Makrophagen, welche in Anwesenheit von CCL5 gereift sind, vermindert auf eine Stimulation mit LPS, was in einer verminderten Expression von M1-Makrophagen-Genen wie IL6, CXCL8, aber auch von M2-Makrophagen- Genen wie IL10 und ARG1 resultiert (HUSSEN et al. 2013). Degranulierungsprodukte (DGP) neutrophiler Granulozyten führen zu einer selektiven Aktivierung von cM und intM, aber nicht von ncM (HUSSEN et al. 2016). Degranulierungsprodukte von neutrophilen Granulozyten führen zu einer Differenzierung von Monozyten in Makrophagen, welche eine verminderte Expression von MHC-Klasse-II und eine vermehrte Expression von CD163 zeigen und somit Eigenschaften von M2-Makrophagen besitzen. Andererseits zeigen diese Makrophagen eine erhöhte Produktion von antiinflammatorischen (IL-10) und proinflammatorischen Zytokinen (IL-12) (HUSSEN et al. 2016). Dies spricht gegen einen stark polarisierenden Effekt von neutrophilen DGP und für die Entstehung eines gemischten M1/M2-Phänotyps in Anwesenheit
19
von neutrophilen DGP (HUSSEN et al. 2016). Trotzdem zeigen die aus Monozyten gereiften Makrophagen, nach Ko-Kultivierung mit inaktivierten Escherichia coli- und Staphylococcus aureus-Bakterien, eine vermehrte antimikrobielle Aktivität wie Phagozytose und ROS Produktion (HUSSEN et al. 2013).
Die funktionelle Heterogenität der bovinen Monozyten-Subpopulationen, legt eine klinische Relevanz der unterschiedlichen Subpopulationen für verschiede bovine Erkrankungen nahe (HUSSEN u. SCHUBERTH 2017). Frühere Arbeiten zeigten, dass die Zusammensetzung der Monozyten-Subpopulationen prädiktiv für entzündliche Erkrankungen des Rindes ist (POMEROY et al. 2017). Welche Rolle die verschiedenen Monozyten-Subpopulationen spielen, um Pathogene wie M. bovis abzuwehren, ist nicht bekannt.
Der bronchoalveoläre Raum stellt eine Haupteintrittspforte für Pathogene wie M. bovis dar.
Sich aus Monozyten differenzierende Zellen haben daher in der Lunge eine besondere Bedeutung für die Überwachung und die Immunabwehr von Pathogenen (SERBINA et al.
2008). In der Lunge gibt es einige residente Makrophagen und dendritische Zellen, die sich anhand ihrer Expression verschiedener Oberflächenantigene und Lokalisation unterscheiden lassen (GONZALEZ-JUARRERO et al. 2003; HOLT 2005; SUNG et al. 2006). So lassen sich pulmonale und alveolare Makrophagen und pulmonale und alveolare dendritische Zellen unterscheiden (GONZALEZ-JUARRERO et al. 2003; LANDSMAN et al. 2007). Während der Homöostase wandern Monozyten in die Lunge und differenzieren sich zu pulmonalen dendritischen Zellen (DCs) (LANDSMAN et al. 2007). Im Rahmen pulmonaler Entzündungsreaktionen differenzieren sich eingewanderte Monozyten auch zu pulmonalen Makrophagen und alveolaren DCs (LANDSMAN et al. 2007). Weitere wichtige Immunzellen in der Lunge stellen die Alveolarmakrophagen dar. Im Rahmen der normalen Homöostase sind diese Zellen sehr langlebig (40 % bis 60 % turnover pro Jahr in der Maus) (MAUS et al. 2006).
Während einer durch LPS-induzierten Entzündung im bronchoalveolären Raum erhöht sich ihr turnover und sie werden durch neu immigrierende mononukleäre Zellen ersetzt (MAUS et al.
2006). Welche Rolle die einzelnen Subpopulationen für die Generierung verschiedener residenter Makrophagen (z.B. Alveolarmakrophagen) und dendritische Zellen spielen, ist noch weitgehend unklar. Erste Studien an der Maus belegen, dass nur intM die Fähigkeiten besitzen sich in pulmonale Makrophagen zu differenzieren, während sowohl cM und intM in der Lage sind sich zu dendritischen Zellen zu differenzieren (LANDSMAN et al. 2007).
20
2.7 Chemokinrezeptoren von Monozyten
Chemotaktisch wirksame Zytokine (Chemokine) sind eine Familie von kleinen, sezernierten Proteinen (8 bis 14 kDa), welche insbesondere die Wanderung und Migration von Leukozyten steuern (ZLOTNIK u. YOSHIE 2000). Chemokine spielen sowohl eine wichtige Rolle in der Erhaltung der Homöostase des Immunsystems (Angiogenese, Leukozytenreifung, Leukozytenmigration, lymphatische Organogenese (MOORE et al. 1998; CUPEDO u.
MEBIUS 2003; ONO et al. 2003), sind aber auch an der Entstehung einer protektiven oder nicht-protektiven Immunantwort sowie an der Steuerung der damit verbundenen Entzündungsreaktion beteiligt (WIDDISON u. COFFEY 2011; HUGHES u. NIBBS 2018).
Chemokine werden bereits in der ersten Phase einer Infektion freigesetzt und führen über ein Konzentrationsgefälle, dem sogenannten Chemokingradienten zur selektiven Rekrutierung von Leukozyten aus dem Blut zu dem Ort der Infektion (MURPHY et al. 2014). Bisher sind etwa 50 verschieden Chemokine des Menschen bekannt, welche anhand der Anordnung und Anzahl der N-terminalen Cystein-Reste sowie der zwischen ihnen liegenden Aminosäuren und Disulfidbrücken in vier Kategorien eingeteilt werden: CC, CXC, CX3C und XC (ZLOTNIK u.
YOSHIE 2000; HUGHES u. NIBBS 2018). Das Vorhandensein verschiedener Chemokin-Gene in unterschiedlichen Spezies, aber auch genetische Variationen der Chemokin-Gene innerhalb einer Spezies sind ein Grund für die unterschiedliche speziesspezifische, aber auch intraspeziesspezifische Suszeptibilität und den unterschiedlichen Verlauf einiger Erkrankungen (GUERGNON u. COMBADIERE 2012; HUGHES u. NIBBS 2018). Ihre chemotaktische Wirkung vermitteln Chemokine über G-Protein-gekoppelte-Oberflächenrezeptoren (Chemokinrezeptoren) auf den Zielzellen (HUGHES u. NIBBS 2018). Die Chemokin- Rezeptor-Interaktion führt innerhalb von wenigen Sekunden zur Aktivierung der Zellen, welche sich unter anderem in einem Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration, der Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies und der Ausschüttung von Proteasen aus zytoplasmatischen Granula äußert. Die Aktivierung führt auch zu einer vermehrten Expression von Integrinen auf der Zelloberfläche, die eine Adhärenz der Leukozyten an die Endothelzellen der Blutgefäße und so die Migration in ein Entzündungsgebiet ermöglichen (BAGGIOLINI 1998). Chemokine und Chemokinrezeptoren sind zumeist promiskuitiv, das heißt einerseits, dass ein Chemokin an verschiedene Rezeptoren binden kann und vice versa (MANTOVANI 1999). Weiterhin interagieren Chemokine redundant mit ihren Zielzellen, was bedeutet, dass ein Chemokin in
21
der Lage ist, auf verschiedene Leukozytenpopulationen zu wirken und andererseits eine Leukozytenpopulation mit verschiedenen Chemokinen reagieren kann (MANTOVANI 1999).
Durch die Promiskuität und Redundanz wird ermöglicht, dass der Ausfall eines Chemokins oder Rezeptors durch ein anderes Chemokin oder einen anderen Rezeptor kompensiert werden kann (MANTOVANI 1999). Während große Teile des humanen und murinen Chemokin-System bereits erforscht sind, existieren kaum funktionelle Studien über das bovine Chemokin-System. Die Erforschung boviner Chemokine und ihrer Liganden erfolgte bisher vor allem auf dem Vergleich der Chemokin-Gene des Menschen mit homologen Gensequenzen des Rindes (NOMIYAMA et al. 2010; WIDDISON u. COFFEY 2011).
CCL4
CCL4, ein CC-Chemokin, auch als MIP-1β (Macrophage Inflammatory Protein-1β) bezeichnet, wird insbesondere von Makrophagen, aber auch von anderen Immunzellen (Lymphozyten, NK-Zellen, Mastzellen, dendritischen Zellen, neutrophilen Granulozyten) produziert und vermittelt deren Migration (BAGGIOLINI 1998; MAURER u. VON STEBUT 2004). Auch einige Zellen nicht hämatopoetischen Ursprungs (Epithelzellen, Fibroblasten, Astrozyten, Mikroglia) sind in der Lage CCL4 zu produzieren, wenngleich in geringerem Ausmaß. Die CCL4-Synthese wird durch LPS, Substanz P und proinflammatorische Zytokine wie TNF-α, IFN-γ und IL-1 gesteigert, wohingegen antiinflammatorische Zytokine wie IL-10 einen hemmenden Einfluss auf die CCL4-Synthese haben. CCL4 bindet an den CCR5-Rezeptor, welcher vor allem auf Makrophagen und Monozyten aber auch auf T-Zellen und dendritischen Zellen exprimiert wird (MAURER u. VON STEBUT 2004). Das beim Rind vorkommende CCL4-Gen ist homolog zu dem humanen CCL4-Gen. CCL4 scheint bei durch das Bovine Immundefizienz-Virus hervorgerufenen Erkrankungen eine Rolle zu spielen (WIDDISON u. COFFEY 2011). Das Bovine Immundefizienz-Virus nutzt den CCL4-Rezeptor um in Wirtszellen einzudringen. Bei einer kompetitiven Hemmung durch CCL4 war die Infektionsrate von fetalen bovinen Lungenzellen herabgesetzt (WRIGHT et al. 2002).
22 CCL5
CCL5 gehört wie CCL4 ebenfalls zur Gruppe der CC-Chemokine und wird auch als RANTES (Regulated upon Activation Normal T cell Expressed and Secreted) bezeichnet. CCL5 hat seine Bedeutung in der Rekrutierung von Monozyten, T-Lymphozyten, NK-Zellen, dendritischen Zellen, Mastzellen, eosinophilen und basophilen Granulozyten, wird aber auch von Thrombozyten, synovialen und tubulären Epithelzellen, Fibroblasten sowie einigen Tumorzellen exprimiert (SCHALL et al. 1990; SORIA u. BEN-BARUCH 2008; ALDINUCCI u. COLOMBATTI 2014). Die Aktivität von CCL5 wird hauptsächlich durch dessen Bindung an CCR5, aber auch an CCR3 und CCR1 vermittelt (SAMSON et al. 1996). CD44 und CCR4 können zusätzlich an der Bindung von CCL5 beteiligt sein (APPAY u. ROWLAND-JONES 2001; ROSCIC-MRKIC et al. 2003; ALDINUCCI u. COLOMBATTI 2014). Eine vermehrte Produktion von CCL5 ist an der Entstehung einer Reihe von Erkrankungen wie Atherosklerose, atopische Dermatitis, Glomerulonephritis, Endometriose, entzündliche Atemwegserkrankungen wie Asthma, aber auch neurologischen Störungen wie der Alzheimer- Erkrankung oder an einer allogenen Transplantatabstoßung und der Entstehung einiger Tumoren beteiligt, indem es eine übermäßige Rekrutierung von Leukozyten in das betroffene Gewebe bedingt (MEURER et al. 1993; ROSSI u. ZLOTNIK 2000; APPAY u. ROWLAND- JONES 2001). Bei Stimulation boviner mononukleärer Zellen mit CCL5 kommt es zu einem signifikant messbaren Kalziumeinstrom in bovinen Monozyten, wobei cM und intM signifikant stärker aktiviert werden als ncM (FRANK 2012; HUSSEN et al. 2014). CCL5 lässt insbesondere cM und in signifikant geringerem Maße auch intM in vitro migrieren, während es auf ncM keine chemotaktische Wirkung zu haben scheint (HUSSEN et al. 2014). Weiterhin hat CCL5 einen positiven Effekt auf die Überlebensrate sich zu Makrophagen ausdifferenzierender boviner Monozyten. Dies geht einher mit einer Änderung des Phänotyps: So weisen unter dem Einfluss von CCL5 ausdifferenzierte Makrophagen eine höhere Expression von CD16 und eine niedrige MHC-Klasse-II- und CD14-Expression auf, während die Expression von CD163 und CD11b unbeeinflusst bleibt. CCL5 hat keinen Einfluss auf die Phagozytose und die ROS-Bildung der in vitro differenzierten Makrophagen (HUSSEN et al. 2014). Der Anstieg der Genexpression von IL10, ARG1 und CXCL8 bei Differenzierung der Makrophagen in Anwesenheit von CCL5 ist bei Stimulation dieser Makrophagen mit LPS signifikant geringer als bei Makrophagen, die in Abwesenheit von CCL5 generiert werden (HUSSEN et al. 2014).
23 CX3CL1
CX3CL1 (oder auch Fraktalkine) repräsentiert das einzige Chemokin der CX3C-Familie.
CX3CL1 und CXCL16 sind im Gegensatz zu anderen Chemokinen als Transmembranproteine auf der Zelloberfläche verankert. Durch Proteolyse kann die Chemokin-Domäne abgespalten werden und in den Extrazellularraum abgegeben werden. Die nicht membrangebundene Form von CX3CL1 wirkt als starker Chemoattraktor auf Monozyten und T-Zellen sowie auf NK-Zellen und Mastzellen (BAZAN et al. 1997; PAPADOPOULOS et al. 2000; ANCUTA et al. 2003; MIONNET et al. 2010; HAMANN et al. 2011; WOJDASIEWICZ et al. 2014).
Weiterhin ist die lösliche Form von CX3CL1 an der Angiogenese beteiligt und hat eine chemotaktische Wirkung auf Endothelzellen (VOLIN et al. 2010). Die membrangebundene Form bewirkt auf aktivierten Endothelzellen eine starke, Integrin-unabhängige Adhärenz der oben genannten Leukozyten sowie von neutrophilen Granulozyten. Die CX3CL1-Synthese wird durch proinflammatorische Zytokine wie TNF-α, IFN-γ, IL-1β sowie LPS induziert (IMAIZUMI et al. 2004). Eine Dysregulation von CX3CL1 soll an der Entstehung vieler humaner, insbesondere chronisch-entzündlicher Erkrankungen wie Atherosklerose, rheumatoider Arthritis und Vaskulitis beteiligt sein (LIU et al. 2016). Die biologische Wirkung von CX3CL1 wird über die Bindung an seinen CX3CR1-Rezeptor, einem G-Protein-gekoppelten Transmembranrezeptor, welcher insbesondere auf Lymphozyten und Monozyten exprimiert wird, vermittelt (IMAI et al. 1997; KIM et al. 2011). Die Bindung von CX3CL1 an seinen Rezeptor bewirkt einen Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration in einer mit CX3CR1-transifizierten, humanen Zelllinie (K562 Zellen) (IMAI et al. 1997). Das Rind besitzt ein Gen, welches eine starke Homologie zu dem menschlichen CX3CL1-Gen aufweist (WIDDISON u. COFFEY 2011). Bisher existieren keine Studien zur Funktion von CX3CL1 beim Rind, obwohl die mRNA-Expression des CX3CR1 auf bovinen, humanen und murinen ncM höher ist als auf den CD14-positiven Monozyten (ANCUTA et al. 2003;
AUFFRAY et al. 2007; CORRIPIO-MIYAR et al. 2015).
24
2.8 In-vitro-Differenzierung von Makrophagen aus Monozyten
Das mononukleäre Phagozytose System (MPS) besteht aus myeloiden Vorläuferzellen des Knochenmarks, im Blut zirkulierenden Monozyten sowie bereits im Gewebe ansässigen Makrophagen und dendritischen Zellen (HUME 2006; JUHAS et al. 2015). Das MPS stellt einen wichtigen Bestandteil des angeborenen Immunsystems dar und übernimmt vielfältige Funktionen wie die Phagozytose von apoptotischen oder geschädigten Zellen, Antigenpräsentation und die Produktion eines die Immunantwort lenkenden Zytokinspektrums (JUHAS et al. 2015; ZARIF et al. 2016). Eine besondere Rolle spielt das MPS bei der Bekämpfung von bakteriellen Infektionen sowie in der Steuerung von Entzündungsreaktionen, bei denen die im Blut zirkulierenden, peripheren Monozyten in das betroffene Gewebe einwandern und sich in Makrophagen oder dendritische Zellen differenzieren (VAN FURTH u. COHN 1968; JUHAS et al. 2015). Die Differenzierung der Monozyten wird durch verschiedene Zytokine gesteuert. So differenzieren sich Monozyten in Anwesenheit von GM-CSF (Granulocyte macrophage colony-stimulating factor) oder M-CSF (Macrophage colony-stimulating factor) in Makrophagen mit unterschiedlichen phänotypischen und funktionellen Eigenschaften, während sich die Monozyten in Anwesenheit von GM-CSF und IL-4 in dendritische Zellen differenzieren (LAWRENCE u. NATOLI 2011;
KITTAN et al. 2013). Abhängig von den anwesenden Stimuli können Makrophagen in klassisch-aktivierte (M1) Makrophagen (NATHAN et al. 1983) oder alternativ-aktivierte (M2) Makrophagen polarisiert werden (STEIN et al. 1992; GOERDT u. ORFANOS 1999; KITTAN et al. 2013).
In Anwesenheit von GM-CSF kultivierte Monozyten differenzieren sich in Richtung M1-Makrophagen, welche durch Stimulation mit Th1-Zytokinen wie IFN-γ oder TNF-α oder mit TLR-Liganden wie LPS proinflammatorische Zytokine wie TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12 und Chemokine wie CCL5 produzieren (GOERDT u. ORFANOS 1999; ZARIF et al. 2016). Die proinflammatorischen Eigenschaften der M1-Makrophagen finden weiter in einer gesteigerten Synthese von NO (Stickstoffmonoxid) und ROS sowie einer erhöhten Fähigkeit Antigen zu präsentieren Ausdruck (TAKEUCH u. AKIRA 2011; JUHAS et al. 2015). Daher haben sie eine besondere Bedeutung in der Abwehr bakterieller, viraler und mykotischer Pathogene sowie in der Eliminierung von Tumorzellen (MARTINEZ u. GORDON 2014; ZARIF et al. 2016).
25
In Anwesenheit von M-CSF kultivierte Makrophagen differenzieren sich in Richtung M2-Makrophagen, welche durch Stimulation mit Th2-Zytokinen wie IL-4, IL-10 und IL-13, antiinflammatorische Zytokine wie IL-10, TGF-β (Transforming growth factor β), IL-1RA (Interleukin-1 Rezeptorantagonist) produzieren (GORDON 2003; JUHAS et al. 2015) und in ihrer Funktion NO zu produzieren gehemmt sind (MILLS et al. 2000). M2-Makrophagen spielen eine besondere Rolle in der Förderung der Wundheilung (MOSSER u. EDWARDS 2008; KOH u. DIPIETRO 2011; ZARIF et al. 2016), bei allergischen Reaktionen (SARADNA et al. 2018) und der Abwehr von Parasiten (KREIDER et al. 2007). Mantovani et al. schlugen eine weitere Unterteilung der M2-Makrophagen in M2a, M2b und M2c-Makrophagen vor.
Danach entstehen bei Exposition der Monozyten mit IL-4 und IL-13 M2a-Makrophagen, bei Exposition mit Immunkomplexen und TLR- oder IL-1-R-Agonisten M2b-Makrophagen, welche beide eher immunregulatorisch in Richtung Th-2-Antwort wirken, während M2c-Makrophagen, welche durch IL-10 induziert werden, eher immunsuppressiv wirken und für den Umbau von Gewebe zuständig sind (Remodeling) (MANTOVANI et al. 2004).
M1- und M2-Makrophagen unterscheiden sich auch in ihren phänotypischen Eigenschaften. So weisen M1-Makrophagen eine vermehrte Expression von MHC-Klasse-II Molekülen, CD80 und CD86 auf (AMBARUS et al. 2012; JUHAS et al. 2015). Laut einer Studie von Ambarus et al. ist CD80 der beste Marker, um mit IFN-γ stimulierte, humane Makrophagen zu charakterisieren (AMBARUS et al. 2012). M2-Makrophagen exprimieren dagegen vermehrt CD206 und/oder CD163 (TIEMESSEN et al. 2007; AMBARUS et al. 2012). Im Rahmen der intrazellulären Signaltransduktion spielen Transkriptionsfaktoren wie STAT (Signal transducer and activator of transcription) eine wichtige Rolle für die Makrophagenpolarisierung (LAWRENCE u. NATOLI 2011). NFκB, AP-1 (Αctivator protein-1), C/EBP-α (CCAAT/enhancer-binding protein α), STAT1 und IRF5 (Interferon regulatory factor 5) gelten als Mediatoren der M1-Polarisierung, während die M2-Polarisierung durch IRF4 (Interferon regulatory factor 4), KLF4 (Kruppel-like factor 4), STAT6 und PPARγ (Peroxisomeproliferator-activated receptor γ) vermittelt wird (LAWRENCE u. NATOLI 2011; JUHAS et al. 2015).
Martinez und Gordon et al. stellten das Konzept der M1- oder M2-Makrophagen in Frage. Die Autoren machen darauf aufmerksam, dass das bisherige System weder die Quelle der Stimuli
26
einbeziehe, noch berücksichtige, dass M1 oder M2-Stimuli im Gewebe ko-existieren.
Demzufolge sollten die Makrophagen nicht in feste Subtypen eingeteilt werden, da der Reifungsprozess sehr komplex und dynamisch sei und von zahlreichen Faktoren abhänge (MARTINEZ u. GORDON 2014). Zum Teil sind die Gene für die Ausprägung der M1- oder M2-Makrophagen pleiotrop, sodass insbesondere unter pathologischen Bedingungen auch gemischte M1/M2-Phänotypen beobachtet werden (PETTERSEN et al. 2011; VOGEL et al.
2013). Während der Reifung können Makrophagen in vier verschiedenen Stadien beeinflusst werden (MARTINEZ u. GORDON 2014): Im ersten Stadium reifen die Makrophagen aus Monozyten, hier spielen insbesondere Wachstumsfaktoren wie GM-CSF und M-CSF, aber auch Adhäsionsmoleküle sowie die Rekrutierung steuernde Chemokine eine Rolle. Danach interagieren die gereiften Makrophagen mit verschiedenen myeloiden und lymphoiden Immunzellen wie T-Helferzellen, NK-Zellen, PMN und deren sezernierten Zytokinen (proinflammatorisch: IFN-γ, TNF, IL-1β, IL-6; antiinflammatorisch: IL-4, IL-13, IL-10, TGF-β). Auch eine Beeinflussung durch nicht hämatopoetische Zellen kann hierbei eine Rolle spielen. Weiterhin erfolgt die direkte (TLRs, NOD (nucleotide-binding oligomerization domain-)-like Rezeptoren, RLRs (retinoic acid-inducible gene-I-like receptor)) oder indirekte Beeinflussung (Immunglobuline verschiedener Klassen, Komplementfaktoren, Lektine) durch das Pathogen selbst. In der letzten Phase, der Resolution (Auflösung der Entzündung), werden die Makrophagen sowohl durch systemische (z.B. Glukokortikoide) als auch lokale Mediatoren (ATP (Adenosintriphosphat), Resolvine, Maresine etc.) beeinflusst (MARTINEZ u. GORDON 2014).
Die Effektivität der Immunabwehr ist abhängig von dem Umfang der Makrophagenplastizität, das heißt von der Fähigkeit der Makrophagen ihren mit einer bestimmten Funktion einhergehenden Phänotyp als Reaktion auf ein wechselndes Milieu oder auf die Anwesenheit von Pathogenen zu verändern (MALYSHEV u. MALYSHEV 2015). Eine Störung der Makrophagenplastizität kann zur Entstehung verschiedener Erkrankungen wie Krebs, Asthma oder Atherosklerose führen. Die Reprogrammierung von Makrophagen, einen bestimmten Phänotyp mit bestimmten Funktionen auszubilden, stellt ein neues Therapiekonzept dar.
Danach sollen durch Stimulation der Makrophagen mit proinflammatorischen Faktoren wie LPS oder IFN-γ M1-Makrophagen entstehen, welche weitere proinflammatorische Zytokine produzieren und so den Effekt verstärken. Auf diese Weise generierte M1-Makrophagen sollen
