Aus der Klinik für Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie der Medizinischen Hochschule Hannover
Einfluss von IL-16 und IFN- α
auf die Interaktion von CD4+ T-Zellen und NK-Zellen im Kontext der akuten Hepatitis C Erkrankung
Dissertation
Zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
Vorgelegt von Andreas Leo Klein
aus Bonn
Hannover 2019
Angenommen vom Senat: 03.02.2020
Präsident: Prof. Dr. med. Michael. P. Manns Betuer der Arbeit: Prof. Dr. med. Heiner Wedemeyer
1. Referent: PD Dr. med Dirk Meyer-Olson 2. Referentin: Prof.`in Dr. nat. Christine Goffinet
Tag der mündlichen Prüfung: 03.02.2020
Prüfungsausschuss:
Vorsitz: Prof Dr. med. Alexander Kapp
1. Prüfer: PD Dr. med. Tomas Smith
2. Prüfer: PD Dr. med. Ingmar Mederacke
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
1. EINLEITUNG 1
1.1 EPIDEMIOLOGIE UND BEDEUTUNG DER HEPATITIS CVIRUSINFEKTION 1
1.2 VIROLOGIE DES HEPATITIS CVIRUS 2
1.3 DER NATÜRLICHE VERLAUF EINER HEPATITIS CVIRUSINFEKTION 4
1.4 DIE ROLLE DES IMMUNSYSTEMS BEI BEWÄLTIGUNG DER HEPATITIS CVIRUSINFEKTION 6
1.4.1 Reaktion des adaptiven Immunsystems 7
1.4.2 Reaktion des angeborenen Immunsystems 8
1.5 DIE EFFEKTE VON INTERFERON-Α AUF DAS MENSCHLICHE IMMUNSYSTEM UND SEINE (THERAPEUTISCHE)ROLLE IN DER
HEPATITIS CVIRUSINFEKTION 10
1.6 INTERLEUKIN-16 UND SEINE ROLLE IM HUMANEN IMMUNSYSTEM 14
1.7 BIOMARKER ZUR VORHERSAGE DES NATÜRLICHEN VERLAUFS DER AKUTEN HEPATITIS CVIRUSINFEKTION 15 1.8 VORARBEITEN DER WISSENSCHAFTLICHEN ARBEITSGRUPPE ZU IMMUNANTWORTEN BEI DER AKUTEN HEPATITIS C 16
1.8.1 Veränderte Zellpopulationen bei der akut symptomatischen Hepatitis C Virusinfektion 16 1.8.2 Das Verhältnis verschiedener löslicher Immunmediatoren zueinander unterscheidet sich nach dem
klinischem Verlauf der akuten Hepatitis C Virusinfektion 18
1.9 ZIEL DER ARBEIT 20
2. MATERIAL UND METHODEN 21
2.1 PATIENTENPROBEN 21
2.2 STIMULATION VON PBMCS VON GESUNDEN BLUTSPENDERN MIT VERSCHIEDENEN LÖSLICHEN IMMUNMEDIATOREN MIT
UND OHNE VORHERIGE AKTIVIERUNG 22
2.3 NK-ZELL UND CD4+T-ZELL ISOLATION UND IN VITROKULTIVIERUNG 23
2.4 KO-KULTUR VON CD4+T-ZELLEN UND NK-ZELLEN 24
2.5 ANALYSE DER ZELLOBERFLÄCHENMARKER UND DER ZELLAPOPTOSE MITTELS DURCHFLUSSZYTOMETRIE 25
2.6 STATISTISCHE ANALYSE 26
3. ERGEBNISSE 27
3.1 ASSOZIATION VON LÖSLICHEN IMMUNMEDIATOREN MIT DEM KLINISCHEN VERLAUF DER AKUTEN HEPATITIS C
VIRUSINFEKTION 27
3.2 AUSWIRKUNG VON LÖSLICHEN IMMUNMEDIATOREN AUF PBMCS VON GESUNDEN BLUTSPENDERN 28 3.3 EINFLUSS VON LÖSLICHEN IMMUNMEDIATOREN AUF DIE CD4+:NK-ZELL RATIO 33
3.3.1 Effekte auf CD4+ T-Zellen 33
3.3.2 Effekte auf NK-Zellen 36
3.4 KO-KULTUR EXPERIMENTE VON PATIENTEN MIT CHRONISCHER UND AKUTER HCVINFEKTION 38 3.4.1 Analyse der Ko-Kultur bei Patienten mit chronischer HCV Infektion 39
3.4.2 Analyse der Ko-Kultur bei Patienten mit akuter HCV Infektion 40
4. DISKUSSION 43
5. ZUSAMMENFASSUNG 50
6. LITERATURVERZEICHNIS 51
7. LEBENSLAUF 62
8. DANKSAGUNG 63
9. EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG 64
Abkürzungsverzeichnis
Ab - antibody, Antikörper
aHCV - akute Hepatitis C Virusinfektion
akt. CD4+ T-Zellen - CD4+ T-Zellen + IL2 + anti-CD3 + anti-CD28 akt.NK - Natürliche Killerzellen + IL2
ALT - Alanin-Aminotransferase
AST - Alanin-Aminotransferase
β-NGF - β-nerve growth factor, Nervenwachstumsfaktor-β CD4+:NK Ratio - CD4+ T-Zell zu Natürlicher Killerzell Quotient cHCV - chronische Hepatitis C Virusinfektion
CO2 - Kohlenstoffdioxid
DAAs - direct-acting antivirals, direkt antivirale Substanz
ER - Endoplasmatisches Retikulum
E:Z Ratio - Effektor- zu Zielzellratio
FACS - fluorescence-activated cell sorting, Durchflusszytometrie
fg - Femtogramm
g - Gravitationskonstante
GRO-α - growth related oncogene-α,
HAV - Hepatitis A Virus
Hb - Hämoglobin
HBV - Hepatitis B Virus
HCV - Hepatitis C Virus
HEV - Hepatitis E Virus
HIV - Humane Immundefizienz-Virus
HLA - human leukocyte antigen
sICAM-1 - soluble intercellular adhesion molecule 1
SIM - soluble immune mediator, löslicher Immunmediator
IFN - Interferon
IFN-γ - Interferon-γ
IFN-α - Interferon-α
IRES - internal ribosomal entry site, interne ribosomale Eintrittsstelle
IL-16 - Interleukin-16
IU - international unit, Internationale Einheit KIR - killer cell immunoglobulin like receptor MCP-3 - monocyte chemotactic protein-3
Min - Minuten
ml - Milliliter
mM - Millimol
mRNA - messenger ribonucleic acid
nAk - neutralisierende Antikörper
ng - Nanogramm
NC - non clearer, Nicht-Ausheiler
ORF - open reading frame, offener Leserahmen
PBMC - peripheral blood mononuclear cells, mononukleäre Zellen des peripheren Blutes
PBS - Phosphate buffered saline,Phosphat-gepufferte Salzlösung
pg - Pikogramm
RBV - Ribavirin
RNA - ribonucleic acid, Ribonukleinsäure
SC - spontaneous clearer, spontaner Ausheiler
SNP - single nucleotide polymorphisms, Einzelnukleotid Polymorphismus
SVR - sustained virologic response, anhaltendes virologisches Ansprechen (auf Therapie)
UAW - unerwünschte Arzneimittelwirkungen
UTR - untranslated regions, untranslatierter Bereich
W12 - Woche zwölf
μ-GT - Gamma-Glutamyltransferase
µl - Mikroliter
μM - Mikromol
% - Prozent
°C - Grad Celsiu
1
1. Einleitung
1.1Epidemiologie und Bedeutung der Hepatitis C Virusinfektion
Das Hepatitis C Virus (HCV) wurde erstmals 1988 von CHOO et al. 1988 nachgewiesen und als Hauptverursacher der bis dahin als „non-A/non-B Hepatitis“ bekannten Erkrankung erkannt (1).
Es wird davon ausgegangen, dass weltweit zwischen 62.5 und 79.4 Millionen Menschen mit der HCV Infektion leben, was 1 % der Weltbevölkerung entspricht (siehe Abbildung 1) (2). Laut BLACH et al. sind in Deutschland zwischen 90.000 und 313.000 Menschen mit dem HCV infiziert (3).
An den Folgen der Infektion sterben jährlich 700.000 Menschen weltweit (4). HCV wird in sieben Genotypen untergliedert, deren Nukleotidsequenzen um 30 % und mehr variieren, sowie etliche Subtypen mit einer Sequenzvariabilität von 15-20 % (5). Das HCV ist weltweit verbreitet, wobei Genotyp I am häufigsten ist. Die verschiedenen Genotypen unterscheiden sich sehr in ihrer geographischen Verteilung und spielen eine entscheidende Rolle bei der Wahl des Therapieregimes (6). So dominiert in Ägypten der Genotyp IV mit 90%, gefolgt von Genotyp I mit 10 %. In Indien herrscht der Genotyp IV mit 64 % vor, gefolgt von Genotyp III mit 28 %. In Deutschland ist Genotyp I mit 62 % führend vertreten. Am zweithäufigsten findet man hier Genotyp III mit 27 % vor (3).
Abbildung 1: Weltweite Prävalenz der HCV Infektion pro Land
Prävalenz: Very High: >5 %, High: 2,5-5 %, Intermediate: 1-2,5 %, Low: <1 %. Übernommen von PHILLIPN (7). Diese Abbildung ist unter der Creative-Commons-Lizenz „Namensnennung – Weitergabe unter gleichen Bedingungen 3.0 nicht portiert“ lizenziert.
2 Die HCV Therapie wurde 2011 mit Einführung der direkt antiviralen Substanzen (direct acting antivirals, DAA) revolutioniert (7). Waren bei der zuvor verwendeten Interferon-α (IFN-α) basierten Immun-Therapie Heilungsraten um die 60 % möglich (8), liegen diese mit den neuen das Virus direkt angreifenden Therapien, heute bei bis zu 95% (9). Bei den neuen Therapien handelt es sich um Kombinationen aus HCV-Proteaseinhibitoren, HCV-Polymeraseinhibitoren und Inhibitoren des HCV Proteins NS5A. Dieser Umbruch schreibt sich in den neuen Zielen der WHO nieder, welche eine Reduktion der weltweiten HCV-Neuinfektionen um 90 % bis 2030 anstrebt (10). Die neuen Medikamente stellen die nationalen Gesundheitssysteme vor erhebliche finanzielle Herausforderungen (11), da die Therapiekosten relativ hoch, regional jedoch sehr unterschiedlich sind (12,13). Therapieverkürzungen sind daher anzustreben, sofern sich keine Reduzierung der Effektivität ergeben, um Kosten zu reduzieren.
1.2Virologie des Hepatitis C Virus
Das Hepatitis C Virus trägt eine einzelsträngige Ribonukleinsäure (RNA) mit Plus-Strang- Polarität und gehört zu der Familie der Flaviviridae, zu der ebenfalls das Gelbfieber Virus, Dengue Virus, West Nil Virus und einige Pestviren gehören. Hier bildet es den eigenen Genus Hepacivirus (14). Das HCV kann nur Menschen und Schimpansen infizieren. Es ist lympho- und hepatotrop, wobei in erster Linie der Hepatozyt die Zielzelle ist (15). Mit 1012 produzierten Virionen pro Tag ist das HCV hoch replikativ (16), was durch die Nutzung eigener Proteine und zusätzlich vieler Ressourcen der Wirtszelle erreicht wird. Die äußere Hülle des Virus besteht aus den beiden viralen Glykoproteinen E1 und E2 sowie Lipiden der Wirtszelle. In der Hülle befindet sich das Nukleokapsid bestehend aus dem Core-Protein, welches wiederum das virale Genom beherbergt (siehe Abbildung 2) (17). Das Genom hat einen offenen Leserahmen (open reading frame, ORF), welcher am 3´und 5´ Ende von zwei untranslatierten Bereichen (untranslated region, UTR) eingegrenzt wird (siehe Abbildung 3). Diese besitzen eine regulatorische Funktion bei der Replikation. In der 5´ gelegenen UTR befindet sich eine interne ribosomale Eintrittsstelle (internal ribosomal entry site, IRES). Von dort wird die virale RNA, bestehend aus circa 9600 Basenpaaren, in ein etwa 3000 Aminosäuren großes Polyprotein translatiert (18).
3 Abbildung 2: Struktur des HCV-Partikels
Angepasst und modifiziert nach GRAHAM (19). Diese Abbildung ist unter der Creative-Commons-Lizenz
„Namensnennung –Weitergabe unter gleichen Bedingungen 3.0 nicht portiert“ lizenziert.
Das HCV gelangt über rezeptor-vermittelte Endozytose in die Wirtszelle. Diverse Studien konnten zeigen, dass dies ein komplexer Prozess ist, der in mehreren Schritten abläuft. Dabei sind eine Reihe von zellulären Proteinen notwendig (20), wozu Heparansulfate (21), der low density lipoprotein Rezeptor (22,23), der scavenger-rezeptor B1 type I (24), CD81+ (25), epidermal-growth-factor-receptor (26), als auch die tight junction Proteine claudin-1 (27) und occludin (28) gehören. Bei der Fusion des Nukleokapsids mit der endosomalen Membran wird die Einzelstrang HCV-RNA in das Zellplasma freigesetzt. Dort wird sie als messenger RNA (mRNA) erkannt und umgehend am rauen endoplasmatischen Retikulum (ER) translatiert (15).
Das so entstandene Vorläuferprotein wiederum wird von Wirts-Proteasen und den viralen Proteasen NS2 und NS3 in Struktur- und Nicht-Strukturproteine prozessiert (siehe Abbildung 3) (17). Drei Strukturproteine bilden die Basis für die Virushülle. Das vielfach vorliegende Core- Protein wird von einer wirtseigenen Lipiddoppelmembran umgeben. Die zwei Hüllproteine, bzw. Glykoproteine E1/E2, bilden einen Heterodimer und sind in dieser Lipiddoppelmembran verankert. Beide Oberflächenproteine spielen eine wichtige Rolle beim Eintritt und der Fusion des HCV mit der Wirtszelle. Insbesondere E2 kann mit mehreren Rezeptoren auf der Wirtszelloberfläche interagieren (29).
Neben den drei Strukturproteinen gibt es das Ionenkanal-Protein p7, welches Ionenkanäle in der Wirtszellmembran bilden kann. Es ist für die Zusammensetzung des HCV und die Freisetzung von Viruspartikeln von Bedeutung (30). Ferner kommen folgende sechs Nicht- Strukturproteine hinzu, welche unterschiedliche Aufgaben besitzen: NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, und NS5B (siehe Abbildung 3). Das Protein NS2 ist eine Metalloprotease und ein
4 Sonderfall, da es sowohl mit Struktur- als auch mit Nicht-Strukturproteinen Komplexe bilden kann (31). Es hat einerseits die Funktion das Vorläuferprotein zwischen NS3 und NS2 zu schneiden, andererseits ist es für die HCV Zusammensetzung und Freisetzung mitverantwortlich. NS3 ist multifunktional. Zum Einen formt es mit NS4A als Kofaktor eine Serinprotease, welche die Spaltung des Virus-Polypeptids an mehreren Stellen katalysiert (32).
Zum Anderen enthält es eine Nukleosid-Triphosphatase und eine Helikase-Funktion, die für den viralen Lebenszyklus und die RNA Replikation von Bedeutung ist (33). Das Membranprotein NS4B kann Veränderungen im ER bewirken, von dem ausgegangen wird, dass es den Ort der Virusreplikation darstellt und das dann als membranous web bezeichnet wird (34,35). NS5A ist ein stark phosphoryliertes, im ER verankertes Protein, welches essentiell für die Virusreplikation und Zusammensetzung ist (36,37). NS5B bildet eine RNA abhängige RNA- Polymerase, die für die Vervielfältigung der viralen RNA sorgt (17).
Abbildung 3: Der Aufbau des HCV Genoms
Angepasst und modifiziert nach GRAHAM (38). Diese Abbildung ist unter der Creative-Commons-Lizenz
„Namensnennung –Weitergabe unter gleichen Bedingungen 3.0 nicht portiert“ lizenziert.
1.3Der natürliche Verlauf einer Hepatitis C Virusinfektion
Eine HCV Infektion kann selbstlimitierend verlaufen oder wie in der Mehrzahl der Patienten chronifizieren (39) und letztlich zu Leberversagen, zur Entwicklung von Leberfibrose oder hepatozellulärem Karzinom führen (40). Die Infektion mit HCV erfolgt parenteral (41).
Häufigster Übertragungsweg ist der Gebrauch gemeinsamer Nadeln beim intravenösen Drogenkonsum, seltener verunreinigte Tätowier- und Piercingnadeln, Nadelstichverletzungen bei medizinischem Personal, sexuelle oder perinatale Übertragung (42). Bis 1990 ein systematisches Screening bei Blutprodukten in Amerika und vielen europäischen Ländern eingeführt wurde, war dies der häufigste Übertragungsweg (43). Nicht nur in Schwellen- und
5 Entwicklungsländern gehen auch heute noch viele Infektionen auf Hygienemängel in Krankenhäusern zurück (44).
Die ersten sechs Monate nach Infektion werden als akute Hepatitis C Infektion (aHCV) bezeichnet. Ist der Patient danach weiterhin HCV RNA positiv, liegt eine chronische Hepatitis C Infektion (cHCV) vor (39). Bei 80 % der Infektionen verläuft die aHCV asymptomatisch, bei 15- 30 % treten Symptome wie Fieber, Kopf-, Gelenk- und Gliederschmerzen, Ikterus, Nausea, Emesis, Hepatosplenomegalie und Juckreiz auf (45,46). Von den akut infizierten Patienten heilen 10-50 % spontan ohne Therapie in den ersten Monaten aus (46–49), während bis zu 60
% der chronisch Infizierten innerhalb von Jahrzehnten eine Leberzirrhose entwickeln (2,50).
Prädiktoren für eine persistierende Infektion sind Koinfektionen mit dem humanen Immundefizienz-Virus (HIV), Hepatitis A Virus (HAV) und Hepatitis B Virus (HBV), das männliche Geschlecht, ein ungünstiger IL28B Genotyp und eine niedriges IP-10 Serumlevel (46,51).
Während Kofaktoren wie Alkoholabusus, Nikotinabusus und Adipositas das Risiko für Leberfibrosierung und letztlich für die Leberfibrose erhöhen. Leberzirrhose ist der Hauptverursacher HCV-assoziierter Morbidität und Mortalität (52,53). Hierbei besteht die Gefahr der Leberdekompensation, der portalen Hypertension oder der Entwicklung eines hepatozellulären Karzinoms (Abbildung 4) (54–56). Zudem kann es zu extrahepatischen Manifestationen kommen. Am häufigsten ist die kryoglobulinämische Vaskulitis, aber auch Lymphome, insbesondere B-Zell Non-Hodgkin-Lymphome, Nierenerkrankungen und neuropsychiatrische Erkrankungen können sich manifestieren. Die Porphyria cutanea tarda, endokrine Störungen, Sjögren und Sicca Syndrom, sowie Arthritiden sind ebenfalls möglich (57). Es wurde eine Vielzahl von Determinanten, wie die Viruslast, der virale Genotyp, die Stärke der Immunantwort und der IL28B Genotyp der Patienten beschrieben, die Hinweise für die unterschiedlichen Verläufe liefern (39,58–60). Da das HCV selbst weder zur Apoptose noch zur Nekrose der Hepatozyten führt, glaubt man, dass der Leberschaden von dauerhaft aktivierten Immunzellen verursacht wird (61). Dies könnte die unterschiedlichen Verläufe erklären. Eine genaue Ursache bleibt jedoch unklar.
6 Abbildung 4: Natürlicher Verlauf der Hepatitis C Virusinfektion
Angepasst und modifiziert nach WEDEMEYER (62). Mit freundlicher Genehmigung des Berufsverband Deutscher Anästhesisten (BDA). Alle Rechte liegen beim BDA und Prof. Dr. Wedemeyer.
1.4Die Rolle des Immunsystems bei Bewältigung der Hepatitis C Virusinfektion
Sowohl das angeborene als auch das adaptive Immunsystem haben entscheidenden Anteil an der Reaktion auf die HCV Infektion. Es ist jedoch nicht abschließend verstanden, welche Mechanismen zu einer Ausheilung beziehungsweise chronischen HCV Infektion führen. Ein Ineinandergreifen beider Komponenten des Immunsystems scheint zur Eliminierung infizierter Zellen und zur Unterdrückung der Virusreplikation erforderlich zu sein. Hierfür wird eine suffiziente zytotoxische NK- und T-Zell Funktion, sowie eine ausgewogene Zytokinfreisetzung benötigt, um somit ein anhaltendes virologisches Ansprechen (sustained virologic response, SVR) zu erreichen (siehe Abbildung 5) (63).
7 1.4.1 Reaktion des adaptiven Immunsystems
Die Grundpfeiler des adaptiven Immunsystems sind die T- und die B-Lymphozyten. Sie müssen erst aktiviert werden, also Antigene präsentiert bekommen, bevor sie eine klonale Expansion durchlaufen und ihre Effektorfunktionen ausführen können. Die Präsentation der Antigene erfolgt größtenteils durch Zellen des angeborenen Immunsystems. Somit dauert die Aktivierungsphase des adaptiven Immunsystems länger, ist jedoch hochspezifisch und kann über Jahre als immunologisches Gedächtnis bestehen bleiben (64).
Die B-Lymphozyten können sich nach der Aktivierung in Plasma- und Gedächtniszellen differenzieren und Antikörper produzieren. Damit sind sie die Erzeuger der humoralen Immunantwort (64). Bei einer HCV Infektion produzieren sie neutralisierende Antikörper (nAk), welche die Infektion zumeist weder kontrollieren noch langanhaltende Immunität bieten können (65). Selektionsdruck kann zu Mutationen im viralen Genom führen, wodurch die Antikörper ihre Wirkung verlieren (66). Zudem ist eine Zell-zu-Zell-Infektion beim HCV möglich, wodurch das Virus dem Antikörper keine Angriffsfläche bietet (67). Obwohl nAk die HCV Infektion nicht kontrollieren können ist eine breite und frühe nAk-Antwort mit einer spontanen Ausheilung (spontaneous cleareance, SC) assoziiert (68).
Klassischerweise unterteilt man die T-Zellen in CD4-positive (CD4+) T-Helferzellen und in CD8- positive (CD8+) zytotoxische T-Zellen. Sie haben unterschiedliche Aufgaben in der adaptiven Immunantwort. Sowohl für CD4+ als auch CD8+ T-Zellen wurde an Schimpansen durch Depletion der einzelnen Zellpopulationen gezeigt, dass beide für sich essentiell für die Ausheilung der aHCV sind (69,70). Es besteht ein Konsens, dass eine breite, auf mehrere Virusepitope gerichtete, starke und anhaltende CD8+ und CD4+ T-Zellantwort für eine Ausheilung entscheidend ist (71,72). Eine schwache Immunantwort kann in Patienten, welche die aHCV nicht ausheilen (non-clearer, NC), zu Mutationen im viralen Genom führen. Diese können in einer optimalen Fitness des HCV resultieren und mit einer hohen Virusreplikation einhergehen. Bei einer ausgewogenen Immunantwort entstehen durch den Selektionsdruck auf das HCV viele Quasispezies, deren Fitness reduziert ist, jedoch für eine persistierende Infektion ausreicht (73).
CD8+ T-Zellen erkennen über ihren T-Zellrezeptor erkrankte Zellen, die körperfremde Peptide wie zum Beispiel Virusbestandteile, präsentieren. Kommt es zusätzlich zu einer Bindung mit
8 einem Ko-Rezeptor, wird die CD8+ T-Zelle aktiviert, setzt zytotoxische Stoffe frei und tötet die erkrankte Zelle. Bei chronisch Infizierten wurde beobachtet, dass die Effektorfunktionen der CD8+ T-Zellen verloren oder abgeschwächt werden (74). Gleichzeitig exprimieren sie auf Grund anhaltender Antigenstimulation inhibitorische Rezeptormoleküle (75), was als T cell exhaustion bezeichnet wird.
Die Hauptaufgabe der CD4+ T-Zellen besteht in der Aktivierung der CD8+ T-Zellen und antigenpräsentierenden Zellen, Induktion des B-Zell Reifungsprozesses für die Antikörperproduktion und der Produktion von antiviralen Zytokinen wie Interferon (IFN)-α und IFN-γ und Tumornekrosefaktor (TNF). Die Aktivierung anderer Immunzellen findet sowohl über Zell-Zell-Kontakt und insbesondere über die Ausschüttung von Zytokinen statt (64).
Abbildung 5: Vereinfachte Darstellung der HCV Eliminierung durch das adaptive Immunsystem
1.4.2 Reaktion des angeborenen Immunsystems
Das bedeutet, dass ihre Effektorfunktionen weder eine vorausgegangene Sensibilisierung noch eine spezifische Antigenerkennung benötigen. Daher können sie schnell reagieren. NK-Zellen besitzen sowohl zytotoxische Eigenschaften als auch die Fähigkeit inflammatorische Zytokine, insbesondere IFN-γ und IFN-λ freizusetzen (77). Diese sind unentbehrlich für die Ausheilung viraler Infektionen und zur Verhinderung maligner Entartungen (64). Bei der aHCV ist die
9 Effektorfunktion der NK-Zellen erhöht (78). Zudem konnte gezeigt werden, dass Individuen mit einem KIR2DL3/HLA-C1 homozygotem Genotyp, welcher für eine geringere Inhibition der NK- Zell Aktivität verantwortlich ist (79), eine höhere Ausheilungsrate aufweisen (80). Diese Erkenntnisse unterstreichen die Bedeutung der NK-Zellen bei der HCV Infektion. Im Falle der chronischen Infektion erhöht sich die Zytotoxizität der NK-Zellen, während sich ihre IFN-λ und IFN-γ Synthese aufgrund der dauerhaften INF-α Exposition reduziert (81,82). Eine suffiziente INF-λ Freisetzung ist jedoch zur Viruskontrolle notwendig (83), während die erhöhte Zytotoxizität ein Grund für die Leberzellschädigung sein kann.
LANG et al. (84) konnten zeigen, dass NK-Zellen eine immunregulatorische Funktion besitzen und die T-Zell Antwort beeinflussen können (siehe 1.4.2 Reaktion des angeborenen Immunsystems. Ferner zeigten WAGGONER et al. (85) in der Maus und NIELSEN et al. (86) in humanen Zellen, dass aktivierte NK-Zellen in der Lage sind, Apoptose von aktivierten CD4+ T- Zellen zu induzieren. Hierdurch wird eine effiziente, antigenspezifische, zytotoxische Immunantwort der CD8+ T-Zellen verhindert (siehe Abbildung 6).
Abbildung 6: NK-Zellen modulierten die adaptive Immunantwort
10 Ein weiterer wichtiger Bestandteil des angeborenen Immunsystems sind lösliche Immun- mediatoren (soluble immune mediators, SIMs), kleine Moleküle, welche Immunantworten regulieren und von vielen verschiedenen Zellen des Körpers produziert werden können.
Funktionell können sie unterteilt werden in Zytokine, Chemokine, Adhäsionsmoleküle und Wachstumsfaktoren. Dabei haben sie mit der Initiierung und Unterdrückung einer Immunreaktion, sowie Anregung von Zellproliferation und Zelltod mannigfaltige Funktionen.
Sie sorgen dafür, dass ein Gleichgewicht zwischen der Abwehr von Pathogenen und Selbsttoleranz im Körper herrscht. Zudem rekrutieren besonders Chemokine Immunzellen an den Ort der Infektion und Entzündung.
1.5Die Effekte von Interferon-α auf das menschliche Immunsystem und seine (therapeutische) Rolle in der Hepatitis C Virusinfektion
Die antiviralen Effekte von IFN wurden erstmals 1957 von ISAAC und LINDEMANN beschrieben (88). Damit legten sie den Grundstein für die Erforschung des IFN Systems. IFN ist aus der Grundlagenforschung in den klinischen Alltag gekommen und spielt bei Behandlung insbesondere viraler und neoplastischer Erkrankungen eine wichtige Rolle. Durch die Erforschung des IFN Systems gelangte man zu grundlegenden Erkenntnissen in der Zellbiologie und Biochemie - angefangen bei Wegen der Signaltransduktion bis hin zu den biochemischen Mechanismen in der Viruskontrolle auf molekularer Ebene (89). Wichtig für das Verständnis ist, dass in vivo IFN immer in eine komplexe Immunantwort eingebettet ist. Es sollte als Netzwerk betrachtet werden, in dem andere lösliche Immunmediatoren (SIMs) die IFN Effekte modulieren und sich gegenseitig beeinflussen (90).
IFN ist ein Zytokin und kann durch einen externen Stimulus, beispielsweise einer Virusinfektion, von Zellen synthetisiert und ausgeschüttet werden. Es wird von vielen unterschiedlichen Zellen produziert, vor allem jedoch von Leukozyten und Fibroblasten. Die IFN Antwort gehört zum angeborenen Immunsystem und sie spielt somit unspezifisch in einem sehr frühen Stadium eine Rolle gegen RNA-Viren, DNA-Viren, intrazelluläre Bakterien und Parasiten (siehe Abbildung 7) (91). Zudem unterstützt sie die Aktivierung des adaptiven Immunsystems (89). Man unterscheidet Typ I Interferone (IFN-α, IFN-β und IFN-ω) mit hauptsächlich antiviraler Wirkung
11 und Typ II Interferone (IFN-γ) mit immunmodulatorischer Wirkung. IFN wirkt autokrin und parakrin, und kann dadurch die Verbreitung von Pathogenen reduzieren (siehe Abbildung 7) (64,89).
Abbildung 7: Effekte von Typ I Interferonen auf das menschliche Immunsystem bei Virusinfektionen oder maligner Entartung
Abkürzungen: CD4 Th, CD4+ T-Helferzelle; CD4 Tfh, follikuläre T-Helferzelle; Th1, Typ-1-T-Helferzelle;
Treg, regulatorische T-Zelle. B cell, B-Zelle, HyperIgG, Hyperimmunglobulin-G; IL10, Interleukin-10; IL- 10+ Breg, Interleukin-10 positive regulatorische B-Zelle; PDL1, programmed death ligand 1; IL10, Interleukin-10; IDO, Indoleamine 2,3 Deoxygenase; CD8 T cell, CD8+ T-Zelle; CXCR5+ TCF+ subset, CXC- Motiv-Chemokinrezeptor 5 positive T-Zell-spezifischer Transkriptionsfaktor positive Subpopulation;
DNA, Desoxyribonukleinsäure; IFN-1, Interferon-1. Übernommen von SNELL et al. (90). Mit freundlicher Genehmigung des Elsevier Verlages. Alle Rechte sind vorbehalten und liegen beim Elsevier Verlag.
Im Kontext der HCV Infektion nimmt das IFN-α eine wichtige Rolle ein. Es gibt auf dem Chromosom 9 insgesamt 13 IFN-α Gene, von denen keins ein Intron besitzt. IFN-α besteht aus
12 165 oder 166 Aminosäuren und es sind aktuell 23 verschiedene Varianten beschrieben, wovon die meisten nicht glykosyliert sind. Alle Proteinvarianten scheinen ihre Wirkung als Monomer zu entfalten. Man unterscheidet diese in zwei Gruppen: das immediate early gene (IFN-α4), welches extrem schnell nach einem Stimulus wirkt, da es bereits synthetisiert in der Zelle vorliegt (92), weiterhin eine Gruppe von langsamer synthetisierten IFN-α (IFN-α2, IFN-α5, IFN- α6, und IFN-α8) (93). Fast alle Blutzellen sind in der Lage IFN-α zu produzieren, der Großteil stammt nach in vitro Analysen von dendritischen Vorläuferzellen (94).
IFN-α bindet an die IFN-α Rezeptoren I und II, woraufhin die sogenannte Janus kinase signal transducer and activator of transcription (JAK-STAT) Signalkaskade aktiviert wird. Aus dieser resultiert eine veränderte Transkription von hunderten von IFN-stimulierten Genen (IFN- stimulateded genes, ISGs), deren Proteine und Funktionen ebenso vielfältig sind. Teils werden Pathogene direkt in ihren Signalwegen beeinflusst, Chemokine, Zytokine und deren Rezeptordichte können sich ändern, aber auch die Kommunikation zwischen Zellen sowie die Zellaktivität werden beeinflusst. Eine negative Rückkopplung stellt die Rückkehr zur Homöostase sicher. Zudem kann bei gleichzeitig vorhandener Doppelstrang-RNA die Apoptose eingeleitet werden (89–91,95).
IFN-α hat zudem immunregulatorische Effekte und erhöht insbesondere die Dichte des Haupthistokompatibilitätskomplexes (major histocompatibility complex, MHC) Klasse-I auf der Zelloberfläche. Dadurch verbessert es die Erkennung infizierter Zellen durch zytotoxische CD8+
T-Zellen, welche essentielle Schlüsselkomponenten zur körpereigenen Viruselemination darstellen (Siehe Abbildung 5) (89). IFN-α ist jedoch ein zweischneidiges Schwert, da es neben den oben erwähnten antiviralen und antineoplastischen Eigenschaften auch einer chronischen Infektion förderlich werden kann. Denn bei dauerhafter IFN Stimulation spielen die notwendigen Rückkopplungsmechanismen eine wichtige Rolle. Sie schützen vor einer zu starken Immunreaktion und dadurch bedingter Immunpathologie, bedingen jedoch auch eine Dysfunktionalität von Immunzellen. Es ist mittlerweile ausreichend belegt, dass zytotoxische CD8+ T-Zellen durch dauerhafte IFN Stimulation erschöpft werden (T cell exhaustion). Das bedeutet, dass ihre Proliferation und Zytotoxizität beeinträchtigt sind, sie vermehrt inhibitorische Moleküle exprimieren und die Apoptoseneigung erhöht ist (90).
IFN-α wurde 1986 zum ersten Mal als Medikament bei onkologischen Erkrankungen von der United States Food and Drug Administration (FDA) zugelassen (96). Neben seinen erwünschten
13 Effekten hat es viele schwerwiegende unerwünschte Arzneimittelwirkungen (UAW), wie Fieber, Neutropenie und Depression. Daraus resultiert eine Reihe von Kontraindikationen, beispielsweise eine bestehende Depression oder schwere Herz- und Leberschäden (45). Zur Behandlung der HCV Infektion wurde 1991 IFN-α eingeführt, allerdings mit nur geringen Heilungsraten um die 6 % bei dem HCV Genotyp 1 (siehe Abbildung 8). Seit 1997 wurde IFN-α in Kombination mit Ribavirin (RBV), einem Nukleosidanalogon mit breiter antiviraler Wirksamkeit, eingesetzt. Dies erhöhte die SVR-Rate auf circa 32 %. Eine weitere verbesserte Therapieoption war ab 2001-2002 das pegylierte IFN-α (pegIFN-α) in Kombination mit RBV, welches bei Genotyp 1 Infektion Ausheilungsraten um die 42 % ermöglichte. Bei der PEGylierung wird dem Interferonmolekül ein Polyethylenglycol angehängt, welches weder toxisch noch immunogen ist. Dies verändert die pharmakokinetischen Eigenschaften des IFN- α, sodass sich die renale Clearance und die Proteolyse reduziert und somit die Plasmahalbwertszeit um ein Vielfaches verlängert. Die tägliche IFN-α Gabe reduzierte sich so auf eine wöchentliche. Gleichzeitig wird der Plasmaspiegel konstanter gehalten (97).
Abbildung 8: Zusammenfassung der Therapieentwicklung und Heilungsraten der chronischen Hepatitis C Virusinfektion mit Genotyp 1
Abkürzungen: m, Monate; SVR, sustained virologic response, anhaltendes virologisches Ansprechen; IFN, Interferon-α; PEG-IFN, Peginterferon- α
Übernommen von CARTER et al. (98). Mit freundlicher Genehmigung des John Wiley and Sons Verlages.
Alle Rechte sind vorbehalten und liegen beim John Wiley and Sons Verlag.
14 Ab 2011 gab es eine bahnbrechende Neuerung mit der Einführung der direct acting antivirals (DAAs), die bei deutlich reduzierten UAW den Einsatz von IFN-α nach und nach weitgehend ersetzten. 2014 gab es das erste IFN-freie Therapieregime zur Behandlung der HCV Infektion.
Heute können mehr als 95 % aller Patienten mit einer solchen Therapie erfolgreich behandelt werden (99). Bei der aHCV sind ebenfalls Studien mit DAAs erfolgt, welche eine Therapieverkürzung erlauben (99,100).
1.6 Interleukin-16 und seine Rolle im humanen Immunsystem
Interleukin-16 (IL-16) wurde 1982 von CENTER und CRUIKSHANK als T-Zell Chemokin entdeckt, welches von humanen, mitogen- oder antigen-stimulierten mononukleären Zellen des peripheren Blutes (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) freigesetzt wird (101). Es wird vom IL-16 Gen auf dem Chromosom 15 codiert und als 631 Aminosäuren langes Vorläuferpeptid translatiert. Danach wird es von der Caspase-3 proteolytisch prozessiert (102).
Nur das C-terminale Peptid hat eine chemotaktische Eigenschaft. Das N-terminale Peptid scheint im Zellzyklus von Bedeutung zu sein. Es kann von einer Vielzahl von Zellen, wie CD4+
und CD8+ T-Zellen, eosinophilen Granulozyten, Mastzellen, dendritischen Zellen, neuronalen Zellen und Epithelzellen freigesetzt werden (103). Es bindet ausschließlich an den CD4-Rezeptor (104) und kann dabei an Lymphozyten, Monozyten und eosinophilen Granulozyten wirken (103). Da es den CCR5-Signalweg abschwächt (105) und von diesem berichtet wurde, dass er mit dem CD4-Rezeptor konstitutiv verbunden ist (106), könnte eine Signalweitergabe durch diesen Korezeptor möglich sein. IL-16 wirkt chemotaktisch auf alle CD4-Rezeptor exprimierenden peripheren Immunzellen. Auf CD4+ T-Zellen wirkt es als Wachstumsfaktor, wobei es alleine nicht die Zellproliferation initiieren kann (107). IL-16 scheint eine Aktivierung des T-Zellrezeptorsignals dosisabhängig inhibieren zu können. Das gilt sowohl bei antigenspezifischer als auch bei genereller Aktivierung über den CD3-Rezeptor. Dies geschieht vermutlich sowohl über ein inhibitorisches Signal als auch über eine Störung des CD4-Rezeptors im Komplex mit dem T-Zellrezeptor. Interessanterweise wird nach IL-16 Inkubation und anschließender Aktivierung Fas (CD95) nicht hochreguliert (108). Dies könnte eine Erklärung für einen reduzierten CD95-vermittelten programmierten Zelltod (activation-induced cell death) sein.
15 1.7Biomarker zur Vorhersage des natürlichen Verlaufs der akuten Hepatitis C Virusinfektion Die Besonderheit der aHCV bei einem kleineren Teil der Patienten spontan auszuheilen, jedoch in den meisten Fällen eine chronische Infektion hervorzurufen, hat schon früh das Forschungsinteresse auf verlässliche, prädiktive Marker zur Verlaufsvorhersage gelenkt.
Insbesondere die Aussicht, auf die schwerwiegenden unerwünschten Wirkungen der IFN- basierten Therapie verzichten zu können, ist wünschenswert. Sollte die Standardtherapie der aHCV künftig aus DAAs bestehen, würde dieser Grund weniger schwer wiegen, allerdings kommt hier ein finanzieller Aspekt zum Tragen. Entsprechend scheint die Suche nach prädiktiven Markern weiter sinnvoll: zum einen aus gesundheitsökonomischen Gründen, zum anderen lassen sich Erkenntnisse oft auf andere virale Erkrankungen wie die Infektionen mit HBV, HEV und HIV übertragen. Gegebenenfalls ließe sich mit neuen Markern auch die Therapie mit DAAs verfeinern. Trotz intensiver Bemühungen konnte bisher kein solch verlässlicher, klinischer oder biochemischer Marker gefunden werden. Weder ein einzelner Marker, noch ein Score bestehend aus mehreren Parametern, hat bisher den Weg in die klinische Anwendung gefunden. Es konnten jedoch für einige Marker und wirtsspezifische Merkmale gezeigt werden, dass sie mit einer Ausheilung assoziiert sind. Dazu gehören beispielsweise ein geringeres Alter, ein symptomatischer Verlauf, das weibliche Geschlecht, ethnische Zugehörigkeit, die Viruslast zu Beginn der Erkrankung, der KIR2DL3/HLA-C1, sowie noch einige mehr (80,109–112).
Insbesondere Polymorphismen auf Chromosom 19 in den Regionen q13.12 und q13.13, welche für verschiedene Versionen des IFN-λ codieren, sind stark mit SVR assoziiert (113). Konkret konnte das für die zwei Einzelnukleotid-Polymorphismen (single nucleotide polymorphisms, SNPs) rs12979860 und rs8099917, die für IFN-λ3 (IFNL3 auch bekannt als IL28B) codieren, gezeigt werden (58,114,115). Außerdem wurde beschrieben, dass ein niedriger Plasmaspiegel des Chemokines IP10 (CXCL10) in Zusammenhang mit einer Ausheilung steht (116). Zudem scheint die Kombination aus SNPs sowie Varianten des und IP10, sowie Varianten des HLA-DR, HLA-B, HLA-C und KIR den prädiktiven Wert zu erhöhen (117).
16 1.8Vorarbeiten der wissenschaftlichen Arbeitsgruppe zu Immunantworten bei der akuten
Hepatitis C
In der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. WEDEMEYER wurde gemeinsam mit Frau Dr. HENGST und Frau Dr. SCHLAPHOFF nach einem prädiktiven Marker zur Vorhersage des natürlichen Verlaufes der aHCV gesucht (100). Gleichzeitig wurde dabei die Immunantwort auf das HCV detailliert untersucht. Zur Verfügung standen Proben aus der akuten HCV III Studie, einer prospektiven Multicenter Doppelblindstudie (ISRCTN88729946, www.isrctn.com) (48) in der Patienten mit akuter symptomatischer HCV Infektion rekrutiert wurden. In einem Studienarm wurden die Patienten nach Diagnose (baseline) für zwölf Wochen (W12) beobachtet. Falls sie zu diesem Zeitpunkt HCV-RNA positiv waren, werden sie als non clearer (NC) klassifiziert und wurden mit pegIFN-α und Ribavirin behandelt. Patienten, die an W12 HCV-RNA negativ waren, wurden weiterhin beobachtet und galten als spontaneous clearer (SC). Mit den Proben wurde eine umfangreiche Phänotypisierung von NK- und T-Zellen, sowie eine breite Analyse von löslichen Immunmediatoren durchgeführt. So entstand ein detailliertes Bild der Immunantwort auf mehreren Ebenen mit der Möglichkeit, den Pathomechanismus der viralen Persistenz weiter zu ergründen. Die Ergebnisse dieser Vorarbeiten sind auf Kongressen vorgestellt (EASL, London 2014) und veröffentlicht (118).
1.8.1 Veränderte Zellpopulationen bei der akut symptomatischen Hepatitis C Virusinfektion Es wurden PBMCs von insgesamt 22 Patienten und von mehreren Zeitpunkten aus der oben beschriebenen Studie mittels Durchflusszytometrie charakterisiert. Hierbei konnte erstmals ein interessantes Phänomen beschrieben werden. Die Frequenz der CD3+ T-Lymphozyten war zur baseline bei den NC im Vergleich zu den SC Patienten, deutlich erniedrigt. Hierfür war die Subpopulation der CD4+ T-Zellen verantwortlich (siehe Abbildung 8). Die verbleibenden CD4+
T-Zellen waren bei den NC zudem stärker aktiviert, erkennbar an erhöhter HLA-DR und CD154 Expression auf der Zelloberfläche. Die Subpopulation der CD8+ T-Zellen unterschied sich hingegen kaum (siehe Abbildung 9).
18 Des Weiteren wurde beschrieben, dass die Frequenz der CD3- CD56+ NK-Zellen in den NC tendenziell erhöht ist, was auf die CD56dim NK-Zell Subpopulation zurückzuführen war (siehe Abbildung 9). Zudem war die Perforin Expression in NK-Zellen von NC erhöht, was eine gesteigerte Zytotoxizität gegenüber Zielzellen impliziert (119).
Betrachtet man beide Phänomene zusammen und bildet den Quotienten aus verminderten Frequenz von CD4+ T-Zellen und erhöhten NK-Zellen bei NC im Vergleich zu SC, so ergibt sich ein signifikanter Unterschied (siehe Abbildung 9). Bei einem Quotienten aus CD8+ T- und NK- Zellen gibt es hingegen keinen Unterschied (siehe Abbildung 9).
1.8.2 Das Verhältnis verschiedener löslicher Immunmediatoren zueinander unterscheidet sich nach dem klinischem Verlauf der akuten Hepatitis C Virusinfektion
Die Regulation und Assoziation zwischen den einzelnen unterschiedlichen SIMs während der aHCV Infektion wurde mithilfe der Software R untersucht, indem die Korrelationen der löslichen Immunmediatoren untereinander sowohl in NC als auch in SC geprüft wurden (siehe Abbildung 10A).
Zum Zeitpunkt der baseline wurde ersichtlich, dass bei NC, im Vergleich zu SC das entzündliche Milieu verändert war. Bei SC waren viele positive Korrelationen zwischen den einzelnen Modulatoren zu beobachten (dargestellt mit blauen Kreisen), mit einer offensichtlichen Gruppenbildung. Ein anderes Bild wurde bei den NC deutlich. Positive und negative Korrelationen sind hier seltener zu finden. Im Vergleich zwischen NC und SC stachen besonders IL-16, IFN-α, GRO-α, sICAM-1 und MCP-3 heraus (siehe Abbildung 10B).
20 1.9Ziel der Arbeit
Das Besondere an der akuten Hepatitis C Virusinfektion ist, dass sie bei einem Teil der Patienten ausheilt und in einem im anderen größeren Teil zur chronischen Infektion führt. Bisherige Versuche einen prädiktiven Marker für die Ausheilung zu finden, um nur die Patienten zu behandeln, welche die akute HCV Infektion nicht spontan ausheilen würden, waren nur eingeschränkt erfolgreich. Daher war es mein Ziel solche neue potentielle Marker zu identifizieren.
Das Phänomen der verminderten CD4+ T-Zell:NK-Zell Ratio zwischen spontan ausheilenden Patienten (SC) und nicht ausheilenden Patienten (NC) in aHCV ist bisher nicht beschrieben worden. Gleichzeitig haben wir herausgefunden, dass sich das Immunmilieu der löslichen Immunmediatoren zwischen diesen beiden Patientengruppen unterscheidet. Mein zweites Ziel war es daher, zu ergründen inwieweit die CD4+ T-Zell:NK-Zell Ratio mit dem veränderten Zytokinmilieu in Zusammenhang stehen und ob sich hierdurch der Pathomechanismus der viralen Persistenz bei HCV Infektion erklären lässt.
21
2. Material und Methoden
2.1Patientenproben
Es wurden 26 Patientenproben aus der akuten HCV III Studie, einer prospektiven doppelblinden Multicenterstudie eingeschlossen (ISRCTN88729946, www.isrctn.com) (48). Für die immunologischen Untersuchungen mit den Patientenproben aus dieser Studie lag ein - Ethikvotum vor (Nr.3272 Medizinische Hochschule Hannover Ethik-Kommission). In dieser Studie wurden Patienten mit akuter symptomatischer HCV Infektion rekrutiert. In einem Studienarm wurden die Patienten nach positiver akuter HCV Diagnose (baseline) für zwölf Wochen (W12) beobachtet. Falls sie zu diesem Zeitpunkt weiterhin HCV-RNA positiv waren, werden sie im Folgenden als non clearer (NC) definiert (n=13).
Mittelwert der NC
Mittelwert
der SC p - Wert Anzahl von
Patienten
13 13 > 0,99
Geschlecht (m/w) 10/3 3/9 0,017 Alter in Jahren 41,62 42,75 0,93 Viruslast (BL IU/ml) 626.576 20.710.000 0,96
ALT (ULON) 34,23 31,42 0,68
AST (ULON) 17,08 22,67 0,56
γ-GT (ULON) 7,692 8,833 0,93 Bilirubin (ULON) 4,769 5,583 0,58 Kreatinin (ULON) 1 1 > 0,99
Hb g/dl 15,15 14,61 0,19
Leukozyten(tsd/ml) 7,387 6,981 0,5 Thrombozyten
(tsd/ml)
285,3 264,8 0,61
Quick (%) 93,62 100,8 0,04
Tabelle 1: Klinische Charakteristik von Patienten mit aHCV aufgeteilt in NC und SC zur baseline Abkürzungen: ALT, Alanin-Aminotransferase; AST, Aspartat-Aminotransferase; γ-GT, Gamma- Glutamyltransferase; Hb, Hämoglobin
Sie wurden dann mit pegIFN-α und Ribavirin behandelt. Waren die Patienten an W12 HCV-RNA negativ, werden sie als spontanes clearer (SC) definiert (n=13). Diese Patienten wurden weitere 24 Wochen beobachtet und bei positiver HCV-RNA ebenfalls mit pegIFN-α und Ribavirin
22 behandelt. Es wurden von 21 Patienten Serum- bzw. Plasmaproben, sowie von allen 26 Patienten PBMCs an BL und W12 gesammelt.
2.2Stimulation von PBMCs von gesunden Blutspendern mit verschiedenen löslichen Immunmediatoren mit und ohne vorherige Aktivierung
PBMCs wurden aus dem Vollblut von gesunden Spendern an der Medizinischen Hochschule Hannover mittels Dichtegradientenzentrifugation mit Ficoll als Trennlösung mit 300 g über 20 Minuten sedimentiert, entnommen und zweimalig mit phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) gewaschen. Eine repräsentative Probe wurde mit 0,2 % Trypanblau Puffer gefärbt und mit dem Nexcelom CellOMeter (PEQLab) gezählt. Im Anschluss wurden die PBMCs in Teilen von 15 x 106 bis 20 x 106 Zellen in Freezing Medium (60 % hitzeinaktiviertem fetal calf serum, 30 % RPMI, 10
% sterilem endotoxinfreiem DMSO) zuerst bei -80 °C in einem Isopropanolbehälter und anschließend in Flüssigstickstoff bei -196 °C kryokonserviert. Zum Gebrauch wurden die Zellen mit PBS aufgetaut und einmalig gewaschen. Die PBMCs wurden für vier Stunden, einen, drei und sieben Tage in einer Konzentration von 3x106 Zellen/ml bei 37 °C mit 5 % CO2 in AB Medium (Medium RPMI-1640 ergänzt mit 10 % humanen AB Serum, 1 % nicht essentiellen Aminosäuren, 1 % Pyruvat, 1 mM L-Glutamin, 5 mM HEPES und 0.1 mg/ml Penicillin/Streptavidin) kultiviert. Stimuliert wurden sie in Duplikaten entweder mit IL-16 (5 ng/ml und 50 ng/ml), IFN-α (100 ng/ml), sICAM-1 (50 ng/ml), GRO- α (5 ng/ml und 50 ng/ml) oder MCP-3 (5 ng/ml und 50 ng/ml) (Alle von der Firma PeproTech). Im Anschluss wurden NK und T-Zellen und auf Apoptose analysiert (siehe 2.5 und 2.6).
In einer nächsten Testreihe wurden die Zellen während der Stimulation mit löslichen Immunmediatoren gleichzeitig mittels anti-CD3 und anti-CD28 gebundenen Microbeads (Miltenyi Biotec) in einem 1:4 Bead:Zell Verhältnis aktiviert. Hierbei wurden folgende lösliche Immunmediatoren in unterschiedlichen Konzentrationen verwendet: sICAM-1 (5, 50, 100, 500 ng/ml), IL-16 (5, 50, 100, 500 ng/ml) GRO-α, (5, 50, 100 ng/ml) und INF- α (5, 50, 100 ng/ml).
Die Inkubationszeit betrug entweder einen oder vier Tage. Anschließend wurden NK- und T- Zell mittels Durchflusszytometrie analysiert (Siehe 2.5 und 2.6). Die restlichen Bedingungen entsprachen der ersten Testreihe.
23 2.3NK-Zell und CD4+ T-Zell Isolation und in vitro Kultivierung
PBMCs wurden von akut und chronisch infizierten HCV Patienten aus der Hepatitis Studien- Ambulanz der Klinik für Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie der Medizinischen Hochschule Hannover, sowie gesunden Individuen gesammelt. Alle Individuen willigten schriftlich in den Gebrauch ihrer Proben für Forschungszwecke ein. PMBCs wurden vom Vollblut mittels Dichtegradientenzentrifugation mit Ficoll als Trennlösung sedimentiert, entnommen, zweimalig mit PBS gewaschen und gezählt. Im Anschluss wurden sie in Teilen von 15 x 106 bis 20 x 106 Zellen in Freezing Medium (60 % hitzeinaktiviertem fetal calf serum, 30 % RPMI-Medium, 10 % sterilem endotoxinfreiem Dimethylsulfoxid) zuerst über Nacht bei -80 °C in einem Isopropanolbehälter und anschließend in Flüssigstickstoff bei -196 °C bis zum Gebrauch kryokonserviert. Zur Isolierung der Zellpopulation wurden PBMC aufgetaut und die CD4+ T-Zellen mittels antikörpergebundener MicroBeads (Miltenyi Biotec) positiv selektiert. Im Anschluss wurde aus der Negativfraktion mithilfe des NK Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec) die NK-Zellen durch negative Isolation separiert. Die CD4+ T-Zellen und NK-Zellen wurden jeweils für 20 Stunden in einer Konzentration von 3x106 Zellen/ml bei 37 °C mit 5 % CO2 kultiviert. CD4+
T-Zellen wurden zusätzlich mittels anti-CD3 und anti-CD28 gebundenen Microbeads (Miltenyi Biotec) in einem 1:10 Bead:Zell Verhältnis mit 5 IU/ml rekombinanten humanen IL-2 (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) in AB Medium in 24-Well Platten aktiviert (akt. CD4). Es gab verschiedene Konditionen. In der Ersten wurde rekombinantes humanes IL-16 (PreProTech) in einer Konzentration von 500 ng/ml zugefügt (akt. CD4+ + IL16), in der Zweiten rekombinantes humanes IFN-α (PreProTech) in einer Konzentration von 100 ng/ml (akt. CD4+ + INF-α) und in der Dritten beide Zytokine (akt. CD4+ + IL16 + INF-α). NK-Zellen wurden abhängig von der Menge der isolierten Zellen entweder in 96-, 48- oder 24-Well Platten kultiviert und mit 100 IU/ml rekombinanten humanen IL-2 (Invitrogen) (akt. NK) und teils zusätzlich 100 ng/ml rekombinanten humanen IFN-α (PreProTech) (akt. NK + INF-α) aktiviert. Beide Zellpopulationen wurden auch mit AB-Medium als Negativkontrolle inkubiert (Medium Kontrolle).
24 Abbildung 11: Versuchsschema der Isolation und Aktivierung von CD4+ T-Zellen und NK-Zellen
2.4Ko-Kultur von CD4+ T-Zellen und NK-Zellen
Nach der Aktivierung wurden die Zellen gezählt und in einer Konzentration von 1,5x106 Zellen/ml in AB-Medium resuspendiert. Die Experimente wurden nur fortgesetzt wenn mehr als 90 % der Zellen vital waren. Autologe CD4+ T-Zellen und NK-Zellen wurden in 96-Well Platten in unterschiedlichen Effektor/Zielzell Verhältnissen mit 2µl/Well FITC-labelled anti- CD107a Antikörpern (BD Pharmingen) für 3 Minuten bei 300 g zur Sedimentation zentrifugiert und dann für 4 Stunden bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Nach 210 Minuten wurden 2 µM BrefeldinA (Sigma-Aldrich, Germany) für weitere 30 Minuten hinzugefügt. Vor der Oberflächenfärbung wurden 100.000 Counting Beads (Spherotech, Lake Forest, IL) hinzugefügt.
25 Abbildung 12: Schema des Versuchsaufbaus zur Ko-Kultivierung von CD4+ T-Zellen und NK- Zellen
2.5Analyse der Zelloberflächenmarker und der Zellapoptose mittels Durchflusszytometrie Vor der Oberflächenfärbung wurden die Zellen mit PBS gewaschen und dann in PBS mit 2 % fetal calf serum und 0.05 % Natriumazid resuspendiert. Alle Oberflächenfärbungen wurden bei Raumtemperatur in Dunkelheit für 20 min durchgeführt. Die Annexin V Färbung wurde mit PE- gekoppeltem Annexin V (BD Pharmingen) nach dem Herstellerprotokoll durchgeführt. Dabei wurden die Zellen in einer Konzentration von 3x106 Zellen/ml im Bindungs-Puffer für 15 Minuten in Dunkelheit gefärbt. Anschließend wurden alle Zellen direkt am BD fluorescence- activated cell sorting (FACS) Canto II (Becton Dickinson, Heidelberg, Germany) akquiriert. Die FACS Daten wurden mit FlowJo v9.4 Software (TreeStar Inc., San Diego, CA, USA) analysiert.
NK-Zellen wurden aus PBMCs nach dem Ausschluss von Doubletten wie folgt identifiziert:
Lymphozyten mithilfe des FSC/SSC Gates, CD14negCD19negCD3negCD56pos; CD4 Zellen wurden aus PBMCs nach dem Ausschluss von Doubletten wie folgt identifiziert: Lymphozyten mithilfe des FSC/SSC Gates, CD14negCD19negCD56negCD3posCD4pos. Bei den Ko-Kulturexperimenten wurden die Doubletten ausgeschlossen und die Lymphozyten mithilfe des FSC/SSC Gates identifiziert und aus diesen direkt die CD4pos und CD56posZellen identifiziert. Zur Identifizierung NKG2D, NKG2A, MIC-A/B, HLA-E, HLA-DR+, CD38+ und CD69+ Zellen wurden fluorescence minus one (FMO) Kontrollen verwendet.
26 2.6Statistische Analyse
Die statistischen Analysen wurden mit der GraphPad Software (La Jolla, CA, USA) durchgeführt.
Mittels D’Agostino -Pearson Test (bei n ≥ 5) oder Kolmogorow-Smirnow-Test (bei n ≤ 5) wurde analysiert, ob die Werte der Gaußschen Normalverteilung entsprachen. War dies der Fall, folgte ein (un-)gepaarter t-Test gefolgt von einem F-Test. Unterschieden sich die Varianzen signifikant, wurde der t-Test mit Welch´s Korrektur durchgeführt. Waren die Werte nicht normalverteilt, wurde der Wilcoxon matched-pairs signed rank Test verwendet. Signifikanzen werden wie folgt dargestellt: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001; **** p<0,0001
27
3. Ergebnisse
3.1Assoziation von löslichen Immunmediatoren mit dem klinischen Verlauf der akuten Hepatitis C Virusinfektion
Die Serumkonzentration von SIMs der Patienten wurde mittels LUMINEX-based multiplex technology (BioPlex Pro Human Cytokine Panel; Bio-Rad, Hercules, CA) von HENGST bestimmt und von SCHLAPHOFF normiert (118). Um herauszufinden inwieweit bestimmte SIMs mit dem Verlauf der akuten HCV Infektion in Zusammenhang stehen, habe ich die SIM Expression in Patienten, welche spontan ausheilten (SC), mit Patienten, die nicht ausheilten (NC), zur baseline verglichen.
Abbildung 13: Die normierte Serumkonzentration ausgewählter löslicher Immunmediatoren zur baseline im Vergleich zwischen Ausheilern und nicht Ausheilern
Die roten Balken markieren den Mittelwert. Die Symbole repräsentieren eine Messung jeweils eines Patienten. (NC, n=13 (Ein Wert wurde jeweils bei GRO-α, MCP-3 und TNF-α exkludiert, da sie nach den Grubbs' Test als Ausreißer identifiziert wurden; SC, n=13 (Ein Wert wurde jeweils bei MCP-3 und TNF-α exkludiert, da sie nach den Grubbs' Test als Ausreißer identifiziert wurden).
28 Das Zytokin IFN-α war signifikant unterschiedlich und die Expression war in NC erhöht. Das Chemokin IP-10 (CXCL10), dem in Studien ein prädiktiver Wert bei Behandlung der HCV Infektion nachgewiesen wurde, wies in unserer Kohorte keinen signifikanten Unterschied auf (siehe Abbildung 13).
Kein weiteres SIM, das nach der Korrelationsanalyse von HENGST zwischen NC und SC verändert war (siehe Abbildung 10), korrelierte in dieser Analyse mit dem Mann-Whitney-Test signifikant mit dem klinischen Verlauf.
3.2Auswirkung von löslichen Immunmediatoren auf PBMCs von gesunden Blutspendern In der Vorarbeit konnte HENGST zeigen (EASL, London 2014) (118), dass sich die CD4+ T-Zell:NK- Zell Ratio (CD4+:NK Ratio) bei der aHCV zwischen NC und SC unterscheidet (siehe Abbildung 9).
Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass das Milieu der löslichen Immunmediatoren in diesen beiden Patientengruppen sehr unterschiedlich war (siehe Abbildung 10). Als nächstes wurde untersucht, ob ein SIM für die veränderte CD4+:NK Ratio verantwortlich sein könnte.
Abbildung 14: Korrelation von β-NGF und IFN-α aus normierten Serumproben zur baseline zu der jeweiligen CD4+ T-Zell:NK-Zell Ratio
Die Dreiecke repräsentieren jeweils einen Patienten. Die schwarze Linie zeigt die lineare Regression von β-NGF (links) IFN-α (rechts) zur CD4+T-Zell:NK-Zell Ratio. (n=21 (NC und SC))
Hier zeigte sich eine signifikante negative Korrelation von beta nerve growth factor (β-NGF), einem Nervenwachstumsfaktor mit immunregulatorischen Eigenschaften (120), mit der
29 CD4+:NK Ratio (siehe Abbildung 14 links). Interessanterweise konnte derselbe Trend für IFN-α beobachtet werden (siehe Abbildung 14 rechts).
Um in einem ersten Schritt zu untersuchen welche Effekte die in der in der Korrelationsanalyse identifizierten SIMs IFN-α, IL-16, GRO-α, MCP-3 und ICAM-1 auf die zelluläre Immunantwort haben, wurden PBMCs von gesunden Blutspendern mit diesen in unterschiedlicher Konzentration stimuliert und mit Medium Kotrollen verglichen. Um die optimale Dauer der Stimulation herauszufinden, wurden die PBMCs für vier Stunden, einen, drei und sieben Tage mit dem jeweiligen löslichen Immunmediator inkubiert. Die Auswertung erfolgte mittels FACS Analysen. Als Aktivierungsmarker auf CD4+ T-Zellen und CD8 + T-Zellen wurden CD25, CD138 verwendet, sowie PD1 als Inhibitionsmarker (Daten werden nicht gezeigt). Auf NK-Zellen und CD3+ T-Zellen wurden HLA-DR, CD69 und CD38 als Aktivierungsmarker gemessen. IFN-α führte zu einer erhöhten Aktivierung der NK- und T-Zellen (siehe Abbildung 15). Für IL-16, GRO-α, MCP-3 und ICAM-1 konnten keine deutliche Effekte auf den Aktivierungsstatus, in den verwendeten Konzentrationen, gemessen werden (Daten werden nicht gezeigt). Zusätzlich wurde mittels einer Annexin V Färbung geprüft, ob die 5 oben genannten SIM´s einen direkten Einfluss auf die Apoptose der oben betrachteten Zellreihen hat. Dies war nicht der Fall (Daten werden nicht gezeigt).
Abbildung 15: Der Effekt von IFN-α auf PBMCs von gesunden Blutspendern
Die grünen Vierecke repräsentieren die Medium Kontrolle und die roten Kreise repräsentieren die Kondition mit 100 pg/ml IFN-α (n=3, für 7 Tage n=2). Die roten Linien repräsentieren die Mittelwerte.
30 Um zu prüfen, ob neben der Stimulation mit einem SIM noch ein zusätzliches stimulierendes Signal benötigt wird, wurden die T-Zellen zusätzlich über den T-Zellrezeptor mit anti-CD3 und anti-CD28 Beads aktiviert (siehe Abbildung 16 und 17) und die Expression von unterschiedlichen Zelloberflächenmarkern analysiert. Das Verhältnis der Zellpopulationen zueinander war nicht beeinflusst (Daten werden nicht gezeigt). Es ist bekannt, dass aktivierte NK-Zellen aktivierte CD4+ T-Zellen in die Apoptose treiben können (84–86). Daher ist meine Haupthypothese, dass es in NC zur NK Zell-vermittelten Apoptose der CD4+ T-Zellen kommt.
Wichtig bei diesem Effekt scheint der Aktivierungsstatus der Zellen zu sein, weshalb insbesondere dieser verglichen wurde. (siehe Abbildung 15, 16 und 17). Im Vergleich zur (aktivierten) Kontrolle sieht man deutlich, dass IFN-α die NK- und CD3+ T-Zellen zusätzlich aktiviert, wobei dies bei den CD3+ T-Zellen insbesondere die CD4+ T-Zellen sind (siehe Abbildung 16).
Bei GRO-α ist nach einem Tag eine Aktivierung der Zellen mit statistischer Signifikanz zu sehen, welche bis zu Tag drei deutlich abfällt. sICAM-1 schien die Zellen eher zu inhibieren, zeigte aber kein einheitliches Bild. Nach der Stimulation mit IL-16 konnte man insbesondere in der höchsten Konzentration von 500 pg/ml eine verminderte Aktivierung der CD3+ T-Zellen feststellen (siehe Abbildung 17). Die Aktivierungsmarker HLA-DR und CD38 ergaben ein ähnliches Bild (Daten werden nicht gezeigt). Auffallend war die überall zu beobachtende hohe Standardabweichung zwischen den Individuen. Rezeptormoleküle, die für eine gesteigerte (NKG2D) oder verminderten (NKG2A) NK Zell Zytotoxizität stehen, waren nicht verändert.
Genauso wenig waren deren jeweiligen Liganden (MIC-A/B und HLA-E) auf den T-Zellen verändert (Daten werden nicht gezeigt).
Ein weiterer Grund für die veränderte CD4+:NK Zell Ratio im Blut könnte die Migration der CD4+
T-Zellen in die Leber, dem Ort der Entzündung und Virusreplikation sein. Die Expression des Chemokinrezeptors CXCR3, welcher zu diesem Zweck auf T-Zellen exprimiert wird (121), veränderte sich allerdings nicht nach der Stimulation mit den verwendeten SIMs (Daten werden nicht gezeigt).
33 3.3Einfluss von löslichen Immunmediatoren auf die CD4+:NK-Zell Ratio
Die Stimulation von CD4+ T-Zellen und NK-Zellen mit verschiedenen SIMs konnte die veränderte CD4+:NK Ratio, die wir in Patienten mit aHCV beobachteten, nicht erklären. Aus diesem Grund wurde Apoptose-Assay etabliert. Hierfür wurden CD4+ T-Zellen und NK-Zellen isoliert, separat aktiviert, mit IFN-α und IL-16 stimuliert und letztlich ko-kultiviert. Für die Dauer der Aktiveierung und Ko-kultivierung orientierte ich mich an NIELSEN et al. (86). Anschließend wurde die Apoptose der CD4+ T-Zellen, die Degranulation der NK-Zellen und der Aktivierungsstatus beider Zelltypen gemessen. Ich konzentrierte mich auf diese beiden SIM´s, da durch IFN-α sowohl CD4+, CD8+ T-Zellen als auch NK-Zellen aktiviert wurden. IL-16 verursachte, insbesondere in der höchsten Konzentration, eine reduzierte Aktivierung der CD3+ T-Zellen.
Interessant ist an diesem Chemokin ferner, dass es über den CD4-Rezeptor wirkt. CRUIKSHANK et al. beobachteten ebenfalls eine verminderte Aktivierung bei anti-CD3 Stimulation, sowie zusätzlich bei T-Zellrezeptor-Stimulation (104,108).
3.3.1 Effekte auf CD4+ T-Zellen
LANG et al., WAGGONER et al. und NIELSEN et al. (84–86) haben gezeigt, dass nur aktivierte NK-Zellen auch aktivierte CD4+ T-Zellen in die Apoptose treiben können. Falls eine Zellpopulation nicht aktiviert ist, geht dieser Effekt verloren (86). Deshalb wurden nach der Separation die NK-Zellen mit IL-2 und die CD4+ T-Zellen mit IL-2, anti-CD3 und anti-CD28 Beads über 20 Stunden aktiviert und anschießend immer für 4 Stunden ko-kultiviert. Eine Zunahme der CD4+ T-Zellapoptose ist erst in höheren Effektor:Zielzellratios (E:Z Ratio) im Vergleich zur Medium Kontrolle zu beobachten. Wurden die NK-Zellen zusätzlich mit IFN-α inkubiert, steigerte sich die Zahl apoptotischer CD4+ T-Zellen (siehe Abbildung 18 A). In der E:Z Ratio von 1:10 war dieser Effekt signifikant unterschiedlich. Wurden die CD4+ T-Zellen ebenfalls zusätzlich mit IFN-α aktiviert, kam es zu einer weiteren minimalen Steigerung der Apoptoserate (siehe Abbildung 18 B). Erstaunlicherweise hatte die Zugabe von IL-16 bei der CD4+ T-Zell Aktivierung einen gegenteiligen Effekt. In niedrigen E:Z Ratios, ähnlich den physiologischen Bedingungen im peripheren Blut, schützte es die CD4+ T-Zellen signifikant vor der Apoptose (siehe Abbildung 17 C). Die Apoptoserate liegt dann auf dem Niveau der Medium Kontrolle.
Interessanterweise ist dieser Effekt bei einer E:Z Ratio von 1:10 am stärksten ausgeprägt und
34 bis zu einer Ratio von 1:2 vorhanden. In der höchsten Ratio von 1:1 sieht man keinen Unterschied. Dort scheint die große Menge an NK-Zellen den schützenden Effekt zu egalisieren.
Inkubiert man die CD4+ T-Zellen mit IFN-α und IL-16, so geht der protektive Effekt von IL-16 verloren. Die Apoptoserate ist dann ähnlich den alleinig mit IFN-α inkubierten CD4+ T-Zellen (siehe Abbildung 18 D).
Abbildung 18: In vitro NK Zell-vermittelte Apoptose der CD4+ T-Zellen bei gesunden Blutspendern Separate zwanzigstündige Aktivierung von autologen CD4+ T-Zellen und NK-Zellen in den genannt Konditionen. Anschließende vierstündige Ko-kultivierung in unterschiedlichen E:Z Ratios. Es wird der identische Datensatz viermal gezeigt. Die p-Werte stehen in A) für akt. CD4+/akt. NK vs. akt. CD4+/akt.
NK + IFN-α und in C) für akt. CD4+/akt. NK + IFN-α vs. akt. CD4+ + IL-16/akt. NK + IFN-α; Es werden Mittelwert und Standardabweichung gezeigt.
(n=5, außer Medium Kontrolle n=4)
Ohne die Zugabe von NK-Zellen (1:0 E:Z Ratio) kam es in keiner Kondition zu einer signifikanten erhöhten Apoptose der CD4+ T-Zellen. Daher scheinen die aktivierten NK-Zellen die CD4+ T- Zellen abzutöten (siehe Abbildung 18 A-D). Dieser Effekt könnte zielgerichtet sein. Um dies zu
35 prüfen, analysierte ich den Aktivierungsstatus von apoptotischen (Annexin V positiv) und vitalen (Annexin V negativ) CD4+ T-Zellen anhand des Aktivierungsmarkers HLA-DR. Dazu wurden die Konditionen untersucht in denen eine vermehrte CD4+ T-Zellapoptose stattfindet, also CD4+ T- und NK-Zellen aktiviert waren (akt. CD4/akt. NK + INF-α; akt. CD4 + INF-α/akt. NK + INF- α; akt. CD4 + IL-16 + INF-α /akt. NK + INF-α). Die apoptotischen Zellen exprimierten mehr HLA- DR auf der Oberfläche (siehe Abbildung 19 A). Dies legt eine bevorzugte Apoptose aktivierter CD4+ T-Zellen nahe und bestätigt somit die Beobachtungen anderer (84–86).
Abbildung 19: Aktivierungsstatus der CD4+ T-Zellen bei gesunden Blutspendern
A) Vergleich der HLA-DR Expression von Annexin V positiven (gestrichelte Linien) und Annexin V negativen (durchgezogene Linien) CD4+ T-Zellen nach separater zwanzigstündige in vitro Aktivierung von autologen CD4+ T-Zellen und NK-Zellen. Im Anschluss vierstündige Ko-kultivierung in unterschiedlichen E:Z Ratios in den genannt Konditionen. (n=5).
B) HLA-DR Expression auf CD4+ T-Zellen nach zwanzigstündiger in vitro Aktivierung und anschließender vierstündiger Kultivierung ohne NK-Zellen (E:Z Ratio 0:1). Jedes Symbol steht für einen Messwert, für jedes n = 2 Messwerte bei Verwendung von Duplikaten.
(n=5, außer Medium Kontrolle n=4). Es werden Mittelwerte gezeigt (A und B) und Standardabweichungen (B) gezeigt.
Auffällig ist allerdings, dass der Aktivierungsstatus der IL-16 stimulierten CD4+ T-Zellen sich nicht von den allein aktivierten unterscheidet (siehe Abbildung 19 B). Die IFN-α stimulierten CD4+ T-Zellen sind interessanter Weise weniger aktiviert als die alleinig mit anti-CD3 und anti- CD28 Beads aktivierten Zellen (siehe Abbildung 19 B). Gleichzeitig werden sie vermehrt in die
36 Apoptose getrieben (siehe Abbildung 18 B). Die weitere Zugabe von IL-16 scheint das Aktivierungslevel nicht zu verändern (siehe Abbildung 19 B). Die Beobachtungen machen deutlich, dass eine Aktivierung der CD4+ T-Zellen nötig ist, um sie zu Zielzellen der aktivierten NK-Zellen zu machen. Jedoch beeinflusst ein weiterer, bisher unbekannter Mechanismus auf CD4+ T-Zell Seite die Zytotoxizität der NK-Zellen stark. Die Zytotoxizität scheint sich durch IL-16 zu vermindern und durch IFN-α zu erhöhen. Zudem egalisiert die Stimulation mit IFN-α den protektiven Effekt von IL-16.
3.3.2 Effekte auf NK-Zellen
Um zu bestätigen, dass NK-Zellen direkt für die CD4+ T-Zellapoptose verantwortlich sind, wurde die Apoptose indirekt auf Ebene der NK-Zellseite über den Marker CD107a gemessen. CD107a ist ein Oberflächenmarker für die Degranulation der zytotoxischen Zellen.
Im Einklang mit den bisherigen Ergebnissen steigt die Rate an CD107a positiven NK-Zellen, wenn diese zusätzlich zu IL-2 mit IFN-α aktiviert werden. In den E:Z Ratios 1:5 und 1:2 ist dieser Anstieg signifikant (siehe Abbildung 20 A).
Es überrascht, dass NK-Zellen weniger degranulieren wenn sie auf CD4+ T-Zellen treffen, die zusätzlich mit IFN-α aktiviert wurden (Abbildung 20 B). Spannend ist der Vergleich der NK-Zell Degranulation nach der Ko-Kultur mit CD4+ T-Zellen, die mit oder ohne IL-16 stimuliert wurden.
In diesem Fall vermindert IL-16 die Degranulation der NK-Zellen (siehe Abbildung 20 C).
Insbesondere in der 1:5 E:Z Ratio ist dies sichtbar und statistisch signifikant. Genauso wie in den bisherigen Ergebnissen geht bei einer gleichzeitiger IL-16 und IFN-α Stimulation der CD4+ T- Zellen dieser Effekt verloren (Abbildung 20 D).
