Aus der Fachrichtung Innere Medizin Klinik für Innere Medizin IV Nieren- und Hochdruckkrankheiten
Universitätsklinikum des Saarlandes, Homburg/Saar Direktor: Prof. Dr. H. Köhler
Individuelle Quantifizierung der Wirkstärke von Calcineurininhibitoren auf T Zellen
und
Durchflußzytometrischer Nachweis xenoreaktiver NK-Zellen
Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin der Medizinischen Fakultät
der UNIVERSITÄT DES SAARLANDES 2007
vorgelegt von Kai Wilhelm van Bentum geboren am 16. Juli 1973 in Kranenburg
Tag der Promotion:
Dekan:
Berichterstatter:
Für meine liebe Frau Gritta und unseren Kindern
sowie meinen Eltern
Publikationen
Teile der Arbeit wurden publiziert:
Rapid identification of preformed alloreactive T cells for use in a clinical setting / Sester, Urban.; Thijssen, Stephan.; van Bentum, Kai; Neumann, F.; Kuboschok, Boris.; Sester, Martina.; Köhler, Hans. In: Transplatation 78 (2004), 706-714
Ergebnisse dieser Arbeit wurden in Form folgender Beiträge als Poster oder Vorträge auf Kongressen vorgestellt:
Individual susceptibility to immunosuppressive effects of calcineurin inhibitors analyzed in whole blood / K. van Bentum, U. Sester, S. Thijssen, M. Girndt, M. Sester, and H. Köhler (2000). Joint Annual Meeting of Immunology 2000 Düsseldorf
Individuelle Quantifizierung der Hemmbarkeit antigenspezifischer Immunantworten - eine neue Strategie zur Dosierung von Immunsuppressiva / K. van Bentum, U. Sester, S.
Thijssen, M. Girndt, M. Sester, and H. Köhler (2001) 45. Jahreskongress der Saarländisch- Pfälzischen Internistengesellschaft e.V. 2001 Saarbrücken; dem 32. Kongress der Gesellschaft für Nephrologie in Münster
Wirkstärken – statt Spiegelbestimmungen – neue Konzepte zur Individualisierung der Immunsuppression / Sester, U., Müller-Lantzsch, C., van Bentum, K., Girndt, M., Sester, M., Köhler, H. (2002) Kongress der deutschen Gesellschaft für Innere Medizin
Differential immunosuppressive effects of cyclosporin A and tacrolimus in combination with steroids / Sester, Urban ; Sester, Martina ; van Bentum, Kai. ; Girndt, Matthias ; Köhler, Hans. - In: J Am Soc.Nephrol., 12 (2001) , 867A
Interindividual variability of the immunosuppressive strength of cyclosporin A and tacrolimus / Sester, Urban ; van Bentum, Kai. ; Thijssen, S. ; Girndt, Matthias ; Sester, Martina ; Köhler, Hans. - In: J Am Soc.Nephrol., 12 (2001) , 868A
Interindividuelle Variabilität der Wirkstärke von Cyclosporin A und Tacrolimus / van Bentum, Kai. ; Sester, Urban ; Thijssen, S. ; Girndt, Matthias ; Sester, Martina ; Köhler, Hans. - In: Nieren- und Hochdruckkrankheiten, 30 (2001) , 424
Humaner T-Zell-Assay zur Quantifizierung der Wirkung von Immunsuppressiva in vivo / Thijssen, Stephan ; Sester, Urban ; Sester, Martina ; van Bentum, Kai ; Gärtner, Barbara ; Girndt, Matthias ; Köhler, Hans. - In: Nieren- Hochdruckkh., 29 (2000) , 417 (Abstract)
Rapid whole blood T-cell assay to quantify the effect of immunosuppressive drugs in vivo / Thijssen, Stephan ; Sester, Urban ; Sester, Martina ; van Bentum, Kai ; Gärtner, Barbara ; Girndt, Matthias ; Köhler, Hans. - In: Am Soc.Nephrol, 11 (2000) , 671A (Abstract)
Zusammenfassung
Die Prognose von organtransplantierten Patienten sowie das Transplantatüberleben konnte durch die Entwicklung neuer Immunsuppressiva, insbesondere durch Calcineurininhibitoren (CNI), in den letzten Jahrzehnten deutlich verbessert werden. Jedoch ist es weiterhin schwierig, eine Überimmunsuppression, die schwerste Infektionen zur Folge haben kann, und eine Unterimmunsuppression, die zur Abstoßung und somit zum Verlust des Transplantats führen kann, zu vermeiden. Hierbei spielen patientenindividuelle Faktoren eine Rolle.
Ziel dieser Arbeit war es daher einen Vollblutassay zu entwickeln und zu charakterisieren, der dem physiologischem Milieu weitestgehend entspricht. Zudem sollte der Assay die Wirkstärke von Immunsuppressiva individuell, schnell und zuverlässig messen, um später in der klinischen Anwendung eine individuell angepaßte Medikamentendosierung vornehmen zu können.
Das Prinzip des Assays besteht aus der durchflußzytometrischen Analyse der Induktion von Zytokinen und deren Hemmung unter Einwirkung von Immunsuppressiva. Hierbei zeigte sich, dass CD4 und CD8 T Zellen individuell in gleichem Ausmaß durch CNI inhibiert wurden. Hinsichtlich der Empfindlichkeit auf CNI fanden sich interindividuelle Unterschiede mit intraindividueller Konstanz. Bei einer Medikamentenkombination von Methylprednisolon und CNI konnte bezüglich des FK506 ein synergistischer Effekt nachgewiesen werden. Bei Cyclosporin A wurde hingegen kein Synergismus festgestellt. Des Weiteren wurde gezeigt, dass mit dem Assay auch eine Quantifizierung der Wirkstärke von CNI im Verlauf nach Transplantation möglich ist. Der hier vorgestellte Vollblutassay ist daher geeignet, um die intraindividuelle Empfindlichkeit auf CNI zu quantifizieren.
In einem weiteren Teil der Arbeit wurde ein von uns etabliertes Protokoll zum Nachweis einer Alloreaktion beim Menschen auf die Anwendung zur Analyse einer Xenoreaktion zwischen Mensch und Schwein übertragen. Da bei der Unverträglichkeit von artfremden Organen zur Zeit die hyperakute sowie die akut humorale Abstoßung im Vordergrund stehen, ist die zelluläre Abstoßung bisher kaum untersucht worden. Wir konnten mit Hilfe einer gemischten Lymphozytenzellkultur aus humanen und porcinen PBMC durchflusszytometrisch nachweisen, dass natürliche Killerzellen maßgeblich an der xenoreaktiven Abstoßung beteiligt sind. Dies könnte für die Zukunft insofern wichtig sein, dass bei Gelingen einer Xenotransplantation die Xenoreaktivität der NK-Zellen vor Transplantation individuell bestimmt werden kann. Zudem könnte auch die Wirkung von Immunsuppressiva, die spezifisch NK-Zellen inhibieren, besser untersucht werden.
Summary
The outcome of transplant patients and the survival of transplanted organs has significantly improved over the last decades because of the development of new immunosuppressive drugs, in particular calcineurininhibitors (CNI). However, it is still difficult to avoid an over- and under-immunosuppression, which can cause severe infections or lead to a rejection of the transplanted organ, respectively. The degree of immunosuppression is influenced by individual patient factors.
The aim of this study was to develop and to characterize a whole blood assay that is very similar to the physiological milieu. In addition, it should be able to measure the inhibitory power of immunosuppressive drugs fast and reliably, allowing for specific adjustment of drug dosages in a clinical setting.
The basis of this assay consists of analysis of the induction of cytokines as well as their inhibition under immunosuppression by flow cytometry. Results showed that individual CD4 and CD8 T-cells were inhibited to the same extent by CNI. There were interindividual differences with intraindividual constancy regarding to the susceptibility to CNI. Combination of CNI and Methylprednisolone resulted in a synergistic effect concerning FK506, whereas combination with Cyclosporin A did not show synergism. Furthermore it was shown that this assay can be used to quantify the immunosuppressive strength of CNI in the post- transplantation period. Finally it was verified that this assay can be used to quantify the intraindividual susceptibility of CNI.
Another part of this thesis dealt with the use of a novel method to show alloreactivity in humans (established at our laboratory) to analyze xenoreactivity between human and pigs.
Since the peracute and acute humoral rejection of species-incompatible organs is currently receiving the most attention, cellular rejection has not been well studied yet. By using a mixed lymphocyte culture consisting of human and porcine lymphocytes we were able to document (with flow cytometry analysis) that natural killer cells are significantly involved in the xenoreactive rejection. This may become important to evaluate individual xenoreactivity of NK-cells prior to transplantation if xenotransplantation becomes possible. Furthermore the impact of immunosuppressive drugs specifically inhibiting NK-cells could be better analysed.
Abkürzungen
α-h Anti-Human Adeno-Ag Adenovirusantigen
APZ antigenpräsentierende Zelle
BFA Brefeldin A
CD cluster of differentiation (Oberflächenantigen)
CD4+ CD4 positiv
CD8+ CD8 positiv
CD16+ CD16 positiv
CMV Cytomegalievirus
CNI Calcineurininhibitor
CyA Cyclosporin A
EthOH Ethanol
FACS Fluorochrom activated cell sorter
FITC Fluoresceinisothio-Cyanat
FK506 Tacrolimus
GRE Glucocorticoid response element INFγ+ Interferon-γ positiv
MA Mausantikörper MP Methylprednisolon
PBMC mononukleäre Zellen des peripheren Blutes PeCy5 Phycoerythrin Cyanin 5
PerCP Peridinin Chlorophyll Protein PFA Paraformaldehyd
SEB Staphylococcus aureus Enterotoxin B TZR T-Zellrezeptor
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung __________________________________________________________ 13 1.1. Transplantation __________________________________________________________ 13 1.2. Abstoßungsreaktionen _____________________________________________________ 13
1.2.1. Xenotransplantation __________________________________________________________ 14
1.3. T-Zellaktivierung und die Bedeutung von Calcineurin __________________________ 15 1.3.1. Vor- und Nachteile der Immunsuppressionstherapie _________________________________ 17
1.4. Calcineurininhibitoren_____________________________________________________ 17 1.5. Dosierung von Calcineurininhibitoren ________________________________________ 19 1.6. Wirkungsmechanismen von Methylprednisolon ________________________________ 20 1.7. In vitro Untersuchungen zur Analyse der Wirkung von Immunsuppressiva _________ 21 1.8. Ziel der Arbeit ___________________________________________________________ 21 1.8.1. Individuelle Wirkstärkenbestimmung von Immunsuppressiva __________________________ 21 1.8.2. Direkte zelluläre Xenoreaktivität ________________________________________________ 22
2. Materialien und Methoden ____________________________________________ 23 2.1. Immunsuppressiva ________________________________________________________ 23 2.2. Antikörper_______________________________________________________________ 23 2.3. Antigene_________________________________________________________________ 24 2.4. Chemikalien und Reagenzien _______________________________________________ 24 2.5. Geräte und Hilfsmittel _____________________________________________________ 25 2.6. Immunsuppressiva ________________________________________________________ 27 2.6.1. Verwendung von FK506 _______________________________________________________ 27 2.6.2. Verwendung von Cyclosporin A_________________________________________________ 27 2.6.3. Verwendung von Methylprednisolon _____________________________________________ 27
2.7. Der Vollblutassay _________________________________________________________ 27 2.7.1. Vorinkubation von Vollblutproben mit Immunsuppressiva ____________________________ 27 2.7.2. Vollblutstimulation ___________________________________________________________ 28
2.8. Fixieren der Zellen nach Vollblutstimulation __________________________________ 28 2.9. Färbung der Zellen________________________________________________________ 29 2.10. Darstellung der Inhibition der T Zellen durch Calcineurininhibitoren _____________ 30 2.11. Xenostimulation humaner PBMC mit PBMC von Schweinen_____________________ 31
2.11.2. Ficoll-Dichtegradient und Isolierung von PBMC ____________________________________ 31 2.11.3. Zellen einfrieren _____________________________________________________________ 32 2.11.4. Zellen auftauen ______________________________________________________________ 32 2.11.5. Zellen zählen ________________________________________________________________ 32 2.11.6. Lyse von Schwein-PBMC______________________________________________________ 33 2.11.7. Stimulation _________________________________________________________________ 33 2.11.8. Fixierung ___________________________________________________________________ 33 2.11.9. Färbung ____________________________________________________________________ 34
2.12. Computerprogramme _____________________________________________________ 34 3. Ergebnisse__________________________________________________________ 35
3.1. Mit SEB-stimulierten T Zellen lässt sich die Wirkstärke von Immunsuppressiva am besten diskriminieren______________________________________________________ 35 3.1.1. SEB-Stimulation versus Adeno-Ag-Stimulation_____________________________________ 35 3.1.2. Die gemessene Wirkstärke von Immunsuppressiva ist unabhängig von der individuellen
Reaktivität auf SEB __________________________________________________________ 37
3.2. Intraassayvarianz _________________________________________________________ 39 3.3. Die Wirkstärke von Calcineurininhibitoren ist in CD4 und CD8 T Zellen vergleichbar 41 3.4. Im einzelnen Individuum besteht eine enge Korrelation zwischen CD4 und CD8 T-
Zellinhibition_____________________________________________________________ 42 3.5. Korrelation von niedrigen und hohen CNI-Dosen ______________________________ 43 3.6. Die Untersuchung der Empfindlichkeit von FK506 und Cyclosporin A im selben
Patienten ________________________________________________________________ 44 3.7. Interassayvarianz _________________________________________________________ 45 3.8. Messung der Wirkstärke von Cyclosporin A in nierentransplantierten Patienten ____ 47 3.9. Quantifizierung der Wirkung von Calcineurininhibitoren in Kombination mit
Methylprednisolon auf T Zellen _____________________________________________ 49 3.10. T-Zell-Reaktivität bei nierentransplantierten Patienten unter CNI- und MP-Therapie 51 3.11. Langzeitnierentransplantierte Patienten haben eine höhere Frequenz an SEB-reaktiven
T Zellen als gesunde Probanden _____________________________________________ 52 3.12. Durchflußzytometrische Analyse der Xenostimulation __________________________ 54 3.12.1. Xenoreaktivität auf intakte PBMC vom Schwein (Modell für direkte zelluläre Xenoreaktion) _ 54 3.12.2. Lysierte PBMC vom Schwein (Modell für indirekte zelluläre Xenoreaktion) ______________ 56
4. Diskussion__________________________________________________________ 57 4.1. Warum eignet sich Vollblut zur Analyse? _____________________________________ 58
4.2. SEB als geeignetes Stimulans zur Quantifizierung der Wirkstärke von
Immunsuppressiva ________________________________________________________ 58 4.3. Geringe Intraassayvarianz _________________________________________________ 59 4.4. Geringe Interassayvarianz__________________________________________________ 59 4.5. Wirkung von CNI auf CD4 und CD8 T Zellen _________________________________ 60 4.6. Die Quantifizierung der intraindividuellen Empfindlichkeit auf CNI ______________ 60 4.7. Wirkstärke von Cyclosporin A in nierentransplantierten Patienten _______________ 62 4.8. Wie wirken Cyclosporin A und FK506 in Kombination mit Methylprednisolon? ____ 63 4.9. Immunsuppression bei nierentransplantierten Patienten mit CNI _________________ 63 4.10. Aktivierte T Zellen bei gesunden und transplantierten Probanden ________________ 64 4.11. Übersicht über bisherige Versuche einer Quantifizierung der Wirkstärke von
Immunsuppressiva in vitro _________________________________________________ 64 4.12. NK-Zellen dominieren bei der Xenoreaktion __________________________________ 66 4.13. Ausblicke ________________________________________________________________ 68 5. Literaturverzeichnis __________________________________________________ 69 6. Dank ______________________________________________________________ 74 7. Lebenslauf _________________________________________________________ 75
1. Einleitung
1.1. Transplantation
Durch die Organtransplantation ist es möglich geworden, das Leben von Patienten mit einer irreversiblen Organerkrankung oder -schädigung zu verlängern und auch ihre Lebensqualität deutlich zu verbessern. Die erste Niere wurde 1954 in Boston von Prof. Murray transplantiert;
die ersten Leber- (Prof. Starzl) und Lungentransplantationen (Prof. Hardy) wurden 1963 sowie die erste Herztransplantation (Prof. Barnard) 1967 durchgeführt.
Dem steigenden Erfolg der Transplantation sowie der stetig verbesserten Immuntherapie und dem steigenden Transplantatüberleben stehen steigende Patientenzahlen auf den Wartelisten gegenüber. Auf Grund der Anzahl von Patienten, die ein Organ benötigen, ist ein Organmangel entstanden. Deshalb gibt es viele Bemühungen, neue Strategien zu entwickeln, diesem Trend entgegenzuwirken. So wurde zum Beispiel das „Old for Old“-Programm entwickelt, bei dem auch Organe von Spendern über einem Alter von 65 Jahren transplantiert werden. Des Weiteren wird daran gearbeitet Organe von Schweinen oder anderen Tieren so zu manipulieren, dass sie auf den Menschen transplantiert werden können. Zudem werden ständig neue immunsuppressive Pharmaka entwickelt.
Eine Strategie, einem Verlust des transplantierten Organs und somit auch einer Retransplantation entgegenzuwirken besteht darin, die Immunsuppression hinsichtlich Zusammensetzung und Intensität fortlaufend zu optimieren.
1.2. Abstoßungsreaktionen
Wird ein Organ eines Individuums einer Spezies (Spender) in den Organismus eines anderen Individuums derselben Spezies (Empfänger) transplantiert, spricht man von einer Allotransplantation. Meist erkennt das Immunsystem des Empfängers das Transplantat jedoch als körperfremdes Gewebe und es kommt zu einer Abstoßung (JANEWAY, TRAVERS, 1999). Dabei unterscheidet man drei Formen der Abstoßungsreaktion: Die hyperakute, die akute und die chronische Abstoßung.
Bei einer hyperakuten Abstoßung binden bestehende Antikörper des Empfängers an auf Endothelzellen exprimierte Major Histocompatibility Komplex (MHC)-Moleküle oder Blutgruppenantigene, was innerhalb von Minuten bis zu wenigen Stunden zum Organversagen führen kann.
Im Gegensatz dazu entwickeln sich akute Abstoßungen in einem Zeitraum von Tagen bis Monaten. Hier liegt vor allem ein zellvermitteltes Geschehen mit humoraler Beteiligung zu Grunde. Dabei gibt es initial zwei verschiedene Wege, die letztendlich zur Organabstoßung führen: Auf der einen Seite gelangen antigenpräsentierende Zellen (APZ) des Spenders, die aus dem Transplantat stammen, in die Lymphknoten des Empfängers, werden dort von alloreaktiven T Zellen des Empfängers erkannt und aktivieren diese. Hierbei handelt es sich um eine direkte Erkennung der Fremdantigene. Demgegenüber werden Fremdantigene von körpereigenen antigenpräsentierenden Zellen aufgenommen und zum Lymphknoten transportiert. Dort treten die APZs in Kontakt mit T-Lymphozyten und präsentieren ihnen die Alloantigene mit Hilfe ihrer MHC II-Moleküle; man spricht von indirekter Erkennung. In beiden Fällen werden die T-Lymphozyten des Empfängers aktiviert und es wird eine Abstoßung initiert (HEEGER, 2003).
Die chronische Abstoßung - auch chronische Transplantatdysfunktion genannt – erstreckt sich zeitlich über Monate bis Jahre und ist meist ein multifaktorielles Geschehen. Durch verschiedene Faktoren wie z. B. vorausgegangene akute Abstoßungsepisoden, Hypertonie, Toxizität der verabreichten immunsuppressiven Pharmaka kommt es zu einer Schädigung des Gefäßendothels im Transplantat mit nachfolgender Arteriosklerose. Des Weiteren kommt es zur Fibrosierung der Glomeruli und Tubuli in der Niere, was letztendlich im Transplantatversagen endet (SAYEGH, 1999); (JANEWAY, TRAVERS, 1999);
(PFITZMANN R. et al., 2001); (JOHNSON, FREEHALLY, 2000).
1.2.1. Xenotransplantation
Unter Xenotransplantation versteht man die Organtransplantation über Speziesgrenzen hinweg. Die Xenotransplantation stellt daher eine weitere Strategie dar, dem Organmangel entgegenzuwirken. Die Forschung der Xenotransplantation konzentriert sich vor allem auf Organe von Schweinen, die in den Menschen transplantiert werden sollen. Schweine sind hinsichtlich der Größe und der Anatomie sowie biologisch und physiologisch dem Menschen ähnlich und recht einfach zu halten. Außerdem lassen sich Schweine genetisch leicht manipulieren (BUCHER et al., 2005) ; (DESCHAMPS et al., 2005).
Nach aktuellem Kenntnisstand ist eine Xenotransplantation jedoch noch nicht mit mittel- oder langfristigem Erfolg möglich. Immunologische und physiologische sowie biochemische Barrieren bewirken eine ausgeprägte Abstoßungsreaktion gegenüber Xenotransplantaten. In Analogie zur Alloreaktion wird zwischen hyperakuter (innerhalb von 24 Stunden), akuter
humoraler (nach 24 Stunden) sowie einer akuten zellulären Xenotransplantat-Abstoßung unterschieden.
Die hyperakute Abstoßung betrifft vor allem Schädigungen des Parenchyms und der Gefäße, die unmittelbar nach Reperfusion zu ausgedehnten Hämorhagien und Thrombosen führen. Bei der Transplantation von Schwein auf Mensch sind insbesondere bereits bestehende humane xenoreaktive Antikörper, die an die Glykoproteine der porcinen Zelloberflächen (Gal α1,3 Gal Oligosaccharide) binden, für dieses Geschehen verantwortlich. Außerdem führt diese Bindung der Antikörper zu einer Aktivierung des Komplementsystems, weshalb es zusätzlich zu einer deutlichen Gewebsschädigung kommt.
Die akute zelluläre Abstoßung eines Xenotransplantates ist bisher nur wenig untersucht . Einer der Gründe liegt darin, dass im Tierexperiment nach wie vor die rasch einsetzende humorale Abstoßungsreaktion dominiert. Der Verlauf einer akuten zellulären Abstoßung wird ähnlich der Alloabstoßung beschrieben. So scheint das gesamte Spektrum der mononukleären Zellen (B- und T Zellen, Plasmazellen, natürliche Killerzellen und Makrophagen) beteiligt zu sein sein. Hinweise darauf ergaben histopathologische Untersuchungen, in denen Infiltrationen dieser Zellen in Xenotransplantaten nachgewiesen werden konnten.
(SCHUURMAN et al., 2003); (BUCHER et al., 2005).
Da das Wissen diesbezüglich noch lückenhaft ist, brachten wir PBMC von Schweine mit humanen PBMC in einer sogenannten gemischten Lymphozytenkultur zusammen, um die zellulären Abwehrmechanismen ex vivo zu untersuchen und zu charakterisieren. Humane PBMC wurden mit porcinen PBMC oder deren Lysat in vitro inkubiert, um eine direkte bzw.
indirekte Xenoreaktion zu simulieren. Anschließend folgte die Analyse im Durchflußzytometer.
1.3. T-Zellaktivierung und die Bedeutung von Calcineurin
Bindet eine APZ mit ihrem antigentragenden MHC-Molekül an einen T-Zellrezeptor (TZR) über CD3 und CD4 oder CD8, so wird die T Zelle nicht sofort aktiviert. Es bedarf zusätzlich eines kostimulatorischen Signals. Der B7-Ligand der APZ muss an den kostimulatorischen Rezeptor CD28 der T Zelle binden, um diese vollständig zu aktivieren (MEDZHITOV, JANEWAY, 2000); (HARLAN, KIRK, 1999); (KLEIN, SATO, 2000); (JOHNSON, FREEHALLY, 2000). Es werden dadurch verschiedene Signaltransduktionswege der Zelle aktiviert. Im Zusammenhang mit dieser Arbeit kommt einem Signaltransduktionsweg besondere Bedeutung zu: Dem Phospholipase C-γ-Kalzium-Calcineurin-Signalweg (Abbildung 1). Durch den zytoplasmatischen Teil des TZR und dem CD3-Komplex werden
eine Reihe von Tyrosinkinasen aktiviert. Dies hat eine Aktivierung der Phosphodiesterase Phospholipase C-γ (PLC-γ) zur Folge. PLC-γ spaltet Phosphaditylinositoldiphosphat (PIP2),
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Signaltransduktionskaskade der T-Zellaktivierung via Calcineurin.
APC
T Zelle
TZR
B7 CD 28
ein Lipid der Zellmembran, in Diacylglyzerin (DG) und Inositoltrisphosphat (IP3) (SCHMIDT, 1997). IP3 induziert den Austritt von Kalzium aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) und öffnet Kalziumkanäle in der Zellmembran (CRABTREE, 1999), so dass Kalzium seinem Konzentrationsgradienten folgend in die T Zelle gelangt. Die hohe intrazelluläre Kalziumkonzentration führt zur Aktivierung von Calcineurin, eine kalzium- und calmodulinabhängige Serinphosphatase. Calcineurin kann danach das intrazytoplasmatische Protein, NFAT (nukleärer Faktor aktivierter T Zellen) dephosphorylieren. In diesem Zustand gelangt NFAT in den Zellkern (SHAW et al., 1995) und bindet mit Hilfe des Aktivierungsproteins AP-1 an spezifische DNA Kontrollelemente und aktiviert somit die Transkription von Genen, die immunologisch wichtige Zytokine, wie Interleukin-2 (IL-2), Interferon-γ (INF-γ), IL-4, Tumornekrosefaktor-α (TNFα) oder den Granulozyten- Makrophagen koloniestimulierenden Faktor (GM-CSF) kodieren. Diese Zytokine haben chemotaktische Wirkung, aktivieren weitere Immunzellen oder fördern ihre Proliferation und Differenzierung (ALMAWI, 2001); (ALMAWI, MELEMEDJIAN, 2000); (HALLORAN, 2001); (HALLORAN, MELK); (REFOJO et al., 2001).
Eine besondere Bedeutung kommt bei aktivierten T Zellen dem Zytokin IL-2 zu, welches weitere T Zellen und natürliche Killerzellen aktiviert und diese bei der Proliferation
MHC
PIP2 PLC IP3
Ca2+
Ca2+
ER
Zellkern Ca2+
Ca2+
Ca2+
Calcineurin NF-AT Transkription
INFγ, IL-2, etc.
unterstützt. INF-γ aktiviert Makrophagen, erhöht die Expression von MHC-Molekülen und Komponenten des Antigenprozessierungssystems (PARKIN, COHEN, 2001).
1.3.1. Vor- und Nachteile der Immunsuppressionstherapie
Um eine akute Abstoßung nach Transplantation zu verhindern, wird das Immunsystem des Empfängers durch Pharmaka, wie zum Beispiel Cyclosporin A (CyA), Tacrolimus (FK506), Azathioprin, Mycophenolat mofetil, OKT3, IL-2-Rezeptorantagonisten oder Kortikosteroide inhibiert. Meist werden Kombinationen mehrerer Immunsuppressiva eingesetzt, da auf diese Weise verschiedene Angriffspunkte des Immunsystem in seiner Abwehrfunktion gehemmt werden können.. Weiterhin werden durch dieses Vorgehen die Nebenwirkungen geringer gehalten, da geringere Dosen eines einzelnen Pharmakons verabreicht werden können.
Unter einer immunsuppressiven Therapie sind Immunzellen idealerweise nicht in der Lage eine Abwehrreaktion gegen das Transplantat einzuleiten. Allerdings ist diese Hemmung der Abstoßungsreaktion mit erheblichen Nebenwirkungen verbunden. Aufgrund der Immunsuppression ist das Immunsystem auch in seiner Fähigkeit eingeschränkt gegen andere körperfremde Antigene eine Immunantwort auszulösen. So können Viren, Bakterien und andere Krankheitserreger schwer verlaufende Infektionen verursachen und selbst allgemein harmlose Infektionen auf Grund einer fehlenden Immunantwort exazerbieren. Es kann sogar im Zuge eines Infektes eine Abstoßung induziert werden (BREHM et al., 2003).
Es ist also wichtig, Dosierung und Kombination von Immunsuppressiva so zu wählen, dass einerseits das Transplantat nicht abgestoßen wird und andererseits Viren, Bakterien und andere Krankheitserreger in ausreichendem Maße abgewehrt werden können (PFITZMANN R. et al., 2001); (JOHSON, FEEHALLY, 2000).
1.4. Calcineurininhibitoren
Cyclosporin A (Sandimmun®) und FK506 (Tacrolimus® (Tsukuba macrolide immunosuppressive)) haben als Calcineurininhibitoren eine breite Anwendung bei der Abstoßungsprophylaxe nach Organtransplantation gefunden. Cyclosporin (Abbildung 2), ein zyklisches Polypeptid der Pilze Trichoderma polysporum und Cyclindrocarpon lucidum, wurde 1976 entdeckt und wird seit 1983 in der Organtransplantation zur immunsuppressiven Therapie angewandt (STARZL et al., 1981); (BOREL et al., 1977); (KIANI et al., 2000) .
Abbildung 2: Molekularstruktur von Cyclosporin A.
FK506 (Abbildung 3), ein Makrolid, das von dem Pilz Streptomyces tsukubaensis synthetisiert wird, wurde 1984 entdeckt (GOTO et al., 1987) . Bereits 1987 gelang die erste Herztransplantation an Ratten unter FK506 (GUMMERT et al., 1999) . 1994 wurde erstmals seine Wirkung bei Leber- und 1997 bei Nierentransplantierten in Studien untersucht. Es ist mit dem CyA strukturell nicht verwandt, hat aber einen nahezu identischen Wirkungsmechanismus (RUZICKA et al., 1999); (PFITZMANN R. et al., 2001); (HENRY, 1999).
Abbildung 3: Molekularstruktur von Tacrolimus (FK506).
Beide Substanzen gehören zur Gruppe der Calcineurininhibitoren (CNI) und binden an unterschiedliche intrazytoplasmatische Proteine, den Immunophilinen. CyA bindet an
aus einem Immunophilin und CNI können an Calcineurin binden und dieses in seiner Funktion hemmen. Calcineurin ist dann nicht mehr in der Lage, NFAT zu dephosphorylieren (DAMBRIN et al., 2000); (ALMAWI, MELEMEDJIAN, 2000); (NEYE, 2000) . NFAT gelangt somit nicht in den Nucleus (FLANAGAN et al., 1991) . Die Folge ist eine Inhibition der Transkription von IL-2-, INF-γ- oder anderen Zytokingenen (IL-4, IL-5 und TNF-α) (ANDERSSON et al., 1992); (KUINOSE et al., 2000) (siehe 1.3 ci-dessus). Die Induktion einer Immunantwort wird unterbunden.
Im Gegensatz zu CyA beeinflusst FK506 nicht nur die Aktivierung von NFAT, sondern es blockiert auch die Expression des IL-7-Rezeptors auf Prä-B- und T Zellen, sowie die proliferierende Wirkung der Zytokine IL-2 und IL-7 auf T Zellen. Es wird auch eine Inhibition anderer Signalwege diskutiert. Weiterhin hemmt nur CyA die NO-Synthase, weshalb bei der CyA-Therapie unter anderem häufiger eine Hypertonie auftritt als unter FK506 (ALMAWI, MELEMEDJIAN, 2000); (HENRY, 1999) . Hinsichtlich ihrer Nebenwirkungen unterscheiden sich die beiden Substanzen noch in anderen Punkten voneinander. Unter einer Immunsuppression mit FK506 treten weniger akute Abstoßungen auf und ein geringere Inzidenz an Hyperlipidämien konnte ebenfalls festgestellt werden. Des Weiteren kann es unter CyA zu kosmetischen Problemen wie zum Beispiel Gingivahyperplasie oder Hypertrichosen kommen. Auf der anderen Seite werden unter Immunsuppression mit FK506 häufigere BK-Virus-induzierte Nephropathien beschrieben und häufiger ein Diabetes mellitus diagnostiziert (HALLORAN, 2004) .
1.5. Dosierung von Calcineurininhibitoren
Zur Optimierung der CNI-Gabe werden zur Zeit vor allem zwei Methoden angewandt. Zum einen wird der Talspiegel, also der CNI-Spiegel im Blut vor der morgendlichen Medikamenteneinnahme, zur Dosisfindung herangezogen. Zum anderen gibt es die Möglichkeit des sogenannten C2-Monitoring. Es wird dabei der Spiegel zwei Stunden nach Einnahme eines CNI gemessen. Hierbei wird die individuelle orale Bioverfügbarkeit des Medikamentes berücksichtigt, da die Aufnahme des CyA u.a. durch verschioedene Nahrungsaufnahme starken Schwankungen unterworfen ist. Zur letzteren Methode sind insbesondere mit CyA viele Studien durchgeführt worden. Dadurch konnte eine Optimierung des Transplantatüberlebens erreicht werden (NASHAN et al., 2002), (EINECKE et al., 2004) . Das C2-Monitoring verlangt jedoch einen höheren logistischen Aufwand und hängt vor allem von der Mitarbeit des Patienten ab. Vielerorts beschränkt man sich daher allein auf die Bestimmung des Talspiegels.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich die Dosierung der CNI nach der gemessenen Konzentration im Blut richtet. Inwieweit die CNI das Immunsystem konzentrationsabhängig und individuell unterschiedlich stark supprimieren, wird dabei nicht berücksichtigt.
1.6. Wirkungsmechanismen von Methylprednisolon
Methylprednisolon (MP) ist ein Steroid (Abbildung 4), das dem natürlichen Adrenokortikoid Kortisol entspricht. Es hat jedoch einen bis zu fünfmal stärkeren antiinflammatorischen Effekt. Dies wird durch eine zusätzliche Doppelbindung zwischen dem ersten und zweiten Kohlenstoffatom (C-Atom) und durch eine Methylgruppe am sechsten C-Atom des Steroidgerüstes erreicht. Außerdem besitzt MP keine mineralkortikoide Wirkung (RUMMEL, 1993) .
Abbildung 4: Molekularstruktur von Methylprednisolon (MP).
Glukokortikoide wie MP werden schon lange zur immunsuppressiven Therapie nach Organtransplantation bzw. zur Therapie einer Abstoßung eingesetzt (KAUFMAN et al., 2004). MP ist wie alle Steroide lipophil und besitzt ein geringes Molekulargewicht. Daher kann MP passiv durch Zellmembranen diffundieren. Im Zytosol bindet MP an intrazytoplasmatische Steroidrezeptoren. Diese sind an Hsp90 (zwei Hitze-Schock-Proteine) gebunden, was sie daran hindert, in den Zellkern zu gelangen. Bindet MP an solch einen Rezeptor, so löst sich das Hsp90 vom Rezeptor. Der MP-Steroidrezeptor-Komplex gelangt dann in den Zellkern. Dort bindet er an Glukokortikoid-Antwort-Elemente (glucocorticoid responsive elements; GRE) (ALMAWI, 2001) . Hierbei handelt es sich um spezifische Promotorsequenzen, die eine Reihe von Genen regulieren (DE BOSSCHER et al., 2003) . Auf diese Weise wird die Synthese von IL-1 bis IL-6, IL-8, IL-11, IL-12, IL16, INF-γ, TNFα, M-CSF, G-CSF, CSF-1, GM-CSF und Adhäsionsmolekülen inhibiert (GORANTLA et al., 2000) . Steroide induzieren außerdem die Apoptose von T Zellen. Diese Mechanismen führen
zu einer effektiven Hemmung der Immunaktivierung (JANEWAY, TRAVERS, 1999);
(PFITZMANN R. et al., 2001).
1.7. In vitro Untersuchungen zur Analyse der Wirkung von Immunsuppressiva
Bisher erfolgte die Untersuchung der biologischen Effekte von Immunsuppressiva fast ausschließlich in isolierten Lymphozyten-Zellkultursystemen oder in Tiermodellen. In den letzten Jahren wurden Vollblutassays entwickelt, mit denen man durchflusszytometrisch mit hoher Sensitivität und Spezifität die T-zelluläre Immunfunktion messen kann (PICKER et al., 1995); (SUNI et al., 1998); (AHMED, VENKATARAMAN, 2001).
So kann beispielsweise eine spezifische T-Zellreaktivität gegen einzelne Erreger sehr genau quantifiziert werden (SESTER et al., 2001). Um die Wirkstärke der Immunsuppression auf T-Lymphozyten durch CyA, FK506 und MP in vitro zu untersuchen, wurde ein speziell etablierter Vollblutassay verwendet, in dem sich die Induktion von Zytokinen und deren Inhibition unter Einwirkung von Immunsuppressiva quantifiziert läßt (SESTER et al., 2005).
Dieser Vollblutassay hat gegenüber dem Arbeiten mit isolierten Lymphozyten folgende Vorteile. Erstens befinden sich die Lymphozyten im physiologischen Milieu. Zweitens wird nur ein geringes Blutvolumen von < 1 ml benötigt und drittens bleibt das Verhältnis zwischen den im Plasma proteingebundenen Pharmaka und der Verteilung in den Blutzellen unbeeinflusst (DAMBRIN et al., 2000), (LEMAIRE, TILLEMENT, 1982), (BEYSENS et al., 1991), (MACHIDA et al., 1991). Außerdem werden durch die kurze Stimulationszeit und die Inhibition der Zytokinsekretion durch Brefeldin A (BFA) indirekte Effekte wie Bystander- Aktivierung von nicht antigenspezifischen T Zellen oder eine Modulation der Zytokinbildung durch T Zellen oder zusätzliche Zytokine weitestgehend verhindert (SESTER et al., 2002b).
1.8. Ziel der Arbeit
1.8.1. Individuelle Wirkstärkenbestimmung von Immunsuppressiva
Das Ziel dieser Arbeit war es einen Vollblutassay zu entwickeln und zu charakterisieren, der die Wirkstärke von Immunsuppressiva und deren Kombination für jeden Patienten individuell, schnell und zuverlässig misst, um in der klinischen Anwendung eine individuell angepaßte Medikamentendosierung vornehmen zu können. Vergleichbar ist dieses Herangehen mit der Behandlung der Diabetiker. Letztendlich wird hier nicht der Insulinspiegel im Serum gemessen, sondern der Blutzucker, also die Wirkung des Insulins auf die Höhe des Blutzuckerspiegels. Dabei sollte der Vollblutassay dem physiologischen Geschehen im Körper so nah wie möglich sein und die Effekte der Immunsuppressiva im
klinisch relevanten Bereich messen. Zuerst mußte dafür ein geeignetes polyklonales Stimulans gefunden werden, welches der physiologischen T-Zell-Aktivierung am nächsten kommt und welches bei jedem Probanden zu einer T-Zellaktivierung führt. In einem zweiten Schritt sollte für das neue Testsystem gezeigt werden, mit welcher Zuverlässigkeit interindividuelle Unterschiede in der Empfindlichkeit gegenüber einzelner Immunsuppressiva gemessen werden können (Intraassayvarianz) und wie stabil diese individuellen Unterschiede über die Zeit sind (Interassayvarianz).
Aus früheren Arbeiten ist bekannt, dass es besonders nach dem Verlust von CMV- spezifischen CD4 T Zellen zu einer CMV-Reaktivierung kommen kann (SESTER et al., 2001; SESTER et al., 2005). Es sollte daher geprüft werden, ob eine Inhibition durch Calcineurininhibitoren eine der beiden T-Zellpopulationen bevorzugt hemmt. Dies wäre für den o.g. Fall von klinischer Bedeutung. Ob sich dieser Assay auch bei transplantierten Patienten, die bereits Immunsuppressiva einnehmen, anwenden lässt, sollte ebenfalls untersucht werden. Hier stellte sich auch die Frage, inwieweit die Medikamentenkonzentration im Serum einen Einfluß auf die Aktivierung der T ZelleT Zellen hat.
In der Klinik werden zur effizienten Abstoßungsprophylaxe keine Einzelsubstanzen sondern Kombinationen verschiedener Immunsuppressiva eingesetzt. Die synergistische Wirkstärke mit der empirischen bzw. spiegeladaptieren Dosierung kann jedoch nur unzureichend abgeschätzt werden. Daher sollte im letzen Teil der Arbeit überprüft werden, ob sich die Wirkstärke von Immunsuppressiva-Kombinationen mit dem neu etablierten Testverfahren quantifizieren lassen. Dabei wurde untersucht, inwieweit sich die synergistischen Effekte der Kombination von Methylprednisolon mit CyA bzw. von Methylprednisolon mit FK506 unterscheiden.
1.8.2. Direkte zelluläre Xenoreaktivität
In einem zweiten Teil der Arbeit sollte in Analogie eines neu etablierten Test zum Nachweis einer Alloreaktion (SESTER et al., 2004) ein ähnlicher Versuchsansatz zum Nachweis einer Xenoreaktion etabliert werden. Untersucht wurde, welche Zellpopulationen an der Xenoreaktion beteiligt sind. In dieser Untersuchung wurden sowohl intakte Schweine-PBMC als auch Zellysate zur Stimulation eingesetzt, um eine direkte und indirekte zelluläre Xenoreaktion zu simulieren.
2. Materialien und Methoden
2.1. Immunsuppressiva
Immunsuppressivum Hersteller
FK506 Astellas, München
Cyclosporin A Sandoz, Gerlingen
Methylprednisolon Sanofi Aventis, Frankfurt a. M.
2.2. Antikörper
Antikörper Spezies Konjugat Klon Menge pro Probe1 Hersteller
α-h CD4 Murin FITC 13B8.2 2µl Coulter/Immunotech, Krefeld α-h CD4 Murin PE 13B8.2 4µl Coulter/Immunotech, Krefeld α-h CD4 Murin PeCy5 13B8.2 5 µl Coulter/Immunotech, Krefeld α-h CD4 Murin PerCP SK3 4 µl BD Biosciences, Heidelberg α-h CD8 Murin PeCy5 DK25 5µl Dako, Hamburg
α-h CD8 Murin PerCP SK1 4µl BD Biosciences, Heidelberg α-h CD16 Murin FITC 4µl Dako, Hamburg
α-h CD28 Murin L293 1µg/ml (VB) zur Kostimulation
BD Biosciences, Heidelberg
α-h CD45 Murin FITC BRA- 55
Sigma, Deisenhofen
α-h CD49d Murin 9F10 1µg/ml (VB) zur Kostimulation
PharMingen, Hamburg
α-h CD56 Murin PE 4µl Sigma, Deisenhofen α-h CD69 Murin PE L78 4µl BD Biosciences, Heidelberg
Antikörper Spezies Konjugat Klon Menge pro Probe1 Hersteller
α-h INFγ murin FITC 4S.B3 0,5µl BD Biosciences, Heidelberg α-h INFγ murin PE B27 0,3µl BD Biosciences, Heidelberg
1 150µl Vollblutprobe oder 106 PBMC 2.3. Antigene
Antigen Bemerkung Hersteller
Adenovirusantigen 32µl/ml Vollblut Bio Whittaker, Walkersville, USA Adeno-Kontrollantigen 32µl/ml Vollblut Bio Whittaker, Walkersville, USA CMV-Antigen 32µl/ml Vollblut Bio Whittaker, Walkersville, USA CMV-Kontrollantigen 32µl/ml Vollblut Bio Whittaker, Walkersville, USA
SEB 2,5µg/ml Vollblut Sigma, Deisenhofen
2.4. Chemikalien und Reagenzien
Chemikalie Bemerkung Hersteller
Brefeldin A Sigma, Deisenhofen
BSA (bovine serum albumin) Serva, Heidelberg
DMSO (Dimethylsulfoxid) Serva, Heidelberg
Essigsäure, 100%ige Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe
FCS (foetal calf serum) Viralex PAA Laboratories GmbH, Cölbe
Ficoll (1,077 g/ml) Linaris, Wertheim-Bettingen
Fl-N2 (Flüssiger Stickstoff) Messer-Griesheim
H2Obidest Braun, Melsungen
Heparin Braun, Melsungen
NaN3 (Natriumazid) Fluka Chemie, Buchs, Schweiz
PBS (phosphat buffered saline) PH 7,4 Linaris, Bettingen am Main
PFA (Paraformaldehyd) Sigma, Deisenhofen
Chemikalie Bemerkung Hersteller RPMI-Zellkulturmedium VLE RPMI 1640 Biochrom KG, Berlin
Saponin PH 7,4 Sigma, Deisenhofen
2.5. Geräte und Hilfsmittel
Geräte und Hilfsmittel Hersteller
1,5ml Reaktionsgefäß Eppendorf, Hamburg
1,8ml Kryoröhrchen Nunc GmbH, Wiesbaden
10µl, 20µl, 100µl, 200µl und 1000µl Pipetten Eppendorf, Hamburg 15ml und 50ml Polypropylen-Röhrchen Greiner, Frickenhausen 1ml, 5ml, 10ml und 25ml Stabpipetten Corning Costar, Bodenheim
20ml Spritze Braun, Melsungen
5ml PP (Polypropylen)-Falcon-Röhrchen Becton Dickinson, Heidelberg 5ml PP-Falcon-Röhrchen mit Deckel Becton Dickinson, Heidelberg
Brutschrank Heraeus, Hanau
CellQuest (Auswertungs-Software) Becton Dickinson, Heidelberg
Hämocytometer-Deckgläser Roth, Karlsruhe
FACScan-Gerät Becton Dickinson, Heidelberg
Kühlzentrifuge Fischer, Saarbrücken
Lithium-Heparinröhrchen / Gel 4,7ml Sarstedt, Nümbrecht
Mikroskop (Modell: TMS) Nikon, Japan
Neubauer Zählkammer Roth, Karlsruhe
Pipettenspitzen Greiner, Frickenhausen
Pipettierhilfe Integra Biosciences, Fernwald
Steribank Biohazard, Woerden
Vortex-Gerät NeoLab, Heidelberg
Wasserbad Köttermann, Uetze-Hänigsen
Geräte und Hilfsmittel Hersteller
Zentrifuge Heraeus, Hanau
2.6. Immunsuppressiva
2.6.1. Verwendung von FK506
FK506 wurde in Ethanol absolut (EthOH) gelöst und für die Untersuchungen verdünnt. Zwei Stocklösungen wurden bei den Versuchen verwendet (33 µg/ml bzw. 11 µg/ml). Diese wurden im Verhältnis 1:500 zu dem zu untersuchenden Vollblut gegeben, sodass folgende klinisch relevante Vollblutendkonzentrationen vorlagen: 67 ng/ml bzw. 22 ng/ml. Die Verwendung von zwei verschiedenen Stocklösungen gewährleistete, dass im Versuchsansatz jeweils dieselbe Konzentration an Lösungsmittel vorhanden war.
2.6.2. Verwendung von Cyclosporin A
CyA wurde in absolutem EthOH gelöst. Zwei verschiedene Stocklösungen wurden für unsere Versuche verwendet (500 µg/ml bzw. 166 µg/ml). Die im Experiment verwendeten Endkonzentrationen betrugen nach einer 1:500 Verdünnung im Vollblut 1 µg/ml bzw. 333 ng/ml.
2.6.3. Verwendung von Methylprednisolon
Methylprednisolon wurde in absolutem EthOH verdünnt. Eine Stocklösung von 500 µg/ml wurde für unsere Versuche verwendet. Die im Experiment verwendete Endkonzentration betrug nach einer 1:500 Verdünnung im Vollblut 1 µg/ml.
2.7. Der Vollblutassay
2.7.1. Vorinkubation von Vollblutproben mit Immunsuppressiva
Sowohl gesunden Probanden als auch nierentransplantierten Patienten wurde Vollblut in 4,7 ml Lithium-Heparin-Gel-Monovetten abgenommen. Von jedem Probanden wurden je nach Versuch mehrere Proben angesetzt. Für jede Probe wurden 450 µl Vollblut in ein 15 ml- Röhrchen pipettiert. Die Calcineurininhibitoren wurden zwei Stunden und das Methylprednisolon 30 min vor Stimulationsbeginn in den unter 2.6 aufgeführten Konzentrationen zugegeben. Die Proben wurden kurz gemischt, damit sich die Reagenzien gleichmäßig verteilen konnten. Die Zeitpunkte der Immunsuppressivazugabe ergaben sich zum einen aus den Ergebnissen vorheriger Untersuchungen und zum anderen aus logistischer Optimierung bei größerer Probandenzahl.
Außerdem wurde bei jedem Probanden eine Negativkontrolle durchgeführt, die mit dem Lösungsmittel (EthOH) volumenäquivalent behandelt wurde. Hierdurch wurde eine Aktivierung durch EthOH oder eine vom Stimulus unabhängige Aktivierung ermittelt bzw.
ausgeschlossen. Zwischen den Pipettiervorgängen inkubierten wir die Proben bei 37° C, 6%
CO2 im Brutschrank.
2.7.2. Vollblutstimulation
Die Proben wurden anschließend mit spezifischen und unspezifischen T-Zell-Stimuli versetzt.
Um die T Zellen vollständig zu aktivieren, werden Antikörper gegen CD49d und CD28 eingesetzt (WALDROP et al., 1998); (HARLAN, KIRK, 1999) . CD49d ist ein Zellintegrin.
Es wird auch als VLA-4 (very late activation antigen) bezeichnet und dient sowohl der Bindung an Endothelzellen über vaskuläre Zelladhesions-Moleküle (VCAM-1) als auch zur weiteren Aktivierung der T Zellen (JANEWAY, TRAVERS, 1999). CD28 ist ein Co- Rezeptor, der in unmittelbarer Umgebung des T-Zellrezeptors auf der Zelloberfläche exprimiert wird. Bindet eine APZ mit ihrem antigentragenden MHC-Molekül an einen T- Zellrezeptor, so muß der Ligand B7 der APZ an den Co-Rezeptor der T Zelle binden, damit diese vollständig aktiviert wird (SAYEGH, TURKA, 1998); (MEDZHITOV, JANEWAY, 2000). Beide Vorgänge dienen der Beschleunigung und Unterstützung der T-Zellstimulation.
Als Kontrolle wurde eine Probe eines jeden Probanden ohne Immunsuppression mit einem Kontroll-Ag und den kostimulatorischen Antikörpern behandelt. Nach jedem Pipettiervorgang wurden die Proben gut gemischt und bei 37° C, 6% CO2 im Brutschrank inkubiert. Damit die Zytokinproduktion zellassoziiert nachgewiesen werden konnte, wurde zwei Stunden nach Stimulationsbeginn auf jede Probe der Transportinhibitor Brefeldin A hinzugegeben.
Intrazellulär wurde somit eine Akkumulation der induzierten Zytokine intrazellulär erreicht (DINTER, BERGER, 1998). Nach jedem Pipettiervorgang wurden die Proben sorgfältig durchmischt.
2.8. Fixieren der Zellen nach Vollblutstimulation
Sechs Stunden nach Stimulationsbeginn wurden die Proben mit 20 mM EDTA behandelt und für 10 Sekunden sorgfältig mittels Vortexer gemischt, um Zell-Zell-Interaktionen aufzulösen.
Nach 15 min Inkubation bei Raumtemperatur wurden 9 ml Lysing-Solution/ml (VB) zugegeben, um die Erythrozyten zu lysieren und die Leukozyten zu fixieren. Auch hier wurde jede Probe gut gemischt. Die Lysing-Solution ließen wir 10 min bei Raumtemperatur auf die Zellen einwirken, bevor die Proben bei 350 g 10 min lang zentrifugiert wurden. Anschließend
für 10 min bei 350 g zentrifugiert. Nach diesem Waschgang wurde der Überstand abgesaugt und das Zellpellet in 400 µl FACS-Puffer resuspendiert. Die fixierten Zellen konnten jetzt direkt gefärbt (siehe 2.9 unten) oder bis zur Färbung über Nacht bei 4° C im Kühlschrank aufbewahrt werden.
Lysing Solution: 50 ml Lysing Solution 10fach-Lösung in 450 ml (Bi) Aqua destillata PBS: 50 ml 10fach PBS in 450 ml Aqua destillata, pH 7,4
FACS-Puffer: PBS, 5% filtriertes FCS, 0,5% BSA, 0,07% NaN3, pH 7,4
2.9. Färbung der Zellen
Von jeder Probe wurden 200 µl der fixierten Zellsuspension in ein FACS-Röhrchen pipettiert.
Anschließend wurden die Zellmembranen durch die Zugabe von 2 ml FACS-Puffer-0,1%
Saponin 10 min lang permeabilisiert. Fluochrommarkierte Antikörper können jetzt sowohl an T-Zell-spezifische Strukturen der Zelloberfläche binden, aber auch durch die permeabilisierte Zellmembran in das Innere der Zelle gelangen und dort mit den akkumulierten Zytokine interagieren.
Um die an einer Abstoßung maßgeblichen T Zellen genauer zu differenzieren, wurden in dieser Arbeit Antikörper gegen CD4 und CD8 verwendet. Dadurch konnte zwischen beiden T-Zellpopulationen unterschieden werden. Das Zytokin INFγ wurde als Aktivierungsmarker verwendet und dementsprechende Antikörper eingesetzt. Im Anschluß folgte eine Zentrifugation für 10 min bei 350 g. Der Überstand wurde abgesaugt.
Pro Probe wurden die fluorochrommarkierten Antikörpern (CD4-PE, CD8-PerCP und INFγ- FITC), 1 µl 5% Saponin zur Aufrechterhaltung der Permeabilisation und FACS-Puffer in einem Endvolumen von 50 µl in den unter 2.2 aufgeführten Konzentrationen / Volumina auf die Proben pipettiert.
Anschließend wurden die Proben für 30 bis 45 min bei Raumtemperatur inkubiert. Um ein Ausbleichen der Fluochrome zu verhindern, wurden die Proben hierfür ins Dunkle gestellt.
Danach wurden nicht gebundene Antikörper durch Zugabe von 3 ml FACS-Puffer 10 min Zentrifugation bei 350 g entfernt. Des Weiteren wurde das Zellpellet in 100 µl 1% PFA aufgenommen. Auch hier folgte nach jedem Pipettiervorgang eine sorgfältige Durchmischung mit einem Vortexgerät. Die Messung am FACS-Gerät konnte hiernach erfolgen.
4%iges Paraformaldehyd (PFA): 8 g PFA in 200 ml PBS, bei 56 °C im Wasserbad lösen.
Zugabe von 10 Tropfen 1 M NaOH erhöht die Löslichkeit des PFA, anschließend wurde die Einstellung des pH-Wertes durch Titration mit 1 M HCl auf pH 7,4 durchgeführt.
1%iges PFA: 25 ml 4%iges PFA auf 75 ml PBS.
5% Saponin in PBS
2.10. Darstellung der Inhibition der T Zellen durch Calcineurininhibitoren A
B
Abbildung 5: Beispiel einer FACS-Analyse ohne und mit Immunsuppression. A: Mit SEB stimulierte CD4+ (grau) und CD8+ T Zellen (schwarz) ohne Calcineurininhibitor (Mock- Behandlung). B: Mit SEB stimulierte CD4+ (grau) und CD8+ T Zellen (schwarz), die durch FK506 [67 ng/ml] inhibiert wurden.
4.85%
5.89%
Die Versuchsergebnisse wurden Software-gestützt am FACS-Gerät ausgewertet. Mittels des
(side scatter) darzustellen. Dadurch werden die Zellpopulationen grob differenziert. Durch die Färbung mit fluochrommarkierten Antikörpern gegen spezifische Zellmoleküle ist die weitere Differenzierung möglich. Die Analyse wird mit Hilfe des Programm Cell-Quest durchgeführt.
So gelingt es nur die CD4 positiven und CD8 positiven T-Lymphozyten in einem Diagramm darzustellen. Abbildung 5 zeigt T Zellen aus einer SEB-Vollblutstimulation ohne Immunsuppression und mit Behandlung durch 67 ng/ml FK506. Da auf der Ordinate die Intensität des CD4-Markers aufgetragen ist, stellt die obere Zellpopulation die CD4+ Zellen dar, die untere die CD8+ Zellen. Die Abnahme der INFγ positiven T-Lymphozyten und deren Ausmaß der INFγ-Produktion unter FK506 ist deutlich zu erkennen.
2.11. Xenostimulation humaner PBMC mit PBMC von Schweinen 2.11.1. Probengewinnung
Von sechs Schweinen wurden direkt während der Schlachtung jeweils ca. 100 ml Vollblut mit einem EDTA-enthaltenen Gefäß aufgefangen.
2.11.2. Ficoll-Dichtegradient und Isolierung von PBMC
5 bis 15 ml Vollblut wurden in ein 50 ml Polypropylenröhrchen (PP-Röhrchen) pipettiert, mit sterilem PBS auf ein Volumen von 35 ml aufgefüllt und gemischt. Anschließend wurden die Proben vorsichtig mit 13 ml Ficoll unterschichtet und danach bei 1300 g 20 min zentrifugiert.
Außerdem wurde die Bremse der Zentrifuge ausgeschaltet, damit beim Auslaufen des Rotors die Interphase des Ficoll-Dichtegradienten nicht durch Erschütterungen oder Vibrationen zerstört wird. Mit einer 5 ml Stabpipette wurde nun die Interphase mit den mononukleären Zellen vorsichtig und gründlich abgesaugt und in ein weiteres 50 ml PP-Röhrchen gegeben.
Bei der Isolierung von PBMC aus 20 bis 30 ml Vollblut eines Probanden wurden die Zellen der Interphase für die weitere Aufarbeitung ab jetzt zusammengeschüttet. Die Zellen wurden nun in zwei Schritten wie folgt gereinigt. Zuerst wurde das PP-Röhrchen bis auf 50 ml mit kaltem PBS-0,02% EDTA aufgefüllt und für 10 min bei 4° C und bei 650 g zentrifugiert und die Proben dekantiert. Im zweiten Schritt wurde analog verfahren, nur die Umdrehungszahl der Zentrifuge wurde, um die Zellen zu schonen auf 300 g herabgesetzt. Die Zellen wurden anschließend in Kulturmedium resuspendiert und gezählt.
Kulturmedium: RPMI-10% FCS-1% Glutamin-1% Pen-Strep
2.11.3. Zellen einfrieren
Zuerst haben wir ein zweifach konzentriertes Einfriermedium angesetzt, das auf die zu erwartende Zellzahl bzw. auf die Kryoröhrchen abgestimmt worden war. Pro Röhrchen wurden 900 µl Einfriermedium benötigt. Die einzufrierenden Zellen wurden so im Kulturmedium resuspendiert, dass die gewünschte Zellzahl in 900 µl aufgenommen und auf 900 µl Einfriermedium pipettiert werden konnte. Anschließend wurden die Kryoröhrchen gut verschlossen und umgehend bei -70°C tiefgefroren. Dieser Vorgang sollte deshalb recht zügig bearbeitet werden, da das DMSO zelltoxisch, zur Verhinderung der Bildung großer Eiskristalle in den Zellen jedoch notwendig ist. Nach einigen Tagen wurden die Zellen in flüssigen Stickstoff überführt.
2x Einfriermedium: 20% DMSO, 60% FCS und 20% Kulturmedium 2.11.4. Zellen auftauen
Die PBMC enthaltenen Kryoröhrchen wurden aus dem mit flüssigem Stickstoff gefüllten Behälter entnommen und in einem Warmwasserbad 37°C zügig aufgetaut. Bevor die Kryoröhrchen mit unter die sterile Arbeitsbank gebracht wurden, wurden sie mit 70 %igem Ethanol abgewischt, um eine Kontamination durch Bakterien o. ä. zu vermeiden.
Anschließend wurden die Zellen in ein 15 ml PP-Röhrchen mit 9 ml 37° C warmen Kulturmedium pipettiert und sofort bei Raumtemperatur für 10 min bei 250 g zentrifugiert.
Der Überstand wurde abgesaugt, die Zellen wurden in 2 ml Kulturmedium resuspendiert und gezählt.
2.11.5. Zellen zählen
Zuerst wurden 90 µl Trypanblaulösung in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß vorgelegt.
Anschließend pipettierten wir 10 µl der zu bestimmenden Zellsuspension hinzu. Die Probe wurde gemischt und 10 µl wurden in eine Neubauer-Zählkammer (0,0025 mm2; 0,1 mm) gegeben. Die abgestorbenen Zellen färbten sich blau. Die Zellen wurden nun zügig gezählt.
Es wurden jeweils 2 x 16 sich gegenüberliegende Kleinstquadrate gezählt. Die Anzahl der Zellen in 16 Kleinstquadraten entspricht n∗104 Zellen/ml.
Bei mit Hilfe eines Ficoll-Dichtegradienten gewonnenen, frischen PBMC wurden die Zellen vor der Zellzählung in Essigsäurelösung verdünnt, um im Ansatz verbliebene Erythrozyten vollständig zu lysieren. Dabei verwendeten wir eine 3%ige Essigsäure, die 1:10 mit der Zellsuspension verdünnt wurde. Eine Trypanblaufärbung ist bei frisch isolierten PBMC weniger relevant, da kaum tote Zellen zu erwarten waren.
Trypanblaulösung: 0,4 g Trypanblau in 100 ml PBS.
3 %ige Essigsäure: 3 ml Eisessig in 97 ml Aqua dest.
2.11.6. Lyse von Schwein-PBMC
Zur Lyse wurden die Zellen einem wechselnden Zyklus von Einfrieren und Auftauen unterzogen. Dazu wurden 2 Mio Schweine-PBMC in Kulturmedium in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß pipettiert und mit Kulturmedium auf 450 µl aufgefüllt. Anschließend wurde das Reaktionsgefäße gut verschlossen und für 15 bis 20 Sekunden in flüssigen Stickstoff getaucht, zwei Min bei Raumtemperatur belassen und anschließend in einem 37° C warmen Wasserbad wieder aufgetaut. Dieser Vorgang wurde bei jeder Probe fünfmal wiederholt, um eine ausreichende Lyse zu erreichen.
2.11.7. Stimulation
Jeweils eine Million humaner PBMC wurden mit einer Million Schweine-PBMC bzw. dem Äquivalent einer Million lysierter Schweine-PBMC zusammengebracht. In der Negativkontrolle wurden eine Million PBMC mit einer Million PBMC desselben Schweins bzw. desselben Probanden zusammengebracht. Dies war notwendig, um eine Aussage über die unspezifische Aktivität der jeweiligen PBMC machen zu können. Die benötigten Zellmengen wurden in zuvor beschriftete Polypropylen-FACS-Röhrchen (mit Deckel) pipettiert. Dabei wurde das für eine Million Zellen benötigte Volumen mit Kulturmedium auf 225 µl aufgefüllt, um ein Probengesamtvolumen von 450 µl zu erhalten. Die Stimulation erfolgte in Anwesenheit der kostimulatorischen Antikörper CD28 und CD49 (s.o.).
Anschließend wurden die Proben gut gevortext und sofort für fünf min bei 250 g zentrifugiert, damit eine zur Stimulation notwendige Zell-Zell-Interaktion möglichst rasch gegeben war.
Die Proben wurden danach bei 37° C, 6% CO2 und mit lose aufgesetztem Deckel im Brutschrank inkubiert. 30 min nach Stimulationsbeginn wurden die Zellen kurz resuspendiert, nochmals für fünf min bei 250 g zentrifugiert und wieder in den Brutschrank zurückgestellt.
90 min später wurde BFA zu jeder Probe pipettiert. Die Proben wurden sorgfältig gemischt, wie zuvor beschrieben zentrifugiert und wiederum für weitere vier Stunden im Brutschrank inkubiert.
2.11.8. Fixierung
Damit die Zellen bis zur und während der FACS-Analyse in einem stabilen Zustand blieben, wurde sie folgendermaßen fixiert. Sechs Stunden nach Stimulationsbeginn wurden je ml Ansatzvolumen 100 µl [20mM] EDTA auf die Proben pipettiert, anschließend wurden diese
für zehn Sekunden gevortext und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Es erfolgte ein Waschgang, bei dem unabhängig vom Ansatzvolumen jeweils 2 ml PBS-0,02% EDTA auf jede Probe pipettiert wurden. Nach 10 minütiger Zentrifugation bei 300 g wurde der Überstand vorsichtig abgesaugt. Das Zellpellet wurde in den Röhrchen kurz aufgelockert und dann zur Fixierung der Zellen in 300 µl 37° C warmen 4% PFA resuspendiert. Bei diesem Pipettiervorgang sollte die Zellsuspension mehrfach zügig auf- und abpipettiert werden, um die Probe gut zu mischen und eventuell vorhandene Zellaggregate zu lösen. Nach genau fünf min Inkubation bei Raumtemperatur wurden jeweils 1,2 ml kalter FACS-Puffer auf die Proben gegeben und die Proben wurden abermals 10 min bei 300 g zentrifugiert. Der Überstand wurde danach abgesaugt und die Zellpellets jeweils in 600 µl FACS-Puffer resuspendiert.
2.11.9. Färbung
Es wurden zwei verschiedene Färbeansätze hergestellt, da in diesem Versuch nicht nur T- Lymphozyten untersucht werden sollten, sondern auch NK-Zellen. Der erste Färbeansatz umfaßte die fluochrommarkierten Antikörper CD8-PECy-5, CD4-FITC und INFγ-PE, der zweite beinhaltete CD8-PECy-5, CD16-FITC und INFγ-PE.
Die Proben wurden wie unter 2.9 beschrieben behandelt und im FACScan analysiert.
2.12. Computerprogramme
Zur Erstellung dieser Arbeit wurden die folgenden Computerprogramme verwendet.
Programm Anwendung Microsoft Access Datenverwaltung
CellQuest Messung und Auswertung der durchflusszytometrischen Daten Microsoft Excel Datenverarbeitung
Graphpad Prism Grafik und Statistik Microsoft Word Textverarbeitung
3. Ergebnisse
3.1. Mit SEB-stimulierten T Zellen lässt sich die Wirkstärke von Immunsuppressiva am besten diskriminieren
3.1.1. SEB-Stimulation versus Adeno-Ag-Stimulation
Zuerst suchten wir ein geeignetes Stimulans, das in allen getesteten Probanden eine T- Zellaktivierung auslösen würde. Wir stellten der Stimulation mit SEB einer Stimulation mit Adenovirus-Antigen (Adeno-Ag) gegenüber. Adeno-Ag wählten wir deshalb, da in Bezug auf Adenoviren eine nahezu 100 %ige Durchseuchung in der Bevölkerung vorliegt und bei der Verwendung von Adeno-Ag die Art und Weise der Aktivierung der physiologischen T- Zellaktivierung entspricht, da das Antigen zuvor von den APZ prozessiert wird. In ähnlicher Weise ist bekannt, dass sich mit SEB ebenfalls in jedem Probanden eine T Zellreaktion unterschiedlicher Frequenz stimulieren lassen. SEB hingegen stimuliert die T Zellen als Superantigen ohne die Notwendigkeit der Antigenprozessierung. Dennoch gingen wir davon aus, dass unter SEB-Stimulation die Immunantwort deutlicher ausfallen würde als mit Adeno- Ag, da bei letzterem die T-Zell-Aktivierung erfahrungsgemäß eher geringer ist (SESTER et al., 2002a).
Auf Grund der Erfahrungen früherer Arbeiten (Thijssen 2006) wurde INFγ als Marker aktivierter T Zellen gewählt. Hiermit wurde zuerst die Frequenz Adeno-Ag- bzw. SEB- reaktiver, INFγ+ T-Lymphozyten von 15 gesunden Probanden analysiert und der Effekt der Calcineurininhibitoren Cyclosporin A (CyA) und FK506 getestet. Abbildung 6 A ist der Anteil der Adeno-Ag- und SEB-reaktiven Zellen bezogen auf 10000 CD4 T Zellen dargestellt. Mit Mock sind Proben gekennzeichnet, zu denen kein Immunsuppressivum gegeben und die somit nicht inhibiert wurden. Im Gegensatz dazu ist eine dosisabhängige Inhibition der mit Calcineurininhibitoren behandelten Proben (Abbildung 6) zu erkennen. Die Immunantwort nach SEB Stimulation wies bekanntermaßen eine breite Streuung auf und fiel gegenüber der Stimulation mit Adeno-Ag im Durchschnitt sehr viel stärker aus (SEB- Stimulation: 634 ± SD 376 INFγ+/10000 CD4 T Zellen; Adeno-Ag-Stimulation 53 ± SD 33,3 INFγ+/10000 CD4 T Zellen).
Unter Adeno-Ag-Stimulation lag der Anteil der INFγ+ T Zellen teilweise sogar unter der Detektionsgrenze von 5 INFγ+/10000 CD4 T Zellen.
Mock
CyA 369 n g/ml
CyA 1111 n g/m
l
FK506 22 ng
/ml
FK506 67 ng/m l
Mock
CyA 369 n g/ml
CyA 1111 n g/m
l
FK506 22 ng
/ml
FK506 67 ng/m 0 l
250 500 750 1000 1250
Adeno-Ag SEB A
Anzahl IFN-γ-pos/10000 CD4 T-Zellen
Mock
CyA 369 ng/
ml
CyA 11 11 ng/
ml
FK506 22 ng /ml
FK506 67 ng/
ml
Moc k
CyA 369 ng/
ml
CyA 11 11 ng/
ml
FK506 22 ng /ml
FK506 67 ng/
ml 0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130
Adeno-Ag SEB B
Aktive CD4 T-Zellen in %
Abbildung 6: Vergleich der Stimulation mit Adeno-Ag und SEB. A: Anteil INFγ positiver CD4 T Zellen von 10000 CD4 T Zellen. B: Werte auf nicht-inhibierte Probe normiert;
verbliebene Aktivität in Prozent bezogen auf den Leerwert. Die Querstriche repräsentieren die medianen Frequenzen.
In der Population der CD8 T Zellen lagen unter Adeno-Ag-Stimulation der Anteil INFγ+
Zellen unterhalb der Detektionsgrenze. Lediglich bei zwei Probanden konnte in der nicht inhibierten Probe eine Frequenz INFγ+ T Zellen oberhalb des Schwellenwertes von 5 INFγ+/10000 CD8 T Zellen gemessen werden. Unter SEB-Stimulation konnte hingegen für CD8 T Zellen eine deutliche Dosisabhängigkeit wie bei CD4 T Zellen gesehen werden.
(Daten nicht gezeigt).
Da interindividuell in der nicht inhibierten Probe der Anteil SEB-reaktiver T-Lymphozyten (SEB-Reaktivität) bzw. Adeno-Ag-reaktiver T Zellen eine relativ hohe Variabilität aufwies, wurden die Werte der mit Calcineurininhibitoren behandelten Proben auf die Werte der nicht inhibierten Proben anhand der folgenden Formel normiert (Abbildung 6 B).
( ) ( )
(
SEB-Reaktivität)
100t Reaktivitä -
SEB t
Reaktivitä -
SEB
% in
Inhibition − ×
=
IS ohne
IS mit IS
ohne
Diese Darstellung erlaubt den Vergleich der Wirkstärke der Calcineurininhibitoren zwischen den einzelnen Individuen. Dabei zeigt sich, dass interindividuell große Unterschiede in der Inhibierbarkeit der T-Zellaktivierung bestehen. Dies gilt sowohl für die SEB-stimulierten als auch für die Adeno-Ag-stimulierten Proben. Durch die geringe Ausgangsfrequenz Adeno-Ag reaktiver T Zellen besitzt dieser Stimulationsmodus jedoch eine höhere Anfälligkeit gegenüber zufälliger Streuungen der Messwerte als die Stimulation mit SEB (Abbildung 6 B).
Aufgrund dieser Ergebnisse stellt SEB den am besten geeigneten Stimulus zur Quantifizierung der Wirkstärke von Immunsuppressiva (IS) dar. Als Maß für die Wirkstärke eines Immunsuppressivums wählten wir die Inhibition der SEB-Antwort in Prozent.
3.1.2. Die gemessene Wirkstärke von Immunsuppressiva ist unabhängig von der individuellen Reaktivität auf SEB
Damit die Inhibition der SEB-Reaktivität im klinischen Alltag als Maß für die Wirkstärke von Immusuppressiva herangezogen werden kann, muss sichergestellt werden, dass sie nur von der Konzentration des Immunsuppressivums und der individuellen Empfindlichkeit gegenüber dieser Substanz abhängt, nicht jedoch von der individuellen Ausgangsreaktivität gegenüber SEB. Daher korrelierten wir in den von 35 Individuen entnommenen Blutproben die SEB-Ausgangsreaktivität in den nicht inhibierten Proben mit der relativen Inhibition nach der Zugabe von Calcineurininhibitoren. Abbildung 7 zeigt die Ergebnisse für CD8 T Zellen unter Immunsuppression durch CyA. Eine Korrelation konnten wir bei verschiedenen
getesteten Konzentrationen weder für FK506 noch für CyA nachweisen. Dies galt sowohl für die Analyse von CD4 T Zellen als auch für CD8 T Zellen. In Tabelle 1 sind die Ergebnisse zusammengefaßt dargestellt.
Die gemessene Wirkstärke von Immunsuppressiva ist folglich unabhängig von der individuellen SEB-Ausgangsreaktivität. Somit stellt SEB einen geeigneten Stimulus und die relative Inhibition ein geeigneter Parameter zur Quantifizierung der immunsuppressiven Wirkstärke dar.
0 500 1000 1500
40 50 60 70 80 90 100
Anteil SEB-reaktive r CD8 T-Zellen pro 10000 CD8 T-Zellen - ohne Immunsuppre ssion
% Inhibition durch CyA [1 µg/ml]
Abbildung 7: Keine Korrelation zwischen der SEB-Reaktivität in der Leerprobe und Inhibition durch CyA [1 µg/ml]. Dargestellt ist der Anteil SEB reaktiver CD8 T- Lymphozyten in Assoziation mit dem individuellem Ausmaß der Inhibition.
