Xenostimulation humaner PBMC mit PBMC von Schweinen 1. Probengewinnung

Von sechs Schweinen wurden direkt während der Schlachtung jeweils ca. 100 ml Vollblut mit einem EDTA-enthaltenen Gefäß aufgefangen.

2.11.2. Ficoll-Dichtegradient und Isolierung von PBMC

5 bis 15 ml Vollblut wurden in ein 50 ml Polypropylenröhrchen (PP-Röhrchen) pipettiert, mit sterilem PBS auf ein Volumen von 35 ml aufgefüllt und gemischt. Anschließend wurden die Proben vorsichtig mit 13 ml Ficoll unterschichtet und danach bei 1300 g 20 min zentrifugiert.

Außerdem wurde die Bremse der Zentrifuge ausgeschaltet, damit beim Auslaufen des Rotors die Interphase des Ficoll-Dichtegradienten nicht durch Erschütterungen oder Vibrationen zerstört wird. Mit einer 5 ml Stabpipette wurde nun die Interphase mit den mononukleären Zellen vorsichtig und gründlich abgesaugt und in ein weiteres 50 ml PP-Röhrchen gegeben.

Bei der Isolierung von PBMC aus 20 bis 30 ml Vollblut eines Probanden wurden die Zellen der Interphase für die weitere Aufarbeitung ab jetzt zusammengeschüttet. Die Zellen wurden nun in zwei Schritten wie folgt gereinigt. Zuerst wurde das PP-Röhrchen bis auf 50 ml mit kaltem PBS-0,02% EDTA aufgefüllt und für 10 min bei 4° C und bei 650 g zentrifugiert und die Proben dekantiert. Im zweiten Schritt wurde analog verfahren, nur die Umdrehungszahl der Zentrifuge wurde, um die Zellen zu schonen auf 300 g herabgesetzt. Die Zellen wurden anschließend in Kulturmedium resuspendiert und gezählt.

Kulturmedium: RPMI-10% FCS-1% Glutamin-1% Pen-Strep

2.11.3. Zellen einfrieren

Zuerst haben wir ein zweifach konzentriertes Einfriermedium angesetzt, das auf die zu erwartende Zellzahl bzw. auf die Kryoröhrchen abgestimmt worden war. Pro Röhrchen wurden 900 µl Einfriermedium benötigt. Die einzufrierenden Zellen wurden so im Kulturmedium resuspendiert, dass die gewünschte Zellzahl in 900 µl aufgenommen und auf 900 µl Einfriermedium pipettiert werden konnte. Anschließend wurden die Kryoröhrchen gut verschlossen und umgehend bei -70°C tiefgefroren. Dieser Vorgang sollte deshalb recht zügig bearbeitet werden, da das DMSO zelltoxisch, zur Verhinderung der Bildung großer Eiskristalle in den Zellen jedoch notwendig ist. Nach einigen Tagen wurden die Zellen in flüssigen Stickstoff überführt.

2x Einfriermedium: 20% DMSO, 60% FCS und 20% Kulturmedium 2.11.4. Zellen auftauen

Die PBMC enthaltenen Kryoröhrchen wurden aus dem mit flüssigem Stickstoff gefüllten Behälter entnommen und in einem Warmwasserbad 37°C zügig aufgetaut. Bevor die Kryoröhrchen mit unter die sterile Arbeitsbank gebracht wurden, wurden sie mit 70 %igem Ethanol abgewischt, um eine Kontamination durch Bakterien o. ä. zu vermeiden.

Anschließend wurden die Zellen in ein 15 ml PP-Röhrchen mit 9 ml 37° C warmen Kulturmedium pipettiert und sofort bei Raumtemperatur für 10 min bei 250 g zentrifugiert.

Der Überstand wurde abgesaugt, die Zellen wurden in 2 ml Kulturmedium resuspendiert und gezählt.

2.11.5. Zellen zählen

Zuerst wurden 90 µl Trypanblaulösung in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß vorgelegt.

Anschließend pipettierten wir 10 µl der zu bestimmenden Zellsuspension hinzu. Die Probe wurde gemischt und 10 µl wurden in eine Neubauer-Zählkammer (0,0025 mm²; 0,1 mm) gegeben. Die abgestorbenen Zellen färbten sich blau. Die Zellen wurden nun zügig gezählt.

Es wurden jeweils 2 x 16 sich gegenüberliegende Kleinstquadrate gezählt. Die Anzahl der Zellen in 16 Kleinstquadraten entspricht n∗10⁴ Zellen/ml.

Bei mit Hilfe eines Ficoll-Dichtegradienten gewonnenen, frischen PBMC wurden die Zellen vor der Zellzählung in Essigsäurelösung verdünnt, um im Ansatz verbliebene Erythrozyten vollständig zu lysieren. Dabei verwendeten wir eine 3%ige Essigsäure, die 1:10 mit der Zellsuspension verdünnt wurde. Eine Trypanblaufärbung ist bei frisch isolierten PBMC weniger relevant, da kaum tote Zellen zu erwarten waren.

Trypanblaulösung: 0,4 g Trypanblau in 100 ml PBS.

3 %ige Essigsäure: 3 ml Eisessig in 97 ml Aqua dest.

2.11.6. Lyse von Schwein-PBMC

Zur Lyse wurden die Zellen einem wechselnden Zyklus von Einfrieren und Auftauen unterzogen. Dazu wurden 2 Mio Schweine-PBMC in Kulturmedium in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß pipettiert und mit Kulturmedium auf 450 µl aufgefüllt. Anschließend wurde das Reaktionsgefäße gut verschlossen und für 15 bis 20 Sekunden in flüssigen Stickstoff getaucht, zwei Min bei Raumtemperatur belassen und anschließend in einem 37° C warmen Wasserbad wieder aufgetaut. Dieser Vorgang wurde bei jeder Probe fünfmal wiederholt, um eine ausreichende Lyse zu erreichen.

2.11.7. Stimulation

Jeweils eine Million humaner PBMC wurden mit einer Million Schweine-PBMC bzw. dem Äquivalent einer Million lysierter Schweine-PBMC zusammengebracht. In der Negativkontrolle wurden eine Million PBMC mit einer Million PBMC desselben Schweins bzw. desselben Probanden zusammengebracht. Dies war notwendig, um eine Aussage über die unspezifische Aktivität der jeweiligen PBMC machen zu können. Die benötigten Zellmengen wurden in zuvor beschriftete Polypropylen-FACS-Röhrchen (mit Deckel) pipettiert. Dabei wurde das für eine Million Zellen benötigte Volumen mit Kulturmedium auf 225 µl aufgefüllt, um ein Probengesamtvolumen von 450 µl zu erhalten. Die Stimulation erfolgte in Anwesenheit der kostimulatorischen Antikörper CD28 und CD49 (s.o.).

Anschließend wurden die Proben gut gevortext und sofort für fünf min bei 250 g zentrifugiert, damit eine zur Stimulation notwendige Zell-Zell-Interaktion möglichst rasch gegeben war.

Die Proben wurden danach bei 37° C, 6% CO2 und mit lose aufgesetztem Deckel im Brutschrank inkubiert. 30 min nach Stimulationsbeginn wurden die Zellen kurz resuspendiert, nochmals für fünf min bei 250 g zentrifugiert und wieder in den Brutschrank zurückgestellt.

90 min später wurde BFA zu jeder Probe pipettiert. Die Proben wurden sorgfältig gemischt, wie zuvor beschrieben zentrifugiert und wiederum für weitere vier Stunden im Brutschrank inkubiert.

2.11.8. Fixierung

Damit die Zellen bis zur und während der FACS-Analyse in einem stabilen Zustand blieben, wurde sie folgendermaßen fixiert. Sechs Stunden nach Stimulationsbeginn wurden je ml Ansatzvolumen 100 µl [20mM] EDTA auf die Proben pipettiert, anschließend wurden diese

für zehn Sekunden gevortext und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Es erfolgte ein Waschgang, bei dem unabhängig vom Ansatzvolumen jeweils 2 ml PBS-0,02% EDTA auf jede Probe pipettiert wurden. Nach 10 minütiger Zentrifugation bei 300 g wurde der Überstand vorsichtig abgesaugt. Das Zellpellet wurde in den Röhrchen kurz aufgelockert und dann zur Fixierung der Zellen in 300 µl 37° C warmen 4% PFA resuspendiert. Bei diesem Pipettiervorgang sollte die Zellsuspension mehrfach zügig auf- und abpipettiert werden, um die Probe gut zu mischen und eventuell vorhandene Zellaggregate zu lösen. Nach genau fünf min Inkubation bei Raumtemperatur wurden jeweils 1,2 ml kalter FACS-Puffer auf die Proben gegeben und die Proben wurden abermals 10 min bei 300 g zentrifugiert. Der Überstand wurde danach abgesaugt und die Zellpellets jeweils in 600 µl FACS-Puffer resuspendiert.

2.11.9. Färbung

Es wurden zwei verschiedene Färbeansätze hergestellt, da in diesem Versuch nicht nur T-Lymphozyten untersucht werden sollten, sondern auch NK-Zellen. Der erste Färbeansatz umfaßte die fluochrommarkierten Antikörper CD8-PECy-5, CD4-FITC und INFγ-PE, der zweite beinhaltete CD8-PECy-5, CD16-FITC und INFγ-PE.

Die Proben wurden wie unter 2.9 beschrieben behandelt und im FACScan analysiert.

2.12. Computerprogramme

Zur Erstellung dieser Arbeit wurden die folgenden Computerprogramme verwendet.

Programm Anwendung Microsoft Access Datenverwaltung

CellQuest Messung und Auswertung der durchflusszytometrischen Daten Microsoft Excel Datenverarbeitung

Graphpad Prism Grafik und Statistik Microsoft Word Textverarbeitung

3. Ergebnisse

3.1. Mit SEB-stimulierten T Zellen lässt sich die Wirkstärke von Immunsuppressiva