In-vitro-Differenzierung von Makrophagen aus Monozyten

Das mononukleäre Phagozytose System (MPS) besteht aus myeloiden Vorläuferzellen des Knochenmarks, im Blut zirkulierenden Monozyten sowie bereits im Gewebe ansässigen Makrophagen und dendritischen Zellen (HUME 2006; JUHAS et al. 2015). Das MPS stellt einen wichtigen Bestandteil des angeborenen Immunsystems dar und übernimmt vielfältige Funktionen wie die Phagozytose von apoptotischen oder geschädigten Zellen, Antigenpräsentation und die Produktion eines die Immunantwort lenkenden Zytokinspektrums (JUHAS et al. 2015; ZARIF et al. 2016). Eine besondere Rolle spielt das MPS bei der Bekämpfung von bakteriellen Infektionen sowie in der Steuerung von Entzündungsreaktionen, bei denen die im Blut zirkulierenden, peripheren Monozyten in das betroffene Gewebe einwandern und sich in Makrophagen oder dendritische Zellen differenzieren (VAN FURTH u. COHN 1968; JUHAS et al. 2015). Die Differenzierung der Monozyten wird durch verschiedene Zytokine gesteuert. So differenzieren sich Monozyten in Anwesenheit von GM-CSF (Granulocyte macrophage colony-stimulating factor) oder M-CSF (Macrophage colony-stimulating factor) in Makrophagen mit unterschiedlichen phänotypischen und funktionellen Eigenschaften, während sich die Monozyten in Anwesenheit von GM-CSF und IL-4 in dendritische Zellen differenzieren (LAWRENCE u. NATOLI 2011;

KITTAN et al. 2013). Abhängig von den anwesenden Stimuli können Makrophagen in klassisch-aktivierte (M1) Makrophagen (NATHAN et al. 1983) oder alternativ-aktivierte (M2) Makrophagen polarisiert werden (STEIN et al. 1992; GOERDT u. ORFANOS 1999; KITTAN et al. 2013).

In Anwesenheit von GM-CSF kultivierte Monozyten differenzieren sich in Richtung M1-Makrophagen, welche durch Stimulation mit Th1-Zytokinen wie IFN-γ oder TNF-α oder mit TLR-Liganden wie LPS proinflammatorische Zytokine wie TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12 und Chemokine wie CCL5 produzieren (GOERDT u. ORFANOS 1999; ZARIF et al. 2016). Die proinflammatorischen Eigenschaften der M1-Makrophagen finden weiter in einer gesteigerten Synthese von NO (Stickstoffmonoxid) und ROS sowie einer erhöhten Fähigkeit Antigen zu präsentieren Ausdruck (TAKEUCH u. AKIRA 2011; JUHAS et al. 2015). Daher haben sie eine besondere Bedeutung in der Abwehr bakterieller, viraler und mykotischer Pathogene sowie in der Eliminierung von Tumorzellen (MARTINEZ u. GORDON 2014; ZARIF et al. 2016).

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In Anwesenheit von M-CSF kultivierte Makrophagen differenzieren sich in Richtung M2-Makrophagen, welche durch Stimulation mit Th2-Zytokinen wie IL-4, IL-10 und IL-13, antiinflammatorische Zytokine wie IL-10, TGF-β (Transforming growth factor β), IL-1RA (Interleukin-1 Rezeptorantagonist) produzieren (GORDON 2003; JUHAS et al. 2015) und in ihrer Funktion NO zu produzieren gehemmt sind (MILLS et al. 2000). M2-Makrophagen spielen eine besondere Rolle in der Förderung der Wundheilung (MOSSER u. EDWARDS 2008; KOH u. DIPIETRO 2011; ZARIF et al. 2016), bei allergischen Reaktionen (SARADNA et al. 2018) und der Abwehr von Parasiten (KREIDER et al. 2007). Mantovani et al. schlugen eine weitere Unterteilung der M2-Makrophagen in M2a, M2b und M2c-Makrophagen vor.

Danach entstehen bei Exposition der Monozyten mit IL-4 und IL-13 M2a-Makrophagen, bei Exposition mit Immunkomplexen und TLR- oder IL-1-R-Agonisten M2b-Makrophagen, welche beide eher immunregulatorisch in Richtung Th-2-Antwort wirken, während M2c-Makrophagen, welche durch IL-10 induziert werden, eher immunsuppressiv wirken und für den Umbau von Gewebe zuständig sind (Remodeling) (MANTOVANI et al. 2004).

M1- und M2-Makrophagen unterscheiden sich auch in ihren phänotypischen Eigenschaften. So weisen M1-Makrophagen eine vermehrte Expression von MHC-Klasse-II Molekülen, CD80 und CD86 auf (AMBARUS et al. 2012; JUHAS et al. 2015). Laut einer Studie von Ambarus et al. ist CD80 der beste Marker, um mit IFN-γ stimulierte, humane Makrophagen zu charakterisieren (AMBARUS et al. 2012). M2-Makrophagen exprimieren dagegen vermehrt CD206 und/oder CD163 (TIEMESSEN et al. 2007; AMBARUS et al. 2012). Im Rahmen der intrazellulären Signaltransduktion spielen Transkriptionsfaktoren wie STAT (Signal transducer and activator of transcription) eine wichtige Rolle für die Makrophagenpolarisierung (LAWRENCE u. NATOLI 2011). NFκB, AP-1 (Αctivator protein-1), C/EBP-α (CCAAT/enhancer-binding protein α), STAT1 und IRF5 (Interferon regulatory factor 5) gelten als Mediatoren der M1-Polarisierung, während die M2-Polarisierung durch IRF4 (Interferon regulatory factor 4), KLF4 (Kruppel-like factor 4), STAT6 und PPARγ (Peroxisomeproliferator-activated receptor γ) vermittelt wird (LAWRENCE u. NATOLI 2011; JUHAS et al. 2015).

Martinez und Gordon et al. stellten das Konzept der M1- oder M2-Makrophagen in Frage. Die Autoren machen darauf aufmerksam, dass das bisherige System weder die Quelle der Stimuli

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einbeziehe, noch berücksichtige, dass M1 oder M2-Stimuli im Gewebe ko-existieren.

Demzufolge sollten die Makrophagen nicht in feste Subtypen eingeteilt werden, da der Reifungsprozess sehr komplex und dynamisch sei und von zahlreichen Faktoren abhänge (MARTINEZ u. GORDON 2014). Zum Teil sind die Gene für die Ausprägung der M1- oder M2-Makrophagen pleiotrop, sodass insbesondere unter pathologischen Bedingungen auch gemischte M1/M2-Phänotypen beobachtet werden (PETTERSEN et al. 2011; VOGEL et al.

2013). Während der Reifung können Makrophagen in vier verschiedenen Stadien beeinflusst werden (MARTINEZ u. GORDON 2014): Im ersten Stadium reifen die Makrophagen aus Monozyten, hier spielen insbesondere Wachstumsfaktoren wie GM-CSF und M-CSF, aber auch Adhäsionsmoleküle sowie die Rekrutierung steuernde Chemokine eine Rolle. Danach interagieren die gereiften Makrophagen mit verschiedenen myeloiden und lymphoiden Immunzellen wie T-Helferzellen, NK-Zellen, PMN und deren sezernierten Zytokinen (proinflammatorisch: IFN-γ, TNF, IL-1β, IL-6; antiinflammatorisch: IL-4, IL-13, IL-10, TGF-β). Auch eine Beeinflussung durch nicht hämatopoetische Zellen kann hierbei eine Rolle spielen. Weiterhin erfolgt die direkte (TLRs, NOD (nucleotide-binding oligomerization domain-)-like Rezeptoren, RLRs (retinoic acid-inducible gene-I-like receptor)) oder indirekte Beeinflussung (Immunglobuline verschiedener Klassen, Komplementfaktoren, Lektine) durch das Pathogen selbst. In der letzten Phase, der Resolution (Auflösung der Entzündung), werden die Makrophagen sowohl durch systemische (z.B. Glukokortikoide) als auch lokale Mediatoren (ATP (Adenosintriphosphat), Resolvine, Maresine etc.) beeinflusst (MARTINEZ u. GORDON 2014).

Die Effektivität der Immunabwehr ist abhängig von dem Umfang der Makrophagenplastizität, das heißt von der Fähigkeit der Makrophagen ihren mit einer bestimmten Funktion einhergehenden Phänotyp als Reaktion auf ein wechselndes Milieu oder auf die Anwesenheit von Pathogenen zu verändern (MALYSHEV u. MALYSHEV 2015). Eine Störung der Makrophagenplastizität kann zur Entstehung verschiedener Erkrankungen wie Krebs, Asthma oder Atherosklerose führen. Die Reprogrammierung von Makrophagen, einen bestimmten Phänotyp mit bestimmten Funktionen auszubilden, stellt ein neues Therapiekonzept dar.

Danach sollen durch Stimulation der Makrophagen mit proinflammatorischen Faktoren wie LPS oder IFN-γ M1-Makrophagen entstehen, welche weitere proinflammatorische Zytokine produzieren und so den Effekt verstärken. Auf diese Weise generierte M1-Makrophagen sollen

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antitumorale und antimikrobielle Eigenschaften aufweisen. Dadurch sind sie in der Lage, Tumoren oder Infektionen effektiver zu bekämpfen. So können Tumor-assoziierte M2-Makrophagen durch IFN-γ in M1-Makrophagen reprogrammiert werden, welche antitumorale Eigenschaften besitzen, indem sie beispielsweise die Aktivität zytotoxischer T-Zellen erhöhen (DULUC et al. 2009). Andersherum soll die Stimulation von Makrophagen mit antiinflammatorischen Stimuli wie IL-10, IL-13 oder TGF-β zur Entstehung antiparasitär wirksamer, wundheilungsfördernder M2-Makrophagen entstehen. Das Konzept weist noch viele Unklarheiten auf. So wird von M2-Makrophagen berichtet, die trotz der Anwesenheit von M1-Stimulatoren entstanden sind und vice versa (ZHANG u. MORRISON 1993; BENOIT et al. 2008; MALYSHEV u. MALYSHEV 2015).

Aus Monozyten gereifte Rindermakrophagen wurden bisher auf verschiedene Weisen generiert. Um M1- oder M2-Makrophagen zu generieren, inkubierten Castillo-Velazquez et al.

die über 10 bis 12 Tage aus Blutmonozyten generierten Makrophagen über 22 Stunden (Stdn.) mit LPS und IFN-γ oder IL-4. In Mycobacterium avium spp. paratuberculosis-resistenten Rindern führte die Stimulation der Zellen mit LPS allein zu einer höheren NO-Produktion als in mit IL-4 oder IFN-γ stimulierten Makrophagen, während die Phagozytose der Bakterien durch die anwesenden Stimuli nicht beeinflusst wurde (CASTILLO-VELÁZQUEZ et al. 2013).

Werling et al. generierten Makrophagen, indem sie periphere mononukleäre Zellen separierten und über 6 bis 10 Tage in Teflon-Beuteln kultivierten. Anschließend wurden die Makrophagen durch Adhäsion an Mikrotiterplatten isoliert und mit verschiedenen TLR-Liganden mit oder ohne IFN-γ kultiviert. Makrophagen, welche in Anwesenheit von IFN-γ und LPS generiert wurden, zeigten eine höhere NO-Produktion als nur mit den TLR-Liganden inkubierte Makrophagen, wobei IFN-γ zu keiner Steigerung der NO-Produktion führte (WERLING et al.

2004). Einer anderen Methode nach werden CD14-positive Monozyten durch Magnetic activated cell sorting (MACS) aus dem Blut von Rindern gewonnen, über 4 bis 7 Tage kultiviert, am Tag 6 mit IFN-γ und 24 Stdn. später mit LPS oder mit IL-4 und IL-13 stimuliert (DUVEL et al. 2012). Die klassische Aktivierung mit LPS und IFN-γ führt zu einer verminderten CD163-Expression, während diese durch Aktivierung mit IL-4 und IL-13 nicht verändert ist. Mit LPS aktivierte Makrophagen zeigen eine vermehrte Genexpression von IL10, aber auch von IL12 und NOS2. Nach der Studie zeigen auch mit IFN-γ vorinkubierte und mit

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LPS stimulierte Makrophagen eine vermehrte Expression von IL12 und NOS2 (DUVEL et al.

2012). Eine vermehrte Expression von IL-10 konnte aber auch nach alternativer Aktivierung von Makrophagen mit IL-4 und Sekretionsprodukten von Fasciola hepatica festgestellt werden (FLYNN u. MULCAHY 2008).

Das in dieser Arbeit für die Polarisierung boviner Makrophagen angewendete Versuchsschema (3.4.1) orientiert sich an der Arbeit von Zarif et al. Sie verglichen verschiedene Vorgehensweisen zur Polarisierung humaner, CD14-positiver Monozyten in M1- oder M2-Makrophagen. Die homogenste und am stärksten polarisierte Zellpopulation wurde bei einer Stimulation der Monozyten mit GM-CSF oder M-CSF über 5 Tage und anschließender erneuter Stimulation mit M1- (GM-CSF, IFN-γ, IL-6) oder M2- (M-CSF, IL-4, IL-13, IL-6) Zytokinen für weitere 4 Tage erreicht (ZARIF et al. 2016).