Durchflusszytometrische Bestimmung der intrazellulären Kalzium

Nach der Separation boviner MNC wurden diese über 10 Min. zentrifugiert (400 x g, 4 °C).

Um die Monozyten zu markieren, wurden diese über 30 Min. auf Eis im Kühlschrank (4 °C) mit einem kreuzreaktiven Maus-anti-human-CD172a-RPE-Cy5-Antikörper (finale Verdünnung: 1:30 in MIF-Puffer) (9.2.3.1) inkubiert und zweimal mit 5 ml MIF-Puffer gewaschen (10 Min., 400 x g, 4 °C). Um die Monozyten-Subpopulationen zu markieren,

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wurden die MNCs dagegen über 30 Min. mit einem primärem, kreuzreaktiven, unmarkierten Maus-anti-human-CD16-Antikörper (finale Verdünnung: 1:50) (9.2.3.1) bei 4 °C auf Eis inkubiert, zweimal mit 5 ml MIF-Puffer gewaschen (10 Min., 400 x g, 4 °C) und anschließend mit einem Ziege-anti-Maus-PE (finale Verdünnung: 1:100) (9.2.3.1) markierten Sekundärantikörper über weitere 30 Min. auf Eis inkubiert. Nach erneutem zweimaligen Waschen in MIF-Puffer (10 Min., 400 x g, 4 °C) wurden die MNCs erneut 30 Min. auf Eis mit einem kreuzreaktiven Maus-anti-human-CD14-AF 647-Antikörper (finale Verdünnung: 1:50) (9.2.3.1) inkubiert und erneut zweimal mit MIF-Puffer gewaschen (10 Min., 400 x g, 4 °C). Zur Messung der mit einer Aktivierung der Zellen einhergehenden erhöhten intrazellulären Kalziumkonzentration wurden diese mit dem Kalziumsensitiven Farbstoff Fluo-4-Acetoxymethylester (Fluo4-AM) (9.2.3) inkubiert. Zunächst liegt das Molekül in ungeladener Form vor und gelangt durch die AM-Modifikation in den Intrazellularraum. Durch die anschließende Spaltung des Fluo-4-AM durch im Zytoplasma vorkommende Esterasen wird das Fluo4 in seine geladene Form überführt, welche in der Lage ist Kalziumionen zu binden.

Durch die Bindung des Kalziums erhöht sich die Fluoreszenzintensität des Fluorochroms, welches durchflusszytometrisch im Fluoreszenzkanal 1 (FL 1, Grünfluoreszenz) erfasst werden kann. Fluo4-AM (50 μg) wurde in 5 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) (9.2.3) gelöst und 95 μl fetales Kälberserum (9.2.3) hinzugefügt. Nun wurden die mit CD172a oder anti-CD14 und anti-CD16 markierten Monozyten auf 3 x 10⁶ Monozyten/ml in HBSS (Hank´s balanced salt solution) (9.2.3) eingestellt. Diese wurden mit 2 μl Fluo-4 AM (1:10 in PBS, final: 100 nmol/l) über 30 Min. bei 37 °C im Brutschrank jeweils in An- und Abwesenheit von M. bovis (MOI 10) inkubiert, zweimal in HBSS gewaschen (10 Min., 250 x g, RT) und erneut in das Ausgangsvolumen aufgenommen. Unmittelbar danach wurden 150 μl der Zellsuspension in 1,5 ml Eppendorfgefäße, welche 100 μl Propidiumiodid-Lösung (9.2.6.3) enthielten, überführt. Im direkten Anschluss erfolgte die durchflusszytometrische Messung der Stimulus-induzierten Aktivierung boviner Monozyten. Dazu wurde die Fluoreszenzintensität im Kanal FL 1 in Abhängigkeit von der Zeit gemessen. Nachdem sich nach etwa 30 Sek. die Basislinie eingestellt hatte, erfolgte die Zugabe von 50 μl des jeweiligen Stimulus mittels einer Kapillarspitze (9.2.2) bei laufender Messung. Die gesamte Messdauer betrug 2 Min. Als Negativkontrolle wurde vor jeder Messung HBSS als Stimulus eingesetzt. Um das Maß der maximalen Aktivierung festzustellen, erfolgte am Ende jeder Messreihe die Stimulation mit

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1 μg/ml Ionomycin (9.2.3). Als weitere Positivkontrolle wurden die Zellen mit rekombinantem bovinen CCL5 (boCCL5 100 nmol/l) stimuliert (9.2.3). Als zu testende Stimuli wurden rekombinantes bovines CCL4 (boCCL4) und CX3CL1 (jeweils boCX3CL1 100 nmol/l) (9.2.3), M. bovis (MOI 10) oder dessen LAMPs (1 μg/ml) eingesetzt. Nach jeder Messung wurde das Durchflusszytometer über 1 bis 2 Min. mit A. dest. gespült, um eine mögliche Voraktivierung der Zellen durch im Durchflusszytometer vorhandene Reste vorangegangener Stimuli auszuschließen.

Für die Auswertung wurden die Zellen im Dichteplot dargestellt (FSC/SSC) und die Monozyten durch Setzen eines Fensters identifiziert (siehe Abb. 3). Nach selektiver Darstellung der Monozyten wurden die vitalen, PI-negativen Monozyten durch Setzen eines Fensters bestimmt.

Unter den vitalen Zellen wurden CD172a-positive oder klassische (CD14⁺/CD16^-), intermediäre (CD14⁺/ CD16⁺) und nicht-klassische (CD14^-/ CD16⁺) Monozyten identifiziert.

Von den CD172a-positiven Monozyten oder den einzelnen Monozyten-Subpopulationen (cM, intM, ncM) wurde jeweils die Grünfluoreszenz im Kanal FL 1 in Abhängigkeit von der Zeit erfasst. Vor und unmittelbar nach der Stimulation wurde eine 15 Sek. umfassende Region (Region 1 und Region 2) gesetzt. Nun erfolgte die Einzeldarstellung von R1 (vor Stimulation) und R2 (nach Stimulation). Ein Quadrant wurde so gelegt, dass sich die horizontale Linie oberhalb der Basislinie befand (< 15 % der in diesem Plot dargestellten Ereignisse). Der prozentuale Anteil der in R2 dargestellten Zellen, welcher sich oberhalb der horizontalen Linie befand, wurde von dem in R1 dargestellten prozentualen Anteil im oberen rechten Quadranten erfasster Zellen subtrahiert, Mittelwerte sowie der Standardfehler ermittelt und mithilfe eines Säulendiagramms graphisch dargestellt.

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Abb. 3 Prinzip der Messung des Kalzium-Einstroms in bovinen Monozyten-Subpopulationen.

Mononukleäre Zellen (MNC) wurden aus bovinem Blut isoliert, mit Antikörpern gegen CD14 und CD16 markiert und mit Fluo-4 beladen. A) Monozyten (Region: ‚Mono‘) wurden im Dichteplot (FSC/SSC) identifiziert. B) Darstellung der Monozyten im Dichteplot (FL 3/SSC) und Identifikation der Propidiumiodid-negativen, vitalen Monozyten (Region ‚vital‘). C) Darstellung der vitalen Monozyten und Identifikation klassischer (cM), intermediärer (intM) und nicht-klassischer (ncM) Monozyten anhand ihrer Expression von CD14 und CD16. D) Erfassung der Grünfluoreszenz über die Zeit, nach gating auf vitale, klassische Monozyten (cM) und Setzen eines 15 Sek. langen Zeitfensters vor Stimulation (Region R1) und nach Stimulation (Region R2). E) Einzeldarstellung von R1 und Setzen eines Quadranten, sodass sich im oberen rechten Quadranten (Q1-UR) < 15 % der erfassten Ereignisse befanden. F) Einzeldarstellung von R2 und Setzen eines mit in E) dargestellten, identischen Quadranten (Q2-UR). Zur Auswertung wurde der prozentuale Anteil der in R2 dargestellten Zellen, welcher sich im oberen rechten Quadranten befand, erfasst und von dem in R1 dargestellten prozentualen Anteil im oberen rechten Quadranten dargestellter Zellen subtrahiert.

48 3.5.3 Phagozytose Assay

Für die Bestimmung der Phagozytoseaktivität wurden separierte CD14-positive Monozyten über 48 Stdn. in Anwesenheit von 20 ng/ml boGM-CSF oder 20 ng/ml boM-CSF in R10F⁺-Medium in einer 12-Well-Zellkulturplatte (9.2.2) (0,5 x 10⁶ Monozyten/Well) kultiviert. Anschließend erfolgte die Ablösung der Zellen von der Zellkulturplatte. Dazu wurde der Überstand verworfen und die Zellen mit 300 μl Accutase® über 3 bis 5 Min. bei 37 °C im Brutschrank (5 % CO2) abgelöst. Zur Inaktivierung der Accutase® wurden nun 500 μl R10F⁺-Medium hinzugefügt, die Zellen in ein 5 ml Röhrchen überführt und zentrifugiert (10 Min., 300 x g, RT). Nach Verwerfen des Überstandes wurden die Zellen in 1 ml RPMI-Medium (9.2.3) resuspendiert. 50 μl der Zellsuspension wurden in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß, in dem 150 μl Propidiumiodid-Lösung (9.2.6.3) vorgelegt waren, überführt und die Anzahl vitaler MdM durchflusszytometrisch bestimmt. Die Zellzahl wurde in RPMI-Medium auf 1 x 10⁶ Zellen/ml eingestellt. Je 100 μl der Zellsuspension (1 x 10⁵ Zellen) wurden in eine 96-Well-Zellkulturplatte mit Rundboden überführt und mit in Paraformaldehyd-fixierten, FITC-markierten, opsonisierten oder nicht-opsonisierten E. coli (MOI 50) (9.2.5.2) über 40 Min. bei 37 °C im Brutschrank (5 % CO2) inkubiert. Für die Opsonisierung FITC-markierter E. coli wurden diese über 45 Min. bei 37 °C im Brutschrank (5 % CO2) mit 500 μl heterologem, bovinen Serum (1:10 in PBS verdünnt) inkubiert.

Anschließend erfolgte ein Waschschritt mit RPMI-Medium, wobei die Bakterien zweimal bei 14 000 x g über 5 Min. zentrifugiert und schließlich in das Ausgangsvolumen aufgenommen wurden. Um die Zahl Phagozytose-aktiver Zellen zu bestimmen, wurden diese zweimal mit 200 μl PBS gewaschen (Zentrifugation: 5 Min., 300 x g, 4 °C), schlussendlich in 100 μl PBS aufgenommen und in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß überführt, in dem 100 μl Propidiumiodid-Lösung vorgelegt waren. Die Prozentzahl FITC-markierter in Makrophagen aufgenommener E. coli (Phagoztoseaktive Makrophagen) wurde im FL 1 durchflusszytometrisch erfasst (Daten nicht gezeigt).

3.5.4 Generierung reaktiver Sauerstoffspezies

Um zu untersuchen, ob sich boGM-CSF-MdM von boM-CSF-MdM in ihrer Fähigkeit ROS zu bilden unterscheiden, wurden separierte CD14-positive Monozyten wie in 3.2.2.1 beschrieben isoliert und wie in 3.4.1 über 48 Stdn. oder 96 Stdn. in Anwesenheit von 20 ng/ml boGM-CSF

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oder 20 ng/ml boM-CSF kultiviert und abgelöst. Nach der durchflusszytometrischen Bestimmung der Zahl vitaler Makrophagen wurden diese in RPMI-Medium auf 2 x 10⁶ Zellen/ml eingestellt. Je 100 μl der Zellsuspension (2 x 10⁵ Zellen) wurden in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß überführt und mit inaktiviertem, heterologen, bovinen Serum-opsonisierten oder nicht-Serum-opsonisierten E. coli für 15 Min. stimuliert. Anschließend wurde der Stimulus durch zweimaliges Waschen der Zellen mit 500 μl PBS (300 x g, 10 Min., RT) entfernt und die Zellen mit RPMI-Medium in das Ausgangsvolumen aufgenommen. In eine 96-Well-Zellkulturplatte mit Rundboden wurde 100 μl DHR-Percoll (Dihydrorhodamin 123) (9.2.3) vorgelegt und je 50 μl der stimulierten Zellen hinzugegeben. Dihydrorhodamin ist ein Fluoreszenzfarbstoff, welcher zur Detektion intrazellulärer ROS wie Peroxid und Peroxinitrit eingesetzt wird. Kommt das Zellmembrangängige DHR in Kontakt mit ROS, wird es zu Rhodamin 123 oxidiert, welches im FL 1 (Emissionsmaximum 507-527 nm) erfasst werden kann. Ein Teil der Zellen wurde zusätzlich mit final 100nM PMA (Phorbol-12-Myristat-13-Acetat) stimuliert (9.2.3). Die Zellen wurden mithilfe eines Plattenrüttlers resuspendiert und für 30 Min. bei 37 °C (5 % CO2) im Brutschrank inkubiert.

Anschließend wurde die Rundbodenplatte sofort auf Eis verbracht und die Zellsuspensionen in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß, in dem 100 μl Propidiumiodid-Lösung (9.2.6.3) vorgelegt waren, überführt und die ROS-Aktivität der Makrophagen durch Bestimmung der MFI (Mittlere Fluoreszenzintensität) im Fluoreszenzkanal 1 bestimmt.

Um die ROS-Bildung in Anwesenheit von M. bovis oder dessen LAMPs in An- oder Abwesenheit von IFN-γ zu testen, wurden frisch separierte MNC (3.2.1) in RPMI-Medium auf 6 x 10⁶ Zellen/ml eingestellt und je 100 μl der Zellsuspension in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß überführt. Dann wurden die Zellen mit LPS (1 μg/ml), LAMPs (1 μg/ml) oder M. bovis (MOI 10) in An- und Abwesenheit von boIFN-γ (100 ng/ml) über 24 Stdn. stimuliert (24 Stdn.

wurden in einem Vorversuch als die Zeit ermittelt, nach der die stärkste ROS-Bildung erfolgte;

Daten nicht gezeigt). Anschließend wurde der Stimulus durch zweimaliges Waschen der Zellen mit 500 μl PBS (300 x g, 10 Min., RT) entfernt und die Zellen mit RPMI-Medium in das Ausgangsvolumen aufgenommen. Alle weiteren Schritte wurden wie oben beschrieben durchgeführt.

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3.6 Messung der Stickoxid-Produktion boviner Makrophagen

Die Messung der Stickoxid-(NO)-Produktion von Makrophagen wurde mit dem Griess-Test durchgeführt. Nach der Separation CD14-positiver Monozyten (3.2.2.1) wurden die Zellen in R10F-Medium resuspendiert, auf 4 x 10⁵ Zellen/ml eingestellt und je 200 μl der Zellsuspension (0,8 x 10⁵ Zellen) in eine 96-Well-Zellkulturplatte mit Flachboden (9.2.2) verbracht. Die Zellen wurden nun mit 20 ng/ml boGM-CSF mit oder ohne M. bovis (MOI 10) oder 20 ng/ml boM-CSF über 48 Stdn. funktionell polarisiert. Danach wurde der Überstand verworfen, die Zellen mit je 200 μl PBS gewaschen und je nach Experiment mit 200 μl R10F-Medium, 1 μg/ml LPS, 1 μg/ml LAMPs, M. bovis (MOI 10) jeweils in An- und Abwesenheit von 100 ng/ml boIFN-γ oder mit 100 μg/ml Zymosan in Duplikaten stimuliert.

Alle Stimuli wurden in 200 μl R10F-Medium angesetzt. Nach 24 Stdn. wurde der Zellüberstand in 1,5 ml Eppendorfgefäße überführt und zentrifugiert (5 Min., 500 x g, RT). Je 50 μl des zellfreien Überstandes wurden in eine 96-Well-Flachbodenplatte überführt und mit je 50 μl Griess-Reagenz (9.2.3) über 5 Min. in Aluminiumfolie eingeschlagen bei RT inkubiert.

Parallel dazu wurde eine zweifache Verdünnungsreihe einer 128 μM Natriumnitritlösung in R10F-Medium angelegt (128 μmol/l bis 2 μmol/l) (9.2.3). 50 μl jeder Verdünnungsstufe sowie 50 μl R10F (als Nullwert) wurden ebenfalls in die 96-Well-Flachbodenplatte gegeben und zur selben Zeit wie die Zellüberstände mit 50 μl Griess-Reagenz über 5 Min. in Aluminiumfolie eingeschlagen bei RT inkubiert. Die Ansätze wurden jeweils in Triplikaten ausgeführt. Die optische Dichte (OD) wurde nun mithilfe eines Mikrotiterplatten-Filterphotometers (9.1) bei einer Wellenlänge von 550 nm bestimmt. Zur Auswertung wurden die in OD gemessenen Werte in mOD umgerechnet und der Mittelwert von den in Triplikaten gemessenen Ansätzen gebildet. Um den NO-Gehalt der Zellüberstände zu bestimmen, wurde zunächst eine Natriumnitritstandardkurve als Referenzkurve erstellt. Dazu wurden die mOD in Abhängigkeit von der Verdünnungsstufe (2 μmol/l bis 128 μmol/l) dargestellt. In die Formel der Kurve wurden nun die in den Zellüberständen gemessenen mOD-Werte eingefügt und so der in den Proben enthaltene NO-Gehalt in μmol bestimmt.

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3.7 Kultivierung von BoMac-Zellen

Die BoMac-Zelllinie wurde im Brutschrank in 5 % CO2 Atmosphäre bei 37°C in D10F⁺-Medium (9.2.6.2) kultiviert. Die Kultivierung erfolgte in T25er oder T75er Kulturflaschen (9.2.2)unter Zusatz von 5 ml bzw. 15 ml Medium. Bei einer Konfluenz von 90 % wurden die Zellen passagiert. Dazu wurden die Zellen zweimal mit 5 ml bzw.

10 ml D⁺-Medium (9.2.6.2) gewaschen und nach jedem Waschschritt über 10 Min. im Brutschrank (37 °C, 5 % CO2) inkubiert. Anschließend wurden die Zellen über 6 Min. im Brutschrank mit 3 bzw. 6 ml Trypsin (1:10 in PBS, 9.2.6.2) abgelöst. Danach noch anhaftende Zellen wurden durch vorsichtiges Klopfen von dem Zellkulturflaschenboden gelöst und das Trypsin durch Zusatz von 3 bzw. 10 ml D10F⁺-Medium inaktiviert. Nun wurde die Zellsuspension zentrifugiert (10 Min., 300 x g, 4 °C), der Überstand verworfen und die Zellen in 5 ml D10F⁺-Medium resuspendiert. Pro T25er Zellkulturflasche wurden 250 μl und pro T75er Zellkulturflasche 500 μl Zellsuspension ausgesät und das Volumen auf 5 ml (T25) oder 15 ml (T75) D10F⁺-Medium aufgefüllt. Für experimentelle Ansätze erfolgte die Anzucht der BoMac-Zellen in einer 24-Well-Zellkulturplatte. Dazu wurden 20 μl der Zellsuspension im Verhältnis 1:3 mit Trypanblau (9.2.3) versetzt und in einer Bürker-Zählkammer (9.1) gezählt.

Es wurden je 0,2 x 10⁶ Zellen/Well ausgesät und die Zellsuspension mit D10F⁺-Medium auf ein Gesamtvolumen von 1 ml/Well gebracht. Für experimentelle Ansätze mit M. bovis erfolgte die Kultivierung der Zellen in D10F-Medium (ohne Zusatz von Penicillin-Streptomycin).

3.7.1 In-vitro-Stimulation von BoMac-Zellen

Zur Untersuchung ob BoMac-Zellen in gleichem Maße polarisiert werden können wie primäre MdM, wurden die BoMac-Zellen wie in 3.7 beschrieben von der Zellkulturflasche abgelöst. In eine 24-Well-Zellkulturplatte wurden je 0,05 x 10⁶ Zellen in D10F⁺-Medium eingesät und entweder mit 20 ng/ml boGM-CSF oder 20 ng/ml boM-CSF stimuliert. Nach 48 Stdn. wurde ein Teil der Zellen phänotypisch charakterisiert (siehe unten). Der andere Teil der Zellen wurde entweder mit 20 ng/ml LPS und 20 ng/ml boIFN-γ sowie 20 ng/ml boGM-CSF (boGM-CSF-BoMac) oder mit 20 ng/ml boIL-4 und 20 ng/ml boIL-13 sowie 20 ng/ml boM-CSF (boM-CSF-BoMac) über weitere 48 Stdn. kultiviert. Am Ende der Kultivierungsphase erfolgte die phänotypische Charakterisierung mit einem kreuzreaktiven

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Maus-anti-human-CD163-RPE-Antikörper (finale Verdünnung 1:30) und einem kreuzreaktiven Maus-anti-Schaf-MHC-II-FITC-Antikörper (finale Verdünnung 1:40) (9.2.3.1) mittels Membranimmunfluoreszenz (3.5.1). Um zu überprüfen, ob die Antikörper spezifisch an die BoMac-Zellen binden, wurde parallel eine Isotypkontrolle mitgeführt (IgG1-RPE, finale Verdünnung 1:30 und IgG2a-FITC, finale Verdünnung 1:40).

Zur Feststellung, ob eine Inkubation von BoMac-Zellen mit M. bovis zu einer Änderung der Morphologie oder des Phänotyps der BoMac-Zellen führt, wurden je 0,06 x 10⁶ Zellen pro Well in eine 24-Well-Zellkulturplatte in D10F-Medium (9.2.6.2) eingesät und über 24 Stdn. mit M. bovis (MOI 10) inkubiert. Anschließend wurden die Zellen phänotypisch charakterisiert (siehe oben).

3.7.2 Einfrieren und Auftauen der BoMac-Zelllinie

Um die BoMac-Zellen einzufrieren, wurden diese bei 90 %iger Konfluenz aus einer T25er Zellkulturflasche abgelöst. Dazu wurden die Zellen zweimal mit jeweils 5 ml D⁺-Medium gespült. Nach Verwerfen des Überstandes wurden die Zellen über 6 Min. im Brutschrank (37 °C, 5 % CO2) mittels 3 ml Trypsin (1:10 in PBS) abgelöst. Danach noch anhaftende Zellen wurden durch vorsichtiges Klopfen von dem Zellkulturflaschenboden gelöst und das Trypsin durch Zusatz von 3 ml D10F⁺-Medium inaktiviert. Nun wurde die Zellsuspension zentrifugiert (10 Min., 300 x g, 4 °C), der Überstand verworfen und die Zellen in 5 ml D10F⁺-Medium resuspendiert. Um die Zahl vitaler Zellen zu ermitteln, wurden 20 μl der Zellsuspension im Verhältnis 1:3 mit Trypanblau versetzt und in einer Bürker-Zählkammer gezählt. Die Zellen wurden anschließend zentrifugiert (10 Min., 300 x g, 4 °C), in BoMac-Gefriermedium (9.2.6.2) resuspendiert und auf 1 x 10⁶ Zellen/ml eingestellt. Jeweils 1 ml der Zellsuspension wurde in ein Kryoröhrchen (9.2.2) überführt. Diese wurden über Nacht bei - 80 °C in einem Gefrierbehältnis um 1 °C/Min. heruntergekühlt. Die Lagerung der Zellen erfolgte bei - 80 °C.

Um die Zellen aufzutauen, wurde das Kryoröhrchen langsam zwischen den Händen gerollt.

Sobald sich die Zellen wieder in Suspension befanden, wurden diese in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen, in welchem 10 ml vorgewärmtes D10F⁺-Medium vorgelegt waren, überführt. Um das DMSO, welches im Gefriermedium enthalten war, zu entfernen, wurden die Zellen zunächst zentrifugiert (10 Min., 300 x g, 4 °C) der Überstand verworfen, die Zellen in

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10 ml D10F⁺-Medium resuspendiert und in eine T75er Zellkulturflasche überführt. Die Kultivierung der Zellen erfolgte in einem Brutschrank (37 °C, 5 % CO2). Vor Nutzung der Zellen für Versuche wurden diese mindestens zweimal passagiert.

3.8 Proteinanalytische Methoden

Um zu untersuchen, ob M. bovis mit dem IFN-γ−Signaltransduktionsweg interferiert, wurden die Aktivierung von STAT1 (signaltransducer of activation and transcription 1) und PKC-α (Proteinkinase C-α) mittels Western-Blot analysiert. Dazu wurden bovine CD14-positive Monozyten wie unter 3.2.2.1 beschrieben aus dem Blut von Rindern isoliert und 2 x 10⁶ Zellen/Well in einer 6-Well-Zellkulturplatte (9.2.2) eingesät. Diese wurden über 48 Stdn. unter dem Einfluss von boGM-CSF (20 ng/ml) in An- oder Abwesenheit von M. bovis (MOI 10) in R10F-Medium im Brutschrank inkubiert.

3.8.1 Zellstimulation

Da das im R10F-Medium enthaltene fetale Kälberserum verschiedene Proteine wie Wachstumsfaktoren und Hormone enthält, deren Zusammensetzung variabel ist, wurden die Zellen einmal mit 2 ml serumfreien RPMI-Medium gewaschen, bevor sie über 4 Stdn. mit 3 ml serumfreien RPMI-Medium inkubiert wurden. Zur Stimulation wurden die Zellen für 15 Min. mit 20 ng/ml boIFN-γ oder 12 μl PBS im Brutschrank inkubiert. Nach der Stimulation wurde das Medium entfernt, die Zellen auf Eis gelegt, einmal mit 500 μl, 4 °C kaltem PBS gespült und im direkten Anschluss mit der Proteinextraktion (3.8.2) begonnen.

3.8.2 Proteinextraktion

Um das Protein aus den stimulierten Zellen zu extrahieren, wurden die Kulturen mit 70 μl Boehringer-Lysepuffer (9.2.6.4), welcher einen Firmen-spezifischen Phosphataseinhibitor-Mix (9.2.3) (finale Verdünnung: 1:100) enthielt, über 5 Min. inkubiert, mit einem Zellschaber abgelöst, in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß überführt und zentrifugiert (5 Min., 20 000 x g, 4 °C). Die Proteinmenge wurde mit dem DC Protein Assay (Bio-Rad, 9.2.3) bestimmt. Dazu wurden 20 μl der A´ Lösung (1000 μl Lösung A + 25 μl Lösung S) in einer 96-Well-Flachbodenplatte vorgelegt, bevor jeweils 2 μl der Proben oder zur

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vergleichenden Betrachtung einer BSA-Standardkurve, 0, 1, 2, 3 und 4 μl einer BSA-Lösung (2 mg/ml) hinzupipettiert wurden. Anschließend wurden die Wells mit 200 μl Lösung B versetzt und über 5 Min. im Dunkeln gelagert. Die Absorption wurde mit einem Mikrotiterplatten-Filterphotometer gemessen und die Proteinmenge mithilfe der BSA-Standardkurve in einer Excel-Tabelle ermittelt. Die Proteinlysate wurden nun auf je 8 μg Protein pro 20 μl eingestellt. Dazu wurden die Proben mit jeweils 4 μl Laemmli-Puffer (4 x) (9.2.6.4), welcher beta-Mercaptoethanol und SDS (9.2.3) enthielt, versetzt und das Volumen mit Boehringer-Lysepuffer (9.2.6.4) auf 20 μl aufgefüllt. Die Proteine wurden nun über 5 Min. bei 95 °C in einem Blockthermostat (9.2.2) denaturiert und bei -20 °C gelagert.

3.8.3 SDS-Gelelektrophorese

Bei der SDS-Gelelektrophorese werden Proteine ihrem Molekulargewicht entsprechend aufgetrennt. Die während der Proteinextraktion erfolgte Denaturierung sorgt gemeinsam mit dem SDS, welches sich in einem bekannten Maße an die Proteine anlagert und so deren negative Ladung überdeckt, zur Auflösung der Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur. Die auf diese Weise linearisierten Proteine können nun in einem diskontinuierlichen Gel durch Anlegen einer Spannung entsprechend ihrer Größe aufgetrennt werden.

Zunächst wurde ein diskontinuierliches Gel, bestehend aus Sammel- und Trenngel gegossen.

Für die in dieser Arbeit detektierten Proteine wurde eine Acrylamidkonzentration von 12 % und eine Geldicke von 1,5 mm gewählt. Um das Gel nach unten hin abzudichten, wurde am unteren Rand des Trenngels ein Stopfgel (9.2.6.4) gegossen. Dann wurde die Gel-Gießapparatur einmal zu jeder Seite geschwenkt, um das Gel auch seitlich abzudichten. Nach dem Gießen des Trenngels (9.2.6.4) wurden Luftblasen durch Zugabe von 500 μl Isopropanol (9.2.3) entfernt.

Nach 13 Min. wurde das Isopropanol unter Zuhilfenahme eines Filters wieder entfernt. Danach wurde das Sammelgel (9.2.6.4) gegossen und ein 1,5 mm Kamm eingesetzt. Nachdem die Gele ausgehärtet waren, wurden sie in die Elektrophorese Apparatur von Bio-Rad (9.1) eingespannt und die Kammer mit 1 Liter (l) SDS-Laufpuffer (9.2.6.4) gefüllt. Dann wurden die Taschen zweimal mit 1 ml SDS-Laufpuffer gespült um Gelreste zu entfernen. Vor dem Auftragen der Proben wurden diese 2 bis 3 Min. bei 95 °C erhitzt und bei 17 000 x g für 10 Sek. zentrifugiert.

Pro Tasche wurden 20 μl der Proben oder 6 μl eines Proteinmarkers (9.2.3) aufgetragen.

Zunächst erfolgte das Einlaufen der Proben über 15 Min. bei 100 V. Dieser Schritt dient zur

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Schaffung einer gleichmäßigen Lauffront der Proben. Dann traten die Proben in das Trenngel ein und wurden über 75 Min. ihrer Größe nach elektrophoretisch aufgetrennt.

3.8.4 Western-Blot

Durch Anlegen einer Spannung wurden die im Gel aufgetrennten Proteine mittels Tank-Blot-Verfahren (Wet-Blot) auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Dazu wurde das Gel aus der Elektrophoreseapparatur gewonnen, das Sammelgel abgetrennt und das Gel in Blot-Puffer (9.2.6.4) gebracht. Außerdem wurden zwei Schwämme, zwei Filter (1,0 mm), drei Filter (0,36 mm) und die Nitrozellulosemembran (0,45 mm, 9.2.2) in Blot-Puffer eingelegt. Diese wurden nach dem Sandwich-Verfahren in die Western-Blot Apparatur (Bio-Rad, 9.1) eingebracht: Auf das helle Kunststoffgitter (zeigt später zur roten Seite der Blot-Kassette, positiver Pol) wurden ein Schwamm, ein 1 mm Filter und ein 0,36 mm Filter aufgelegt.

Eventuelle Luftblasen wurden durch einmaliges Rollen mit einer 10 ml Pipette entfernt. Darauf folgten die Nitrozellulosemembran, das Gel, zwei 0,36 mm Filter und ein 1 mm Filter. Nun wurden eventuelle Luftblasen erneut durch Rollen mit einer weitlumigen Pipette entfernt, der zweite Schwamm aufgelegt und die Kunststoffgitter geschlossen. Die Gitter wurden nun so in die Blot-Kassette eingebracht, dass auf der Seite der schwarzen Blot-Kassette (schwarzes Kunststoffgitter, negativer Pol) das Gel und auf der roten Seite der Blot-Kassette (helles Kunststoffgitter, positiver Pol) die Nitrozellulosemembran lag. Nun wurde der Tank vollständig mit Blot-Puffer gefüllt. Um eine Überhitzung zu vermeiden wurde dem Tank noch ein Eisblock und zur Durchmischung des Puffers ein Rührfisch (9.1) zugefügt. Die anschließende Übertragung der Proteine aus dem Gel auf die Nitrozellulosemembran erfolgte über 1 Std. bei 100 V.

3.8.5 Immunoblot

Bei der Immunodetektion nach einem Western-Blot werden die nachzuweisenden Proteine durch Chemilumineszenz sichtbar gemacht. Die geblotteten Proteine werden mit einem Primärantikörper markiert. In einem zweiten Schritt werden gebundene Primärantikörper mit einem Sekundärantikörper nachgewiesen, der mit dem Enzym Meerrettich-Peroxidase (HRP, horseradish peroxidase) gekoppelt ist. Die Enzym-katalysierte Umsetzung des hinzugefügten Substrates (Luminophor) führt zur Freisetzung von elektromagnetischer

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Strahlung im Bereich des ultravioletten und sichtbaren Lichts (Chemilumineszenz). Diese wird in einer Chemilumineszenz-Detektionseinheit erfasst. Lumineszierende Proteinbanden lassen sich Software-gestützt, densitometrisch (semiquantitativ) auswerten.

Zunächst wurde die Nitrozellulosemembran zur Rehydratation in voll-entsalztes-Wasser

Zunächst wurde die Nitrozellulosemembran zur Rehydratation in voll-entsalztes-Wasser

Im Dokument Interaktion von Mycoplasma bovis mit bovinen Monozyten-Subpopulationen (Seite 52-0)