5. Diskussion
5.3 boGM-CSF und boM-CSF gereifte Makrophagen unterscheiden sich in
Der weitere Verlauf einer Infektion hängt maßgeblich von der Differenzierung von Monozyten in proinflammatorische (M1) oder antiinflammatorische (M2) Makrophagen ab (ZHANG u.
WANG 2014). Um zu prüfen, inwieweit M. bovis die Polarisierung von Makrophagen beeinflusst, wurde zunächst gefragt, ob und wie sich bovine Makrophagen nach aus der Humanmedizin bekannten Schemata polarisieren lassen. Dazu wurde zunächst das Konzept geprüft, ob boGM-CSF und boM-CSF allein zu einer Polarisierung boviner MdM führen. Zur Bestimmung des Polarisierungsgrades wurden morphologische (FSC, SSC), phänotypische (CD163, MHC-Klasse-II) und funktionelle (Bildung reaktiver Sauerstoffspezies, Stickoxid-Produktion) Parameter untersucht. Die Änderung morphologischer Parameter wie Zellgröße und Komplexität einer Zelle sind Indizien für die Reaktion mit einem Agens (FLETCHER u. SELIGMANN 1985). Auf Basis morphologischer Parameter unterscheiden sich boGM-CSF- und boM-CSF-MdM von in Medium gereiften MdM (Abb. 12).
Übereinstimmend mit humanen Studien waren die in Anwesenheit der Wachstumsfaktoren
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kultivierten MdM signifikant größer (FSC) als in Medium kultivierte MdM (YOUNG et al.
1990). Nach 96 Stdn. unterschieden sich boGM-CSF- und boM-CSF-MdM auch hinsichtlich ihrer Komplexität (Abb. 12). Dies stimmt mit Angaben aus der Literatur überein, wonach sich humane M-CSF-MdM morphologisch von GM-CSF-MdM unterscheiden (YOUNG et al. 1990;
VOGEL et al. 2014). Unter dem Einfluss von GM-CSF gereifte humane MdM weisen sowohl eine runde als auch eine elongierte Zellform auf, während unter dem Einfluss von M-CSF gereifte humane MdM eine spindelzellige Morphologie aufweisen (JAGUIN et al. 2013;
VOGEL et al. 2014). Nach der Reifung können die Makrophagen durch proinflammatorische (LPS, IFN-γ) oder antiinflammatorische Stimuli (IL-4, IL-13) aktiviert werden (VOGEL et al.
2014). Daher wurde als nächstes das Konzept geprüft, ob eine zusätzliche Stimulation, der unter dem Einfluss der Wachstumsfaktoren gereiften MdM zu einer stärkeren Polarisierung führt.
Die Stimulation der boGM-CSF-MdM mit LPS/boIFN-γ bzw. der boM-CSF-MdM mit boIL-4/boIL-13 hatte in der Tat einen zusätzlichen Einfluss auf die Morphologie boviner MdM.
So waren LPS/IFN-γ-stimulierte boGM-CSF-MdM kleiner als IL-4/IL-13-stimulierte boM-CSF-MdM, während sich die Zellen in ihrer Komplexität nicht voneinander unterschieden (Abb. 13). Aus der Literatur ist bekannt, dass mit LPS und IFN-γ stimulierte humane GM-CSF-MdM eine spindelzellige Morphologie aufweisen, während mit IL-4 stimulierte M-CSF-GM-CSF-MdM eher eine runde Morphologie, bei gleichzeitiger Anwesenheit einiger elongierter Zellen zeigen (VOGEL et al. 2014).
Daraus kann auf Basis morphologischer Parameter geschlossen werden, dass bovine MdM durch boGM-CSF und boM-CSF polarisiert werden können und dass eine zusätzliche Stimulation der Zellen zu einer Verstärkung des Effektes führt.
Übereinstimmend mit humanen und murinen Studien, unterschieden sich auch bovine boGM-CSF und boM-CSF-MdM hinsichtlich ihrer phänotypischen Eigenschaften. So wiesen bovine boM-CSF-MdM wie humane M-CSF-MdM eine signifikant höhere CD163-Expression im Vergleich zu (bo)GM-CSF-MdM auf (Abb. 15) (AMBARUS et al. 2012; SAMANIEGO et al. 2014). Dagegen führte in einer anderen Studie die Reifung humaner MdM in Anwesenheit von GM-CSF oder M-CSF nicht zu signifikanten Unterschieden hinsichtlich der CD163-Expression (VOGEL et al. 2014). Die CD163-Expression in bovinen Medium- und boM-CSF-MdM, unterschied sich nach 48 Stdn. wie in humanen MdM (VOGEL et al. 2014)
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nicht signifikant voneinander (Abb. 15). Nach 96 Stdn. unterschieden sich die CD163-Expression von boM-CSF-MdM und Medium-MdM jedoch signifikant (Abb. 15).
Daraus kann geschlossen werden, dass die in Medium kultivierten bovinen MdM bezogen auf die Expression von CD163, übereinstimmend mit humanen MdM, sowohl von der Differenzierung der MdM in Anwesenheit von boGM-CSF als auch von boM-CSF verschieden sind (AMBARUS et al. 2012). Da sich die CD163-Expression zwischen über 48 Stdn. und 96 Stdn. kultivierten boGM-CSF bzw. boM-CSF-MdM nicht signifikant voneinander unterschied (Abb. 15), kann daraus geschlossen werden, dass 48 Stdn. zur Differenzierung von bovinen Monozyten in Makrophagen mit unterschiedlichen phänotypischen Eigenschaften ausreichen.
Eine zusätzliche Stimulation der boGM-CSF- und boM-CSF-MdM (mit LPS/IFN-γ oder IL-4/IL13) führte nicht zu einer wesentlichen Modulation der CD163-Expression (Abb. 16).
Entgegen der beobachteten Veränderungen beim Rind, konnte eine Reifung humaner Monozyten in Anwesenheit von M-CSF und anschließender Stimulation mit IL-4 im Vergleich zu mit IFN-γ stimulierten GM-CSF-MdM keine Veränderung der CD163-Expression bewirken (AMBARUS et al. 2012). Da sich humane nur mit IL-4 oder IFN-γ stimulierte MdM, im Gegensatz zu nur mit GM-CSF oder M-CSF polarisierten MdM, nicht in ihrer Expression von CD163 unterschieden, schlossen die Autoren, dass die Polarisierung der Makrophagen mit GM-CSF und M-CSF sich nur partiell mit den durch IFN-γ oder IL-4 herbeigeführten phänotypischen Eigenschaften überlappen (AMBARUS et al. 2012). Dagegen zeigten bovine, mit LPS/boIFN-γ klassisch aktivierte MdM eine signifikant niedrigere CD163-Expression als alternativ mit boIL-4 und boIL-13 aktivierte bovine MdM (DUVEL et al. 2012). Dies deutet darauf hin, dass die Polarisierung durch boGM-CSF/boM-CSF und die Stimulation durch LPS/boIFN-γ bzw. IL4/IL-13 im bovinen System in dieselbe Richtung gesteuert wird. In Anwesenheit von GM-CSF, LPS und IFN-γ oder M-CSF und IL-4 gereifte canine MdM zeigten keinen Unterschied in der Höhe der CD163-Expression (HEINRICH et al. 2017). Auch andere in dieser Studie untersuchte, typische humane M1- oder M2-Marker verhielten sich in caninen MdM nicht wie in humanen MdM (HEINRICH et al. 2017). Die Polarisierung von bovinen, caninen und humanen MdM scheint sich also speziesspezifisch zu unterscheiden. Bezogen auf die MHC-Klasse-II-Expression zeigte sich eine Verstärkung des polarisierenden Effektes nur
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in boGM-CSF-MdM, welcher sich in einer vermehrten MHC-Klasse-II-Expression in stimulierten boGM-CSF-MdM äußerte.
Daraus kann geschlossen werden, dass sich bovine MdM auf Basis der CD163-Expression polarisieren lassen und eine zusätzliche Stimulation den polarisierenden Effekt der Wachstumsfaktoren nicht wesentlich verstärkt. Auch wenn die geringere CD163-Expression in boGM-CSF-MdM im Vergleich zu den boM-CSF-MdM für eine Polarisierung in Richtung M1-Phänotyp spricht (VOGEL et al. 2014), deutet die fehlende Änderung der MHC-Klasse-II-Expression, einem typischen M1-Marker (AMBARUS et al. 2012), in boGM-CSF-MdM gegen eine klare Polarisierung der Zellen. In der Literatur wird berichtet, dass zur Bestimmung des M1- oder M2-Phänotyps stets mehrere Marker herangezogen werden sollten (VOGEL et al. 2014). Zum Zeitpunkt der Versuchsdurchführung waren keine weiteren, aus Studien mit humanen MdM bekannten typischen M1- (z. B. CD80, CD86) oder M2-Marker (z.B. CD206) (AMBARUS et al. 2012; VOGEL et al. 2014; JUHAS et al. 2015), welche mit der Spezies Rind kreuzreagieren, verfügbar, weswegen keine weiteren phänotypischen Marker zur Untersuchung des Polarisierungsgrades boviner MdM herangezogen wurden.
boGM-CSF- und boM-CSF-Makrophagen unterscheiden sich nicht wesentlich in ihrer Funktion
Auch die funktionellen Analysen der mit boGM-CSF oder boM-CSF inkubierten MdM sprechen gegen eine klare Polarisierung der Zellen. So unterschieden sich boGM-CSF- und boM-CSF-MdM nicht in ihrer Fähigkeit zur Phagozytose opsonisierter oder nicht-opsonisierter E. coli (Daten nicht gezeigt). Humane M-CSF-MdM weisen eine höhere Fähigkeit auf, opsonisierte Latex-Kügelchen, lebende E. coli und Lactobacillus lactis zu phagozytieren als GM-CSF-MdM (NEU et al. 2013). Genexpressionsanalysen deuten auf eine ähnlich hohe Phagozytoseaktivität von in Anwesenheit von GM-CSF oder M-CSF gereiften murinen Makrophagen hin (MABBOTT et al. 2010). Auch nach Aktivierung muriner und humaner Makrophagen mit klassischen M1- oder M2-Stimuli zeigen sich, die Phagozytosefähigkeit betreffend, keine einheitlichen Ergebnisse (TARIQUE et al. 2015; ZHANG et al. 2016).
Insofern scheint die Phagozytosefähigkeit als Indikator für die Polarisierung von humanen und bovinen MdM nicht geeignet zu sein. Weiterhin scheint es, bezogen auf die
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Phagozytoseaktivität, speziesspezifische Unterschiede zwischen humanen, murinen und bovinen, in Anwesenheit von GM-CSF oder M-CSF generierten Makrophagen zu geben.
Über 48 Stdn. und 96 Stdn. polarisierte boGM-CSF- und boM-CSF-MdM unterschieden sich nur im Detail in ihrer Fähigkeit zur Produktion reaktiver Sauerstoffspezies. So wiesen über 48 Stdn. mit nicht-opsonisierten E. coli inkubierte boGM-CSF-MdM bei Stimulation mit PMA eine höhere ROS-Bildung auf als nur mit nicht-opsonisierten E. coli inkubierte boGM-CSF-MdM (Abb. 21). Nach 96 Stdn. verhielt sich der beobachtete Effekt umgekehrt. So wiesen mit nicht-opsonisierten E. coli stimulierte boM-CSF-MdM nach zusätzlicher Stimulation mit PMA eine höhere ROS-Produktion auf als nur mit nicht-opsonisierten E. coli inkubierte boM-CSF-MdM (Abb. 22). Bei diesem Ergebnis muss jedoch in Betracht gezogen werden, dass die Anzahl der Tiere nicht repräsentativ für die durchgeführte Untersuchung ist (nach 48 Stdn. n = 4, nach 96 Stdn. n = 2). Insgesamt fällt auf, dass die bovinen MdM weder nach Inkubation mit opsonisierten oder nicht-opsonisierten E. coli, noch bei zusätzlicher Stimulation mit PMA eine vermehrte Produktion reaktiver Sauerstoffspezies zeigen. Aus der Literatur ist bekannt, dass es Unterschiede in der ROS-Bildung von MdM verschiedener Rinderrassen gibt. So zeigten aus Holstein-Friesian gewonnene MdM bei Stimulation mit Zymosan oder Listeria monocytogenes eine signifikant geringere Fähigkeit reaktive Sauerstoffspezies zu bilden als MdM aus Brown Swiss (GIBSON et al. 2016). Da die hier verwendeten Kühe alle der Rasse Holstein Friesian angehören, könnte dies eine Erklärung für das fehlende Ansprechen der bovinen MdM auf eine Stimulation mit E. coli sein. Laut Literatur besitzen murine, in Anwesenheit von GM-CSF kultivierte Peritonealmakrophagen eine höhere Fähigkeit reaktive Sauerstoffspezies zu bilden als M-CSF-Makrophagen (DING et al. 1988).
Auch hier scheint es also speziesspezifische Unterschiede hinsichtlich der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies von GM-CSF- und M-CSF-Makrophagen zu geben.
Weiterhin unterschieden sich mit Zymosan stimulierte boGM-CSF- und boM-CSF-MdM auch nicht in ihrer Fähigkeit NO zu bilden (Abb. 24). Funktionelle Studien, welche die NO-Produktion in Anwesenheit von GM-CSF oder M-CSF generierten Makrophagen vergleichen, sind rar. Murine in Anwesenheit von GM-CSF oder M-CSF kultivierte Peritonealmakrophagen unterscheiden sich nicht in ihrer Fähigkeit zur NO-Produktion, während IFN-γ allein eine vermehrte Produktion von NO bewirkt (DING et al. 1988). Klassisch
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aktivierte, mit IFN-γ und LPS stimulierte murine Makrophagen weisen eine vermehrte Expression von iNOS, einem Enzym, welches für die Produktion von NO verantwortlich ist, auf (CHAN u. RICHES 2001). Allerdings unterscheidet sich die iNOS-Regulation zwischen murinen und bovinen Makrophagen (ADLER et al. 1995), weshalb aus den murinen Studien keine Rückschlüsse auf die NO-Produktion von bovinen Makrophagen gezogen werden können. Bei Stimulation boviner Makrophagen mit IFN-γ wurde im Gegensatz zu murinen Makrophagen keine Erhöhung der iNOS-Expression oder der NO-Produktion beobachtet (ADLER et al. 1995; JUNGI et al. 1996b). Klassisch aktivierte, mit LPS und IFN-γ stimulierte bovine Makrophagen wiesen jedoch eine vermehrte iNOS-Expression auf als mit IL-4 und IL-13 aktivierte Makrophagen (DUVEL et al. 2012). Daraus kann geschlossen werden, dass boGM-CSF und boM-CSF, obwohl sie in der Literatur als M1 oder M2 polarisierende Agenzien gelten (TAKEUCH u. AKIRA 2011), im Gegensatz zu den klassischen M1- (LPS, IFN-γ) oder M2-Stimuli (IL-4, IL-13), keinen differenziellen Einfluss auf die NO-Produktion boviner MdM haben.
Hinsichtlich der Phagozytose, NO- und ROS-Produktion unterscheiden sich bovine boGM-CSF-MdM nicht von boM-boGM-CSF-MdM und lassen daher keine Rückschlüsse auf eine funktionell-polarisierende Wirkung dieser beiden Wachstumsfaktoren zu. Die Expression von Makrophagenmarkern und die Zytokinproduktion hängen sowohl von der Reifung (GM-CSF und M-CSF) als auch von der Aktivierung der Zellen (z.B. LPS, IFN-γ, IL-4, IL-13) ab (VOGEL et al. 2014). Möglicherweise hätte eine Stimulation der boGM-CSF-MdM mit LPS/boIFN-γ sowie der boM-CSF-MdM mit boIL-4/boIL-13 eine klarere Polarisierung hinsichtlich der funktionellen Eigenschaften bewirkt.
Weiterhin ist zu bedenken, dass die Funktion der Makrophagen durch die Bindung der anti-CD14-MicroBeads an die Monozyten während der Isolation (einphasiges magnetisches Zellseparationsverfahren, 3.2.2.1) beeinflusst werden kann. Neu et al. untersuchten, ob mittels positiver oder negativer magnetischer Zellseparation gewonnene humane und mit GM-CSF oder M-CSF polarisierte MdM sich in ihren phänotypischen oder funktionellen Eigenschaften unterscheiden. Während die Separationstechnik keinen Einfluss auf den Phänotyp der GM-CSF oder M-CSF-MdM hatte, wiesen mittels CD14-MACS gewonnene GM-CSF-MdM eine höhere Fähigkeit auf Listeria monocytogenes zu phagozytieren. Die Isolationsmethode hatte jedoch
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keinen Einfluss auf die Phagozytose von opsonisierten Latex-Kügelchen, lebenden E. coli und Lactobacillus lactis (NEU et al. 2013). Eine Studie verglich die Phagozytoseaktivität von mittels MACS oder durch Adhärenz an Zellkulturflaschen gewonnenen, aus Monozyten generierten dendritischen Zellen (DC). Dabei zeigte sich bei mittels MACS gewonnenen, aus Monozyten generierten dendritischen Zellen eine signifikant geringere Zahl an phagozytoseaktiven Zellen, während die Phagozytoseaktivität, gemessen an der mittleren Fluoreszenzintensität sich zwischen beiden Isolationsmethoden nicht unterschied. Durch MACS-Separation gewonnene Monozyten wiesen aber eine höhere Reinheit und Vitalität auf (DELIREZH et al. 2013). Der Studie nach Neu et al. zufolge ist es unwahrscheinlich, dass die Separationstechnik einen Einfluss auf den Phänotyp der boGM-CSF und boM-CSF-MdM hatte.
Bei der Untersuchung zur Phagozytosefähigkeit kann jedoch der Effekt der Separationstechnik eine Rolle spielen (DELIREZH et al. 2013; NEU et al. 2013).