9. Anhang
9.2 Material
9.2.4 Versuchstiere
Zur Blutentnahme wurden ausschließlich weibliche Tiere der Rasse „Deutsche Schwarzbunte“, Typ Holstein-Friesian verwendet. Alle Tiere waren klinisch gesund und der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover zugehörig (AZ 33.19-42502-05-17A176). Die Tiere waren im Durchschnitt 7,5 Jahre alt.
177 9.2.5 Biologische Materialien
9.2.5.1 Mykoplasmen
Mycoplasma bovis, Stamm PG45 Prof. Dr. Renate Rosengarten, Mycoplasma Biosafety Services GmbH, Wien
(Österreich)
Mycoplasma bovirhinis, Stamm PG43T Dr. Jochen Meens, Institut für
Mikrobiologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover;
Prof. Dr. Renate Rosengarten, Mycoplasma Biosafety Services GmbH, Wien
(Österreich) Lipid-assoziierte Membranproteine
(LAMPs) von Mycoplasma bovis, Stamm PG45
Dr. Jochen Meens, Institut für
Mikrobiologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Die Mykoplasmen wurden bei -80° C gelagert.
9.2.5.2 Bakterien
Escherichia coli, Stamm 2045/2/12, PFA-fixiert
Institut für Mikrobiologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Escherichia coli, Stamm 2045/2/12, hitzeinaktiviert (30 Min bei 60 °C), opsonisiert mit Rinderpoolserum
Institut für Mikrobiologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Escherichia coli -FITC markiert, Stamm 2045/2/12, PFA-fixiert
Institut für Mikrobiologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Die inaktivierten Bakterien wurden bei -20° C gelagert.
178 9.2.5.3 Eukaryotische Zellen
BoMac-Zellen (Bovine Macrophage Cells) Dr. Joachim Spergser,
Veterinärmedizinische Universität Wien, Institut für Mikrobiologie
Die Zellen wurden bei -80° C unter Zusatz von 25 % FCS und 10 % DMSO gelagert.
9.2.6 Lösungen, Puffer, Kulturmedien
Die Lagerung der Lösungen, Puffer und Kulturmedien erfolgte, wenn nicht anders beschrieben, bei 4° C.
Natriumnitritlösung (128 μM)
NaNO2 34,5 mg
Aqua tridest. ad 50 ml
Isotones Percoll
NaCl 0,9 g
Percoll® ad 1000 ml
9.2.6.1 Puffer und Lösungen für die Zellseparation Lymphozytenseparationsmedium®
Das Lymphozytenseparationsmedium® ist eine wässrige, isotone Lösung, welche sich aus einem hochmolekularen Zucker, dem Röntgenkontrastmittel Isopaque und Natriumdiatrizoat zusammensetzt. Bei 10 °C liegt die Dichte der Lösung bei 1,077 g/ml. Für die Zellseparation wurde das Lymphozytenseparationsmedium® in dieser Arbeit unverdünnt eingesetzt.
179 Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS)
Zur Herstellung der Lösung wurden folgende Chemikalien abgewogen und in Aqua tridest.
gelöst:
NaCl 8 g
KCl 1,24 g
Na2HPO4 0,2 g
KH2PO4 0,2 g
Aqua tridest. ad 1000 ml
Danach erfolgte die Einstellung des pH-Wertes der Lösung auf 7,4 unter Zuhilfenahme von 1N NaOH.
Doppelt konzentrierte phosphatgepufferte Salzlösung (2 x PBS)
NaCl 16 g
KCl 2,48 g
Na2HPO4 0,4 g
KH2PO4 0,4 g
Aqua tridest. ad 1000 ml
Danach erfolgte die Einstellung des pH-Wertes der Lösung auf 7,4 unter Zuhilfenahme von 1N NaOH.
180 EDTA-Stammlösung (0,5 mol/l)
EDTA x 2 H2O 16,8 g
NaOH-Plätzchen 5,6 g
Aqua dest. ad 50 ml
Danach erfolgte die Einstellung des pH-Wertes der Lösung auf 7,5 unter Zuhilfenahme von 3 N HCl und das Auffüllen mit A. dest. auf 100 ml. Vor Gebrauch wurde die Lösung mit einem 0,2 μm Filter steril filtriert.
MACS-Puffer
Bovines SerumalbuminFraktion V (BSA)
5 g
EDTA-Stammlösung (0,5 mol/l) 4 ml
PBS ad 1000 ml
Anschließend wurde die Lösung mit einem 0,2 μm Filter steril filtiert.
9.2.6.2 Zellkulturmedien und Zusätze
Für die Kultivierung von Leukozyten und BoMac-Zellen wurden verschiedene Medien verwendet. Zur Bereitstellung von Nährstoff-, Hormon- und Wachstumsfaktoren wurde einigen Kulturmedien fetales Kälberserum zugesetzt. Dann wurde das Medium mit einem 10F gekennzeichnet. Bei Zusatz von Penicillin-Streptomycin erfolgte eine zusätzliche Bezeichnung mit einem „+“.
BoMac-Gefriermedium
Fetales Kälberserum um 2,5 ml
Penicillin-Streptomycin 1,0 ml
DMEM-Medium ad 10 ml
181
D10F+ (DMEM-Medium mit 10 % (v/v) fetalem Kälberserum)
DMEM-Medium 500 ml
Fetales Kälberserum 50 ml
Penicillin-Streptomycin 10 mg
R0+ (RPMI-1640-Medium)
RPMI-1640-Medium 500 ml
Penicillin-Streptomycin 10 mg
R10F+ (RPMI-1640-Medium mit 10 % (v/v) fetalem Kälberserum)
RPMI-1640-Medium 500 ml
Fetales Kälberserum 50 ml
Penicillin-Streptomycin 10 mg
Trypsin-EDTA
Trypsin-EDTA 5 ml
PBS 45 ml
Hank´s buffered Salt Solution (HBSS) ohne Phenolrot
9.2.6.3 Puffer und Lösungen für die Durchflusszytometrie MIF-Puffer
Bovines SerumalbuminFraktion V (BSA)
2,5 g
NaN3 0,05 g
PBS ad 500 ml
182 Trägerflüssigkeit (Sheath)
Als Trägerflüssigkeit für die durchflusszytometrische Messung diente PBS mit 0,1 mg/ml NaN3.
Propidiumiodid-Stammlösung
Die aliquotierte Stammlösung (100 μg/ml) wurde bei -20 °C gelagert. Zur Anfärbung toter Zellen wurde die Stammlösung mit PBS auf eine Endkonzentration von 4 μg/ml gebracht:
Propidiumiodid-Stammlösung (100 μg/ml)
1 ml
PBS ad 25 ml
9.2.6.4 Puffer und Lösungen für den Western-Blot APS (Ammoniumperoxodisulfat 10 %)
Ammoniumperoxodisulfat 2 g
VE-H2O 20 ml
Blot-Puffer
TG-Puffer (10 x) 100 ml
Methanol 200 ml
SDS (10 %) 2,5 ml
VE-H2O ad 1000 ml
183 Boehringer Lysepuffer
TRIS, pH 7,4 50 mM
NaCl 150 mM
NaF 40 mM
EDTA 3 mM
EGTA 2 mM
NP40 1 % (v/v)
SDS 0,1 % (w/v)
NaDoc 0,1 % (w/v)
Laemmli-SDS (4x)
TRIS 1,45 g
SDS 4 g
Glycerol 20 ml
Bromphenolblau 20 mg
A. dest. ad 50 ml
Vor Gebrauch wurden 1 ml Laemmli (4x) 25 μl beta-Mercaptoethanol zugesetzt.
Lower TRIS
TRIS Base 90,855 g
SDS (10 %) 20 ml
VE-H2O ad 500 ml
Magermilchpulverlösung (5 %)
Milchpulver Blotting grade, fettarm 2,5 g
TBS-T ad 50 ml
184 Sammelgel
VE-H2O 2,7 ml
Rotiphorese Gel 30 0,67 ml
Upper TRIS 0,5 ml
Ammoniumperoxodisulfat (10 %) 0,04 ml
TEMED 0,008 ml
Bromphenolblau 0,05 ml
SDS (10 %)
SDS 100 g
VE-H2O ad 1000 ml
SDS-Laufpuffer
TG-Puffer (10 x) 100 ml
SDS (10 %) 10 ml
VE-H2O ad 1000 ml
Stopfgel
Trenngel 0,5 ml
TEMED 0,005 ml
Stripping-Puffer pH 2,0
Glycin 7,5 g
Tween-20 1,25 ml
SDS (10 %) 50 ml
VE-H2O ad 1000 ml
185 TG-Puffer (10 x)
TRIS Base 30,3 g
Glycin 144 g
VE-H2O ad 1000 ml
TBS (10 x), pH 7,4
TRIS Base 60,55 g
NaCl 90 g
VE-H2O ad 1000 ml
TBS (1 x)
TBS (10 x) 100 ml
VE-H2O ad 1000 ml
TBS-T
Tween-20 2,5 ml
TBS (1 x) ad 1000 ml
Trenngel (12 % Acrylamid)
VE-H2O 2,4 ml
Rotiphorese Gel 30 3,1 ml
Lower TRIS 2 ml
Ammoniumperoxodisulfat (10 %) 0,075 ml
TEMED 0,005 ml
186 Upper TRIS, pH 6.8
TRIS-HCl 39,4 g
SDS (10 %) 20 ml
VE-H2O ad 500 ml
187
9.3 Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Versuchsschemata zur Untersuchung der Differenzierung von bovinen MdM (monocyte-derived macrophages) unter dem Einfluss der Wachstumsfaktoren GCSF und
M-CSF. ... 38
Abb. 2: Versuchsschemata zur Untersuchung des Einflusses von M. bovis, dessen LAMPs oder M. bovirhinis auf die Stimulation von MdM (monocyte-derived macrophages) mit IFN-γ. ... 40
Abb. 3 Prinzip der Messung des Kalzium-Einstroms in bovinen Monozyten-Subpopulationen. ... 47
Abb. 4: Chemokin-induzierter Kalziumeinstrom in bovinen Monozyten. ... 61
Abb. 5: Chemokin-induzierter Kalziumeinstrom in bovinen Monozyten-Subpopulationen. .. 63
Abb. 6: CCL5-induzierter Kalziumeinstrom in mit M. bovis inkubierten bovinen Monozyten-Subpopulationen. ... 65
Abb. 7: M. bovis induzierter Kalziumeinstrom in bovinen Monozyten-Subpopulationen. ... 67
Abb. 8: Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht in vitro kultivierter BoMac-Zellen. ... 69
Abb. 9 CD163-und MHC-Klasse-II-Expression in vitro kultivierter BoMac-Zellen. ... 70
Abb. 10: Vergleichende Betrachtung der CD163 und MHC-Klasse-II Expression in vitro kultivierter MdM (monocyte-derived macrophages) und BoMac-Zellen. ... 72
Abb. 11 Morphologische und phänotypische Eigenschaften von mit M. bovis kultivierten MdM (monocyte-derived macrophages) und BoMac-Zellen im Vergleich. ... 74
Abb. 12: Relative Größe und Komplexität von unter dem Einfluss von boGM-CSF oder boM-CSF gereiften Makrophagen (MdM, monocyte-derived macrophages). ... 76
Abb. 13: Einfluss einer polarisierenden Stimulation auf die Größe und die Komplexität von Makrophagen (MdM, monocyte-derived macrophages), die unter dem Einfluss von boGM-CSF oder boM-CSF in vitro differenzieren. ... 78
Abb. 14: Vorwärts- (FSC) und Seitwärtsstreulicht (SSC) von polarisierten Makrophagen (MdM, monocyte-derived macrophages) unter dem Einfluss von M. bovis und dem Mykoplasmen-Kulturmedium mbsFRIIS. ... 80
Abb. 15: CD163- und MHC-Klasse-II-Expression von unter dem Einfluss der Wachstumsfaktoren boGM-CSF oder boM-CSF gereiften MdM (monocyte-derived macrophages). ... 82
188
Abb. 16: CD163- und MHC-Klasse-II-Expression von unter dem Einfluss der Wachstumsfaktoren boGM-CSF und boM-CSF gereiften und mit LPS und boIFN-γ oder boIL-4 und boIL-13 stimulierten MdM (monocyte-derived macrophages). ... 8boIL-4 Abb. 17: CD163- und MHC-Klasse-II-Expression von in vitro generierten Makrophagen unter dem Einfluss von boGM-CSF, boM-CSF und M. bovis. ... 86 Abb. 18: MHC-Klasse-II-Expression boviner MdM (monocyte-derived macrophages) in Anwesenheit von M. bovis oder M. bovis-LAMPs (Lipid-assoziierte Membranproteine) und boIFN-γ. ... 88 Abb. 19: MHC-Klasse-II-Expression boviner MdM (monocyte-derived macrophages) in Anwesenheit von M. bovis oder M. bovirhinis und boIFN-γ. ... 89 Abb. 20: Einfluss von M. bovis und boIFN-γ auf die MHC-Klasse-II-Expression von Makrophagen, die in vitro aus klassischen (cM), intermediären (intM) und nicht-klassischen (ncM) Monozyten generiert wurden. ... 91 Abb. 21: Bildung reaktiver Sauerstoffspezies von über 48 Stdn. unter dem Einfluss von boGM-CSF oder boM-boGM-CSF gereiften MdM (monocyte-derived macrophages). ... 93 Abb. 22: Bildung reaktiver Sauerstoffspezies von über 96 Stdn. unter dem Einfluss von boGM-CSF oder boM-boGM-CSF gereiften MdM (monocyte-derived macrophages). ... 95 Abb. 23: Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) boviner MdM (monocyte-derived macrophages) in Anwesenheit von M. bovis oder dessen LAMPs (Lipid-assoziierte Membranproteine). ... 97 Abb. 24 NO-Produktion von boGM-CSF- und boM-CSF-MdM (monocyte-derived macrophages). ... 99 Abb. 25: IFN-γ-vermittelte NO-Produktion in bovinen MdM (monocyte-derived macrophages) in Anwesenheit von M. bovis oder dessen LAMPs (Lipid-assoziierte Membranproteine). .. 100 Abb. 26: Proteinexpression von pPKC-α und pSTAT1 in MdM (monocyte-derived macrophages) unter dem Einfluss von M. bovis und IFN-γ. ... 101
189
9.4 Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Fluoreszenzkanäle des BD Accuri™ C6 Flow Cytometers ... 42 Tab. 2: Übersicht über in der Membranimmunfluoreszenz eigesetzte Antikörper ... 44 Tab. 3: Für die Proteindetektion verwendete Antikörper ... 57
190
9.5 Abkürzungsverzeichnis
°C Grad Celsius
µ mikro (x 10-6)
µl Mikroliter
µm Mikrometer
A. dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser) A. tridest. Aqua tridestillata (destilliertes Wasser)
Abb. Abbildung
AF Alexa Fluor
ANOVA Analysis of variance (Varianzanalyse)
AZ Aktenzeichen
bo rekombinantes bovines
BoMac Bovine Macrophages (bovine Makrophagenzelllinie) BSA Bovines Serumalbumin
bzw. beziehungsweise
CCL β-Chemokin-Ligand mit zwei Cysteinmolekülen in Folge CD cluster of differentiation (Differenzierungsmuster)
cM classical Monocyte (klassischer Monozyt) CO2 Kohlenstoffdioxid
CR Chemokin-Rezeptor
CXCL α-Chemokin-Ligand mit zwei Cysteinmolekülen, die durch eine beliebige Aminosäure getrennt werden
DGP Degranulation product (Degranulierungsprodukte) DMSO Dimethylsulfoxid
DNA desoxyribonucleic acid (Desribonukleinsäure) E. coli Escherichia coli
EDTA ethylendiamine-tetraacetic acid (Ethylendiamintetraacetat) ELISA enzyme-liked Immunosorbent Assay
et al. et alii (lateinsch: und andere) FITC Fluoresceinisothiocyanat
191
FL 1 Messkanal des Durchflusszytometers für emittierte Fluoreszenz Grünfluoreszenz (495 nm; 520 nm)
FL 2 Messkanal des Durchflusszytometers für emittierte Fluoreszenz Orangefluoreszenz (495 nm; 578 nm)
FL 3 Messkanal des Durchflusszytometers für emittierte Fluoreszenz Rotfluoreszenz (530 nm; 615 nm)
FL 4 Messkanal des Durchflusszytometers für emittierte Fluoreszenz Dunkelrotfluoreszenz (650 nm; 668 nm)
for forward (vorwärts)
FSC forward scatter (Vorwärtsstreulicht), Messparameter des BD Accuri® Flow Cytometers
g Gramm
ggf. gegebenenfalls
GM-CSF Granulocyte macrophage colony-stimulating factor (Granulozyten-Monozyten-Kolonie-stimulierender Faktor)
HBSS Hank´s buffered salt solution
H20 Wasser
H202 Wasserstoffperoxid
IFN Interferon
Ig Immunglobulin
IL Interleukin
intM intermediate Monocyte (intermediärer Monozyt) iNOS Induzierbare Stickoxid-Synthase
kDa Kilodalton
l Liter
LAMPs Lipid-associated membrane proteins (Lipid-assoziierte Membranproteine) LPS Lipopolysaccharid
m milli (x 10-3) M. bovis Mycoplasma bovis M. bovirhinis Mycoplasma bovirhinis
MACS magnetic activated cell sorting (magnetische Zellseparation)
192
M-CSF Macrophage colony-stimulating factor (Makrophagen-Kolonie stimulierender Faktor)
-MdM Monocyte-derived macrophages (aus Monozyten gereifte Makrophagen) MHC-II Major-histocompatibility-complex class-II
(Haupthistokompatibilitätskomplex-Klasse-II) MIF Membranimmunfluoreszenz
Min. Minute(n)
ml Milliliter
mm Millimeter
MNC mononuclear cells (mononukleäre Zellen)
MOI Multiplicity of infection (Multiplizität der Infektion)
mol Mol
mRNA messenger RNA (Boten-RNA)
n = die Anzahl der Einzelbeobachtungen zur Berechnung des Mittelwertes n.ops Nicht opsonisiert
ns nicht signifikant NaCl Natriumchlorid NaHep Natrium-Heparin
ncM nonclassical Monocyte (nicht-klassischer Monozyt) NK-Zellen Natürliche Killerzellen
NO Nitric oxide (Stickstoffmonoxid/Stickoxid) o.Ä: oder ähnliches
OD Optische Dichte
ops opsonisiert
p Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Ähnlichkeitsanalyse zweier Datengruppen PAMP Pathogen-associated molecular pattern (Pathogen-assoziiertes molekulares
Muster)
PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) (R)PE (R)-Phycoerythrin
PI Propidiumiodid
PKC Proteinkinase C