4. Ergebnisse
4.2 Phänotypische und morphologische Eigenschaften von BoMac-Zellen
4.2.1 Morphologische und phänotypische Eigenschaften von unter dem Einfluss der Wachstumsfaktoren boGM-CSF oder boM-CSF kultivierten BoMac-Zellen
Um zu prüfen, ob sich die BoMac-Zellen unter dem polarisierenden Einfluss von boGM-CSF und boM-CSF sowie Stimulation der Zellen mit boIFN-γ und LPS einerseits und boIL-4 und boIL-13 andererseits in Makrophagen mit unterschiedlichen morphologischen und phänotypischen Eigenschaften ausdifferenzieren, wurden die BoMac-Zellen wie unter 3.7.1 beschrieben über 48 Stdn. mit boGM-CSF oder boM-CSF inkubiert. In Analogie zu den primären Makrophagen wurde versucht die Polarisierung der boGM-CSF-BoMac-Zellen mit LPS und boIFN-γ zu verstärken (und die der boM-CSF-BoMac-Zellen mit boIL-4 und boIL-13). Die Charakterisierung der Zellen umfasste die Bestimmung der CD163- und
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MHC-Klasse-II-Expression sowie der mittleren Größe (forward scatter, FSC) und der Komplexität (side scatter, SSC) der Zellen.
Abb. 8: Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht in vitro kultivierter BoMac-Zellen.
Zellen der bovinen Makrophagenzelllinie BoMac (Bovine Macrophages) wurden über 48 Stdn. mit 20 ng/ml rekombinantem bovinen GM-CSF (boGM-CSF) oder 20 ng/ml rekombinantem bovinen M-CSF (boM-CSF) oder nur mit Kulturmedium (Medium) inkubiert. Nach 48 Stdn. erfolgte die erneute Stimulation der boGM-CSF-BoMac mit 20 ng/ml boGM-CSF, 20 ng/ml LPS und 20 ng/ml rekombinantem bovinen IFN-γ (boIFN-γ) oder der boM-CSF-BoMac mit 20 ng/ml boM-CSF, je 20 ng/ml rekombinantem bovinen IL-4 (boIL-4) und IL-13 (boIL-13). Am Ende der In-vitro-Kultur wurden der mittlere Forward Scatter (FSC) als Maß für die relative Größe vitaler BoMac-Zellen nach 48 Stdn. (A) und 96 Stdn. (B) sowie der mittlere Side Scatter (SSC) als Maß für die Komplexität der vitalen BoMac-Zellen nach 48 Stdn. (C) und 96 Stdn. (D) durchflusszytometrisch erfasst (n = 4, Mittelwerte ± SEM). Signifikante Unterschiede wurden mittels einfacher ANOVA und Post-hoc-Test nach Tukey ermittelt (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).
A) B)
C) D)
48 Stdn. 96 Stdn.
S S C F S C S S C
Medium boGM-CSF boM-CSF
LPS + boIFN-γ +
boIL-4 + boIL-13 +
Medium boGM-CSF boM-CSF
LPS + boIFN-γ +
boIL-4 + boIL-13 +
Medium boGM-CSF boM-CSF
Medium boGM-CSF boM-CSF
F S C
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Die Wachstumsfaktoren boGM-CSF und boM-CSF führten nach 48 Stdn. zu keiner Veränderung des FSC (Abb. 8, A) oder des SSC (Abb. 8, C) im Vergleich zueinander oder im Vergleich zu den in D10F+-Medium gereiften BoMacs (p > 0,05). Nach Stimulation der boGM-CSF-BoMac-Zellen mit LPS und boIFN-γ (Abb. 8, Β) zeigten diese einen höheren FSC als die in Medium kultivierten BoMac-Zellen (p = 0,004). Auch die boM-CSF-BoMac-Zellen zeigten nach Stimulation mit boIL-4 und boIL-13 (Abb. 8, B) einen höheren FSC als die in Medium kultivierten BoMac-Zellen (p = 0,004). Der SSC war in den stimulierten boGM-CSF-BoMac-Zellen signifikant höher als in den in Medium kultivierten (p = 0,009) und den stimulierten boM-CSF-BoMac-Zellen (p = 0,005) (Abb. 8, D), während sich der SSC zwischen den in Medium kultivierten BoMac-Zellen und den stimulierten boM-CSF-BoMac-Zellen nicht unterschied (p > 0,05).
Abb. 9 CD163-und MHC-Klasse-II-Expression in vitro kultivierter BoMac-Zellen.
Medium
boGM-CSF
boM-CSF
A) B)
D)
MHC-Klasse-IICD163
48 Stdn. 96 Stdn.
Medium boGM-CSF boM-CSF LPS + boIFN-γ +
boIL-4 + boIL-13 +
Medium boGM-CSF boM-CSF LPS + boIFN-γ +
boIL-4 + boIL-13 +
Medium boGM-CSF boM-CSF Medium boGM-CSF boM-CSF
CD163MHC-Klasse-II
C)
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Zellen der bovinen Makrophagenzelllinie BoMac (Bovine Macrophages) wurden über 48 Stdn. mit 20 ng/ml rekombinantem bovinen GM-CSF (boGM-CSF) oder 20 ng/ml rekombinantem bovinen M-CSF (boM-CSF) oder nur mit Kulturmedium (Medium) inkubiert. Nach 48 Stdn. erfolgte die erneute Stimulation der boGM-CSF-BoMac mit 20 ng/ml boGM-CSF, 20 ng/ml LPS und 20 ng/ml rekombinantem bovinen IFN-γ (boIFN-γ) oder der boM-CSF-BoMac mit 20 ng/ml boM-CSF, je 20 ng/ml rekombinantem bovinen IL-4 (boIL-4) und IL-13 (boIL-13). Am Ende der In-vitro-Kultur wurden die CD163-und MHC-Klasse-II-Expression vitaler BoMac-Zellen nach 48 Stdn. (A, C) und 96 Stdn. (B, D) durchflusszytometrisch erfasst (n = 4, Mittelwerte ± SEM). Die Unterschiede zwischen den Gruppen Medium-, boGM-CSF- und boM-CSF-BoMac wurden mittels einfacher ANOVA und Post-hoc-Test nach Tukey auf statistische Unterschiede geprüft (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).
Die Wachstumsfaktoren boGM-CSF und boM-CSF führten nach 48 Stdn. zu keiner Veränderung der CD163- (Abb. 9, A) oder der MHC-Klasse-II-Expression (Abb. 9, C) im Vergleich zueinander oder im Vergleich zu den in D10F+-Medium gereiften BoMac-Zellen (p > 0,05). Nach 96 Stdn. zeigten die mit LPS und boIFN-γ stimulierten boGM-CSF-BoMac-Zellen eine höhere CD163-Expression im Vergleich zu den in Medium (p < 0,001) kultivierten und den mit boIL-4 und boIL-13 stimulierten boM-CSF-BoMac-Zellen (p < 0,001) (Abb. 9, B). Die stimulierten boM-CSF-BoMac-Zellen wiesen zudem eine niedrigere CD163-Expression als die in Medium kultivierten BoMac-Zellen auf (p = 0,021).
Stimulierte boGM-CSF-BoMac-Zellen zeigten eine höhere MHC-Klasse-II-Expression als in Medium kultivierte BoMac-Zellen (Abb. 9, D) (p = 0,04), während sich die Höhe der MHC-Klasse-II-Expression im Vergleich zu den stimulierten boM-CSF-BoMac-Zellen nicht unterschied (p > 0,05).
Um zu überprüfen, ob die CD163- und MHC-Klasse-II-Expression in BoMac-Zellen mit der primärer MdM vergleichbar ist, wurden primäre, bovine, CD14-positive Monozyten mittels eines magnetischen Zellseparationsverfahrens (3.2.1; 3.2.2.1) aus dem Blut von Rindern isoliert und parallel zu den Zellen der Makrophagenzelllinie BoMac über 48 Stdn. mit den Wachstumsfaktoren boGM-CSF oder boM-CSF oder in Kulturmedium inkubiert (3.4.1 und 3.7.1). Anschließend wurde eine MIF (3.5.1) durchgeführt und die Expression von CD163 und MHC-Klasse-II durchflusszytometrisch analysiert.
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Abb. 10: Vergleichende Betrachtung der CD163 und MHC-Klasse-II Expression in vitro kultivierter MdM (monocyte-derived macrophages) und BoMac-Zellen.
MACS-separierte CD14-positive Monozyten wurden in Anwesenheit von 20 ng/ml rekombinantem bovinen GM-CSF (boGM-CSF) oder 20 ng/ml rekombinantem bovinen M-CSF (boM-CSF) oder nur mit Kulturmedium (Medium) über 48 Stdn. in Makrophagen differenziert. Parallel wurden Zellen der bovinen Makrophagenzelllinie BoMac (Bovine Macrophages) ebenfalls über 48 Stdn. mit 20 ng/ml boGM-CSF oder 20 ng/ml boM-CSF oder nur mit Kulturmedium inkubiert. Am Ende der In-vitro-Kultur wurden die CD163- (A) und MHC-Klasse-II-Expression (B) vitaler BoMac-Zellen durchflusszytometrisch erfasst (n = 4, Box-Whisker-Plots). Die Unterschiede zwischen den Gruppen Medium-, boGM-CSF- und boM-CSF-MdM und Medium-, boGM-CSF- und boM-CSF-BoMac-Zellen wurden mittels ungepaartem t-Test auf statistische Unterschiede geprüft (* p < 0,05; ** p < 0,01;
*** p < 0,001).
A)
Medium
boGM-CSF
boM-CSF
MFI
Medium
Medium
boGM-CSF
boGM-CSF
boM-CSF
boGM-CSF C D 1 6 3 M H C -K la s s e -I I
B)
48 Stdn.
MdM BoMac MdM BoMac
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In R10F+-Medium gereifte und in Anwesenheit von boM-CSF gereifte MdM zeigten eine signifikant höhere CD163-Expression als in D10F+-Medium (Abb. 10, A, p = 0,036) oder in Anwesenheit von boM-CSF (p = 0,041) kultivierte BoMac-Zellen. Dagegen war die CD163-Expression in boGM-CSF kultivierten BoMac-Zellen signifikant höher als in Anwesenheit von boGM-CSF gereiften MdM (Abb. 10, A, p < 0,001). Die MHC-Klasse-II-Expression war sowohl in R10F+-Medium gereiften als auch in Anwesenheit von boGM-CSF oder boM-CSF gereiften, primären MdM signifikant höher als in D10F+-Medium (Abb. 10, B, p < 0,001) oder in Anwesenheit von boGM-CSF (p = 0,002) oder boM-CSF (p = 0,002) gereiften BoMac-Zellen. Weiterhin ist die Varianz der CD163-Expression der in Medium gereiften MdM und der in boM-CSF gereiften MdM signifikant größer als in Medium (p < 0,001) oder boM-CSF (p < 0,001) kultivierten BoMac-Zellen. Auch die Varianz der MHC-Klasse-II-Expression zwischen den in Medium, boGM-CSF oder boM-CSF gereiften MdM ist signifikant höher als in den analog kultivierten BoMac-Zellen (p < 0,001).
Zur Kontrolle, ob die Antikörper spezifisch an die BoMac-Zellen oder primäre MdM binden, wurden Isotypkontrollen mitgeführt. Dabei zeigte sich weder in der MFI des CD163-PE- noch in der MFI des MHC-Klasse-II-FITC-Antikörpers der BoMac-Zellen ein Unterschied zu der MFI der mitgeführten Isotypkontrolle (p > 0,05; Daten nicht gezeigt).
4.2.2 Beeinflussung der morphologischen und phänotypischen Eigenschaften von BoMac-Zellen durch M. bovis
Um zu überprüfen, ob sich die BoMac-Zelllinie als Modellzelle für die Interaktion von M. bovis mit primären, ausdifferenzierten Makrophagen eignet, wurden die BoMac-Zellen wie unter 3.7.1 beschrieben, 24 Stdn. mit M. bovis inkubiert und anschließend sowohl morphologisch als auch phänotypisch charakterisiert. Dazu wurden FSC, SSC sowie die Oberflächenexpression von CD163 und MHC-Klasse-II durchflusszytometrisch bestimmt. Vergleichend dazu wurden über 48 Stdn. aus Monozyten gereifte Makrophagen über 24 Stdn. mit M. bovis inkubiert und der FSC und SSC sowie die Oberflächenexpression von CD163 und MHC-Klasse-II durchflusszytometrisch bestimmt.
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Abb. 11 Morphologische und phänotypische Eigenschaften von mit M. bovis kultivierten MdM (monocyte-derived macrophages) und BoMac-Zellen im Vergleich.
MACS-separierte CD14-positive Monozyten wurden über 48 Stdn. in Makrophagen differenziert und anschließend über 24 Stdn. mit M. bovis (MOI 10) inkubiert. Parallel wurden Zellen der bovinen Makrophagenzelllinie BoMac (Bovine Macrophages) ebenfalls über 24 Stdn. mit M. bovis (MOI 10) kultiviert. Am Ende der In-vitro-Kultur wurden der mittlere Forward Scatter (FSC) (A), der mittlere Side Scatter (SSC) (B) sowie die CD163- und MHC-Klasse-II-Expression vitaler MdM bzw.
BoMac-Zellen durchflusszytometrisch erfasst (C, D) (n = 6, Box-Whisker-Plots). Die Unterschiede zwischen den Gruppen Medium-MdM und Medium-BoMac bzw. mit M. bovis inkubierten MdM und BoMac-Zellen wurden mittels ungepaartem t-Test auf statistische Unterschiede geprüft (* p < 0,05;
** p < 0,01; *** p < 0,001). Die Unterschiede zwischen den Gruppen Medium-MdM und mit M. bovis inkubierten MdM bzw. Medium-BoMac- und mit M. bovis inkubierten BoMac-Zellen wurden mittels gepaartem t-Test auf statistische Unterschiede geprüft (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).
Der FSC von mit M. bovis inkubierten MdM war signifikant höher als nur in R10F-Medium inkubierten MdM (p < 0,001), wohingegen der FSC der in D10F-Medium inkubierten BoMac-Zellen höher war als in den mit M. bovis kultivierten BoMac-Zellen (p = 0,015) (Abb.
11, A). Der FSC von MdM und BoMac-Zellen unterschied sich dabei nicht voneinander
C) D)
A) B)
Medium
M. bovis
F S C S S C
C D 1 6 3 M H C -K la s s e -I I
MdM BoMac
Medium M. bovis
Medium M. bovis
Medium M. bovis
Medium M. bovis
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(p > 0,05). Die Varianz des FSC war sowohl in den in Medium gereiften BoMac- als auch in den mit M. bovis inkubierten BoMac-Zellen signifikant höher als in den Medium-MdM bzw.
mit M. bovis inkubierten MdM (p < 0,001). Der SSC war sowohl in Medium kultivierten BoMac-Zellen (p = 0,010) als auch in mit M. bovis inkubierten BoMac-Zellen (p = 0,28) signifikant höher als in den entsprechenden MdM (Abb. 11, B). Während die mit M. bovis inkubierten MdM einen signifikant höheren SSC aufwiesen als die in Medium kultivierten MdM (p < 0,001), gab es zwischen dem SSC der in Medium kultivierten oder mit M. bovis kultivierten BoMac-Zellen keinen Unterschied (p > 0,05). Auch hier war die Varianz des SSC in den BoMac-Zellen signifikant höher als in den MdM (p < 0,001). Die CD163-Expression unterschied sich weder signifikant zwischen BoMac-Zellen und MdM noch zwischen in Medium oder mit M. bovis kultivierten MdM bzw. BoMac-Zellen (p > 0,05) (Abb. 11, C). Die MHC-Klasse-II-Expression war sowohl in R10F-Medium (p = 0,003) als auch mit M. bovis kultivierten MdM (p = 0,002) signifikant höher als in den entsprechenden BoMac-Zellen (Abb. 11, D). Die MHC-Klasse-II-Expression unterschied sich nicht zwischen in An- oder Abwesenheit von M. bovis kultivierten MdM oder BoMac-Zellen (p > 0,05).