Morphologische Eigenschaften in vitro polarisierter Makrophagen

Modulation der morphologischen Eigenschaften durch boGM-CSF und boM-CSF

Um der Frage nachzugehen, ob Makrophagen, die unter dem polarisierenden Einfluss der Wachstumsfaktoren boGM-CSF und boM-CSF gereift sind, unterschiedliche morphologische Eigenschaften aufweisen, wurden magnetisch selektierte CD14-positive Monozyten (3.2.1, 3.2.2.1) über 48 Stdn. und 96 Stdn. mit boGM-CSF oder boM-CSF inkubiert, wobei nach 48 Stdn. eine erneute Zugabe der Wachstumsfaktoren boGM-CSF oder boM-CSF erfolgte. An drei Zeitpunkten (0, 48, 96 Stdn.) erfolgte die durchflusszytometrische Erfassung der mittleren Größe (forward scatter, FSC) und der Komplexität (side scatter, SSC) (3.4.1).

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Abb. 12: Relative Größe und Komplexität von unter dem Einfluss von boGM-CSF oder boM-CSF gereiften Makrophagen (MdM, monocyte-derived macrophages).

MACS-separierte bovine CD14-positive Monozyten wurden in Anwesenheit von 20 ng/ml rekombinantem bovinen GM-CSF (boGM-CSF) oder 20 ng/ml rekombinantem bovinen M-CSF (boM-CSF) oder nur in Kulturmedium (Medium) über 48 Stdn. oder 96 Stdn. in Makrophagen differenziert. Am Ende der In-vitro-Kultur und direkt nach der Monozyten-Separation (0 Stdn.) wurden der mittlere Forward Scatter (FSC, A) als Maß für die relative Größe sowie der mittlere Side Scatter (SSC, B) als Maß für die Komplexität der vitalen Zellen durchflusszytometrisch erfasst (n = 4, Mittelwerte ± SEM). Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mittels einfacher ANOVA und Post-hoc-Test nach Tukey bestimmt und mit Buchstaben gekennzeichnet.

A)

B)

2.0×10⁰⁶ 2.5×10⁰⁶ 3.0×10⁰⁶ 3.5×10⁰⁶ 4.0×10⁰⁶

a a a

a a

b b

b b

0 Stdn. 48 Stdn. 96 Stdn.

0 Stdn. 48 Stdn. 96 Stdn.

100 000 200 000 300 000 400 000

a a a

b b bd

cde d e

S S C F S C

Medium boGM-CSF boM-CSF

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Der FSC von MdM, die in Anwesenheit von Wachstumsfaktoren differenzierten, war sowohl nach 48 Stdn. (p < 0,001) als auch nach 96 Stdn. (p = 0,002) signifikant höher als in Ansätzen ohne Wachstumsfaktor-Zusatz (Abb. 12, A). Die Wachstumsfaktoren unterschieden sich nicht signifikant in ihrem Effekt auf den FSC der MdM (p > 0,05).

Gegenüber den Monozyten (0 Stdn.) führten alle Kulturbedingungen zu einer signifikanten Erhöhung der Komplexität der MdM nach 48 oder 96 Stdn. in Kultur (SSC, Abb. 12, B, p < 0,001). Der SSC war in den über 48 Stdn. kultivierten MdM unabhängig von den Kulturbedingungen nicht signifikant unterschiedlich (p > 0,05). Alle Kulturbedingungen führten nach 96 Stdn. zu einer weiteren, signifikanten Steigerung des SSC (Medium-MdM:

p < 0,001; boGM-CSF-MdM: p = 0,015, boM-CSF-MdM: p < 0,001). BoGM-CSF-MdM wiesen nach 96 Stdn. eine signifikant größeren SSC als boM-CSF-MdM auf (p < 0,001).

Morphologische Eigenschaften von boGM-CSF- oder boM-CSF-MdM nach Stimulation mit LPS/boIFN-γ oder boIL-4/boIL-13

Es wurde geprüft, ob eine Stimulation der über 48 Stdn. unter boGM-CSF-Einfluss gereiften Makrophagen mit LPS und boIFN-γ oder der unter boM-CSF-Einfluss gereiften Makrophagen mit boIL-4 und boIL-13 die morphologische Veränderung der Makrophagen verstärken kann.

Dazu wurden die über 48 Stdn. gereiften boGM-CSF-MdM mit LPS und boIFN-γ sowie die boM-CSF-MdM mit boIL-4 und boIL-13 stimuliert und erneut mit den Wachstumsfaktoren boGM-CSF und boM-CSF inkubiert (3.4.1). Nach weiteren 48 Stdn. erfolgte die durchflusszytometrische Bestimmung des FSC und des SSC.

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Abb. 13: Einfluss einer polarisierenden Stimulation auf die Größe und die Komplexität von Makrophagen (MdM, monocyte-derived macrophages), die unter dem Einfluss von boGM-CSF oder boM-CSF in vitro differenzieren.

MACS-separierte bovine CD14-positive Monozyten wurden in Anwesenheit von 20 ng/ml rekombinantem bovinen GM-CSF (boGM-CSF), 20 ng/ml rekombinantem bovinen M-CSF (boM-CSF) oder nur in Kulturmedium ohne Zusatz (Medium) über 96 Stdn. in Makrophagen differenziert. Nach 48 Stdn. erfolgte die Stimulation der boGM-CSF-MdM mit 20 ng/ml LPS und 20 ng/ml rekombinantem bovinen IFN-γ (boIFN-γ) und 20 ng/ml boGM-CSF. Den boM-CSF-MdM wurde nach 48 Stdn. je 20 ng/ml rekombinantes bovines IL-4 und IL-13 (boIL-4, boIL-13) und 20 ng/ml boM-CSF zugesetzt.

Am Ende der In-vitro-Kultur wurden der mittlere Forward Scatter (FSC) (A) sowie der mittlere Side Scatter (SSC) (B) vitaler MdM durchflusszytometrisch erfasst (n = 4, Mittelwerte ± SEM). Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mittels einfacher ANOVA und Post-hoc-Test nach Tukey bestimmt und mit Buchstaben gekennzeichnet.

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Die zusätzliche Stimulation der boGM-CSF-MdM mit LPS und boIFN-γ führte zu keiner signifikanten Änderung des FSC (p > 0,05) (Abb. 13, A), während die zusätzliche Stimulation der boM-CSF-MdM mit boIL-4 und boIL-13 zu einer signifikanten Steigerung des FSC führte (p = 0,001). Der FSC IL-4/IL-13-stimulierter boM-CSF-MdM unterschied sich signifikant vom FSC der LPS/IFN-γ-stimulierten boGM-CSF-MdM (p = 0,029). Wurden die zusätzlichen Stimuli nicht zugesetzt, unterschied sich der FSC von boGM-CSF-MdM und boM-CSF-MdM nicht signifikant (p > 0,05).

Die zusätzliche Stimulation der boGM-CSF-MdM mit LPS und boIFN-γ führte zu einer signifikanten Erhöhung des SSC (p < 0,001) (Abb. 13, B) während die zusätzliche Stimulation der boM-CSF-MdM mit boIL-4 und boIL-13 zu keiner signifikanten Veränderung des SSC führte (p > 0,05). Der SSC unterschied sich weder in den unstimulierten boGM-CSF-, boM-CSF- und Medium-MdM, noch zwischen den stimulierten boGM-CSF-, boM-CSF- und Medium-MdM (p > 0,05).

Modulation der morphologischen Eigenschaften durch M. bovis

Um zu untersuchen, ob die Anwesenheit von M. bovis die Morphologie von boGM-CSF-MdM oder boM-CSF-MdM beeinflusst, wurden bovine CD14-positive Monozyten (3.2.1, 3.2.2.1) über 72 Stdn. in Anwesenheit von boGM-CSF oder boM-CSF in An- und Abwesenheit von M. bovis (in RPMI-Medium resuspendiert) differenziert. Verglichen wurden M. bovis, die in RPMI-Medium oder in mbsFRIIS-Medium resuspendiert waren (3.4.2). Anschließend wurden der FSC und SSC durchflusszytometrisch erfasst.

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Abb. 14: Vorwärts- (FSC) und Seitwärtsstreulicht (SSC) von polarisierten Makrophagen (MdM, monocyte-derived macrophages) unter dem Einfluss von M. bovis und dem

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MACS-separierte bovine CD14-positive Monozyten wurden in Anwesenheit von 20 ng/ml rekombinantem bovinen GM-CSF (boGM-CSF) oder 20 ng/ml rekombinantem bovinen M-CSF (boM-CSF) und M. bovis (MOI 10) (A, B), M. bovis in mbsFRIIS-Medium (MOI 10) (C, D) oder der dem MOI-Wert entsprechenden Menge mbsFRIIS-Medium (E, F) über 72 Stdn. in Makrophagen differenziert. Am Ende der In-vitro-Kultur wurden der mittlere Forward Scatter (FSC) (A, C, E) sowie der mittlere Side Scatter (SSC) (B, D, F) vitaler MdM durchflusszytometrisch erfasst (n = 4, Mittelwerte ± SEM). Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mittels einfacher ANOVA und Post-hoc-Test nach Tukey bestimmt und mit Buchstaben oder (*) p < 0,1 gekennzeichnet.

Der FSC wurde weder in boGM-CSF noch in boM-CSF-MdM durch M. bovis, M. bovis in mbsFRIIS-Medium oder durch das mbsFRIIS-Medium selbst verändert (p > 0,05) (Abb. 14, A, C, E). In Anwesenheit von M. bovis kultivierte boGM-CSF-MdM wiesen tendenziell eine höhere Komplexität, gemessen am SSC auf (p = 0,069) (Abb. 14, B), während sich der SSC in boM-CSF-MdM in Anwesenheit von M. bovis nicht veränderte. Der SSC war in mit M. bovis, welche sich in dem Mykoplasmenwachstumsmedium mbsFRIIS befanden, inkubierten boGM-CSF- und boM-CSF-MdM signifikant höher als in Abwesenheit von M. bovis in mbsFRIIS-Medium kultivierten MdM, wobei die Veränderung in den boGM-CSF-MdM (p < 0,001) stärker war, als in den boM-CSF-MdM (p = 0,002) (Abb. 14, D). Der SSC zwischen den mit M. bovis in mbsFRIIS-Medium inkubierten boGM-CSF und boM-CSF-MdM unterschied sich nicht voneinander (p > 0,05). Das Mykoplasmenwachstumsmedium mbsFRIIS allein führte wie M. bovis zu einem tendenziell höheren SSC in boGM-CSF-MdM (p = 0,077), während dies in boM-CSF-MdM nicht der Fall war (p > 0,05) (Abb. 14, E). In keinem der Ansätze unterschieden sich boGM-CSF- und boM-CSF-MdM in Größe oder Komplexität (p > 0,05).