5. Diskussion
5.1 Die Eignung der BoMac-Zelle als In-vitro-Modell für primäre bovine
BoMac-Zellen unterscheiden sich in ihren morphologischen und phänotypischen Eigenschaften von primären aus Monozyten gereiften Makrophagen
Als hierfür wesentlich wurde definiert, dass die BoMac-Zellen einen vergleichbaren phänotypischen Wandel nach Kultivierung mit Makrophagen-polarisierenden Wachstumsfaktoren (siehe unten) zeigen.
BoMac-Zellen ließen sich, bezogen auf morphologische (FSC, SSC) und phänotypische Parameter (CD163, MHC-Klasse-II), im Gegensatz zu primären MdM nicht durch boGM-CSF oder boM-CSF polarisieren. Diese Beobachtungen stimmen mit der Studie von Sager et al.
überein, wonach BoMac-Zellen sich morphologisch von primären MdM unterscheiden (SAGER et al. 1999). Die BoMac-Zellen zeigten erst nach Stimulation der boGM-CSF-BoMac-Zellen mit LPS/boIFN-γ und der boM-CSF-BoMac-Zellen mit boIL-4/boIL-13 eine Veränderung ihrer Zellgröße und Komplexität (Abb. 8). Die CD163-Expression verhielt sich allerdings gegenläufig zu der Expression analog stimulierter, primärer MdM. Daraus kann geschlossen werden, dass BoMac-Zellen keinen Rezeptor für boGM-CSF (CD116) (GEARING et al. 1989) und boM-CSF (CD115) (GUILBERT u.
STANLEY 1980) exprimieren oder das Signaling über den Rezeptor anders als in primären Zellen erfolgt. Über die Reaktion von BoMac-Zellen auf eine Stimulation mit LPS gibt es
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widersprüchliche Angaben in der Literatur: Während Stabel und Stabel berichteten, dass BoMac-Zellen nach Stimulation mit LPS vermehrt IL-6 und reaktive Sauerstoffspezies produzieren (STABEL u. STABEL 1995), beobachteten Sager et al. nach Stimulation der BoMac-Zellen mit LPS keinen Anstieg in der Produktion von NO, IFN-γ und TNF-α (SAGER et al. 1999). Die Unterschiede könnten durch eine unterschiedlich hohe Konzentration des eingesetzten LPS in den beiden Studien bedingt sein. Sager et al. sehen die fehlende CD14-Expression in BoMac-Zellen als möglichen Grund für die fehlende Ansprechbarkeit der Zellen auf LPS (SAGER et al. 1999). Ob BoMac-Zellen auf eine Stimulation mit IFN-γ, IL-4 oder IL-13 reagieren, ist nicht bekannt. Daher kann aus den in dieser Arbeit gemachten Beobachtungen nicht darauf geschlossen werden, welche Faktoren die Änderung der relativen Zellgröße (gemessen am FSC-Wert) bedingen.
Die gleichzeitige Erhöhung der CD163- und MHC-Klasse-II-Expression in den stimulierten boGM-CSF-BoMac widersprechen dem von primären MdM bekannten Konzept der Polarisierung, wonach eine Inkubation primärer MdM mit GM-CSF in einer verminderten CD163- und einer erhöhten MHC-Klasse-II-Expression resultiert (AMBARUS et al. 2012).
Aus Abb. 10 ist zu entnehmen, dass BoMac-Zellen signifikant weniger CD163- und MHC-Klasse-II exprimieren als primäre MdM. Die mitgeführten Isotypkontrollen weisen zudem darauf hin, dass BoMac-Zellen kein oder nur in geringem Maße CD163 und MHC-Klasse-II exprimieren. Dies stimmt mit den Untersuchungen von Sager et al. überein, wonach BoMac-Zellen keine MHC-Klasse-II-Moleküle exprimieren (SAGER et al. 1999).
Dagegen ist die Variation der CD163- und MHC-Klasse-II-Expression in den primären MdM signifikant höher als in den BoMac-Zellen. Die Variation spiegelt einen Nachteil von Primärzellen wider, wonach die Funktion der Primärzellen sich je nach Zeitpunkt der Blutentnahme und Kondition des Spendertieres unterscheiden kann (STABEL u. STABEL 1995).
Auch die Passagezahl kann einen Einfluss auf die Eigenschaften einer Zelllinie haben (BRISKE-ANDERSON et al. 1997; WANG et al. 2015; KWIST et al. 2016). In dieser Arbeit wurden BoMac-Zellen mit einer Passagezahl von 18 bis 25 eingesetzt. Da die Charakterisierung der BoMac-Zelllinie von Stabel und Stabel nach 30 Passagen durchgeführt wurde und sich die BoMac-Zellen laut dieser Studie nach morphologischen und funktionellen Gesichtspunkten nicht von den Primärzellen unterscheiden (STABEL u. STABEL 1995), während Sager et al.
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für ihre Studie BoMac-Zellen nach 8 Passagen verwendeten und feststellten, dass BoMac-Zellen sich in ihrer Funktion deutlich von primären MdM unterscheiden (SAGER et al.
1999), ist die Passagezahl eher nicht als Erklärung für die fehlende Ansprechbarkeit der BoMac-Zellen auf die eingesetzten Stimuli anzusehen.
Weiterhin muss berücksichtigt werden, dass primäre MdM in R10F+-Medium und BoMac-Zellen in D10F+-Medium kultiviert wurden, was einen Einfluss auf die Zelldifferenzierung haben kann (LOPEZ-CAZAUX et al. 2006; HOU et al. 2007). Der Effekt des Kulturmediums ist aber sehr wahrscheinlich zu vernachlässigen, da BoMac-Zellen in den Studien von Sager et al. und Stabel und Stabel in RPMI-Medium kultiviert wurden (STABEL u. STABEL 1995; SAGER et al. 1999) und die in dieser Arbeit gemachten Beobachtungen größtenteils mit den Ergebnissen von Sager et al. übereinstimmen. Die Tatsache, dass BoMac-Zellen ihren Ursprung in primären Peritonealmakrophagen haben, hier aber mit primären MdM verglichen wurden, kann ein weiterer Grund für die in dieser Arbeit beobachteten Unterschiede sein, da sich aus Monozyten gereifte Makrophagen zum Teil phänotypisch und funktionell von den im Gewebe ansässigen residenten Makrophagen (z.B.
Alveolarmakrophagen, Kupffersche Sternzellen) deutlich unterscheiden (GONZALEZ-JUARRERO et al. 2003; GORDON et al. 2014). Zumindest könnte dies ein Grund für die unterschiedlichen Ergebnisse der Studien von Stabel und Stabel und Sager et al. sein, da erstere zum Vergleich primäre Peritonealmakrophagen, letztere aber primäre MdM und primäre bronchoalveoläre Makrophagen heranzogen (STABEL u. STABEL 1995; SAGER et al. 1999).
Aus den durchgeführten Untersuchungen, kann geschlussfolgert werden, dass BoMac-Zellen sich weder auf Basis ihrer morphologischen noch ihrer phänotypischen Eigenschaften wie primäre MdM polarisieren lassen.
BoMac-Zellen eignen sich nicht als In-vitro-Modell für die Untersuchung der Interaktion von Mycoplasma bovis mit primären aus Monozyten gereiften Makrophagen
BoMac-Zellen wurden bereits als In-vitro-Modell für die Untersuchung der Interaktion verschiedener Bakterien, Viren und Parasiten mit bovinen Makrophagen genutzt (DONOFRIO u. VAN SANTEN 2001; SHIELS et al. 2004; LANGELAAR et al. 2005; WOO et al. 2006;
SOUZA et al. 2007; LIANG et al. 2010; ABENDANO et al. 2013; ROLA-LUSZCZAK et al.
2014). Aus Abb. 11 ist zu entnehmen, dass sich BoMac-Zellen bei Inkubation mit M. bovis in
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ihren morphologischen Eigenschaften nicht wie primäre MdM verhalten. Ein Grund für die fehlende Änderung der zellulären Komplexität (gemessen am SSC) in BoMac-Zellen kann eine verminderte Aufnahme des Erregers sein, da die Komplexität einer Zelle durch die Aufnahme eines Erregers in Vakuolen steigen kann. Diese These wird durch die Ergebnissen von Woo et al. und Sager et al. gestützt, wonach die Aufnahme von Mycobacterium avium spp.
paratuberculosis in BoMac-Zellen im Vergleich zu bovinen Monozyten signifikant vermindert war (WOO et al. 2006) und BoMac-Zellen nicht in der Lage waren opsonisierte E. coli zu phagozytieren (SAGER et al. 1999). Der Studie nach Stabel und Stabel zufolge können BoMac-Zellen inaktivierte Staphylococcus aureus phagozytieren (STABEL u. STABEL 1995).
Weder BoMac-Zellen noch primäre MdM reagierten auf eine Inkubation mit M. bovis mit einer Änderung der MHC-Klasse-II- und CD163-Expression (Abb. 11).
Damit unterstützt diese Arbeit die aus den Studien von Sager et al. hervorgegangene Schlussfolgerung, dass BoMac-Zellen nur wenige Eigenschaften der Primärzellen aufweisen und daher nur mit Vorsicht für immunologische Studien genutzt werden sollten (SAGER et al.
1999). BoMac-Zellen eignen sich jedenfalls nicht als In-vitro-Modell zur Untersuchung der Interaktion von M. bovis mit bovinen MdM.