Histologische und immunhistochemische Untersuchungen zur Entwicklung des Schleimhaut- assoziierten Immunsystems im bovinen Respirationstrakt und zum Vorkommen von dendritischen Zellen im Respirationstrakt von Kälbern mit respiratorischer Mycoplasma
bovis-Infektion
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin – Doctor medicinae veterinariae –
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Anne Thomasmeyer
aus Salzgitter
Hannover 2006
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein
1.Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Wilfried Meyer
Tag der mündlichen Prüfung: 29.09.2006
Meinen Eltern
Inhaltsverzeichnis
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen ... I
1 Einleitung ... 1
2 Literaturübersicht... 3
2.1 Dendritische Zellen ... 3
2.1.1 Charakterisierung, Vorkommen und Verteilung dendritischer Zellen ... 3
2.1.2 Herkunft, Entwicklung und Reifung dendritischer Zellen ... 4
2.1.3 Funktionen dendritischer Zellen ... 8
2.1.4 Dendritische Zellen beim Rind ... 10
2.1.5 Dendritische Zellen im Respirationstrakt... 11
2.1.5.1 Dendritische Zellen im Respirationstrakt der Ratte... 13
2.1.5.2 Dendritische Zellen im Respirationstrakt des Menschen ... 14
2.1.5.3 Dendritische Zellen im Respirationstrakt des Hundes ... 16
2.1.5.4 Dendritische Zellen im Respirationstrakt des Pferdes ... 17
2.1.5.5 Dendritische Zellen im Respirationstrakt des Rindes ... 17
2.1.5.6 Dendritische Zellen im infizierten Respirationstrakt von Mensch und Tier ... 18
2.2 Mukosa–assoziiertes lymphatisches Gewebe... 20
2.2.1 Bronchus-assoziiertes lymphatisches Gewebe (BALT) ... 20
2.2.2 Larynx- und Trachea-assoziiertes lymphatisches Gewebe (LTALT)... 24
2.2.3 Nasal-assoziiertes lymphatisches Gewebe (NALT)... 25
2.3 Mycoplasma bovis... 26
2.3.1 Allgemeine und spezielle Eigenschaften... 26
2.3.2 Mycoplasma bovis-Infektionen des Rindes ... 27
2.3.3 Immunreaktion in der Lunge des Rindes nach M. bovis-Infektion ... 28
3 Eigene Untersuchungen ... 31
3.1 Material und Methoden ... 31
3.1.1 Untersuchungsmaterial ... 31
3.1.1.1 Pathomorphologisch lungengesunde Tiere ... 31
3.1.1.2 Infektionsversuche mit M. bovis-Feldstämmen... 39
3.1.1.3 Infektionsversuch mit einer klonalen Variante des M. bovis Typ-Stammes PG 45 ... 45
3.1.1.4 Vakzinationsversuch ... 47
3.1.2 Fixation des Untersuchungsmaterials ... 51
3.1.2.1 Paraffineinbettung und Anfertigung von Paraffinschnitten für immunhistologische Untersuchungen ... 51
3.1.3 Protokoll zur Herstellung von Gefrierblöcken in OCT® ... 52
3.1.3.1 Anfertigung von Kryostatschnitten für immunhistologische Untersuchungen ... 52
3.1.4 H.E.- Färbung und Spezialfärbungen... 53
3.1.4.1 Färbung von Paraffinschnitten mit Hämalaun-Eosin... 53
3.1.4.2 Färbung von Paraffinschnitten mit Siriusrot F3B-Technik... 53
3.1.5 Vorversuche zur Immunhistologie... 53
3.1.6 Immunhistologische Untersuchungen ... 54
3.1.6.1 Untersuchungsmethoden am Paraffinmaterial ... 54
3.1.6.2 Untersuchungsmethoden am Kryostatschnitt ... 57
3.1.6.3 Primäre Antikörper ... 59
3.1.6.4 Sekundäre Antikörper ... 62
3.1.6.5 Spezifitätskontrollen... 63
3.1.7 Auswertung und Dokumentation ... 63
3.1.7.1 Lichtmikroskopische Beurteilung... 63
3.1.7.2 Morphometrie und Quantifizierung ... 63
3.1.7.3 Fotografische Beurteilung ... 64
3.1.7.4 Statistische Auswertung... 64
3.2 Untersuchungsergebnisse... 65
3.2.1 Histologische und immunhistologische Befunde am Trachealgewebe von pathomorphologisch lungengesunden Tieren... 65
3.2.1.1 Histologische Befunde und histologischer Aufbau des Mukosa-assoziierten lymphatischen Gewebes (MALT) in der Trachea von lungengesunden Tieren... 65
3.2.1.2 Topographie und Anzahl von MHC Klasse II-exprimierenden Zellen mit dendritischer Morphologie an Paraffinschnitten des Trachealgewebes pathomorphologisch lungengesunder Tiere... 72
3.2.1.3 Immunhistologische Untersuchung zur Darstellung von MHC Klasse II-positiven Zellen an Kryostatschnitten des Trachealgewebes im Quer- und Tangentialschnitt von pathomorphologisch lungengesunden Tieren der Gruppen 1 und 3 ... 77
3.2.1.4 Immunhistologische Untersuchungen zur Darstellung von CD11c-positiven Zellen an Kryostatschnitten des Trachealgewebes im Quer- und Tangentialschnitt von pathomorphologisch lungengesunden Tieren der Gruppen 1 und 3... 80
3.2.1.5 Immunhistologische Untersuchungen zur Darstellung von CD80-positiven Zellen an Kryostatschnitten der mittleren Trachealgewebelokalisation (B2) im Querschnitt von pathomorphologisch lungengesunden Tieren der Gruppen 1 und 3 ... 86
3.2.1.6 Immunhistologische Untersuchungen zur Darstellung von CD86-positiven Zellen an Kryostatschnitten der mittleren Trachealgewebelokalisation (B2) im Querschnitt von pathomorphologisch lungengesunden Tieren der Gruppen 1 und 3 ... 87
3.2.1.7 Immunhistologische Untersuchungen zur Darstellung von CD1-positiven Zellen an Kryostatschnitten der mittleren Trachealgewebelokalisation (B2) im Querschnitt von pathomorphologisch lungengesunden Tieren der Gruppen 1 und 3 ... 88
3.2.1.8 Immunhistochemische Darstellung von CD3-positiven T-Lymphozyten in Mukosa-assoziiertem lymphatischen Gewebe an Paraffinschnitten von pathomorphologisch lungengesunden Tieren ... 88
3.2.1.9 Immunhistochemische Darstellung von B-Lymphozyten in Mukosa-assoziiertem lymphatischen Gewebe an Paraffinschnitten von pathomorphologisch lungengesunden Tieren mit dem monoklonalen Antikörper gegen B-B2... 90
3.2.1.10 Immunhistochemische Darstellung von CD68-positiven Makrophagen an Paraffinschnitten von Trachealgewebe von pathomorphologisch lungengesunden Tieren... 93
3.2.2 Histologische und immunhistologische Befunde an Lungengewebeproben von pathomorphologisch lungengesunden Tieren... 94
3.2.2.1 Histologische Befunde und histologischer Aufbau des Bronchus-assoziierten lymphatischen Gewebes (BALT) in der Lunge von pathomorphologisch lungengesunden Tieren ... 94
3.2.2.2 Topographie und Anzahl von MHC Klasse II-exprimierenden Zellen mit dendritischer Morphologie an Paraffinschnitten des Lungengewebes von pathomorphologisch lungengesunden Tieren ... 99
3.2.2.3 Immunhistologische Untersuchung zur Darstellung von MHC Klasse II-positiven Zellen an Kryostatschnitten des
Lungengewebes von pathomorphologisch lungengesunden Tieren
der Gruppen 1 und 3... 104 3.2.2.4 Immunhistologische Untersuchungen zur Darstellung von
CD11c-positiven Zellen an Kryostatschnitten des Lungengewebes
von pathomorphologisch lungengesunden Tieren der Gruppen 1 und 3 . 105 3.2.2.5 Immunhistologische Untersuchungen an Kryostatschnitten
des Lungengewebes von pathomorphologisch lungengesunden Tieren der Gruppen 1 und 3 zum Nachweis von CD80-positiven Zellen... 106 3.2.2.6 Immunhistologische Untersuchungen an Kryostatschnitten
des Lungengewebes von pathomorphologisch lungengesunden Tieren der Gruppen 1 und 3 zum Nachweis von CD86-positiven Zellen... 107 3.2.2.7 Immunhistologische Untersuchungen an Kryostatschnitten
des Lungengewebes von pathomorphologisch lungengesunden Tieren der Gruppen 1 und 3 zum Nachweis von CD1-positiven Zellen... 107 3.2.2.8 Immunhistochemische Darstellung von CD3-positiven T-Lymphozyten
im Bronchus-assoziierten lymphatischen Gewebe an Paraffinschnitten von pathomorphologisch lungengesunden Tieren ... 108 3.2.2.9 Immunhistochemische Darstellung von B-Lymphozyten im
Bronchus-assoziierten lymphatischen Gewebe an Paraffinschnitten von pathomorphologisch lungengesunden Tieren mit dem monoklonalen Antikörper gegen B-B2... 110 3.2.2.10 Immunhistochemische Darstellung von Makrophagen an
Paraffinschnitten von Lungengewebe pathomorphologisch
lungengesunder Tiere mit dem monoklonalen Antikörper gegen CD68... 113 3.2.2.11 Untersuchungen zum Vorkommen von eosinophilen Granulozyten
im Paraffinschnitt von Lungengewebe von pathomorphologisch
lungengesunden Tieren mit der Sirius F3B-Technik... 115 3.2.2.12 Immunhistologische Untersuchungen von Lungengewebe an
Paraffinschnitten von pathomorphologisch lungengesunden Tieren mit dem monoklonalen Antikörper MAB 970 gegen M. bovis-Antigen ... 116 3.2.3 Histopathologische und immunhistologische Befunde an
Lungengewebeproben von mit M. bovis-Feldstämmen infizierten Tieren .... 116 3.2.3.1 Histopathologische Befunde in der Lunge von mit M. bovis-Feldstamm
1067 und einem französischen Feldstamm infizierten Tieren... 116 3.2.3.2 Topographie und Anzahl von MHC Klasse II-exprimierenden Zellen
mit dendritischer Morphologie an Paraffinschnitten des
Lungengewebes von mit M. bovis-Feldstämmen infizierten Tieren ... 119 3.2.3.3 Immunhistochemische Darstellung von CD68-positiven Makrophagen
an Paraffinschnitten von Lungengewebe mit M. bovis-
Feldstämmen infizierter Tiere... 123 3.2.3.4 Histopathologische Befunde und histologischer Aufbau des
Mukosa-assoziierten lymphatischen Gewebes in der Trachea von Tieren des im Friedrich-Loeffler-Institut mit einem M. bovis-
Feldstamm durchgeführten Infektionsversuches ... 124 3.2.3.5 Topographie und Anzahl von MHC Klasse II-exprimierenden Zellen
mit dendritischer Morphologie an Paraffinschnitten des
Trachealgewebes von Tieren des im Friedrich-Loeffler-Institut mit einem M. bovis-Feldstamm durchgeführten Infektionsversuches... 125 3.2.3.6 Immunhistochemische Darstellung von CD3-positiven T-Lymphozyten
im Mukosa-assoziierten lymphatischen Trachealgewebe an
Paraffinschnitten von Tieren des im Friedrich-Loeffler-Institut mit einem M. bovis-Feldstamm durchgeführten Infektionsversuches... 128 3.2.3.7 Immunhistochemische Darstellung von B-Lymphozyten im
Mukosa-assoziierten lymphatischen Trachealgewebe an Paraffinschnitten von Tieren des im Friedrich-Loeffler-Institut mit einem M. bovis-
Feldstamm durchgeführten Infektionsversuches ... 128 3.2.3.8 Immunhistochemische Darstellung von CD68-positiven Makrophagen
an Paraffinschnitten von Trachealgewebe von Tieren des im Friedrich-Loeffler-Institut mit einem M. bovis-Feldstamm
durchgeführten Infektionsversuches... 129 3.2.3.9 Histopathologische Befunde und histologischer Aufbau des
Bronchus-assoziierten lymphatischen Gewebes (BALT) in der Lunge von Tieren des im Friedrich-Loeffler-Institut mit einem M. bovis-
Feldstamm durchgeführten Infektionsversuches ... 129 3.2.3.10 Topographie und Anzahl von MHC Klasse II-positiven Zellen
mit dendritischer Morphologie an Paraffinschnitten des
Lungengewebes von Tieren des im Friedrich-Loeffler-Institut mit einem M. bovis-Feldstamm durchgeführten Infektionsversuches... 131 3.2.3.11 Immunhistochemische Darstellung von CD3-positiven T-Lymphozyten
im Bronchus-assoziierten lymphatischen Gewebe an Paraffinschnitten von Tieren des im Friedrich-Loeffler-Institut mit einem M. bovis-
Feldstamm durchgeführten Infektionsversuches ... 134 3.2.3.12 Immunhistochemische Darstellung von B-Lymphozyten im
Bronchus-assoziierten lymphatischen Gewebe an Paraffinschnitten von Tieren des im Friedrich-Loeffler-Institut mit einem M. bovis-
Feldstamm durchgeführten Infektionsversuches ... 134 3.2.3.13 Immunhistochemische Darstellung von CD68-positiven Makrophagen
an Paraffinschnitten von Lungengewebe von Tieren des im Friedrich-Loeffler-Institut mit einem M. bovis-Feldstamm
durchgeführten Infektionsversuches... 134 3.2.4 Histopathologische und immunhistologische Befunde an
Lungengewebeproben von Tieren nach Infektion mit einer klonalen
Variante des M. bovis Typ-Stammes PG 45 ... 135 3.2.4.1 Histopathologische Befunde und histologischer Aufbau des
Bronchus-assoziierten lymphatischen Gewebes in der Lunge von Tieren nach Infektion mit einer klonalen Variante des M. bovis
Typ-Stammes PG 45... 135 3.2.4.2 Topographie und Anzahl von MHC Klasse II-exprimierenden Zellen
mit dendritischer Morphologie an Paraffinschnitten des
Lungengewebes von Tieren nach Infektion mit einer klonalen Variante des M. bovis Typ-Stammes PG 45... 136 3.2.4.3 Immunhistochemische Darstellung von CD68-positiven Makrophagen
an Paraffinschnitten von Lungengewebe von Tieren nach Infektion mit einer klonalen Variante des M. bovis Typ-Stammes PG 45... 139 3.2.5 Histopathologische und immunhistologische Befunde an
Lungengewebeproben von Tieren des Vakzinationsversuches... 139 3.2.5.1 Histopathologische Befunde und histologischer Aufbau des
Bronchus-assoziierten lymphatischen Gewebes in der Lunge von
Tieren des Vakzinationsversuches... 139 3.2.5.2 Topographie und Anzahl von MHC Klasse II-exprimierenden Zellen
mit dendritischer Morphologie an Paraffinschnitten des
Lungengewebes von Tieren des Vakzinationsversuches ... 143
3.2.5.3 Immunhistochemische Darstellung von CD68-positiven Makrophagen an Paraffinschnitten des Lungengewebes von Tieren des Vakzinationsversuches... 147
4 Diskussion ... 149
4.1 Trachea-assoziiertes lymphatisches Gewebe (TALT) bei lungengesunden Rindern ... 149
4.2 Dendritische Zellen in der Trachea lungengesunder Rinder... 152
4.3 Bronchus-assoziiertes lymphatisches Gewebe (BALT) bei lungengesunden Rindern ... 158
4.4 Dendritische Zellen in der Lunge gesunder Rinder ... 160
4.5 TALT bzw. BALT bei mit M. bovis-Feldstämmen infizierten Tieren ... 164
4.6 MHC Klasse II-positive dendritische Zellen bei mit M. bovis-Feldstämmen infizierten Kälbern ... 165
4.7 MHC Klasse II-positive dendritische Zellen in der Lunge von mit einer klonalen Variante des M. bovis Typ-Stammes PG 45 infizierten Kälbern ... 169
4.8 Entwicklung des BALTs bei Kälbern des Vakzinationsversuches ... 170
4.9 MHC Klasse II-positive dendritische Zellen in der Lunge von Kälbern des Vakzinationsversuches... 171
5 Zusammenfassung... 174
6 Summary... 176
7 Literaturverzeichnis ... 178
8 Anhang... 190
8.1 Färbungsprotokolle... 190
8.1.1 H.E.-Färbung am Paraffinschnitt... 190
8.1.1.1 Lösungen für die H.E.-Färbung ... 190
8.1.2 Siriusrot-Färbung mittels F3B Technik ... 191
8.2 Pufferrezepte für die Immunhistologie ... 192
8.2.1 Phosphatpuffer ... 192
8.2.2 Citratpuffer... 192
8.2.3 Tween 20... 192
8.3 Vorbehandlungsmethoden für die Immunhistologie ... 192
8.3.1 Demaskierung mit Citratpuffer in der Mikrowelle ... 192
8.3.2 Demaskierung mit 0,05% Pronase E-Lösung... 192
8.3.3 Demaskierung mit Protease XIV-Lösung ... 193
8.4 Reagenzien für die Immunhistochemie ... 193
8.4.1 ABC-Gebrauchslösung ... 193
8.4.2 DAB-Gebrauchslösung ... 193
8.4.3 AEC-Gebrauchslösung ... 193
8.5 Immunhistochemische Methoden ... 194
8.5.1 Färbung von Paraffinschnitten mit der ABC-Methode ... 194
8.5.2 Färbung von Kryostatschnitten mit der ABC-Methode ... 195
8.6 Bezugsquellen für Chemikalien und Antikörper ... 196
8.7 Bezugsquellen für Geräte und Einmalartikel... 199
8.8 Ergebnisstabellen ... 201
8.9 p-Werte... 205
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
ABC Avidin-Biotin-Peroxidase Komplex
Abb. Abbildung
ALVDC engl. Afferent Lymphatic Veiled Dendritic Cell (afferente lymphatische Schleierzellen)
AP Alkalische Phosphatase
APC Antigen-präsentierende Zellen
Aqua dest. Aqua destillata
BALT Bronchus-assoziiertes lymphatisches Gewebe
BRSV Bovines Respiratorisches Synzytialvirus BRALT Bronchioli-assoziiertes lymphatisches Gewebe BRSV Bovines Respiratorisches Synzytialvirus
BSA Bovines Serumalbumin
bzw. beziehungsweise
CD engl. Cluster of differentiation (System zur Bezeichnung von Leukozytendifferenzierungsantigenen)
CFU engl. Colony forming units (koloniebildende Einheiten)
CLP engl. Common Lymphoid Progenitors
(gemeinsame lymphoide Vorläufer)
CMP engl. Common Myeloid Progenitors
(gemeinsame myeloide Vorläufer)
d engl. days (Tage)
DAB 3,3’-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid
DC engl. Dendritic Cell
DRB Deutsch-Rotbunt
DSB Deutsch-Schwarzbunt
ELISA engl. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
et al. et alii (und andere)
GALT engl. Gut-associated lymphatic tissue
(Darm-assoziiertes lymphatisches Gewebe)
GAM-b engl. Goat-Anti-Mouse-biotinylated (Ziege-anti-Maus-biotinyliert) GAR-b engl. Goat-Anti-Rabbit-biotinylated
(Ziege-anti-Ratte-biotinyliert)
Geschl Geschlecht
ggr geringgradig
GM-CSF engl. Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor
h engl. hour (Stunde)
H.E. Hämalaun-Eosin
HCl Salzsäure
H-DSB Holstein-Deutsch-Schwarzbunt
hgr hochgradig
HLA engl. Human Leukocyte-associated Antigen (= MHC II)
HPF engl. High Power Field (Blickfeld im Lichtmikroskop bei 400facher Vergrößerung)
ICAM engl. Intracellular Adhesion Molecules
(intrazelluläre Adhäsionsmoleküle)
IgG Immunglobulin G
IgM Immunglobulin M
IL Interleukin
J Jahre
kDa Kilo Dalton
lfd. laufend
Lz Lymphozyten
m männlich
M Molarität
MAK monoklonaler Antikörper
Makr. Makrophagen
MALT engl. Mucosa-associated lymphatic tissue (Mukosa-assoziiertes lymphatisches Gewebe)
max. maximal
M. bovis Mycoplasma bovis
MHC engl. Major histocompatibility complex
(Haupthistokompatibilitätskomplex)
mgr mittelgradig
Mo Monate
Min. Minuten
MW Mikrowelle
N Normalität
NaCl Natriumchlorid
NaOH Natronlauge
n.Gr. neutrophile Granulozyten
Nr. Nummer
PBS engl. Phosphate-buffered saline (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung)
PCR engl. Polymerase chain reaction
(Polymerasekettenreaktion)
p.i. post infectionem
RTPCR engl. Real-Time Polymerase Chain Reaction
S. Salmonella
SID engl. Sudden Infant Death (plötzlicher Kindstod)
Tab. Tabelle
TCR engl. T-Cell-Receptor (T-Zellrezeptor)
Th T-Helferzelle
TNF- Tumor Nekrose Faktor-
u.a. unter anderem
VIP Vasoaktives Intestinales Peptid
Vsp engl. Variable surface protein
(variables Oberflächenprotein)
w weiblich
z.B. zum Beispiel
1 Einleitung
Die Entwicklung des Mukosa-assoziierten lymphatischen Gewebes (MALT) im Respirationstrakt wurde bei verschiedenen Spezies untersucht, wobei es bislang nur eine Publikation über die Entwicklung des MALTs in der Lunge bei Kälbern bis hin zu adulten Rindern gibt. Im Respirationstrakt kann das MALT entsprechend seiner Lokalisation in Nasal-assoziiertes (NALT), Larynx-assoziiertes (LALT), Trachea-assoziiertes (TALT) oder Bronchus-assoziiertes (BALT) lymphatisches Gewebe eingeteilt werden. Das zum Immunsystem dazugehörige MALT im Respirationstrakt übernimmt Aufgaben bei der Infektionsabwehr und der Weiterverarbeitung immunologischer Informationen.
Untersuchungen an Lungen von Kälbern mit natürlicher und experimenteller Mycoplasma (M.) bovis-Infektion haben gezeigt, dass es zu entzündlichen Lungenalterationen kommt, die von einer ausgeprägten Proliferation des Bronchus-assoziierten lymphatischen Gewebes (BALT) begleitet werden. Da immunhistochemische Untersuchungen mit Antikörpern gegen variable Oberflächenantigene von Mycoplasma bovis gezeigt haben, dass diese Antigene im Respirationstrakt anscheinend auch in vivo exprimiert werden und noch mehrere Wochen nach der Infektion nachweisbar sind, wird angenommen, dass die BALT-Proliferation auf eine kontinuierliche Stimulation des Immunsystems des Wirtes durch die Persistenz dieser variablen Oberflächenantigene von M. bovis zurückzuführen ist.
Dendritische Zellen nehmen im Immunsystem eine wichtige Rolle als Antigen-präsentierende Zellen ein. Sie sind fähig, die Immunantwort zu modulieren, und sind die einzigen bislang bekannten Zellen, die naive T-Zellen aktivieren können. Morphologische und funktionelle Untersuchungen an Labornagern haben gezeigt, dass es im Respirationstrakt ein Netzwerk aus dendritischen Zellen gibt, welchem eine wichtige Rolle bei der Präsentation bakterieller und viraler Erregerantigene zukommt. In Untersuchungen an der Trachea von Kindern wurde festgestellt, dass dendritische Zellen während des ersten Lebensjahres nur bei etwa einem Viertel aller untersuchten Fälle vorkommen, aber bei Kindern mit infektiös bedingten Erkrankungen des Respirationstraktes zu 100% nachweisbar sind. Des Weiteren wurde ein Influx dendritischer Zellen bei akuter Infektion und eine erhöhte Zahl dieser Zellen bei chronischer Infektion mit M. pulmonis bei Ratten festgestellt. Über das Vorkommen und die Topographie dendritischer Zellen im normalen bovinen Respirationstrakt oder im Respirationstrakt mit mikrobiellen Erregern infizierter Kälber oder Rinder sind keine
publizierten Erkenntnisse verfügbar. Bislang gibt es auch keine Untersuchungen zum Vorkommen dendritischer Zellen im Respirationstrakt von Kälbern mit respiratorischer Mycoplasma bovis-Infektion.
Ziel dieser Arbeit war es, die Entwicklung des Trachea-assoziierten lymphatischen Gewebes (TALT) und des Bronchus-assoziierten lymphatischen Gewebes (BALT) sowie das Vorkommen MHC Klasse II-exprimierender dendritischer Zellen in Trachea und Lunge lungengesunder Rinder unterschiedlichen Alters zu charakterisieren.
Des Weiteren sollte die Topographie und die Anzahl von MHC Klasse II-exprimierenden dendritischen Zellen in der Lunge von Kälbern nach experimenteller M. bovis-Infektion analysiert werden.
2 Literaturübersicht
2.1 Dendritische Zellen
2.1.1 Charakterisierung, Vorkommen und Verteilung dendritischer Zellen Dendritische Zellen (DCs) wurden erstmals 1973 in den peripheren Lymphorganen (Milz) der Maus als ein neuer Zelltyp identifiziert (STEINMANN und COHN 1973), der sich hinsichtlich seines Phänotyps deutlich von den bis dahin bekannten Zelltypen des lymphatischen Systems unterschied. Aufgrund der verzweigten Morphologie ihrer Zellfortsätze wurden die Zellen nach dem griechischen Wort Dendron (Baum) benannt. Zu den typischen morphologischen bzw. immunozytochemischen Merkmalen dendritischer Zellen zählen ihr bohnenförmiger exzentrischer Nukleus, die langen zytoplasmatischen Ausläufer, das Vorkommen von juxtanukleären MHC Klasse II-positiven Vesikeln mit Verbindung zum lysosomalen Apparat (ARKEMA et al. 1993) und die starke MHC Klasse II- Expression. Zu den weiteren Oberflächenantigenen, die von dendritischen Zellen exprimiert werden können, zählen CD11c, CD80, CD86 und CD1 (VAN HAARST et al. 1994, 1996), auf die im Kapitel 2.1.2 näher eingegangen wird. Bis auf zahlreiche Mitochondrien besitzen dendritische Zellen nur wenige intrazelluläre Organellen. Zum Teil weisen einige dendritische Zellen Birbeck-Granula auf, die ein typisches Merkmal von Langerhans-Zellen der Haut darstellen und als essentielles Charakteristikum für die Identifikation von Langerhans-Zellen angesehen werden (McWILLIAM et al. 2000). Es handelt sich bei diesen Granula um schläger- oder stabförmige zytoplasmatische Organellen, welche sich im Elektronenmikroskop darstellen (WOLFF et al. 1983). Eine weitere Besonderheit der dendritischen Zelle ist ihre große Mobilität, die mittels Video-Mikroskopie sichtbar gemacht werden kann. Diese zeigt, wie die dendritischen Zellen ihre Fortsätze wie Pseudopodien aus- und wieder einfahren können.
Inzwischen wurden dendritische Zellen bei Labortieren, Nutztieren und in fast allen Organen des Menschen mit Ausnahme der Kornea und des Gehirns (HART et al. 2001) identifiziert.
Dabei konnte eine Vielzahl an verschiedenen Typen in den unterschiedlichen Geweben nachgewiesen werden, von denen einer der ersten bereits 1868 von Paul Langerhans in der Epidermis der Haut entdeckt wurde. STEINMANN (1991) unterteilte das dendritische
Zellsystem in drei funktionelle Kompartimente auf der Grundlage der Gewebelokalisation:
die dendritischen Zellen der nicht-lymphatischen Organe, des Blutes und der Lymphe mit den primären und sekundären lymphatischen Organen. Während die Langerhans-Zelle in der Epidermis lokalisiert ist, kommt die interstitielle dendritische Zelle in Herz, Leber, Lunge und Darm vor. In den afferenten Lymphgefäßen wird die dendritische Zelle auch als Schleierzelle („veiled cell“) bezeichnet. Interdigitierende Zellen sowie lymphoide follikuläre dendritische Zellen werden in den Lymphknoten, im Thymusmark und in den sekundären Lymphorganen gefunden. WRIGHT-BROWNE et al. (1997) beschreiben zusätzlich sogenannte
„indeterminate cells“ der Haut, die er auch dermale Dendrozyten nennt. Die Autoren unterteilen dendritische Zellen in zwei Typen: in die follikulären dendritischen Zellen und die nicht-follikulären dendritischen Zellen, unter denen sie sämtliche anderen zusammenfassen.
Dendritische Zellen wandern vermutlich in bidirektionaler Richtung zwischen den drei von STEINMAN (1991) beschriebenen Kompartimenten, wobei diese Bewegungen anhand zahlreicher Versuche unter Einsatz von Fluorochromen und Radioisotopen beobachtet wurden (AUSTYN et al. 2001). Die Variabilität des Immunphänotyps und des lichtmikroskopischen Erscheinungsbildes der dendritischen Zellen, die beide vom Aktivierungs- und Reifungsstatus der Zelle und von der jeweiligen Isolierungs- bzw. Kultivierungmethode abhängen, sind Gründe für die Schwierigkeit bei der Identifikation dieses Zelltyps und auch der Grund für die komplizierte Nomenklatur. Es wird vermutet, dass sämtliche Subtypen miteinander in Verbindung stehen und verschiedene Differenzierungsstadien ein und derselben Knochenmark-Vorläuferzelle darstellen. Die Halbwertszeit dendritischer Zellen hängt anscheinend vom jeweiligen Gewebe und ihrer Funktion ab. So geben SMITH und HOLT (2000) für epitheliale dendritische Zellen der luftführenden Wege weniger als 2 Tage und für parenchymatöse dendritische Zellen 3 bis 4 Tage an, während für Langerhans-Zellen der Haut die Halbwertszeit über 15 Tage beträgt.
2.1.2 Herkunft, Entwicklung und Reifung dendritischer Zellen
Dendritische Zellen gehören zu einem System hämatopoetischer Zellen, deren Herkunft Gegenstand aktueller Untersuchungen ist. Einigkeit besteht über das Vorhandensein einer gemeinsamen CD34+-pluripotenten Stammzelle aus dem Knochenmark. Die Erlangung von
Erkenntnissen über die Weiterentwicklung samt Phänotyp und Funktion werden durch die Vielzahl von Subtypen sowie durch speziesspezifische Unterschiede erschwert.
Ursprünglich wurde angenommen, dass die dendritische Zelle myeloiden Ursprungs ist und somit nahe verwandt mit Monozyten, Makrophagen und Granulozyten. Studien der letzten Jahre konnten allerdings eine Differenzierung der CD34+-Stammzelle in sogenannte Common Lymphoid Progenitors (CLP) und Common Myeloid Progenitors (CMP) nachweisen (WU und GALY 2001). Diese beiden Entwicklungslinien stellen den Ausgangspunkt für die verschiedenen DC-Subtypen dar, die sich voneinander durch ihre Oberflächenrezeptoren und Funktionen unterscheiden. Dabei dienen CMP den Monozyten als Vorläuferzellen, während die CLP Vorläufer der plasmazytoiden dendritischen Zelle sind (HOOGSTEDEN et al. 2003).
PETERS et al. (1996) beschreiben ein myeloides Differenzierungsprogramm, in dem dendritische Zellen von pluripotenten Vorläuferzellen abstammen und sich über Monozyten und über eine sogenannte akzessorische Zwischenzelle schließlich zu Makrophagen, Granulozyten oder dendritischen Zellen in Abhängigkeit von äußeren Umständen entwickeln können. Daneben besteht die Möglichkeit einer frühen Abspaltung aus einer myeloiden Vorläuferzelle zu einer juvenilen dendritischen Zelle des Blutes, die ihre Differenzierung mit Eintritt in das Gewebe beendet (s. Abbildung 1). Diese Differenzierung dendritischer Zellen aus Monozyten wurde bereits in vitro mittels GM-CSF (Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor) und IL-4 (Interleukin-4) nachvollzogen (ROMANI et al. 1994;
SALLUSTO und LANZAVECCHIA 1994; WANG et al. 2000). Andere in vitro-Studien an humanen Zellen weisen auf zwei unterschiedliche Entwicklungslinien aus der CD34+- Vorläuferzelle hin, aus der CD34+CLA-- und CD34+CLA+-Zellen hervorgehen, die sich wiederum in CD11c+CD1a+- und CD11c+CD1a--immature dendritische Zellen teilen. Bei der Einwanderung in die Haut nimmt das Cutaneous Lymphocyte Antigen (CLA) eine Schlüsselrolle ein, so dass sich aus den CD11c+CD1a+-DCs immature Langerhans-Zellen entwickeln, während sich die CD11c+CD1a--DCs zu interstitiellen DCs weiterdifferenzieren (STRUNK et al. 1997). Im Gegensatz dazu differenzieren sich plasmazytoide dendritische Zellen der CLM- Vorläuferzelle in der Zellkultur mit Zusatz von IL-1, IL-3, IL-7 und TNF- (Tumor Nekrose Faktor- ) zu immaturen dendritischen Zellen (WU und GALY 2001; LIU et al. 2001). Das Fehlen von spezifischen dendritischen Zellmarkern sowie speziesspezifische Unterschiede in der Expression verschiedener Zellrezeptoren führen zu den bereits
beschriebenen Schwierigkeiten beim Aufstellen von phänotypischen Kriterien. Des Weiteren können DC-Subpopulationen der Maus nicht ohne weiteres mit denen vom Menschen oder von anderen Spezies verglichen werden.
Eine andere Unterteilung der dendritischen Zellen nach ihrem Reifungsgrad führt zu der Nomenklatur der juvenilen und maturen dendritischen Zellen. Die unreifen, juvenilen dendritischen Zellen sind in den peripheren Geweben und im Blut lokalisiert. Charakterisiert werden sie durch die Expression zahlreicher MHC Klasse II-Moleküle, von denen allerdings nur wenige auf der Zelloberfläche erscheinen. Aufgrund verschiedener Aufnahme- Mechanismen sind sie in der Lage, große Mengen an löslichen und partikulären Antigenen aufzunehmen, zu prozessieren und mittels MHC Klasse I- und II- Rezeptoren zu präsentieren.
MHC Klasse II-Moleküle an der Oberfläche von juvenilen DC können internalisiert werden.
Sie werden durch einen endosomalen Apparat recycled, können erneut Peptide binden und sind in der Lage, sowohl auf neu synthetisierte als auch auf gebrauchte MHC Klasse II- Moleküle aus einem intrazellulären Pool zurückzugreifen (CELLA et al. 1997). Juvenile dendritische Zellen nutzen zur Antigenaufnahme von löslichen Partikeln bis zu einer Größe von 2 m Makropinozytose, während mittels Mikropinozytose extrazelluläre Flüssigkeit in Clathrin-bemantelten Vesikeln einer Größe von 0,15 m aufgenommen wird (WATTS et al.
1992). Des Weiteren stellen Phagozytose und Rezeptor-vermittelte Endozytose mittels Fc- Rezeptoren, Komplementrezeptoren und C-Typ Lektin-Rezeptoren (Mannose-Rezeptor, DEC 205) weitere Mechanismen der Antigenaufnahme dar (BANCHEREAU und STEINMANN 1989; SALTER und DONG 2001; LAMBRECHT et al. 2001).
Nach Aufnahme der Antigene reifen die DCs und wandern über die Blutbahnen und die afferenten Lymphgefäße zu den sekundären Lymphorganen (CELLA et al. 1997). Dieser Reifungsprozess kann sowohl kontinuierlich als auch durch Umwelt-induzierte Faktoren wie Zytokine (Interleukin 1 und 6, TNF- ), bakterielle Faktoren (Lipopolysaccharide = LPS) und entzündungsstimulierende Mediatoren stattfinden (SMITH und HOLT 1995). Diese Reifung führt zu einer Neuordnung des Zytoskeletts und einer damit einhergehenden Verstärkung der Motilität der Zellen, welche die Wanderung begünstigt. In den Lymphorganen angelangt, begeben sich die DC in die parakortikalen T-Zell-Zonen (STEINMANN et al. 1993; CELLA et al. 1997; AUSTYN et al. 2001). Während dieser Reifung macht die DC phänotypische und funktionelle Änderungen durch. Dazu zählt die Reduktion der Antigenaufnahme, Verlust der
Fc-Rezeptoren und die Verstärkung der Antigen-präsentierenden Funktion mit Aufregulierung der MHC Klasse II- und costimulierender Moleküle (CD40, CD80, CD86) auf der Oberfläche (SMITH und HOLT 1995; CELLA et al. 1997). CELLA et al. (1997) beschreiben in vitro Studien, in denen innerhalb der ersten 24 Stunden nach Stimulation durch LPS oder TNF- bis zu 6x106 MHC Klasse II-Moleküle auf der Oberfläche erscheinen.
Zeitgleich zur Stimulation sinkt die Turnover-Rate der DCs um das Hundertfache, während die Halbzeit der MHC Klasse II-Moleküle ansteigt, was den DCs erlaubt, das Antigen über mehrere Stunden den T-Zellen zu präsentieren (CELLA et al. 1997). Die rekrutierten dendritischen Vorläuferzellen verändern während der ersten 24 Stunden nach Ankunft im entzündeten Gewebe ihr rundes Aussehen in eine pleomorphe Gestalt. Nach Ablauf dieser 24 Stunden dauernden Reifung erhalten diese Zellen ihre hoch verzweigte, ausgereifte dendritische Zellform (McWILLIAM und HOLT 1998). Der Ablauf der Differenzierung und das „homing“ in den verschiedenen Geweben sind weitestgehend unbekannt und geben Anlass zu weiterführenden Studien.
Abbildung 1:
Differenzierungsprogramm dendritischer Zellen
(erstellt auf der Grundlage folgender Publikationen: WU und Galy 2001; Peters et al. 1996)
!
" #
$
2.1.3 Funktionen dendritischer Zellen
Zu den Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) zählen die professionellen APCs, wie die B- Zellen, die Makrophagen und die dendritischen Zellen, die kontinuierlich MHC Klasse II- Moleküle auf der Oberfläche exprimieren, und die opportunistischen APCs, wie die Epithelzellen der luftführenden Wege, Typ II-Pneumozyten und Fibroblasten, die unter geeigneten Bedingungen dazu veranlasst werden können, MHC Klasse II-Komplexe zu bilden. Die bekanntlicherweise effektivsten professionellen APCs sind die dendritischen Zellen, weshalb sie auch als Wächter des Immunsystems bezeichnet werden (STEINMANN 1991; LAMBRECHT et al. 2001). STEINMANN und COHN fanden 1973 heraus, dass DCs etwa 100- bis 300-mal effizienter naive T-Zellen stimulieren können als Makrophagen und B- Zellen. Zu den vielen Funktionen von dendritischen Zellen zählt die Fähigkeit, fremde Antigene aufzunehmen, zu sammeln, zu prozessieren und gebunden an MHC Klasse I- oder II-Molekülen zu präsentieren. Dieser Antigenkontakt induziert die Reifung der DCs, welche die selektive Wanderung zu den T-Zell-Zonen sekundärer lymphatischer Organe auslöst.
Diese Antigenstimulation resultiert in einem drastischen lokalen Anstieg dendritischer Zellen, noch bevor Granulozyten das entzündete Gewebe infiltrieren (McWILLIAM et al. 1996).
Innerhalb der ersten Stunde erreichen die dendritischen Zellzahlen Maximumwerte in dem entzündeten Gewebe, welche die normale Anzahl um das dreifache übersteigen können. Ob diese Infiltration mit DCs aus dem Blut oder durch lokale Proliferation dendritischer Zellen ausgelöst wird, ist noch weitestgehend unbekannt (WERLING et al. 2002).
Die immaturen DCs sind schlechte Antigen-präsentierende Zellen (APCs). Dieser schützende Mechanismus soll das Wirtsgewebe vor durch T-Lymphozyten vermitteltem Schaden bewahren, der unvermeidlich durch eine T-Zell Aktivierung ausgelöst werden würde (HOLT 2000). Auch STEINMANN (1991) beschreibt, wie während der Wanderung die Antigenprozessierung eingestellt wird, um zu verhindern, dass endogene Peptide aufgenommen und prozessiert werden; ein Vorgang, der unweigerlich zu Autoimmunität führen würde. In den sekundären Organen treten DCs in Kontakt zu T-Zellen, um ihnen das MHC-gekoppelte Antigen zu präsentieren. Dazu ist es essentiell, dass neben dem trimolekularen Komplex aus MHC-Molekül, Peptid und T-Zell-Rezeptor (TCR) weitere costimulierende Moleküle wie CD40, CD80, CD86 und intrazelluläre Adhäsionsmoleküle (ICAM) von den dendritischen Zellen exprimiert werden, um eine optimale T-Zellaktivierung
und klonale Expansion zu erhalten und gleichzeitig T-Zell-Anergie zu vermeiden (DUPUIS und McDONALD 1997; LAMBRECHT et al. 2001, s. Abbildung 2). Die CD40-Ligation induziert die Produktion von Zytokinen, deren Zusammensetzung über die Th1- oder Th2- Zelldifferenzierung (Th= T-Helferzelle) aus Th0-Zellen entscheidet. IL-12, Interferon- (IFN- ) und IL-18 sind entscheidend für die Entwicklung von Th1-Zellen, die wiederum zytotoxische T-Zellen und Makrophagen zur intrazellulären Erregerabtötung aktivieren können (LAMBRECHT 2001b). IL-4 und IL-6 sowie das Fehlen der CD40-Ligation führen dagegen zu einer Th2-Entwicklung. Die Differenzierung der T-Zellen ist außerdem von den unterschiedlichen dendritischen Zelllinien abhängig. So führen myeloide DCs humaner Herkunft zu IL-12 Produktion und damit zu einer Th1-Differenzierung. Humane dendritische Zellen der lymphoiden Zelllinie produzieren dagegen nur wenig IL-12, was eine Th2- Differenzierung zur Folge hat (HOOGSTEDEN et al. 2003). Allerdings weisen neuere Studien darauf hin, dass auch Subtypen innerhalb der myeloiden Zellreihe (CD1a+, CD1a-) einen Einfluss auf das Ergebnis der T-Zelldifferenzierung haben (HOOGSTEDEN et al.
2003). In vitro-Arbeiten über die direkte Interaktion zwischen dem Immun- und Nervensystem haben gezeigt, dass Neuropetide wie Substanz P, Calcitonin Generated Peptide (CGRP), Somatostatin und das Vasoaktive intestinale Peptid (VIP) einen Einfluss auf die T- Zell Differenzierung, Aktivierung und Proliferation haben (LAMBRECHT 2001a). Neben der zellulären kann auch die humorale Immunantwort durch DCs beeinflusst werden. So benötigen naive B-Zellen CD4+-Th-Zellen, um völlig aktiviert zu werden und um die Isotypen der Immunglobuline zu wechseln. Hier setzt die Aufgabe der dendritischen Zelle ein, die, wie oben beschrieben, verschiedene Subtypen der CD4+-Th-Zellen aktiviert, zur Migration bringt und dadurch Einfluss auf die Aktivierung und Produktion der Immunglobuline der B-Zellen erhält. Zusätzlich bringen DCs Antigene aus der Peripherie in die B-Zell-Areale der Lymphknoten, die sie entweder den naiven B-Zellen oder den Plasmazellen direkt präsentieren und ihr Überleben sichern. Somit erhalten sie zusammen mit den B-Zellen das immunologische Gedächtnis aufrecht (LAMBRECHT et al. 2001).
Abbildung 2:
Antigenpräsentation (modifiziert nach LAMBRECHT et al. 2001).
DC SIGN = DC-Specific ICAM-3 Grabbing Nonintegrin, ICAM = Intercellular Cell Adhesion Molecule, TRANCE = Tumor Necrosis Factor Related Activation-inducing Cytokine, CD40L = Cluster of Differentiation 40 Ligand
2.1.4 Dendritische Zellen beim Rind
Bislang gibt es nur vergleichsweise wenige publizierte Untersuchungsergebnisse, die sich mit den dendritischen Zellen des Rindes beschäftigen. In Gefrierschnitten von präskapulären Lymphknoten 4 bis 6 Wochen alter Kälber konnten MACHUGH et al. (1988) mittels Immunhistochemie mit den Antikörpern TH97a, CC13 und CC14 in den parakortikalen Regionen CD1-positive dendritische Zellen nachweisen. Diese Antikörper detektieren des Weiteren DCs der Haut und große, mit Fortsätzen versehene Zellen in der afferenten Lymphe.
Diese Untersuchungen bestätigen die Vermutung, dass DCs, die in der Haut lokalisiert sind, über die Lymphgefäße die parakortikalen Areale der Lymphknoten erreichen.
Auch KERESZTES et al. (1996) konnten mit einer Reihe von Antikörpern in Paraffin- und Gefrierschnitten peritrachealer Lymphknoten und der Milz von Schlachtrindern DCs mittels
Antigen- Aufnahme durch Rezeptoren:
Mannose Lektin1/2 Komplement IgG Toll- like
Prozessierung:
Digestion Kürzen Peptidbindung
Signal 2:
CD80/CD86-CD28 DC SIGN-ICAM-3 CD40-CD40L OX40L-OX40 TRANCER- TRANCE 4-1BBL-4-1BB Zytokine
T-Zell Antwort:
Proliferation Differenzierung Migration
Immunhistochemie nachweisen. Dabei konnten mit den beiden gegen MHC Klasse II- gerichteten Antikörpern VPM54 und VPM36 ebenfalls in den parakortikalen Arealen des Lymphknotens DCs gefunden werden. Follikuläre dendritische Zellen in den Keimzentren der Lymphknoten und der Milz ließen sich mit den Antikörpern CM7, DU2-74, IAH-CC57, DM6 und TD4 feststellen. Monoklonale Antikörper gegen CD1 wurden neben MACHUGH et al.
(1988) auch von HOWARD et al. (1993) am bovinen Gewebe eingesetzt. Es wurden die monoklonalen Antikörper CC14, CC20, CC90 gegen das CD1b-Oberflächenantigen verwendet, welches auf bovinen Thymozyten und einer Teilpopulation dendritischer Zellen exprimiert wird. Die restlichen Antikörper CC40, CC122 und 20-27 waren allgemein gegen CD1-Moleküle gerichtet. Alle Antikörper detektierten in der Medulla des Thymus und in der parakortikalen T-Zell-Zone von sekundären lymphatischen Organen des Rindes Zellen mit dendritischer Morphologie. Spätere Untersuchungen von HOWARD et al. (1999, 2004) beschäftigen sich mit dendritischen Zellen der afferenten Lymphe (ALVDC) beim Rind. Die Forschungsergebnisse zeigen, dass es mindestens zwei Untergruppen dieser dendritischen Zellpopulation gibt, die sich in eine größere, heterogene CD11a--, CD26-, CD13-- und CD5-- Gruppe und eine kleinere CD11a+-, CD26+-, CD13+- und CD5+-Gruppe einteilen läßt.
Weiterhin wird vermutet, dass je nach Differenzierungs- und Reifungsgrad der DCs noch weitere Subpopulationen entstehen.
2.1.5 Dendritische Zellen im Respirationstrakt
Die Lunge stellt ein einzigartiges ausbalanciertes System mit der größten epithelialen Oberfläche dar, das in ständigem Kontakt mit der externen Umwelt steht. Bei einem Erwachsenen handelt es sich um 75 m² Oberfläche, die pro Tag bis zu 15000 Litern Luft exponiert ist (HOLT et al. 1990b). Neben dem lebenswichtigen Sauerstoff beinhaltet die eingeatmete Luft eine Vielzahl an Partikeln, toxischen Gasen und Mikroorganismen, mit denen die Epithelien der luft- und gasaustauschenden Wege belastet werden. Um die lokale Homöostase beizubehalten, muß das Immunsystem pathogene Antigene von ubiquitär vorkommenden Antigenen wie Pollen unterscheiden und sie identifizieren können, um die angemessenen Abwehrmechanismen zu mobilisieren. Fehler im Ablauf dieses Erkennungsprozesses würden unweigerlich zu Schädigungen des Lungengewebes und zu immuninduzierten Erkrankungen des Respirationstraktes führen.
Beweise für das Vorkommen von dendritischen Zellen im Respirationstrakt wurden erstmals in Studien über den Phänotyp von Antigen-präsentierenden Zellen in enzymatisch verdauten Lungengewebestücken der Ratte gesammelt (HOLT 1993). In anfänglichen Untersuchungen am menschlichen Lungengewebe wurden DCs bei entzündlichen und fibrosierenden Erkrankungen beschrieben (HOLT 1993). In neueren Untersuchungen wurde nachgewiesen, dass diese Zellen normalerweise in der Lunge von Menschen und Labortieren vorkommen (HOLT 1993, 2000). Die Forschungsergebnisse zeigen sowohl tierartspezifische Unterschiede als auch Abhängigkeiten vom Alter, von den Lebensbedingungen und von der Lokalisation innerhalb des Respirationstraktes. Auch die longitudinale oder tangentiale Schnittführung des Gewebes spielt eine große Rolle. HOLT et al. (1989, 1990b) fanden heraus, dass in tangentialen Gewebeschnitten von Bronchial- bzw. Trachealepithel von Ratte und Mensch sowohl die Anzahl als auch die Morphologie der dendritischen Zellen wesentlich besser zu beurteilen sind als in Longitudinalschnitten. Dabei werden Bronchien oder Trachea der Länge nach aufgeschnitten und tiefgefroren, um die Epithelien in einer planen Ebene parallel zur Basalmembran und im rechten Winkel zur Längsachse der Epithelzellen mittels eines Mikrotoms zu schneiden (s. Abbildung 3).
Abbildung 3:
Tangentiale Schnittführungstechnik an einem Bronchus der Ratte zwecks Darstellung des Netzwerkes dendritischer Zellen (modifiziert nach HOLT et al. 1989).
Tangentialschnitt
Schnittebene parallel zurBasalmembran Epithel
Knorpelspangen
Netzwerk
dendritischer Zellen in der Schleimhaut
2.1.5.1 Dendritische Zellen im Respirationstrakt der Ratte
In der Mehrzahl der Fälle diente die Ratte als Versuchstier zur Erforschung des Vorkommens dendritischer Zellen im Respirationstrakt. Studien von HOLT et al. (1988) identifizierten 12 bis 15% MHC Klasse II-positive Zellen in einer APC-angereicherten Fraktion aus enzymatisch verdautem Lungengewebe, von denen ein Drittel prominente dendritische Fortsätze aufwies. In der bronchoalveolären Lavage konnten dagegen keine freien dendritischen Zellen gefunden werden. Anhand von Gefrierschnitten wurden MHC Klasse II- positive Zellen mit dendritischer Morphologie innerhalb und unterhalb der Epithelien der luftführenden Wege sowie diffus verteilt in den Alveolarsepten nachgewiesen. Die Fortsätze der dendritischen Zellen erstrecken sich zwischen die interzellulären Kanäle, die von Epithelzellen geformt werden, bis zu den apikalen Tight junctions der Epithelzellen, wo die DCs Antigene aufnehmen. Weitere DCs werden im Bindegewebe um Gefäße und in der Pleura gefunden (NICOD et al. 2000). Dendritische Zellzahlen zwischen 500 und 800/mm² epithelialer Oberfläche können in den großen Bronchien und der Trachea festgestellt werden, wobei ähnliche Zellzahlen in der Trachea von Maus und Meerschwein sowie in den kleineren Bronchien des Menschen gefunden werden können (HOLT 2000). Weitere Studien in der Lunge der Ratte haben zu einer Unterteilung der DCs in der Lunge in parenchymale dendritische Zellen und solche der luftführenden Wege geführt, die sich bezüglich des Phänotyps unterscheiden (SMITH et al. 1995). SMITH et al. (1995) fanden heraus, dass die Mehrzahl der DCs in denselben junktionalen Alveolarsepten lokalisiert sind, in denen Alveolarmakrophagen zu finden sind. Ebenfalls in direkter Nachbarschaft kommen DCs und ausgereifte Gewebemakrophagen in der Mukosa der luftführenden Wege vor (HOLT 1993).
Die Autoren beschreiben die Fähigkeit von Alveolarmakrophagen, die Funktionen parenchymaler DCs im Lungengewebe mittels Freisetzung von Stickstoffoxiden (NO) herunterzufahren oder ganz zu unterdrücken. So halten sie die DCs in einem juvenilen, naiven Zustand und daher unfähig, T-Zellen zu aktivieren. In der erstmals von HOLT et al. (1989) durchgeführten Tangentialschnitttechnik an Bronchien und Trachea parallel zur Basalmembran ist ein ausgedehntes intraepitheliales Netzwerk dendritischer Zellen zu finden, das in longitudinalen Schnitten nicht darstellbar ist. Morphometrische Analysen an luftführenden Wegen von Ratten weisen eine umgekehrte Beziehung zwischen dem Durchmesser der Bronchien und der intraepithelialen Dichte der DCs auf. So nimmt die
Dichte mit zunehmender Aufteilung der Bronchien ab. In der 5. Generation der Segmentbronchien können nur noch 50 Zellen/mm² epithelialer Oberfläche gefunden werden (HOLT 1993). Auch in der Trachea werden bezüglich der Lokalisation dendritischer Zellen Unterschiede in der Zellzahl gefunden. Die dorsalen Abschnitte der Trachea weisen im Vergleich zu den ventralen eine höhere Zelldichte auf (881/mm² bzw. 675/mm²). Als eine der Ursachen wird die Aerodynamik der Inhalation diskutiert, die zu einer verstärkten dorsalen Ablagerung eingeatmeter Antigene führt. Des Weiteren kommt eine verstärkte Vaskularisierung in Verbindung mit der Trachealmuskulatur in den dorsalen Abschnitten als Ursache in Betracht (SCHON-HEGRAD et al. 1991; McWILLIAM et al. 2000).
In einer Studie von NELSON et al. (1994) wurden intraepitheliale dendritische Zellen in tangentialen Gefrierschnitten der Trachea und in basalen Bereichen nasaler Turbinalia bereits bei fetalen und neonatalen Ratten entdeckt. Ein Vergleich der Anzahl dendritischer Zellen bei 2 Tage alten Tieren und adulten Ratten zeigte ein geringeres Vorkommen intraepithelialer DCs bei den neonatalen Tieren. Zusätzlich konnten mehr dendritische Zellen in den pharyngealen Bereichen der Trachea beobachtet werden als in den distalen Bereichen. Diese lokalen Unterschiede verschwanden mit zunehmendem Alter der Tiere. Bereits zum Zeitpunkt des Absetzens der Jungtiere erreichte die Anzahl dendritischer Zellen in der Trachea den Level von adulten Tieren ((McWILLIAM et al. 1998)). In Gefrierschnitten von neonatalem Lungengewebe konnten keine dendritischen Zellen gefunden werden. Erst mit zunehmendem Alter konnten Ansammlungen DCs in den Alveolarsepten, im perivaskulären Bindegewebe und in kleineren Bronchien von peripheren Lungenabschnitten nachgewiesen werden. Im Vergleich zu adulten dendritischen Zellen wiesen sie eine geringere MHC Klasse II-Intensität auf, die auf juvenile DCs schließen ließ. Eine 500%ige Zunahme der Anzahl von DCs, die hauptsächlich während der ersten 4 Lebenstage stattfindet, kann zwischen neonatalen und adulten Tieren verzeichnet werden (NELSON et al. 1994).
2.1.5.2 Dendritische Zellen im Respirationstrakt des Menschen
Dendritische Zellen stellen normale Bewohner der nasalen Mukosa, luftführender Epithelien, der Alveolarsepten, des perivaskulären Bindegewebes und der Pleura gesunder Menschen dar (LAMBRECHT et al. 2001). Anders als bei den Labortieren können sie auch in geringer Anzahl auf der alveolaren Oberfläche und somit in der bronchoalveolaren Lavage
nachgewiesen werden (McWILLIAM et al. 2000). Eine dichte Population von Zellen mit dendritischer Morphologie kann außerdem in der pharyngealen Mukosa der Tonsillen (HOLT et al. 1989) und intraepithelial in der Trachea (McWILLIAM et al. 1996) beobachtet werden.
In gesunden Lungenbiopsien des Menschen konnten VAN HAARST et al. (1994) Zellen mit dendritischer Morphologie in den Epithelien von Bronchien und Bronchioli diffus verteilt in der Nähe zur Basalmembran finden. Des Weiteren kamen DCs subepithelial in Ansammlungen zusammen mit T-Zellen und in der T-Zell-Zone des Bronchus-assoziierten lymphatischen Gewebes (BALT) vor. Im Lungenparenchym wurden DCs nur vereinzelt im Bindegewebe verdickter Alveolarwände und in den Bifurkationen der Alveolarsepten beobachtet. Während VAN HAARST et al. (1994) nur einzelne, disseminiert intraepithelial liegende DCs in Tangentialschnitten finden, beschreiben HOLT et al. (1989) ein dichtes Netzwerk innerhalb der Epithelien analog zu dem in Ratten. Insbesondere die ideale Lokalisation unterhalb des Bronchialepithels erlaubt den DCs, ihre Funktion als intraepitheliale Falle für inhalierte Antigene auszuüben und in dieser Wächterrolle den primären Kontakt zwischen Antigen und Immunsystem herzustellen. DCs stellen somit die erste spezifische Abwehrlinie des Körpers dar. Von TSCHERNIG et al. (2001a) wurde das Vorkommen von dendritischen Zellen in der Mukosa von distalen Tracheaabschnitten von bis zu einem Jahr alten Kindern untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass bei allen Kindern, die an respiratorischen Erkrankungen gestorben waren, dendritische Zellen in der Trachealmukosa gefunden werden konnten, die zahlenmäßig zwischen einzelnen Zellen im gesamten Tracheaschnitt und bis zu mehr als 10 Zellen/mm² Basalmembran lagen. Die meisten Patienten, die während des ersten Lebensjahres akut verstorben waren (plötzlicher Kindstod), wiesen keine DCs auf. Im Gegensatz dazu konnten bei der Mehrzahl der über einem Jahr bis 90 Jahre alten Patienten, die einen plötzlichen Tod erlitten hatten, im Trachealepithel DCs festgestellt werden (s. Abbildung 4).
24
90
100
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Anzahl dendritischer Zellen in Prozent
Gruppen
akuter Tod (<1 Jahr) n=29 akuter Tod (1-90 Jahre) n= 59
Tod durch respiratorische Erkrankung (<1 Jahr) n= 8
Abbildung 4:
Vergleich der Anzahl DCs in der Lunge bei <1 Jahr alten Kindern, die an respiratorischen Erkrankungen verstorben waren oder einem akuten Kindstod erlagen, mit >1 bis 90 Jahre alten Patienten (modifiziert nach TSCHERNIG et al. 2001a).
2.1.5.3 Dendritische Zellen im Respirationstrakt des Hundes
PEETERS et al. (2005) weisen mittels Immunhistochemie MHC Klasse II- und CD1c- positive Zellen mit dendritischer Morphologie in der Lunge des Hundes in ähnlichen Lokalisationen nach, wie sie für Ratte und Mensch beschrieben worden sind. Kleinere subepitheliale Ansammlungen von DCs wurden unterhalb der Basalmembran, in tieferen Bereichen der Lamina propria der Bronchien und in den Alveolarsepten teilweise in Form von Aggregaten gefunden. Intraepithelial konnten unterschiedliche Anzahlen von DCs dargestellt werden. Des Weiteren wurden Zellen mit dendritischer Morphologie auch in der Mukosa der Nase und des Kehlkopfes gefunden. Die größte Anzahl von DCs pro „high power field“
(HPF) wurde sowohl bei Welpen als auch ausgewachsenen Hunden in den primären Bronchien nachgewiesen, während in Nase, Kehlkopf, Segmentbronchien und Alveolarsepten weniger Zellen vorhanden waren. Wie auch in der Studie von HOLT (1993) bei Ratten ergab die morphometrische Analyse eine Abnahme der Zahl dendritischer Zellen mit zunehmender Aufteilung der Bronchien. Auch eine altersabhängige Zunahme der DCs, wie sie bei Ratten beschrieben wird (NELSON et al. 1994), wurde von PEETERS et al. (2005) beobachtet. In der Mukosa der Nase, des Kehlkopfes und der Bronchien waren mehr dendritische Zellen bei adulten Tieren festzustellen als in den gleichen Lokalisationen der Welpen.
2.1.5.4 Dendritische Zellen im Respirationstrakt des Pferdes
In den luftführenden Wegen erwachsener Pferde wurde immunhistochemisch intraepithelial in der Nähe zur Basalmembran und subepithelial in der Lamina propria mittels des klonalen Antikörpers CZ2.2+ eine geringe Anzahl CZ2.2+-dendritischer Zellen nachgewiesen (BANKS et al. 1999). Unterschiede zwischen Lungenlappen oder innerhalb eines Lappens konnten nicht festgestellt werden. Die von HOLT et al. (1989) eingeführte Tangentialschnitttechnik führte auch bei Pferden im Tangentialschnitt pro mm² Epithel zu einer größeren Zellzahl als im longitudinalen Schnitt. Im Vergleich zu adulten Tieren konnten in den Lungen von Feten keine CZ2.2+-dendritischen Zellen beobachtet werden. In der fetalen nasalen und trachealen Mukosa wurden dagegen vereinzelt DCs entdeckt (BANKS et al. 1999).
2.1.5.5 Dendritische Zellen im Respirationstrakt des Rindes
In der Lunge von über 4 Tage alten Kälbern bis über 3 Jahre alten Rindern wurden von ANDERSON et al. (1986a) im BALT mittels Elektronenmikroskopie diffus verstreut zwischen Lymphozyten liegende Zellen mit der Morphologie von dendritischen Zellen nachgewiesen. Des Weiteren stellte ANDERSON et al. (1986b) Nachforschungen über Immunglobulin-produzierende Zellen im Respirationstrakt von Rindern unterschiedlichen Alters an.
Darüber hinaus gibt es bislang keine publizierten Untersuchungsergebnisse über das Vorkommen und die Topographie von DCs im bovinen Respirationstrakt.
WERLING et al. (2002) stellten Nachforschungen über die Produktion von Chemokinen durch bovine DCs nach Exposition mit dem Bovinen Respiratorischen Synzytialvirus (BRSV) an. Dabei wurden mit einer RTPCR (Real-Time Polymerase Chain Reaction) folgende Chemokine nachgewiesen: RANTES, MIP-1α (Macrophage Inflammatory Protein), MIP-2α, MIP-3α, MCP-2 (Membran-Cofaktor Protein) und CCR3. Diese Chemokine führten alle zu einer verstärkten Wanderung peripherer Blutlymphozyten. Eine T-Zell-Proliferation mit erhöhter T-Zell-Antwort durch BRSV-aktivierte DCs wurde allerdings nur durch Zusatz der Chemokine Eotaxin oder MIP-1α erreicht.
2.1.5.6 Dendritische Zellen im infizierten Respirationstrakt von Mensch und Tier
Da dendritische Zellen einen zentralen Verbindungspunkt zwischen der angeborenen und der erworbenen Immunität darstellen, führen Fehlfunktionen dieser Zellen zu einer erhöhten Erkrankungsrate und werden als Ursache für zahlreiche Immundefizienzerkrankungen diskutiert. Veränderungen der DCs betreffen ihre Anzahl und ihre Morphologie. Die Ursache hierfür ist in ihrer Rolle als immunogene Zelle begründet und liegt einer abnormalen funktionellen Immunantwort der DCs als Teil des pathologischen Geschehens zugrunde.
Bei zahlreichen Erkrankungen des Respirationstraktes werden erhöhte Zahlen dendritischer Zellen gefunden. Dies ist z. B. bei Asthma, durch Blütenpollen oder Staub ausgelöste Allergien (DE HEER et al. 2004), obliterierender Bronchiolitis, desquamativer interstitieller Pneumonie, diffuser Panbronchiolitis, pulmonaler Histiozytose X, aber auch bei der pulmonalen Sarkoidose mit erhöhter T-Helferzellaktivierung der Fall (HOLT 1993;
LAMBRECHT et al. 1996; MASSARD et al. 1996; TODATE et al. 2000). Auch in den Lungen von Rauchern können erhöhte Zahlen von DCs gefunden werden. Inwiefern allerdings die DCs als Ursache für diese Erkrankungen durch fortlaufende Antigenpräsentation mit Stimulierung und Aufrechterhaltung der Immunantwort in Frage kommen, müssen weiterführende Studien klären. Bei Asthma konnte durch Therapie mit Glukokortikoiden die Antigenaufnahme dendritischer Zellen im Lungengewebe verringert und die Expression costimulierender Antigene sowie der Level der IL-12 Produktion reduziert werden und so eine Besserung der asthmatischen Beschwerden herbeigeführt werden (LAMBRECHT et al. 1996).
In anderen Fällen führt eine Infektion dendritischer Zellen zu Störungen im Ablauf der Immunantwort. Dendritische Zellen verhalten sich gegen eine Reihe von Viren resistent (z.B.
Bovine Virusdiarrhö, Influenza-Virus). Das Parainfluenza-Virus löst allerdings Apoptose dieser Zellen aus, während das Vaccinia-Virus den Reifungsprozess von DCs unterbindet und die CD8-T-Zell-Antwort verhindert (GLEW et al. 2003). Das Masern-Virus infiziert ähnlich wie das humane Immundefizienzvirus (HIV) bevorzugt respiratorische dendritische Zellen, in denen es sich vermehrt und bei Kontakt zu T-Zellen bei beiden Apoptose auslöst (PEEBLES und GRAHAM 2001). Als Wirt dienen DCs diesen Viren als sicheres Versteck und
Transportvehikel zu den sekundären Lymphorganen und können in einem klinisch latenten Stadium über lange Zeit überleben (GLEW et al. 2003; LAMBRECHT et al. 1996).
Die Durchführung von Lungentransplantationen stellt eines der wichtigsten Forschungsgebiete für das immunologische Verständnis von Abstoßungsreaktionen des Wirtes dar. In Studien von nach Lungentransplantation an Bronchiolitis verstorbenen Patienten wiesen die Bronchien subepithelial im Vergleich zu respiratorisch gesunden Patienten erhöhte dendritische Zellinfiltrate auf. Studien an Ratten mit Transplantaten haben gezeigt, dass ein Influx dendritischer Zellen vom Wirtsgewebe ausgeht. Ob eine spezifische Suppression der dendritischen Zellen eine Abstoßungsreaktion verhindern kann oder ob weitere Mechanismen dazu notwendig sind, bleibt weiteren Studien vorbehalten (MASSARD et al. 1996).
Dendritische Zellen werden aber auch als Mediatoren im therapeutischen Sinne zur Ankurbelung des Immunsystems diskutiert. Durch ihren Einfluss auf das adaptive Immunsystem wären sie ideal für die Herstellung von potentiellen zellulären Vakzinen, die lang anhaltende Immunität auslösen und die natürliche Immunität mimicken. In vitro-Studien mit Mäusen haben gezeigt, dass DCs, die mit dem Virus der lymphozytären Choriomeningitis, Chlamydia trachomatis, Pseudomonas aeruginosa oder Mycobacterium spp. aktiviert wurden, ausreichten, um Infektionen der Lunge durch nachfolgende Inokulationen mit lebenden Erregerstämmen erfolgreich abzuwehren (LAMBRECHT et al.
2001).
Auch in Tumoren der Lunge, wie dem Adenokarzinom und dem bronchioloalveolären Karzinom, wird eine erhöhte Infiltration dendritischer Zellen nachgewiesen, die Peptide dieser Tumore präsentieren (MASSARD et al. 1996; LAMBRECHT et al. 1996). Die Dichte der Infiltration der T-Zell-Zonen des BALTs mit dendritischen Zellen korreliert positiv mit der Überlebensrate der Patienten (WRIGHT-BROWNE et al. 1997). Die funktionelle Bedeutung und der sich eventuell aus diesem Wissen ergebende therapeutische Nutzen sind noch ungeklärt.
2.2 Mukosa–assoziiertes lymphatisches Gewebe
Ein wichtiger Teil des mukösen Immunsystems besteht aus organisierten lymphatischen Strukturen, die als Mukosa-assoziiertes lymphatisches Gewebe (MALT) bezeichnet werden.
Sie sind Ort der Antigenaufnahme, Präsentation und Initiation der Immunantwort (HILLER et al. 1997). Neben dem GALT, welches in Form von Peyerschen Platten entlang des Gastrointestinaltraktes auftritt, wurden ähnliche Strukturen im Respirationstrakt gefunden. In der Lunge entlang von Bronchien beschreiben BIENENSTOCK et al. (1973a, b) ein unter dem Begriff Bronchus-assoziiertes lymphatisches Gewebe (BALT) zusammengefasstes organisiertes lymphatisches Gewebe. In neueren Studien an verschiedenen Tierspezies und beim Menschen können im Nasopharynx ein sogenanntes Nasal-assoziiertes lymphatisches Gewebe (NALT) und im Larynx und in der Trachea ein Larynx-/Trachea-assoziiertes lymphatisches Gewebe (LTALT) nachgewiesen werden (MAIR et al. 1987; CHEN et al.
1989; HILLER et al. 1997).
Für den Respirationstrakt des Rindes gibt es nur wenige publizierte Untersuchungsergebnisse über das MALT (ALLAN et al. 1979; ANDERSON et al. 1986a, 1986b).
2.2.1 Bronchus-assoziiertes lymphatisches Gewebe (BALT)
BALT wurde in der Lunge einer Vielzahl von Säugetierspezies inklusive Mensch, sowie von Huhn und Schildkröte gefunden, so dass es als weit verbreitet innerhalb der Vertebraten aufgefasst werden kann (SMINIA et al. 1989). Die Grundstruktur besteht bei allen bislang untersuchten Tierarten im wesentlichen aus vier Bereichen: einer follikelartigen Akkumulation von überwiegend B-Lymphozyten, die mit der Bildung von Keimzentren einhergehen kann, einem parafollikulären Bereich mit überwiegend T-Lymphozyten, einem
„Dome area“ unmittelbar unterhalb des Epithels, in dem dendritische Zellen vorkommen, und dem über dem BALT liegenden abgeflachten, zilienlosen Epithel ohne Becherzellen, das analog zu den Peyerschen Platten als Lymphepithel bezeichnet wird und welches stark von Lymphozyten infiltriert ist (BIENENSTOCK et al. 1973; SMINIA et al. 1989). In der Peripherie sind postkapilläre Venolen, sogenannte „high endothelial venules“ (HEV) zu finden, durch die Lymphozyten in das BALT einwandern. Daneben befinden sich efferente Lymphgefäße, die ein Abwandern der Lymphozyten ermöglichen (TSCHERNIG und PABST
2000), sowie Nervenbahnen (PABST 1997). Im Allgemeinen kann das BALT zwischen einem Bronchus oder Bronchiolus und einem arteriellen Gefäß lokalisiert gefunden werden.
Es kommt im gesamten Bronchialtrakt vor, kann aber häufiger in der Nähe von Bifurkationsstellen nachgewiesen werden (SMINIA et al. 1989).
Obwohl das BALT der Lunge immer wieder mit dem GALT des Gastrointestinaltraktes verglichen wird, bestehen Unterschiede hinsichtlich des typischen Aufbaus in einer Reihe von Spezies. Die T- und B-Lymphozyten bleiben in ihrem Auftreten nicht nur auf die oben beschriebenen Lokalisationen beschränkt. Des Weiteren gibt es im BALT keine typischen, auf die Aufnahme von bestimmten Antigenen spezialisierten M-Zellen. Ein Auftreten von Keimzentren, wie es für das GALT üblich ist, trifft nicht regelmäßig und speziesübergreifend für das BALT zu (PABST und GEHRKE 1990; PABST und BINNS 1994).
Hinsichtlich der Entwicklung und der Organisation des BALTs bestehen große Unterschiede auch innerhalb der verschiedenen Tierarten. So kommt bei der Ratte über den BALT- Follikeln neben Lymphepithel auch unverändertes Bronchialepithel vor (GREGSON et al.
1979 b). Pferd, Schaf und Rind weisen BALT auch als fokale Lymphozytenansammlung ohne follikuläre Organisation auf (MAIR et al. 1987; CHEN et al. 1989; ANDERSON et al.
1986a). Daneben hängt die Entwicklung des BALTs innerhalb einer Spezies anscheinend stark von der jeweiligen Antigenbelastung ab, welcher das Tier bzw. der Mensch ausgesetzt ist (SMINIA et al. 1989).
PABST und GEHRKE (1990) finden in Lungen von über 3 Monate bis 99 Jahre alten Menschen kein BALT, nur in einem sechs Monate alten Kind kann ein einzelner Lymphfollikel ohne assoziierten Bronchus nachgewiesen werden. Die Autoren schließen daraus, dass BALT in der Lunge von gesunden Menschen, die einem täglichen Antigenkontakt ausgesetzt sind, nicht präsent ist (PABST 1992). In späteren Studien an gesunden Lungen von Kindern, Jugendlichen und Erwachsenen kann jedoch bei einem Teil der bis zu 20 Jahre alten Patienten BALT festgestellt werden, welches eine ähnliche Morphologie aufweist wie das anderer Spezies (TSCHERNIG und PABST 2000). Durch Rauchen und andere mikrobielle Stimuli (Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae) kann beim Menschen verstärkt BALT gebildet werden. Außer in pneumonisch erkrankten Lungen wie bei der Diffusen Panbronchiolitis (TODATE et al. 2000) und bei anderen Lungenerkrankungen wie der Zystischen Fibrose oder der Bronchiektasie
