Aus dem Institut für Pathologie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Nachweis von Mycoplasma bovis in der Lunge von experimentell infizierten Kälbern mittels in situ-Hybridisierung
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin
Björn Jacobsen
Hannover 2006
Verlag: DVG-Service GmbHFrankfurter Straße 89 · 35392 Gießen
Telefon (06 41) 2 44 66 · Telefax (06 41) 2 53 75 · E-mail: info@dvg.net · http://www.dvg.net
ISBN 3-939902-10-1
Björn Jacobsen 2006 M. bovis ISH
1. Auflage 2006
© 2006 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen Printed in Germany
ISBN 3-939902-10-1
Verlag: DVG Service GmbH Frankfurter Straße 89
35392 Gießen 0641/24466 info@dvg.net
www.dvg.net
Aus dem Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Nachweis von Mycoplasma bovis in der Lunge von experimentell infizierten Kälbern
mittels in situ-Hybridisierung
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Björn Andreas Jacobsen aus Husum/Nordsee
Hannover 2006
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Peter Valentin-Weigand
Tag der mündlichen Prüfung: 15.11.2006
Diese Arbeit wurde gefördert durch ein Stipendium der Friedrich-Ebert-Stiftung e. V., Bonn
Eigentlich ist alles gleichgültig, wenn man Menschen hat, die man liebt.
Peter Iljitsch Tschaikowsky
Meiner Familie
Teile der hier vorliegenden Arbeit wurden bereits als Kongressbeitrag präsentiert:
B. Jacobsen, W. Jechlinger, M. Zimmermann, J. Spergser, R. Rosengarten, M. Hewicker-Trautwein (2006):
Detection and Localisation of Mycoplasma bovis in Lungs of Experimentally Infected Calves by in situ-Hybridization.
16. internationaler Kongress der IOM (International Organization for Mycoplasmology), 09.-14.06.2006, Cambridge, UK
Inhaltsverzeichnis I
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung...1
2 Literaturübersicht ...3
2.1 Mykoplasmen...3
2.1.1 Charakteristika und Taxonomie ...3
2.1.2 Pathogenitätsmechanismen bei Mykoplasmen ...5
2.1.3 Mykoplasmen als Krankheitserreger...6
2.2 Mykoplasmosen des Rindes ...8
2.2.1 Lungenseuche ...8
2.2.2 Mycoplasma bovis...8
2.2.3 Sonstige Infektionen mit Mykoplasmen beim Rind...8
2.3 Mycoplasma bovis...9
2.3.1 Verbreitung ...9
2.3.2 Erkrankung des Respirationstraktes ...10
2.3.3 Weitere Erkrankungen durch Mycoplasma bovis...15
2.3.4 Immunantwort ...17
2.3.5 Antigen- und Phasenvariation ...17
2.3.6 Immunprophylaxe ...19
2.3.7 Therapie...19
2.3.8 Diagnostik zum Erregernachweis...20
2.4 In situ-Hybridisierung ...20
2.4.1 Methode...20
2.4.2 Anwendung...21
3 Material und Methoden ...23
3.1 Kälber...23
3.1.1 Gruppe 1 (Kontrollgruppe) ...23
3.1.2 Gruppe 2...23
3.1.3 Gruppe 3...25
3.1.4 Gruppe 4...27
3.2 Pathologisch-anatomische Untersuchung der Lungen...28
3.3 Lungengewebeproben ...29
3.4 Histochemische Färbemethoden ...30
3.4.1 Übersichtsfärbung mit Hämatoxylin und Eosin...30
3.4.2 Azanfärbung nach Heidenhain...31
3.4.3 Siriusrot-Färbung F3B Technik... 32
3.5 In situ-Hybridisierung... 32
3.5.1 Sondensynthese... 32
3.5.2 Primer... 33
3.5.3 PCR... 33
3.5.4 Sondentests ... 34
3.5.5 Durchführung der in situ-Hybridisierung ... 35
3.5.6 Chromogen... 35
3.5.7 Kontrollmaterial ... 36
3.5.8 Protokoll für die in situ-Hybridisierung ... 36
3.5.9 Kontrolle der endogenen Peroxidasen ... 38
3.5.10 Auswertung ... 38
3.6 Immunhistochemie ... 38
3.6.1 Antikörper ... 38
3.6.2 Chromogen... 39
3.6.3 Kontrollen ... 39
3.6.4 Protokoll für die Immunhistochemie mit MAB970 ... 39
3.6.5 Auswertung ... 41
3.7 Befunderhebung und Auswertung der Daten ... 41
4 Ergebnisse ... 43
4.1 Ergebnisse der Sondentestung ... 43
4.1.1 Nachweis von Mycoplasma bovis-DNA im Southern Blot ... 43
4.1.2 Spezifitätstest ... 44
4.2 Histopathologische Ergebnisse ... 44
4.2.1 Gruppe 1 (Kontrollgruppe)... 44
4.2.2 Gruppe 2 ... 45
4.2.3 Gruppe 3 ... 45
4.2.4 Gruppe 4 ... 47
4.2.5 Zusammenfassung... 48
4.3 Ergebnisse der in situ-Hybridisierung ... 48
4.3.1 Gruppe 1 (Kontrollgruppe)... 48
4.3.2 Gruppe 2 ... 49
4.3.3 Gruppe 3 ... 49
Inhaltsverzeichnis III
4.3.4 Gruppe 4...51
4.3.5 Zusammenfassung ...53
4.4 Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchung ...53
4.4.1 Gruppe 1 (Kontrollgruppe) ...53
4.4.2 Gruppe 2...54
4.4.3 Gruppe 3...54
4.4.4 Gruppe 4...56
4.4.5 Zusammenfassung ...58
4.5 Fotographische Dokumentation ...58
5 Diskussion ...67
5.1 Histopathologische Befunde ...67
5.2 Die Methode der in situ-Hybridisierung ...72
5.3 Ergebnisse der in situ-Hybridisierung...74
5.4 Persistenz von Mycoplasma bovis...77
5.5 Immunhistochemie ...79
5.6 Diagnostik ...81
5.7 Schlussfolgerung ...82
6 Zusammenfassung ...83
7 Summary...87
8 Literaturverzeichnis ...89
9 Anhang...107
9.1 Ergebnisse der Gruppen 1 bis 4 in tabellarischer Form ...107
9.2 Lösungen für die Azanfärbung nach Heidenhain ...109
9.3 Siriusrot-Farblösung...110
9.4 Lösungen für die Sondensynthese und- spezifizierung...110
9.5 Lösungen für die in situ-Hybridisierung ...111
9.6 Lösungen für die Immunhistochemie ...115
9.7 Bezugsquellen für Chemikalien...115
9.8 Bezugsquellen für Geräte und Einmalartikel ...118
Abkürzungsverzeichnis I
Abkürzungsverzeichnis
A Adenin
Abb. Abbildung
AP alkalische Phosphatase
Aqua bidest. Aqua bidestillata Aqua dest. Aqua destillata
BALF bronchioalveoläre Lavage-Flüssigkeit
BALT engl. bronchus-associated lymphoid tissue (Bronchus- assoziiertes lymphatisches Gewebe)
BCIP 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat Best. Nr. Bestellnummer
bp engl. basepairs (Basenpaare)
BRSV bovines respiratorisches Synzytialvirus
BSA bovines Serumalbumin
BVDV bovines Virusdiarrhoe-Virus
bzw. beziehungsweise
ca. circa
C Cytosin
°C Grad Celsius
CD engl. cluster of differentiation (System zur Bezeichnung von Leukozytendifferenzierungsantigenen)
CFU engl. colony forming units (koloniebildende Einheiten)
d lat. dies (Tage)
DAB 3,3’-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid
d. h. das heißt
DIG Digoxigenin
DNA engl. deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
ELISA engl. enzyme-linked immunosorbent assay (Enzym gekoppeltes, immunologisch-adsorbierendes Nachweisverfahren)
engl. englisch
et al. lat. et alii (= und andere)
Fa. Firma
g Gramm
G Guanin
grie. griechisch
HE Hämatoxylin-Eosin
IHC Immunhistochemie
ISH in situ-Hybridisierung
kbp Kilobasenpaare
kDa Kilo Dalton
lat. lateinisch
M Molarität
mg Milligramm
ml Milliliter
mm Millimeter
µl Mikroliter
µm Mikrometer
M. Mycoplasma
Min. Minuten
n Anzahl
N Normalität
N. N. lat. nomen nescio (nicht bekannt)
Nr. Nummer
p. a. lat. pro analysis (für analytische Zwecke) p. i. lat. post infectionem
PBS engl. phosphate-buffered saline (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung)
PCR engl. polymerase chain reaction (Polymerase- Kettenreaktion)
RNA engl. ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)
SC small colony
SPF spezifiziert pathogenfrei
spp. lat. species
subsp. Subspezies
T Thymin
Tab. Tabelle
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
U Uracil
u. und
Vlp engl. variable lipoprotein (variables Lipoprotein) Vsa engl. variable surface antigen (variables
Oberflächenantigen)
Vsp engl. variable surface protein (variables Oberflächenprotein)
z. B. zum Beispiel
Einleitung 1
1 Einleitung
Mycoplasma (M.) bovis ist neben M. mycoides subsp. mycoides die wichtigste pathogene Mykoplasmenart des Rindes, die weltweit auftritt und zunehmend an Bedeutung gewinnt. Die häufigsten Erkrankungen durch M. bovis sind hierbei Pneumonien und Arthritiden bei Kälbern und Mastitiden bei Kühen. Durch die Erkrankungen entstehen Verluste, die gerade bei der Pneumonie der Kälber zu großen wirtschaftlichen Schäden führen. Meist handelt es sich um therapieresistente Erkrankungen des Respirationstraktes, für die zur Zeit noch kein zufrieden stellender Impfschutz erhältlich ist.
Ziel dieser Arbeit war es, neben der histopathologischen Beschreibung von Lungenveränderungen bei experimentell infizierten Kälbern die Methode der in situ- Hybridisierung für M. bovis an Formalin-fixiertem und Paraffin-eingebettetem Lungengewebe von diesen Kälbern zu etablieren. Dabei sollten die Verteilung und die Lokalisation der DNA analysiert und mit immunhistochemischen Befunden korreliert werden. Hierfür wurden Paraffinschnitte aus den Lungen experimentell infizierter Kälber untersucht. Die verwendeten spezifischen Sonden detektierten die Sequenz des Gens von VspA, einem variablen Oberflächenprotein (engl. variable surface protein) von M. bovis. Frühere Untersuchungen zeigten, dass M. bovis diverse variable Oberflächenproteine exprimiert. Es wird diskutiert, ob diese durch eine Antigenvariation an der Persistenz des Erregers im Respirationstrakt beteiligt bzw. für die fehlende Elimination desselben mitverantwortlich sind. Dabei war es von besonderem Interesse, ob in den verschiedenen Gewebelokalisationen, in denen immunhistochemisch Vsp-Antigene nachweisbar waren, auch die genomische Sequenz des VspA von M. bovis aufgefunden werden kann.
Literaturübersicht 3
2 Literaturübersicht
2.1 Mykoplasmen
2.1.1 Charakteristika und Taxonomie
Die erste Mykoplasmenspezies wurde 1896 von NOCARD und ROUX (1896) beschrieben. Hierbei handelte es sich um Mycoplasma (M.) mycoides subsp.
mycoides small colony (SC), dem Erreger der kontagiösen Pleuropneumonie beim Rind. Seither wurden über 100 Mykoplasmenarten dokumentiert, welche sowohl aus warm- und kaltblütigen Wirbeltieren als auch aus Insekten und Pflanzen sowie Abwässern isoliert wurden (BOONE et al. 2001). Taxonomisch werden die Mykoplasmen in die Klasse der Mollicutes (lat. mollis – weich, cutis – Haut) eingeordnet. Hier werden vier Ordnungen unterschieden (Tabelle 1). Im Gegensatz zu anderen Bakterien besitzen die Mykoplasmen keine Zellwand (RAZIN 1992).
Dieses führt zum einen zu einer pleomorphen Gestalt der 0,3 bis 0,8 µm großen Bakterien (RAZIN 1978). Zum anderen bedingt sich dadurch eine natürliche Resistenz gegenüber Antibiotika, die in die Zellwandsynthese eingreifen, wie beispielsweise β-Laktam-Antibiotika. Auf Grund ihrer geringen Größe und der Pleomorphie sind Mykoplasmen in der Lage, Bakterienfilter mit einer Porengröße von 0,45 µm zu passieren. Hierauf basierte die ursprüngliche Annahme zu Beginn des 20. Jahrhunderts, es handele sich um Viren (MASOVER u. HAYFLICK 1985; RAZIN 1992). Mykoplasmen sind unter bestimmten Bedingungen in der Lage, verzweigte und unverzweigte, bis 150 µm lange Filamente auszubilden. Dieses pilzartige Wachstum führte zu der Namensgebung (grie. myco – Pilz, plasma – Form) (RAZIN 1981). Ihrer geringen Größe entsprechend, besitzen Mykoplasmen das kleinste Genom prokaryotischer Bakterien mit 600 bis 1350 kbp je nach Spezies und Stamm.
Daraus resultiert eine im Vergleich zu beispielsweise Escherichia coli auf ein Fünftel verminderte Genausstattung (RAZIN 1992). Eine Besonderheit der Mykoplasmen ist es, dass das Genom einen erstaunlich geringen Anteil an Guanin und Cytosin aufweist (DYBVIG u. VOELKER 1996).
Tabelle 1: Taxonomie und Eigenschaften der Klasse Mollicutis (modifiziert nach TULLY et al. 1993 und BOONE et al. 2001)
Klassifizierung (Anzahl bekannter Spezies)
G/C- Gehalt (in mol%)
Genom- größe
(in kbp) Vorkommen 1. Ordnung: Mycoplasmatales
Familie: Mycoplasmataceae 1. Gattung: Mycoplasma (112) 2. Gattung: Ureaplasma (7)
23-40 27-30
600-1350 760-1170
Mensch, Tier Mensch, Tier 2. Ordnung: Entomoplasmatales
1. Familie: Entomoplasmataceae 1. Gattung: Entomoplasma (6) 2. Gattung: Mesoplasma (12) 2. Familie: Spiroplasmataceae Gattung: Spiroplasma (34)
27-29 27-30
25-30
790-1140 870-1100
940-2200
Insekten, Pflanzen Insekten, Pflanzen
Insekten, Pflanzen 3. Ordnung: Acholeplasmatales
Familie: Acholeplasmataceae
Gattung: Acholeplasma (14) 26-30 1500-1650
Tiere, Pflanzen, Insekten
4. Ordnung: Anaeroplasmatales Familie: Anaeroplasmataceae 1. Gattung: Anaeroplasma (4) 2. Gattung: Asteroleplasma (1)
29-30 40
1500-1600 1500
Pansen Rd. & Schf.
Pansen Rd. & Schf.
G: Guanin, C: Cytosin, kbp: Kilobasenpaare, Rd.: Rind, Schf.: Schaf
Das Genom entstand während der Evolution wahrscheinlich aus einer Reduktion ehemals Gram-positiver Bakterien (WOESE 1987). Dadurch haben Mykoplasmen eingeschränkte Stoffwechsel- und Biosynthesewege, die eine überwiegend parasitäre Lebensform bedingen (RAZIN 1992). Diese führt auch zu einigen Problemen bei der Kultivierung der anspruchsvollen Mykoplasmen, die nur durch
Literaturübersicht 5
spezielle Nährmedien gewährleistet werden kann (RAZIN 1978). Auf festen Nährböden zeigen Mykoplasmen ein charakteristisches Wachstum in Form von Spiegelei-förmigen Kolonien von bis zu 600 µm Durchmesser, deren Zentrum durch das Einwachsen der Zellen in den Agar dunkler als die Peripherie erscheint (HAYFLICK 1969). Die meisten Mykoplasmenspezies sind unbeweglich. Bei einigen Arten konnte jedoch eine aktive, gleitende Bewegung nachgewiesen werden (KIRCHHOFF 1982).
2.1.2 Pathogenitätsmechanismen bei Mykoplasmen
Mykoplasmen besitzen als anspruchsvolle Mikroorganismen eine ausgesprochene Wirts- und Speziesspezifität (BREDT 1976a). Sie besiedeln als Kommensale oder Parasit überwiegend Schleimhautoberflächen des Respirations- und Urogenitaltraktes, aber auch Augen, Gelenke, Milchdrüse und andere Organe.
Hierbei nutzen sie Kapsel- und Adhärenzstrukturen, die zu einer engen Anlagerung der Mykoplasmen zur Wirtszellmembran führt (RAZIN u. JACOBS 1992; SACHSE et al. 1996). Einige Mykoplasmen des Menschen und der Tiere sind auch in der Lage, in die Wirtszelle einzudringen (LO et al. 1992), wie es schon länger für die Mykoplasmen der Insekten und Pflanzen bekannt war. Diese Eigenschaft findet sich zum Teil auch in den Namen neu dokumentierter Arten wie M. penetrans des Menschen wieder. Da sie keine Zellwand besitzen, sind sie durch gegen Bakterien gerichtete lysosomale Enzyme des Wirtes nicht angreifbar (BREDT 1976a). Des Weiteren vermögen sie durch Nährstoffentzug und Stoffwechselprodukte wie Wasserstoffperoxid und Ammoniak zu einer Schädigung des Wirtes zu führen (RAZIN 1981). Eine weitere Besonderheit ist die Fähigkeit der Mykoplasmen, die wirtseigene Abwehr zu unterlaufen. Hierzu zählt zum einen die Hemmung ziliarer Aktivitäten im Respirationstrakt (GABRIDGE et al. 1985). Zum anderen sind einige Mykoplasmen in der Lage, in Form einer molekularen Mimikry eine Angleichung der antigenen Strukturen an den Wirt zu erlangen, so dass bei einer Abwehrreaktion des Wirtes eine Autoimmunreaktion hervorgerufen werden kann (TANGEN u.
KIRCHHOFF 1995). Zudem zeigen einige Mykoplasmen eine ausgeprägte Variabilität in den Oberflächenproteinen, die zu einer ständigen Änderung der
antigenen Strukturen führt, wie sie beispielsweise für M. hyorhinis und M. bovis beschrieben sind (ROSENGARTEN u. WISE 1991; ROSENGARTEN et al. 1994).
Zusätzlich ist für einige Mykoplasmenspezies eine Suppression von neutrophilen Granulozyten, Lymphozyten und Makrophagen beschrieben (ALMEIDA et al. 1992;
BENNET u. JASPER 1977; THOMAS et al. 1991). Die im Rahmen einer Infektion mit Mykoplasmen entstehenden Läsionen werden möglicherweise eher durch die Abwehrmechanismen des Wirtes verursacht, als durch eine Mykoplasmen-vermittelte Zerstörung von Gewebe (BREDT 1976b).
2.1.3 Mykoplasmen als Krankheitserreger
Mykoplasmen treten bei fast allen Spezies meist als Kommensalen auf. Es sind aber auch verschiedene pathogene Arten beschrieben, wobei der Schweregrad der Erkrankung von zahlreichen äußeren Einflüssen abhängt. Dadurch werden viele Mykoplasmosen zu den so genannten Faktorenerkrankungen gezählt (KIRCHHOFF u. RUNGE 1998). Ursprünglich ging man von einer extremen Wirtsspezifität der Mykoplasmen aus. Doch gibt es zunehmend Beschreibungen von Isolierungen aus
„wirtsfremden“ Tieren. Dieses als „crossing“ bezeichnete Wechseln der Wirte hat eine besondere Bedeutung bei Fällen von immunsupprimierten Patienten (PITCHER u. NICHOLAS 2005).
In der Schweinehaltung ist M. hyopneumoniae weit verbreitet. Dieser führt als alleiniger Erreger zu einer interstitiellen meist subklinisch verlaufenden Pneumonie mit Vermehrung des Bronchus-assoziierten lymphatischen Gewebes (engl.
bronchus-associated lymphatic tissue, BALT). Durch die hierdurch beeinträchtigte Abwehrleistung der Lunge kommt es in der Regel zu einer sekundären bakteriellen Infektion, meist mit Bordetellen, Pasteurellen, aber auch Streptokokken und Hämophilus parasuis. Daraus ergibt sich das Bild der enzootischen Pneumonie (MAES et al. 1996; KIRCHHOFF u. RUNGE 1998).
Als weitere pathogene Mykoplasmenart beim Schwein wäre M. hyorhinis als Erreger von respiratorischen Erkrankungen, Polyserositiden und Arthritiden zu nennen.
Arthritiden werden auch durch Infektionen mit M. hyosynoviae hervorgerufen (KIRCHHOFF u. RUNGE 1998). Eperythrozoon suis, der Erreger einer
Literaturübersicht 7
hämolytischen Anämie beim Schwein, wurde als M. haemosuis nachträglich in das Genus der Mykoplasmen eingruppiert (NEIMARK et al. 2001).
Schafe und Ziegen entwickeln nach einer Infektion mit M. mycoides subsp. capri eine kontagiöse Pleuropneumonie mit ähnlichem Krankheitsbild wie beim Rind.
Respiratorische Entzündungen werden ebenfalls durch M. ovipneumoniae und M.
capricolum subsp. capripneumoniae verursacht (KIRCHHOFF u. RUNGE 1998). M.
agalactiae führt zu dem Krankheitsbild der kontagiösen Agalaktie, ist aber auch in der Lage, entzündliche Veränderungen an Gelenken, Augen und Urogenitaltrakt zu verursachen (KIRCHHOFF u. RUNGE 1998).
An Ratten und Mäusen konnten durch experimentelle Infektionen mit M. arthritidis wertvolle Erkenntnisse über die Entwicklung von Polyarthritiden, wie sie auch beim Menschen vorkommen, gewonnen werden. Wie bei den oben genannten Tieren gibt es auch bei Ratte und Maus mit M. pulmonis eine Spezies, die zu einer Infektion des Respirationstraktes führt, wobei auch Arthritiden, Otitiden und Genitalinfektionen möglich sind (KIRCHHOFF u. RUNGE 1998).
Eine Besonderheit stellt die bei Mäusen durch M. neurolyticum verursachte Rollkrankheit dar. Hierbei werden die neuronalen Veränderungen durch ein Exotoxin des Erregers hervorgerufen (KIRCHHOFF u. RUNGE 1998).
Für die bei Katzen (M. felis), Hunden (M. canis und M. cynos) und Pferden (M.
equirhinis und M. equigenitalis) isolierten Arten ist die definitive pathogene Bedeutung noch unklar (KIRCHHOFF u. RUNGE 1998). Durch Neueingruppierung von Haemobartonella felis als M. haemofelis in die Art der Mykoplasmen findet sich eine für Katzen pathogene Art, welche zu einer hämolytischen Anämie führen kann (NEIMARK et al. 2001).
Beim Menschen haben Infektionen mit M. pneumoniae als Erreger von respiratorischen Erkrankungen große Bedeutung. Die ebenfalls beim Menschen nachgewiesenen Mykoplasmen M. genitalium, M. penetrans und M. fermentans führen zunehmend, vor allem bei Patienten mit Immunschwäche wie bei Infektionen mit dem humanen Immundefizienzvirus (HIV), zu ernst zu nehmenden Erkrankungen (DOMINGUES et al. 2005).
2.2 Mykoplasmosen des Rindes 2.2.1 Lungenseuche
Das Krankheitsbild der kontagiösen Pleuropneumonie (Lungenseuche), ist seit dem 18. Jahrhundert bekannt, allerdings gelang erst 1896 NOCARD und ROUX (1896) die Isolierung des Erregers und damit auch die Isolierung der ersten Mykoplasmenart. Der Erreger M. mycoides subsp. mycoides SC wurde 1929 das letzte Mal in Deutschland nachgewiesen. In West- und Südeuropa kommt es sporadisch zu Ausbrüchen, während die Erkrankung in Afrika und Asien trotz Impfmaßnahmen noch sehr verbreitet ist und zu hohen wirtschaftlichen Verlusten führt (KIRCHHOFF u. RUNGE 1998). Klinisch treten vor allem bei adulten Tieren respiratorische Symptome auf, wobei Kälber eher Arthritiden, Endokarditiden und Myokarditiden aufweisen. Es sind auch chronische, klinisch meist unauffällige Erkrankungen möglich, die für die Epidemiologie des Erregers von großer Bedeutung sind (KIRCHHOFF u. RUNGE 1998).
2.2.2 Mycoplasma bovis
Nach der Erstisolierung aus Milch Mitte der fünfziger Jahre in Schweden (ALSTRØM 1955) und der erstmaligen Beschreibung im Zusammenhang mit entzündlichen Veränderungen bei einem Mastitisausbruch in Connecticut/USA 1961 (HALE et al.
1962) konnte M. bovis im Laufe der Jahre in nahezu allen Ländern der Erde nachgewiesen werden. Wegen der Beteiligung an Mastitiden wurde der Erreger zunächst M. agalactiae var. bovis genannt. Auf Grund phänotypischer Charakterisierung und Nukleinsäure-Hybridisierung erfolgte eine Einteilung in eine eigene Spezies (ASKAA u. ERNØ 1976). Auf die Eigenschaften und die durch M.
bovis verursachten Erkrankungen wird in Kapitel 2.3 näher eingegangen.
2.2.3 Sonstige Infektionen mit Mykoplasmen beim Rind
Neben M. bovis werden auch M. dispar und M. bovirhinis aus den Lungen gesunder und erkrankter Rinder isoliert. Hierbei sind allerdings die beobachteten Veränderungen weniger stark ausgeprägt als bei Infektionen mit M. bovis (DUNGWORTH 1993). Da M. bovirhinis bei bis zu 40% gesunder Kälber
Literaturübersicht 9
beispielsweise in Norddeutschland aus dem Nasenraum isoliert werden konnte, handelt es sich hierbei möglicherweise um eine apathogene Mykoplasmenart (KIRCHHOFF u. BINDER 1986). Zusätzlich konnten experimentell Pneumonien mit M. bovigenitalium verursacht werden; diese Spezies wird allerdings selten aus pneumonischem Lungengewebe isoliert (DUNGWORTH 1993).
Mastitiden können durch eine Vielzahl von Mykoplasmen beim Rind verursacht werden. Zu der ersten mit einer Entzündung des Euters in Zusammenhang gebrachten Art gehört M. bovigenitalium (STUART et al. 1963), wobei der Erreger auch zu Entzündungen im Genitaltrakt führen kann (KIRCHHOFF 1982). Ebenfalls zu den Erregern von Mastitiden werden M. canadense, M. alkalescens, M. arginini, M. dispar und M. californicum genannt (GONZALES u. WILSON 2003). Letztere Art wird auch im Zusammenhang mit Arthritiden beschrieben (HEWICKER-TRAUTWEIN et al. 2002). Da M. californicum auch Pneumonien verursachen kann, hat diese Art neben M. bovis eine große Bedeutung bei dem so genannten „Pneumonie-Arthritis- Syndrom“ der Kälber (SPERGSER et al. 2001; HEWICKER-TRAUTWEIN et al.
2002).
Bei der Infektiösen Bovinen Keratokonjunktivitis (IBK) wird M. bovoculi eine ätiologische Rolle zugesprochen, möglicherweise als Wegbereiter für eine Infektion mit Moraxella bovis (ERNØ u. PERREAU 1985).
2.3 Mycoplasma bovis 2.3.1 Verbreitung
M. bovis ist neben dem Erreger der Lungenseuche M. mycoides subsp. mycoides SC die für das Rind pathogenste Mykoplasmenart. M. bovis gilt als streng wirtsspezifisch, wobei allerdings neben dem Rind natürliche Infektionen bei Schafen beschrieben sind (PFÜTZNER u. SACHSE 1996). Experimentell können zudem Ziegen mit M. bovis infiziert werden (RODRÍGUEZ et al. 2000). Nach der Erstisolierung aus einem Mastitisfall 1961 (HALE et al. 1962) folgte ein Nachweis des Erregers, mutmaßlich verstärkt durch internationale Tiertransporte in vielen Staaten unter anderem auch in Deutschland im Jahr 1975 (WEHNERT et al. 1977). In einzelnen Regionen findet sich eine sehr unterschiedliche Prävalenz (NICOLET
1994), wobei zu berücksichtigen ist, dass M. bovis nicht bei allen Untersuchungen routinemäßig erfasst wird. Gerade bei den Lungenveränderungen treten sekundär Keime wie Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida und Histophilus somni (ehemals Haemophilus somnus, ANGEN et al. 2003) auf, die eine Infektion mit M.
bovis in den Hintergrund drängen (NICHOLAS u. AYLING 2003). Neuere Untersuchungen in verschiedenen Ländern Europas zeigen, dass eine zunehmende M. bovis-Prävalenz zu verzeichnen ist. So konnten KUSILUKA et al. (2000) in Dänemark einen Anstieg der M. bovis-Prävalenz innerhalb von fünf Jahren von 2%
auf 24% feststellen. In Irland und Nordirland, die bis Anfang der 90er Jahre des letzten Jahrhunderts als M. bovis frei galten (REILLY et al. 1993), konnten bei 18%
bzw. 15% der pneumonischen Kälberlungen M. bovis isoliert werden (BRICE et al.
2000; BYRNE et al. 2001). Untersuchungen von VOGEL et al. (2001) ergaben sogar eine M. bovis-Prävalenz von 69% in pneumonisch veränderten Lungen von Kälbern in der Schweiz. LE GRAND et al. (2001) konnten zeigen, dass in Frankreich 2% bis 13% der Tiere serologisch positiv für M. bovis waren. In Australien wiesen sogar 60%
der Tiere Antikörper gegen M. bovis auf (GHADERSOHI et al. 2005). Auf Grund jüngster Untersuchungen in den Niederlanden ist zu vermuten, dass 25% bis 30%
der Pneumonien beim Kalb primär durch M. bovis verursacht werden und dass daraus ein wirtschaftlicher Schaden von 45 bis 55 Euro pro Kalb in einem Milchviehbetrieb und sogar bis zu 117,50 Euro pro Kalb in einem Mastbetrieb entstehen (GEVAERT 2006). REEVE-JOHNSON (1999) schätzt den jährlichen Schaden durch M. bovis bedingte Pneumonien und damit einhergehende Verluste auf bis zu 576 Millionen Euro für den europäischen Raum. Epidemiologischen Untersuchungen zu Folge war der wesentliche Risikofaktor für eine Einschleppung von M. bovis in Milchviehbestände der Zukauf von Kälbern wie auch von Milchkühen (BURNENS et al. 1999). Trotz einer wachsenden Bedeutung wäre eine Eradikation möglich, solange wenige Tiere positiv sind, womit allerdings eine ständige serologische Kontrolle unabdingbar wäre (TER LAAK et al. 1992).
2.3.2 Erkrankung des Respirationstraktes
Die in der Lunge von Kälbern nach spontaner oder experimenteller Infektion mit M.
bovis beschriebenen Läsionen variieren zwischen interstitiellen pneumonischen
Literaturübersicht 11
Veränderungen, katarrhalisch-eitrigen Bronchopneumonien unterschiedlichen Ausmaßes bis hin zu schwerwiegenden Pneumonien, bei denen multiple Nekroseherde und obliterierende Bronchiolitiden im Lungenparenchym auftreten (THOMAS et al. 1975; GOURLAY et al. 1989; ADEGBOYE et al. 1995a;
RODRÍGUEZ et al. 1996a; HEWICKER-TRAUTWEIN et al. 2002; BUCHENAU 2003).
Bei M. bovis handelt es sich um einen Keim, der Infektionen mit anderen bakteriellen wie viralen Erregern durch eine Beeinträchtigung der Abwehrlage des Wirtes begünstigt (POUMARAT et al. 2001). BUCHVAROVA und VESSILINOVA (1989) zeigten durch Untersuchungen von Lungen an Pneumonie verendeter Kälber, dass ein Drittel eine alleinige Infektion mit M. bovis aufwies, während die verbliebenen zwei Drittel eine Kombination von M. bovis mit Pasteurella multocida und/oder Histophilus somni zeigten.
2.3.2.1 Spontaninfektionen
Kälber unterschiedlichen Alters sind empfänglich für eine respiratorische M. bovis- Infektion. Meist tritt diese in den betroffenen Betrieben enzootisch auf, wobei häufig zeitnah ein Auftreten von Mykoplasmenmastitiden bei Kühen zu beobachten ist (BOCKLISCH et al. 1983). Nach einer primär respiratorischen Infektion kann eine hämatogene Ausbreitung stattfinden (BOCKLISCH et al. 1983). Meist kommt es zwischen der ersten und dritten Lebenswoche zu den ersten Anzeichen einer respiratorischen Erkrankung in Form von Dyspnoe, Husten und Nasenausfluss.
Begleitend tritt häufig Fieber bis 41°C, Inappetenz und allgemeine Schwäche auf.
Das zeitnahe Auftreten von Gelenksentzündungen wurde von ROMVÁRY et al.
(1979) als „Pneumonie-Arthritis-Syndrom“ bezeichnet. Vereinzelt kommt es zu Todesfällen, in der Regel allerdings zu einer verminderten Gewichtszunahme (STIPKOVITS et al. 2000b). Die pathologisch-anatomischen Veränderungen variieren zwischen geringgradigen lobulär begrenzten katarrhalisch-eitrigen Bronchopneumonien in den Spitzenlappen, vorwiegend bei alleiniger Isolierung von M. bovis, bis hin zu schweren fibrinös-nekrotisierenden Pleuropneumonien, die große Teile der Lunge bis hin zu den kranioventralen Anteilen der Zwerchfellslappen betreffen (BOCKLISCH et al. 1983; STIPKOVITS et al. 2000b). Die interlobulären
Septen sind verdickt und weisen ein fibrinreiches Ödem auf, und aus den Bronchien ist ein muköses bis eitriges Exsudat abpressbar (STIPKOVITS et al. 2000b).
Schwere Infektionen sind meist Folge einer Mischinfektion mit beispielsweise Pasteurellen (BOCKLISCH et al. 1983). Bei der histologischen Untersuchung des Lungengewebes zeigt sich das Bild einer exsudativen Bronchopneumonie mit z. T.
zerfallenden neutrophilen Granulozyten, mononukleären Entzündungszellen und fibrinreicher Ödemflüssigkeit in Alveolen und Bronchioli. Durch Zellinfiltrate und Ödeme sind auch die alveolären Septen erweitert und verdickt (THOMAS et al. 1975;
GOURLAY et al. 1989; RODRÍGUEZ et al. 1996a; STIPKOVITS et al. 2000b).
Verschiedene Autoren beschrieben eine nekrotisierende Bronchiolitis sowie fokale Koagulationsnekrosen mit amorphem eosinophilen Material im Zentrum, umgeben von einem schmalen Saum pyknotischer Zellkerne (meist von neutrophilen Granulozyten) und einer breiten Schicht aus überwiegend mononukleären Entzündungszellen (GOURLAY et al. 1989; ADEGBOYE et al. 1995a; RODRÍGUEZ et al. 1996a). KHODAKARAM-TAFTI und LÓPEZ (2004) beschrieben zwei unterschiedliche Formen von Nekrosen, die sie bei Kälbern mit natürlicher Infektion fanden. Zum einen fand sich eine Koagulationsnekrose mit noch erkennbaren alveolären Strukturen mit Massen von neutrophilen Granulozyten und Fibrin. Zum anderen war eine verkäsende Form der Nekrose ohne erkennbare Lungenstruktur mit umgebendem Granulationsgewebe nachweisbar, wobei beide Nekroseformen zeitgleich in der Lunge eines Tieres vorkamen.
2.3.2.2 Experimentelle Infektionen
Durch die endobronchiale bzw. intratracheale Infektion drei bis sieben Wochen alter gnotobiotischer Kälber mit einem bei einem Ausbruch respiratorischer Erkrankungen in England isolierten Stamm bewiesen GOURLAY et al. (1976) die Pathogenität von M. bovis im Lungengewebe. Seitdem wurde eine Vielzahl von Infektionsversuchen durchgeführt, welche die Pathogenität und deren Mechanismen von M. bovis erhellen sollten. Hierbei gab es zum einen Arbeitsgruppen, die Versuche an gnotobiotisch gehaltenen Kälbern durchführten (THOMAS et al. 1986; HOWARD et al. 1987a). Andere Gruppen griffen auf konventionell gehaltene Kälber zurück (MARTIN et al. 1983; PFÜTZNER et al. 1983; BRYS et al. 1989; STIPKOVITS et al.
Literaturübersicht 13
2000a). Für die Versuche wurden jeweils aus natürlichen Infektionen stammende Feldisolate verwendet. Diese wurden entweder intratracheal, endobronchial, intranasal oder mittels eines Sprays im Abstand von 10 cm vor der Nase appliziert.
Die Tötung der Tiere erfolgte nach 10 bis 14 Tagen bzw. 21 Tagen nach der Infektion. Trotz des unterschiedlichen Versuchsaufbaus wurden ähnliche Ergebnisse erlangt. Wenige der Kälber zeigten klinische Symptome. Diese waren vorübergehende Pyrexie, Tachypnoe, Husten, Apathie und Lahmheit (GOURLAY et al. 1976; RODRÍGUEZ et al. 1996a). Meist blieben seröser, zum Teil auch mukopurolenter (BRYS et al. 1989) Nasenausfluss oder vorübergehendes Fieber das einzige Symptom (PFÜTZNER et al. 1983; RODRÍGUEZ et al. 1996a). Lediglich in den von STIPKOVITS et al. (2000a) durchgeführten Versuchen kam es zu einzelnen Todesfällen, die auf eine Sekundärinfektion mit Pasteurella multocida und damit einhergehender verstärkter Entzündungsreaktion zurückzuführen waren. Die anschließende Sektion der Tiere ergab auch bei klinisch gesunden Tieren eine Verfestigung des Lungenparenchyms, die bis zu 25% des Gewebes ausmachte.
Diese fand sich in der Regel in den Spitzen- und Mittellappen sowie im Lobus accessorius und wies nur bei stark veränderten Lungen eine Ausbreitung in die kranioventralen Bereiche der Hauptlappen auf (MARTIN et al. 1983). Histologisch zeigten Kälber mit geringen makroskopischen Veränderungen ein überwiegend aus neutrophilen Granulozyten zusammengesetztes entzündliches Exsudat in den Lumina von Bronchiolen. Um die Bronchien akzentuiert fand sich eine interstitielle Pneumonie sowie eine Proliferation der Lymphfollikel des BALT (MARTIN et al.
1983). Mit Zunahme der Entzündungsprozesse bei Tieren mit makroskopischen Veränderungen zeigten sich katarrhalische bis katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonien, die durch Einbeziehung von Nachbarläppchen konfluierend auftraten. Bei den Tieren mit den ausgeprägtesten Lungenveränderungen wurden lobuläre eitrige Bronchopneumonien mit Tendenz zur Einschmelzung, fibrinöse Exsudationen und Abszessbildung gefunden (MARTIN et al. 1983). Meist wurden in diesen Fällen außer M. bovis noch weitere Bakterien wie Mannheimia haemolytica aus den veränderten Arealen isoliert. Auch HOWARD et al. (1987a) und STIPKOVITS et al. (2000a) konnten bei den experimentell infizierten Kälbern
Koagulationsnekrosen unterschiedlicher Ausprägung nachweisen. Die zentralen Nekrosen wurden von einem schmalen Saum untergehender Zellen sowie einer sich daran anschließenden breite Schicht aus mononukleären Entzündungszellen umgeben. Gleichartige Nekrosen wurden auch von THOMAS et al. (1986) beschrieben, wobei hier in größeren Nekrosearealen Überreste von Alveolen und kleinen Bronchioli gefunden wurden, die als „ghost lung structures“ bezeichnet wurden. Eine Proliferation des peribronchiolären lymphatischen Gewebes wurde von allen Autoren in unterschiedlicher Ausprägung beschrieben. Diese führt zum Teil zu einer vollständig die Bronchien umgebenden Lymphozytenscheide, welche auch als
„cuff“-Bildung bezeichnet wird (BRYS et al. 1989). STIPKOVITS et al. (2000a) stellten zudem mikroskopisch Zilienverluste und degenerative Veränderungen zilientragender Zellen des Epithels der mit M. bovis infizierten Kälber fest.
2.3.2.3 Immunhistologische Befunde
In mehreren Untersuchungen wurde mittels immunhistochemischer Methoden M.
bovis-Antigen mit polyklonalen und monoklonalen Antikörpern nachgewiesen (THOMAS et al. 1986; HOWARD et al. 1987a; GOURLAY et al. 1989; ADEGBOYE et al. 1995a; RODRÍGUEZ et al. 1996a; LINKNER et al. 2000; BUCHENAU 2003;
KHODAKARAM-TAFTI u. LÓPEZ 2004). Gerade im Randbereich nekrotischer Veränderungen wurde mittels Immunperoxidase-Technik mit gegen M. bovis gerichtetem Kaninchenserum als primärer Antikörper Antigen nachgewiesen. Dieses lag in Assoziation zu den untergehenden Zellen oder extrazellulär (THOMAS et al.
1986; HOWARD et al. 1987a; GOURLAY et al. 1989; RODRÍGUEZ et al. 1996a). Die Darstellung von M. bovis-Antigen in der Umgebung von Nekrosearealen gelingt RODRÍGUEZ et al. (1996a, b) zudem mit einem monoklonalen Antikörper der Bezeichnung 5A10 sowie ADEGBOYE et al. (1995a) mit einem Antikörperpool aus drei monoklonalen Antikörpern aus Mäuseaszitesflüssigkeit (Bezeichnung der Klone:
MYB57, MYB87, MYB163), die mit dem M. bovis-Stamm M23 erzeugt wurden. Auch im Zentrum von Nekrosen konnten RODRÍGUEZ et al. (1996a) und HOWARD et al.
(1987a) M. bovis-Antigen darstellen. In den beiden Nekroseformen, die von KHODAKARAM-TAFTI und LÓPEZ (2004) beschrieben wurden, fanden sich in allen Bereichen der Nekrosen M. bovis-Antigen, wobei in der Koagulationsnekrose eine
Literaturübersicht 15
deutliche Akzentuierung im Randbereich vorhanden war. Im Bereich der Luftwege konnte M. bovis-Antigen im Exsudat im Bronchiallumen nachgewiesen werden (THOMAS et al. 1986; HOWARD et al. 1987a; GOURLAY et al. 1989; RODRÍGUEZ et al. 1996a). Aber auch Antigen in Form granulärer Strukturen in Bronchial- und Bronchiolarepithelzellen fanden ADEGBOYE et al. (1995a, b) mit einem monoklonalen Antikörperpool gegen M. bovis, GOURLAY et al. (1989) mit Kaninchenantiserum und RODRÍGUEZ et al. (1996a) mit einem monoklonalen Antikörper (Klon 5A10). RODRÍGUEZ et al. (1996a) konnten zudem bei experimentell infizierten Kälbern an der Oberfläche von Epithelzellen kleinerer Bronchien und Bronchiolen Antigen nachweisen. LINKNER et al. (2000) sowie BUCHENAU (2003) fanden in ihren Untersuchungen ähnliche Verteilungen von Antigen. Zusätzlich konnte hier M. bovis-Antigen im Bereich der Alveolarwände mittels monoklonaler Antikörper (1E5, 1A1, 4D7) nachgewiesen werden.
2.3.3 Weitere Erkrankungen durch Mycoplasma bovis
Durch eine hämatogene Streuung treten bei Kälbern im Gefolge von Pneumonien häufig Polyarthritiden auf, die durch schwerwiegende Nekrosen des Gelenkkapselgewebes mit zum Teil destruierenden Knorpel- und Knochenveränderungen gekennzeichnet sind (ROMVÁRY et al. 1979; CORBOZ et al. 1980; HEWICKER-TRAUTWEIN et al. 2003). Diesem Krankheitsbild wurde der Begriff „Pneumonie-Arthritis-Syndrom“ gegeben (ROMVÁRY et al. 1979). Die Veränderungen von meist fibrinopurulentem Charakter können sich auch auf die die Gelenke umgebenden Strukturen ausweiten und somit beispielsweise zu Tendovaginitiden führen (ADEGBOYE et al. 1996). GAGEA et al. (2006) diagnostizierten in einer Studie an natürlich mit M. bovis infizierten Kälbern bei 46%
der Tiere mit pneumonischen Lungen zusätzlich eine Arthritis. Einige Autoren beschreiben bei Kälbern mit entzündlichen Lungenveränderungen mit Nachweis von M. bovis eitrige Otitiden, aus denen ebenfalls M. bovis isoliert werden konnte (WALZ et al. 1997; MAEDA et al. 2003). STIPKOVITS et al. (1993) und AYLING et al. (2005) beschreiben den Nachweis von M. bovis aus entzündlich verändertem Gehirn bei Kälbern, und KINDE et al. (1993) wiesen M. bovis aus Dekubitalabszessen bei
Kälbern nach. Eine Keratokonjunktivitis kann ebenfalls Folge einer Infektion mit M.
bovis sein (KIRBY u. NICHOLAS 1996).
Bei Kühen kommt es durch eine aufsteigende Infektion durch den Zitzenkanal zu der enzootischen Mastitis, wobei subklinische Infektionen mit der Tendenz zur Persistenz relativ häufig auftreten (GONZALEZ u. WILSON 2003). Diese sind epidemiologisch ein kritischer Faktor, zumal durch den Melkvorgang als auch über mit kontaminierter Milch verschmutzte Liegeflächen ein Infektionsrisiko für die restlichen Tiere der Herde gegeben ist (PFÜTZNER u. SACHSE 1996). Die Mykoplasmenmastitis, die zu jedem Zeitpunkt der Laktation, allerdings gehäuft zum Zeitpunkt des Abkalbens auftreten kann, beginnt meist akut (PFÜTZNER u. SACHSE 1996). Die verhärteten und vergrößerten Viertel sind nicht schmerzempfindlich, und der Milchcharakter ist stark verändert. Die Milchleistung nimmt stark ab, wobei es auch zum völligen Sistieren der Milchproduktion kommen kann (PFÜTZNER 1990). Durch die Ausscheidung von M. bovis über die Milch ist auch eine mögliche Infektionsquelle für Kälber bei der Aufnahme der Kolostralmilch bzw. bei der Aufzucht mit Vollmilch gegeben. GHADERSOHI et al. (1999) untersuchten die Prävalenz von M. bovis in Milchviehbeständen in Australien. Bei 77% der Kühe mit hoher Zellzahl konnte M.
bovis nachgewiesen werden. Ob durch eine hämatogene Streuung von einer Mastitis eine Besiedelung des Genitaltraktes möglich ist, oder ob es sich hierbei um aszendierende Infektionen handelt, ist unklar (PFÜTZNER u. SACHSE 1996).
Infektionen des Genitaltraktes führen zu Endometritis und Salpingitis (HARTMANN et al. 1964; KIRCHHOFF 1982). Eine Infektion des Uterus kann zudem zu einer verschlechterten Fertilisation (EAGLESOME u. GARCIA 1990) und verlängerten Rast- und Zwischenkalbezeit führen (UHAA et al. 1990a, b). Ebenfalls beschrieben sind Spätaborte mit Nachweis von M. bovis (BOCKLISCH et al. 1986) sowie die Geburt lebensschwacher Kälber und Nachgeburtsverhaltung (GRUNERT et al.
1992). GRUNERT et al. (1992) beschrieben auch das Auftreten von Arthritiden, Tendovaginitiden, Gliedmaßenverkrümmung und Pneumonie bei in utero infizierten Kälbern. Bei Bullen führt eine aufsteigende Infektion im Genitaltrakt zu einer seminalen Vesikulitis, Epididymitis, Periorchitis und Ampullitis (KIRCHHOFF 1982).
Literaturübersicht 17
Über das kontaminierte Sperma ergibt sich eine mögliche Route für die Einschleppung des Erregers in einen Bestand.
2.3.4 Immunantwort
Mehrere Untersuchungen zeigen, dass der Wirtsorganismus nach einer Infektion mit M. bovis mit einer humoralen Immunantwort, das heißt mit der Bildung von Immunglobulinen reagiert. Diese sind in der Tracheobronchialflüssigkeit und im Zytoplasma von Immunzellen nachweisbar, die im Lungengewebe akkumulieren (HOWARD et al. 1986, 1987a). Des Weiteren kommt es im Lungengewebe zu einer Proliferation des peribronchialen und –bronchiolären lymphatischen Gewebes (so genanntes bronchus-associated lymphoid tissue, BALT) (GOURLAY et al. 1976;
MARTIN et al. 1983; RODRÍGUEZ et al. 1996a; HEWICKER-TRAUTWEIN et al.
2002; BUCHENAU 2003). Trotz dieser sich bei infizierten Tieren entwickelnden Immunantwort ist der Erreger bzw. das Erregerantigen noch mehrere Wochen nach der Infektion in den Lungen der Tiere nachweisbar. Bislang ist der Mechanismus, der es M. bovis ermöglicht, im Respirationstrakt des Wirtes zu persistieren, unklar. Es wird jedoch angenommen, dass eine in der Lunge des Wirtes erfolgende Antigenvariation des Erregers an der Persistenz beteiligt bzw. für die fehlende Elimination desselben mitverantwortlich ist (NICHOLAS u. AYLING 2003;
ROSENGARTEN et al. 2000). Zudem gibt es Untersuchungen von beispielsweise M. dispar, die zeigen, dass Kapselbestandteile einen inhibitorischen Effekt auf bovine Alveolarmakrophagen haben und somit für die Ausbreitung während der Infektion von Bedeutung sind (ALMEIDA et al. 1992). VANDEN BUSH u. ROSENBUSCH (2004) konnten ein die Lymphozyten hemmendes Peptid nachweisen, welches von M. bovis synthetisiert wird.
2.3.5 Antigen- und Phasenvariation
Bei dem auch als „Phasenvariation“ oder „Switching“ bezeichneten Phänomen der Antigenvariation kommt es durch spontanes An- und Abschalten der Synthese von Membranproteinen zur ständigen Änderung der antigenen und strukturellen Eigenschaften der Membranoberfläche des Erregers. Die variablen Oberflächenproteinantigene von M. bovis, bei denen es sich um Lipoproteine handelt, werden als „variable surface proteins“ (Vsps) bezeichnet (BEHRENS et al.
1994). Bislang kennt man die Nukleotidsequenzen von 13 verschiedenen Genen, die jeweils ein Vsp exprimieren (LYSNYANSKY et al. 2001b). Darüber hinaus besitzt M. bovis ein weiteres, nicht mit den Vsps verwandtes Oberflächenprotein, welches die Bezeichnung pMB67 trägt (BEHRENS et al. 1996). Untersuchungen an natürlich und experimentell mit M. bovis infizierten Kälbern zeigen, dass drei Mitglieder der Vsp-Familie, nämlich VspA, VspB und VspC, stark immunogen sind und die humorale Immunantwort stimulieren, wobei Antikörper produziert werden, die spezifisch mit den Vsps von M. bovis reagieren (BRANK et al. 1999). Die bislang zur Antigenvariation von M. bovis existierenden Erkenntnisse sprechen dafür, dass die Vsps nicht nur beim Vorgang der Adhärenz an Wirtszellen beteiligt sind, sondern dass es dem Erreger aufgrund des Phänomens der Antigenvariation gelingt, sich trotz der Immunantwort des Wirtes der Elimination aus dem Respirationstrakt zu entziehen (SACHSE et al. 1996, 2000; LYSNYANSKY et al. 2001b).
Die zur Antigenvariation von M. bovis bislang vorliegenden Erkenntnisse beruhen im Wesentlichen auf Untersuchungen an kultivierten Mikroorganismen, d. h. auf in vitro durchgeführten Experimenten. Immunhistochemische Untersuchungsergebnisse sprechen jedoch dafür, dass es auch in vivo, also im Wirtsgewebe, zur Expression variabler Oberflächenproteinantigene von M. bovis kommt. In diesen immunhistochemischen Untersuchungen konnten in Paraffin- bzw. Gefrierschnitten aus Lungen experimentell infizierter Kälber Vsp-Antigene und pMB67-Antigen von M.
bovis mit verschiedenen monoklonalen Antikörpern (Klone 1E5, 1A1, 4D7, I2) nachgewiesen werden (LINKNER et al. 2000; BUCHENAU 2003). Die verwendeten monoklonalen Antikörper besitzen Spezifitäten für VspA, B und C (Klone 1E5 und 4D7), für VspA, C und andere, noch nicht definierte Vsps (Klon 1A1) oder für pMB67 (Klon I2) (ROSENGARTEN et al. 1994; LE GRAND et al. 1996; BEIER et al. 1998).
So wurde in Lungengewebe experimentell infizierter Kälber mit den genannten monoklonalen Antikörpern eine immunhistochemische Reaktivität für Vsp-Antigene an der Bronchialepitheloberfläche, im Bronchialexsudat, auf der Alveolaroberfläche, in interalveolären Septen, im Randbereich von Nekrosen und im Zytoplasma von Makrophagen und neutrophilen Granulozyten festgestellt (LINKNER et al. 2000;
BUCHENAU 2003). Des Weiteren wurde in diesen Untersuchungen ein
Literaturübersicht 19
Reaktionsprodukt auch im Zytoplasma von Bronchialepithelzellen, an der Basalmembran des Bronchialepithels und im Bereich des proliferierten peribronchiolären Gewebes gefunden.
2.3.6 Immunprophylaxe
Zur Zeit ist keine kommerzielle Vakzine gegen M. bovis verfügbar, die einen vollständigen Schutz vor einer Infektion geben würde. Bei den im Schrifttum beschriebenen Vakzinationsversuchen, in denen mit Formaldehyd oder Saponin inaktivierte M. bovis-Stämme eingesetzt wurden, war zwar eine deutliche Reduktion des Ausmaßes der Lungenveränderungen und der Todesfälle zu verzeichnen, ein vollständiger Infektionsschutz wurde jedoch nicht erzielt (HOWARD et al. 1987a;
BRYSON et al. 1999; NICHOLAS et al. 2002).
2.3.7 Therapie
Die Behandlung mit M. bovis infizierter Kälber ist in der Regel erfolglos, da bei vielen europäischen Stämmen eine zunehmende Resistenz gegenüber Antibiotika festgestellt wurde (AYLING et al. 2000). Die antibiotische Therapie hat allerdings ihre Berechtigung zur Eindämmung sekundärer Infektionen. Fluoroquinolone wie beispielsweise das Danofloxacin und Tylosin zeigten sich 1993 in vitro noch gegen M. bovis antimikrobiell wirksam (COOPER et al. 1993), wobei sich gegen Tylosin mittlerweile Resistenzen ausgebildet haben, welche auch für Oxytetracyclin und Tetracykline auftreten (THOMAS et al. 2003). Gentamycin, Lincomycin und Spectinomycin haben sich als wenig effektiv bei der Behandlung bzw. Vorbeuge von M. bovis bedingter Erkrankungen erwiesen (THOMAS et al. 2003; VISSER et al.
1999). Somit zeigt zur Zeit nur Danofloxacin einen befriedigenden Therapieansatz zur Bekämpfung von M. bovis. Vorbeugende Maßnahmen bei M. bovis-Infektionen umfassen allgemeine Beachtung technischer, hygienischer und anderer Managementfaktoren, regelmäßige Bestandskontrollen, die schnelle und sichere Erkennung erkrankter Tiere sowie die rasche und konsequente Merzung positiver Rinder (BAUMGÄRTNER 1999).
2.3.8 Diagnostik zum Erregernachweis
Auf Grund der Schwierigkeiten der Therapie und der Prophylaxe gegen Infektionen durch M. bovis kommt der bestandsumfassenden Diagnostik eine besondere Bedeutung zu. Die Anzüchtung der anspruchsvollen Keime erweist sich oft als langwierig und schwierig und ist somit nicht das Mittel der Wahl für ein zügiges Ergebnis. In den frühen 90er Jahren wurden Enzym-gekoppelte, immunologisch- adsorbierende Nachweisverfahren (engl. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) entwickelt, die gerade bei der Diagnostik von Milchproben sehr erfolgreich sind (HELLER et al. 1993). Zum Nachweis von M. bovis-Antigen ist auf dem Markt ein kommerzielles Kit erhältlich, welches von BALL und FINLEY (1998) entwickelt wurde (Bio X, Luxemburg). In den 90ern kam zunehmend die Polymerase- Kettenreaktion (engl. polymerase chain reaction, PCR) zum Einsatz (GHADERSOHI et al. 1997). HOTZEL et al. (1999) beschreiben sogar ein kombiniertes Verfahren, bei dem durch monoklonale Antikörper eine Aufkonzentrierung von M. bovis für eine PCR erreicht werden konnte. Bei der Diagnostik der respiratorischen Mykoplasmose ist zu berücksichtigen, dass sich ein Nasentupfer zwar als die bequemere Art der Probensammlung erweist, allerdings eine deutlich geringere Sensitivität aufweist wie die zurückgewonnene Flüssigkeit einer bronchioalveoläre Lavage (bronchioalveoläre Lavage-Flüssigkeit, BALF) (THOMAS et al. 2002).
2.4 In situ-Hybridisierung
Die Methode der in situ-Hybridisierung (ISH) hat sich als ein wertvolles Instrument zur Lokalisierung von Erregernukleinsäuren im infizierten Wirtsgewebe erwiesen (LEITCH et al. 1994).
2.4.1 Methode
Bei der ISH kann man genomische DNA im histologischen Schnitt nachweisen, indem man die Fähigkeit von Nukleotidsträngen nutzt, sich komplementär aneinander zu legen. Die Methode wurde 1969 von PARDUE und GALL (1969) sowie JOHN et al. (1969) unabhängig voneinander entwickelt. Am Anfang war es lediglich möglich, die Sonden mittels Einbau radioaktiver Moleküle in Nukleotide
Literaturübersicht 21
(Phosphor 32P, Schwefel 35S, Jod 125I und Wasserstoff 3H) zu markieren. Das Problem bei diesen radioaktiven Sonden ist zum einen die durch die Strahlung bedingte mögliche Belastung der damit hantierenden Personen. Zum anderen werden für radioaktive Stoffe bestimmte Anforderungen an die Räume gestellt, in denen gearbeitet wird. Ein weiterer Nachteil ist der relativ schnelle Aktivitätsverlust dieser Sonden (LEITCH et al. 1994). Dieses führte zu der Entwicklung nicht radioaktiv markierter Sonden, wobei direkte und indirekte Verfahren unterschieden werden. Zu den direkten Verfahren gehört beispielsweise der Einbau von Fluoreszenzfarbstoffen wie Tetramethylrhodaminisothiocyanat. Die indirekten Verfahren arbeiten mit Markermolekülen wie Biotin und Digoxigenin, die in Nukleinsäuren eingebaut werden. Diese werden anschließend mittels immunhistochemischer Verfahren mit enzymgekoppelten Antikörpern detektiert (LEITCH et al. 1994). Als Sonden können sowohl DNA- als auch RNA-Abschnitte - je nach zu suchender Sequenz - verwendet werden, die zudem in unterschiedlichen Längen eingesetzt werden können (WILKINSON 1999).
2.4.2 Anwendung
Die ISH wurde schon in vielen Untersuchungen zur Detektion bestimmter Organismen im Gewebe verwendet. So findet sie ihre Anwendung bei Viren wie beispielsweise bei dem porzinen Circovirus Typ 2 (KIM u. CHAE 2001), Bakterien wie beispielsweise bei Neorickettsia risticii (CHAE et al. 2002) und Pilzen wie beispielsweise bei Aspergillus fumigatus (HANAZAWA et al. 2000). Bislang gibt es nur wenige Arbeiten, in denen Gensonden zur Darstellung von Mykoplasmen-DNA im Gewebe eingesetzt wurden. So gelang es einigen Autoren (KWON u. CHAE 1999; BOYE et al. 2001; KWON et al. 2002), im Lungengewebe von natürlich oder experimentell infizierten Schweinen erregerspezifische DNA von M. hyopneumoniae und anderen pathogenen Mykoplasmenspezies des Schweines nachzuweisen. Über den Nachweis von M. bovis-DNA in Gewebeproben infizierter Kälber mittels der Methode der ISH gibt es bislang keine Untersuchungen. MC CULLY und BROCK (1992) veröffentlichten 1992 eine DNA-Hybridisierung im Southern Blot mit einer mit radioaktivem Phosphor markierten Sonde an extrahierter M. bovis-DNA. Diese
Sonde wies eine Länge von 1150 bp auf und fand keine weitere Verwendung in einer ISH.
Material und Methoden 23
3 Material und Methoden
3.1 Kälber
Zur Untersuchung lagen Lungengewebeproben von insgesamt 35 Kälbern vor. Diese stammten aus verschiedenen Infektionsversuchen und wurden je nach verwendetem M. bovis-Stamm, Sektionszeitpunkt und eventuelle Vorbehandlung in drei Gruppen sowie eine Kontrollgruppe eingeteilt.
3.1.1 Gruppe 1 (Kontrollgruppe)
In Gruppe 1 fanden sich fünf Kälber, die in den nachfolgend angeführten Infektionsversuchen als negative Kontrolltiere dienten. Diese waren in der bakteriologischen Untersuchung (BU) mittels kultureller Nachweisverfahren und in der PCR frei von M. bovis. Andere Mykoplasmen und weitere Bakterien konnten ebenfalls nicht nachgewiesen werden. Die Daten der Kälber sind in Tabelle 2 wiedergegeben.
Tabelle 2: Daten der Kälber aus Gruppe 1 (Kontrollgruppe)
Lfd.
Nr. Tier-
Nr. E-Nr. Alter in
Tagen M. bovis-
Stamm Sektion p. i.
in Tagen BU Lunge
M. bovis BU Lunge
and. M. BU and.
Bakt.
1 3444 2934/00 60 Kontrolle 21 n n n 2 4835 2935/00 81 Kontrolle 21 n n n 3 307 1504/99 28 Kontrolle 21 n n n 4 4261 1505/99 28 Kontrolle 21 n n n 5 N. N. 1650/99 28 Kontrolle 21 n n n
Lfd. Nr.: laufende Nummer; Tier-Nr.: Tiernummer (während der Infektionsversuche);
N. N.: nicht bekannt, E-Nr.: Einsendungsnummer; p. i.: post infectionem; BU:
bakteriologische Untersuchung; M. bovis: Mycoplasma bovis; and. M.: andere Mykoplasmen; and. Bakt.: andere Bakterien; n: nicht nachgewiesen
3.1.2 Gruppe 2
In Gruppe 2 fanden sich acht Kälber, die aus einem Infektionsversuch stammten, der am damaligen Centre National d´Études Vétérinaires et Alimentaires (CNEVA, jetzt
Agence Française de Sécurité des Aliments, AFSSA) in Lyon, Frankreich, im Januar 1997 durchgeführt worden war. Die Kälber wiesen zum Zeitpunkt der Infektion ein Alter von 21 Tagen auf. Für die Infektion wurden 20 bis 40 ml Mykoplasmensuspension verwendet, die aus einer klonalen Variante des Typ- Stammes PG45 bestand. Diese klonale Variante exprimiert ausschließlich das variable Oberflächenprotein VspA 64 kDa. Es wurde eine Suspension mit einem Titer von ca. 4 x 1010 CFU/ml intratracheal inokuliert. Die Kälber stammten aus Herden seronegativer Kühe, deren Kälber im vorangegangenen Jahr weder Symptome von Pneumonie noch von Arthritis gezeigt hatten. Die Tiere waren serologisch negativ, und es wurde sichergestellt, dass keine der Kühe im vorangegangenen Jahr Anzeichen einer Mastitis gezeigt hatte. Vor Versuchsbeginn wurden alle Tiere auf eine bereits bestehende Infektion mit M. bovis oder andere Mykoplasmen durch Bronchialwaschungen und serologische Tests untersucht. Die Tiere wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Infektion getötet und anschließend seziert.
Bei vier der acht Kälber konnte eine Infektion mit M. bovis postmortal nachgewiesen werden. Bei drei Tieren konnten zum Teil zusätzlich andere Mykoplasmen festgestellt werden. Je ein Tier wies des Weiteren eine Infektion mit Pasteurella multocida bzw. Mannheimia haemolytica auf. Bei einem Kalb wurden nicht genauer bestimmte Bacillus-Spezies nachgewiesen. Die Daten der Tiere sowie die Ergebnisse der Rückisolierung von bakteriellen Keimen aus der Lunge sind in Tabelle 3 wiedergegeben.
Material und Methoden 25
Tabelle 3: Daten der Kälber aus Gruppe 2
Lfd.
Nr. E-Nr. Alter in
Tagen M. bovis-
Stamm Dosis
(CFU/ml) Sektion p. i.
in Tagen BU Lunge
M. bovis BU Lunge
and. M. BU and.
Bakt.
6 2 21 PG45 4 x 1010 10 n n n 7 5 21 PG45 4 x 1010 4 j j M. h.
8 7 21 PG45 4 x 1010 2 n n n 9 8 21 PG45 4 x 1010 10 n n n 10 9 21 PG45 4 x 1010 6 j n n 11 10 21 PG45 4 x 1010 6 j j Bac.
12 12 21 PG45 4 x 1010 2 j n n 13 13 21 PG45 4 x 1010 4 n j P. m.
Lfd. Nr.: laufende Nummer; E-Nr.: Einsendungsnummer; CFU: koloniebildende Einheiten (engl.: colony forming units); p. i.: post infectionem; BU: bakteriologische Untersuchung; M. bovis: Mycoplasma bovis; and. M.: andere Mykoplasmen; and.
Bakt.: andere Bakterien; n: nicht nachgewiesen j: nachgewiesen; M. h.: Mannheimia haemolytica; Bac.: Bacillus-Spezies; P. m.: Pasteurella multocida
3.1.3 Gruppe 3
In Gruppe 3 wurden Kälber zusammengefasst, die aus Infektionsversuchen eines gemeinsamen Forschungsprojektes der Arbeitsgruppen von Prof. Dr. Renate Rosengarten (Institut für Bakteriologie, Mykologie und Hygiene, Veterinärmedizinische Universität Wien, Österreich) und Prof. Dr. Marion Hewicker- Trautwein (Institut für Pathologie, Tierärztliche Hochschule Hannover) entstammten.
Die Versuche wurden im April 1999 und Juli 2000 durchgeführt. Es handelte sich zum einen um Tiere, die mit 30 ml einer bakteriellen Suspension des M. bovis- Stammes 1067 inokuliert wurden. Als Inokulationsroute wurde die Trachea gewählt.
Vier Tiere erhielten die Suspension mit einem Titer von 7,4 x 109 CFU/ml, je zwei Tiere mit einem Titer von 108 bzw. 1010 CFU/ml. Zum anderen wurden vier weitere Tiere mit einem französischen Feldstamm infiziert, der aus einem Bestand in Frankreich isoliert wurde. Dieser wurde je zwei Kälbern mit einem Titer von 108 bzw.
1010 CFU/ml intratracheal inokuliert. Die aus Niederösterreich stammenden Tiere gehörten alle der Rasse Simmentaler an. Während einer zweiwöchigen Akklimatisationsphase zu Beginn des Versuches wurde durch Untersuchungen
mittels bronchioalveolärer Lavage und serologischer Tests wie der Western Blot Technik sichergestellt, dass bei den Kälbern keine natürliche M. bovis-Infektion vorlag. 18 Tage später wurden die Tiere mit der oben beschriebenen M. bovis-Kultur infiziert und 21 Tage nach der Infektion getötet und seziert.
Tabelle 4: Daten der Kälber aus Gruppe 3
Lfd.
Nr. Tier-
Nr. E-Nr. Alter in
Tagen M. bovis-
Stamm Dosis
(CFU/ml) Sektion p. i.
in Tagen
BU Lunge M. bovis
BU Lunge and. M.
BU and.
Bakt.
14 176 2936/00 57 1067 7,4 x 109 21 j n Arc.
15 998 2937/00 57 1067 7,4 x 109 21 j n Arc.
16 4838 2938/00 67 1067 7,4 x 109 21 j n n 17 341 2939/00 63 1067 7,4 x 109 21 j n n 18 7701 1506/99 28 1067 1 x 108 21 j n n 19 3688 1507/99 28 1067 1 x 1010 21 j n P. m.
20 3051 1508/99 28 1067 1 x 108 21 j n n 21 353 1509/99 28 1067 1 x 1010 21 j n P. m.
22 7393 1510/99 28 franz.
Feldstamm 1 x 1010 21 j n P. m.
23 6079 1511/99 28 franz.
Feldstamm 1 x 108 21 j n n
24 7672 1512/99 28 franz.
Feldstamm 1 x 1010 21 j n P.m.
25 7102 1513/99 28 franz.
Feldstamm 1 x 108 21 j n n
Lfd. Nr.: laufende Nummer; Tier-Nr.: Tiernummer (während der Infektionsversuche);
E-Nr.: Einsendungsnummer; franz. Feldstamm: französischer Feldstamm; CFU:
koloniebildende Einheiten (engl.: colony forming units); p. i.: post infectionem; BU:
bakteriologische Untersuchung; M. bovis: Mycoplasma bovis; and. M.: andere Mykoplasmen; and. Bakt.: andere Bakterien; n: nicht nachgewiesen; j:
nachgewiesen; Arc.: Arcanobacterium pyogenes; P. m.: Pasteurella multocida
Bei allen zwölf Tieren wurde postmortal M. bovis in der Lunge nachgewiesen. Andere Mykoplasmen konnten nicht festgestellt werden. Zwei Tiere wiesen eine Infektion mit Arcanobacterium pyogenes und vier andere Kälber eine Infektion mit Pasteurella
Material und Methoden 27
multocida auf. Die Daten der Tiere sowie die Ergebnisse der Reisolierung von bakteriellen Keimen aus der Lunge sind in Tabelle 4 dargestellt.
3.1.4 Gruppe 4
In der letzten Gruppe wurden zehn Kälber zusammengefasst, die ebenfalls aus dem Infektionsversuch des gemeinsamen Forschungsprojektes von Prof. Dr. Rosengarten und Prof. Dr. Hewicker-Trautwein stammten. Diesen Tieren wurde im Alter von ca. 21 bis 35 Tagen ein aufgereinigtes, rekombinantes M. bovis-VspA-Fusionsprotein verabreicht. So wurde zum einen eine 2 ml umfassende Dosis von 1 mg aufgereinigtem M. bovis-VspA-Fusionsprotein, welches mit dem Montanide® IMS 1314 adjuviert wurde, verwendet. Hierbei handelt es sich um wasserlösliche, immunologisch aktive organische Komponenten. Einer anderen Gruppe wurde zweimal im Abstand von 21 Tagen eine 2 ml umfassende Dosis von 1 mg aufgereinigtem M. bovis-VspA-Fusionsprotein verabreicht, welches in diesem Fall mit 2%igem Alum/HS adjuviert wurde. 18 Tage später wurde diesen Tieren 30 ml einer Bakteriensuspension von M. bovis 1067 mit einem Titer von 7,4 x 109 CFU/ml intratracheal inokuliert. Auch hierbei handelte es sich um Kälber der Rasse Simmentaler, in deren Serum weder Antikörper gegen Mycoplasma bovis nachgewiesen noch Mykoplasmen aus der bronchioalveolären Lavage isoliert werden konnten. Alle Tiere dieser Gruppe wurden 21 Tage nach der Infektion getötet und anschließend seziert. Bei neun der zehn Kälber wurde postmortal M. bovis in der Lunge nachgewiesen. Andere Mykoplasmen konnten nicht festgestellt werden.
Sieben Tiere wiesen eine Infektion mit Arcanobacterium pyogenes auf, ein Kalb zusätzlich mit Pasteurella multocida. Die Daten der Kälber sowie die Ergebnisse der Rückisolierung von bakteriellen Keimen aus der Lunge sind in Tabelle 5 zusammengestellt.
