Immunhistochemische Untersuchungen zum Nachweis der Expression von induzierbarer Stickoxid-Synthase (iNOS), Nitrotyrosin (NT) und Mangan-Superoxid-Dismutaase (Mn-SOD) in Lungen von Kälbern nach experimenteller Infektion mit Mycoplasma bovis

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Tierärztliche Hochschule Hannover Institut für Pathologie

Immunhistochemische Untersuchungen zum Nachweis der Expression von induzierbarer Stickoxid-Synthase (iNOS),

Nitrotyrosin (NT) und Mangan-Superoxid-Dismutase (Mn-SOD) in Lungen von Kälbern nach experimenteller

Infektion mit Mycoplasma bovis

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin – Doctor medicinae veterinariae –

(Dr. med. vet.)

Vorgelegt von

Kathrin Anika Hermeyer aus Hamburg

Hannover 2008

(2)

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein

1.Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Martina Hoedemaker

Tag der mündlichen Prüfung: 24. April 2008

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Meinen Eltern

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Inhaltsverzeichnis I

INHALTSVERZEICHNIS

1 EINLEITUNG ...1

2 LITERATURÜBERSICHT...3

2.1 Mykoplasmen ... 3

2.1.1 Erregereigenschaften ...3

2.1.2 Pathogenitätsmechanismen ...4

2.1.3 Mycoplasma bovis-Infektion des Rindes...5

2.1.3.1Infektion des Respirationstraktes ... 6

2.2 Makrophagen in der Lunge ... 9

2.3 Induzierbare Stickoxid-Synthase, Nitrotyrosin, Mangan- Superoxid-Dismutase ... 12

2.3.1 Induzierbare Stickoxid-Synthase...12

2.3.1.1Reaktive Sauerstoffspezies ... 13

2.3.2 Nitrotyrosin...14

2.3.3 Mangan-Superoxid-Dismutase ...15

2.4 iNOS, NT und Mn-SOD im Respirationstrakt... 16

2.4.1 iNOS im Respirationstrakt...16

2.4.2 iNOS und bovine Alveolarmakrophagen...17

2.4.3 iNOS im Respirationstrakt bei Pneumopathien...19

2.4.4 NT im Respirationstrakt bei Pneumopathien...23

2.4.5 Mn-SOD im Respirationstrakt bei Pneumopathien ...25

2.5 Die Phagozytenmarker S100A8 und S100A9... 27

2.5.1 Eigenschaften und Funktion von S100A8 und S100A9 ...27

2.5.1.1S100A8 und S100A9 im Respirationstrakt bei Pneumopathien... 29

3 MATERIAL UND METHODEN ...31

3.1 Untersuchungsmaterial ... 31

3.1.1 Untersuchte Kälber ...31

3.1.2 Kontrolltiere...31

(6)

II Inhaltsverzeichnis

3.1.3 Experimentell mit M. bovis infizierte Kälber ...33

3.1.3.1Infektionsversuch mit einer klonalen Variante des M. bovis-Stammes PG45... 33

3.1.3.2Infektionsversuch mit dem M. bovis-Feldstamm 1067 sowie mit einem französischen M. bovis-Feldstamm... 35

3.1.3.3Vakzinationsversuch... 36

3.1.4 Lungengewebeproben...40

3.1.5 Fixation, Paraffineinbettung und physikochemische Färbemethode ...43

3.1.5.1Fixierung von Gewebeproben ... 43

3.1.5.2Paraffineinbettung von Gewebeproben... 43

3.1.5.3Färbung von Paraffinschnitten mit Hämalaun-Eosin... 44

3.2 Immunhistochemische Untersuchungen... 45

3.2.1 Vorversuche zur Immunhistochemie ...45

3.2.2 Antikörper und Seren ...45

3.2.2.1Primärantikörper ... 45

3.2.2.2Sekundärantikörper und Detektionssystem... 48

3.2.2.3Färbemethoden in der Immunhistochemie... 48

3.2.3 Protokoll der Immunhistochemie ...50

3.2.4 Demaskierungsverfahren ...52

3.2.5 Kontrollen in der Immunhistochemie...53

3.3 Auswertung und Dokumentation... 53

3.3.1 Lichtmikroskopische Beurteilung ...53

3.3.2 Auswertung und Morphometrie...53

3.3.3 Fotografische Dokumentation ...55

4 ERGEBNISSE...57

4.1 Histologische Befunde bei den Kontrolltieren und Lungenveränderungen bei den infizierten Tieren... 57

4.1.1 Histologische Befunde bei lungengesunden Kontrolltieren...57

4.1.2 Histologische Befunde bei experimentell mit M. bovis infizierten Kälbern...58

4.1.3 Entzündliche und sonstige Lungenveränderungen bei experimentell mit M. bovis infizierten Kälbern ohne Nekrosen...60

4.1.4 Entzündliche und sonstige Lungenveränderungen bei experimentell mit M. bovis infizierten Kälbern mit Nekrosen...62

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Inhaltsverzeichnis III

4.1.5 Vergleich der Makrophagenzahlen in verschiedenen Lungen-

kompartimenten zwischen Kontrolltieren, Tieren ohne und mit Nekrosen ...64

4.2 Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen ... 68

4.2.1 Immunhistochemische Untersuchungen an Lungengewebeproben der Kontrolltiere...68

4.2.1.1Expression von iNOS ... 68

4.2.1.2Expression von NT ... 69

4.2.1.3Expression von Mn-SOD ... 69

4.2.1.4Expression von S100A8 ... 70

4.2.2 Immunhistochemische Untersuchungen an Lungengewebeproben der experimentell mit M. bovis infizierten Kälber ohne Nekrosen ...74

4.2.3 Immunhistochemische Untersuchungen an Lungengewebeproben der experimentell mit M. bovis infizierten Kälber mit Nekrosen ...80

4.2.3.6Expression von CD68... 86

5 DISKUSSION...93

5.1 Expression von iNOS, NT und Mn-SOD ... 93

5.1.1 Expression von iNOS, NT und Mn-SOD im Lungengewebe von Kontrolltieren...93

5.1.2 Expression von iNOS, NT und Mn-SOD im entzündlich veränderten Lungengewebe infizierter Kälber...94

5.2 Auftreten von Makrophagen ... 101

5.3 Mögliche Stimulatoren zur Induzierung von iNOS ... 104

(8)

IV Inhaltsverzeichnis

6 ZUSAMMENFASSUNG...109

7 SUMMARY...111

8 LITERATURVERZEICHNIS...113

9 ANHANG ...131

9.1 Ergebnistabellen ... 131

9.2 p-Werte ... 139

9.3 Färbungsprotokolle ... 140

9.3.1 H&E-Färbung am Paraffinschnitt...140

9.3.2 Verwendete Lösungen für die H&E-Färbung...140

9.4 Pufferrezepte für die Immunhistochemie ... 141

9.4.1 Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)...141

9.4.2 Citratpuffer...141

9.5 Bezugsquellen für Chemikalien und Antikörper... 141

9.6 Bezugsquellen für Geräte und Einmalartikel... 145

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Abkürzungsverzeichnis I

Abkürzungsverzeichnis

ABC Avidin-Biotin-Peroxidase Komplex

Abb. Abbildung

AEC „3-Amino-9-ethylcarbazole“

AP Alkalische Phosphatase

Aqua dest. Aqua destillata

ARDS engl. acute respiratory distress syndrome (akute respiratorische Insuffizienz)

BAL Bronchoalveoläre Lavage

BALT Bronchus-assoziiertes lymphatisches Gewebe BRSV Bovines Respiratorisches Synzytialvirus

BOS engl. bronchiolitis obliterans syndrome (Bronchiolitis obliterans)

BrPn. Bronchopneumonie

BSA Bovines Serumalbumin

bzw. beziehungsweise

°C Grad Celsius

Ca²⁺ Kalzium

CF engl. cystic fibrosis (Zystische Fibrose)

CFU engl. colony forming units (koloniebildende Einheiten) COPD engl. chronic obstructive pulmonary disease

(chronisch obstruktive Lungenerkrankung) COX-2 Cyclooxygenase-2

Cu/Zn-SOD Kupfer/Zink-Superoxid-Dismutase DAB 3,3’-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid

DNA engl. desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) DRB Deutsch-Rotbunt

DSB Deutsch-Schwarzbunt

EC-SOD engl. extracellular superoxide dismutase (Extrazelluläre Superoxid-Dismutase) ELISA engl. enzyme-linked immunosorbent assay

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II Abkürzungsverzeichnis

engl. englisch

E-Nr. Einsendungsnummer

eNOS engl. endothelial nitric oxide synthase (endotheliale Stickoxid-Synthase) et al. lat. et alii (und andere)

Fa. Firma

g Gramm Geschl. Geschlecht

ggr. geringgradig

GM-CSF engl. granulocyte-macrophage colony stimulating factor

gr. griechisch

gstgr. geringstgradig

H&E Hämalaun-Eosin

HCl Salzsäure

H-DSB Holstein-Deutsch-Schwarzbunt

hgr. hochgradig

HPF engl. high power field

(Blickfeld im Lichtmikroskop bei 40facher Vergrößerung)

ICAM engl. intercellular adhesion molecules (interzelluläre Adhäsionsmoleküle)

IgG Immunglobulin G

IgM Immunglobulin M

IHC Immunhistochemie

IL Interleukin

IFN Interferon

iNOS engl. inducible nitric oxide synthase (induzierbare Stickoxid-Synthase) J Jahre

kat.-eitrig katarrhalisch-eitrig

kDa Kilo Dalton

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Abkürzungsverzeichnis III

lat. lateinisch

lfd. laufend

Lok. Lokalisation

LPS Lipopolysaccharid

m männlich

M Molarität

mAK monoklonaler Antikörper

max. maximal

M. bovis Mycoplasma bovis

MHC engl. major histocompatibility complex (Haupthistokompatibilitätskomplex)

mgr. mittelgradig

Mo Monate

Min. Minuten

MIP engl. macrophage inflammatory proteins Mn-SOD engl. manganese-superoxide-dismutase

(Mangan-Superoxid-Dismutase) mRNA engl. messenger RNA

MRP8/14 engl. migration inhibitory factor, (MIF)-related proteins-8/14

MW Mikrowelle

NaCl Natriumchlorid

NaOH Natronlauge

NGZ neutrophile Granulozyten nNOS engl. neuronal nitric oxide synthase

(neuronale Stickoxid-Synthase)

NO Stickstoffmonoxid

Nr. Nummer

NRAMP1 engl. natural resistance associated macrophage protein 1

NT Nitrotyrosin

obl. obliterierend

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IV Abkürzungsverzeichnis

pAK polyklonaler Antikörper PBS engl. phosphate-buffered saline

(Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) PCR engl. polymerase chain reaction

(Polymerasekettenreaktion) PGE2 Prostaglandin in E2

p.i. lat. post infectionem

PIMs pulmonale intravaskuläre Makrophagen PMN engl. polymorphonuclear neutrophils

(polymorphkernige neutrophile Granulozyten)

rb rekombinant

Ri Rind

RNA engl. ribonucleic acid (Ribonukleinsäure) RNS engl. reactive nitrogen species

(reaktive Nitroverbindungen)

ROS engl. reactive oxygen species (reaktive Sauerstoffspezies) RT-PCR engl. real-time polymerase chain reaction

SC engl. small colony

SOD engl. superoxide dismutase (Superoxid-Dismutase) spp. lat. species

subsp. lat. subspecies

TGF-β engl. transforming growth factor-β

Th T-Helferzelle

TNF-α Tumor Nekrose Faktor-α

u.a. unter anderem

Vsp engl. variable surface protein (variables Oberflächenprotein)

w weiblich

z.B. zum Beispiel

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Einleitung 1

1 Einleitung

Mycoplasma (M.) bovis gehört zu den für das Rind pathogensten Mykoplasmenarten und führt bei Kälbern zu unterschiedlichen entzündlichen und teils mit schwerwiegenden Nekrosen einhergehenden Lungenläsionen. In vorangegangenen Untersuchungen an experimentell infizierten Kälbern (BUCHENAU 2003;

JACOBSEN 2006) wurde gezeigt, dass sowohl M. bovis-Antigen als auch M. bovis- DNA insbesondere im nekrotischen Lungengewebe persistieren. Bislang sind die an der Entstehung der Lungenläsionen und an der Erregerpersistenz beteiligten Faktoren weitgehend ungeklärt.

Im Rahmen der unspezifischen Immunantwort sind Makrophagen normalerweise als Effektorzellen primär zuständig für die Elimination bakterieller Infektionserreger aus der Lunge. Aktivierte Makrophagen produzieren in entzündlich veränderten Geweben induzierbare Stickoxid-Synthase (iNOS), wodurch die Bildung von Stickstoffmonoxid (NO) katalysiert wird. Da NO zytotoxisch wirkt, wird ihm eine wichtige Rolle bei der Abtötung bakterieller Mikroorganismen zugesprochen. Nitrotyrosin (NT) ist ein Produkt, das während der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies durch die Reaktion von Peroxynitrit mit NO unter Beteiligung von Mangan-Superoxid-Dismutase (Mn- SOD) entsteht. Der Nachweis von NT stellt einen wichtigen Marker für in vivo entstandenes Peroxynitrit dar und kann somit als Indikator für oxidativen Stress angesehen werden.

Aufgrund von immunhistochemischen Ergebnissen zur Expression von iNOS, NT und Mn-SOD bei durch verschiedene bakterielle Erreger bedingten Pneumonien beim Schwein, Rind und Menschen (FLIGGER et al. 1999; RADI et al. 2001; CHO u.

CHAE 2002; CHO u. CHAE 2003a; PALMER et al. 2007) geht man davon aus, dass diese Produkte an der Entstehung der pneumonischen Veränderungen beteiligt sind.

Untersuchungen an isolierten, bovinen Alveolarmakrophagen haben gezeigt, dass diese nach Stimulation mit M. bovis NO produzieren (JUNGI et al. 1996a).

Über eine möglicherweise in vivo stattfindende Bildung derartiger Produkte im Lungengewebe von mit M. bovis infizierten Kälbern und deren Beteiligung an der Entstehung der Lungenläsionen gibt es bislang keine Erkenntnisse.

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2 Einleitung

Ziel dieser Arbeit war es, die bei experimentell mit M. bovis infizierten Kälbern auftretenden unterschiedlichen Lungenveränderungen hinsichtlich der Expression von iNOS, NT und Mn-SOD immunhistochemisch zu untersuchen. Des Weiteren sollten die das Lungengewebe infiltrierenden Makrophagenpopulationen semiquantitativ und unter Verwendung spezifischer Phagozytenmarker (S100A8, S100A9, CD68) charakterisiert werden.

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Literaturübersicht 3

2 Literaturübersicht

2.1 Mykoplasmen

2.1.1 Erregereigenschaften

Taxonomisch werden Mykoplasmen in die Klasse der Mollicutes (lat. mollis – weich, cutis – Haut) eingeordnet, die vier Ordnungen umfasst. Die Gattung Mycoplasma zählt zur Familie der Mycoplasmataceae und zur 1. Ordnung der Mycoplasmatales (TULLY et al. 1993; BOONE et al. 2001). Mykoplasmen sind äußerst kleine (0,3 – 0,8 µm), selbstständig vermehrungsfähige, pleomorphe Bakterien (RAZIN 1992).

Aufgrund ihrer geringen Größe und der fehlenden Zellwand ist eine Filtration durch Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm möglich (HAHN 2000). Das Genom entstand während der Evolution vermutlich aus einer Reduktion ehemals Gram- positiver Bakterien (WOESE 1987). Mykoplasmen haben daher eingeschränkte Stoffwechsel- und Biosynthesewege, was der Grund für eine überwiegend parasitäre Lebensform ist (RAZIN 1992; RAZIN et al. 1998). Auf Grund dessen kommt es häufig zu Problemen bei der Kultivierung dieser anspruchsvollen Bakterien, und die Anzucht bedarf spezieller Nährmedien. Auf festen Nährböden zeigen Mykoplasmen ein charakteristisches Wachstum in Form von spiegeleiförmigen Kolonien von bis zu 600 μm Durchmesser (HAYFLICK 1969). Mykoplasmen sind unter bestimmten Bedingungen in der Lage, verzweigte und unverzweigte, bis zu 150 μm lange Filamente auszubilden. Dieses pilzartige Wachstum führte zur Namensgebung dieser prokaryotischen Bakterienspezies (gr. myco – Pilz, plasma – Form) (RAZIN 1981).

Die meisten Mykoplasmen sind unbeweglich, jedoch konnte bei einigen Arten eine aktive, gleitende Bewegung nachgewiesen werden (KIRCHHOFF 1992). Außerhalb des Wirtes besitzt M. bovis die Fähigkeit, einen Biofilm zu bilden, der das Bakterium vor hohen Temperaturen und Austrocknung schützt, ohne seine Antibiotikaresistenz zu mindern (McAULIFFLE et al. 2006; PEREZ-CASAL u. PRYSLIAK 2007). Die Bildung eines Biofilms könnte außerdem innerhalb des Wirtes eine Erregerpersistenz begünstigen. Zusätzlich sind Biofilme in der Lage, Phagozyten anzulocken, aber deren phagozytäre Eigenschaften zu hemmen. Folglich können die freigesetzten

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4 Literaturübersicht

Enzyme der Phagozyten Schäden im umliegenden Wirtsgewebe verursachen und die Infektion aufrechterhalten (McAULIFFLE et al. 2006).

2.1.2 Pathogenitätsmechanismen

Viele Mykoplasmen besitzen eine starke Affinität zu den Schleimhautoberflächen des Respirations- und Urogenitaltraktes, wobei sie Kapsel- und Adhärenzstrukturen aufweisen, die zu einer engen Anlagerung der Mykoplasmen an die Wirtszellmembran führen (RAZIN u. JACOBS 1992; SACHSE et al. 1996; RAZIN et al.1998). Da Mykoplasmen keine Zellwand besitzen, sind sie durch gegen Bakterien gerichtete, lysosomale Enzyme des Wirtsorganismus nicht angreifbar (BREDT 1976;

RAZIN et al. 1998). Da sie keine Zellwand synthetisieren können, besitzen sie eine natürliche Resistenz gegenüber bestimmten Antibiotika (z.B. β-Lactam-Antibiotika), die an der Zellwandsynthese angreifen (EDWARD u. FREUNDT 1969; RAZIN u.

FREUNDT 1984). Weitere Pathogenitätsmechanismen stellen die Hemmung der ziliären Aktivität des Wirtsgewebes, die unspezifische Aktivierung von T- und/oder B- Lymphozyten, die Suppression von neutrophilen Granulozyten, Lymphozyten und Makrophagen sowie die Antigenvariation dar, durch die Mykoplasmen in der Lage sind, die wirtseigene Abwehr zu unterlaufen (GARBRIDGE et al. 1985; WATSON et al. 1988; CHRISTIANSEN et al. 1990; MOSIER 1997). Einige Mykoplasmen zeigen eine ausgeprägte Variabilität der Oberflächenproteine (variable surface proteins, Vsp), die zu einer ständigen Änderung antigener Strukturen führt, wie sie beispielsweise für Mycoplasma (M.) hyorhinis und M. bovis beschrieben wurden (ROSENGARTEN u. WISE 1991; ROSENGARTEN et al. 1994; ROSENGARTEN et al. 2000; RAZIN et al. 1998). Durch eine Adhäsion an die Wirtszelle mittels 13 verschiedener Adhäsionsmoleküle ist M. bovis in der Lage, die Immunabwehr des Wirtes zu hemmen (ROSENGARTEN et al. 2000; PEREZ-CASAL u. PRYSLIAK 2007). Als Virulenzfaktor wird die Bildung von Cytadhäsin diskutiert (SACHSE et al.

1993; SACHSE 1994; RAZIN et al. 1998). Schon BREDT (1976) vermutete, dass die im Rahmen einer Mykoplasmen-Infektion entstehenden Läsionen im Wirtsgewebe möglicherweise eher durch die Abwehrmechanismen des Wirtes verursacht werden, als durch eine Mykoplasmen-vermittelte Gewebezerstörung. RAZIN et al. (1998)

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beschreiben die Fähigkeit von Mykoplasmen, die Immunantwort des Wirtes durch Induktion von Zytokinen, Hemmung oder Stimulation von T- und B-Lymphozyten, Steigerung der Zytotoxizität von Makrophagen und natürlichen Killerzellen sowie Aktivierung der Komplementkaskade und Verstärkung der Expression von Zellrezeptoren zu modulieren. Für einige Mykoplasmenspezies ist ein Substanzverzehr der Aminosäure L-Arginin beschrieben, allerdings wird M. bovis diese Eigenschaft nicht zugeschrieben (RAZIN et al. 1998; THOMAS et al. 1990).

GEARY et al. (1981) beschreiben ein von M. bovis gebildetes Polysaccharidtoxin.

RAZIN et al. (1998) sind der Ansicht, dass Mykoplasmen keine Toxine bilden können, beschreiben jedoch durch den Metabolismus dieser Bakterien anfallende toxische Nebenprodukte wie Hydrogenperoxid und Superoxid-Radikale, die in Verdacht stehen, die Wirtszellmembranen oxidativ zu schädigen.

2.1.3 Mycoplasma bovis-Infektion des Rindes

HALE et al. (1962) gelang 1961 die Erstisolierung von M. bovis aus einem schweren Mastitisfall. Eine durch internationale Tiertransporte verstärkte Erregerstreuung in viele Länder, unter anderem nach Deutschland im Jahr 1977, wurde anschließend beschrieben und ging mit hohen, wirtschaftlichen Verlusten einher (NICHOLAS u.

AYLING 2003). Heute ist M. bovis die am weitesten verbreitete pathogene Mykoplasmenart in Europa und Nordamerika, die Mastitiden bei Milchvieh sowie Arthritiden und enzootische Pneumonien bei Kälbern und Jungrindern verursacht (GOURLAY et al. 1989; PFÜTZNER u. SACHSE 1996). M. bovis wird als primärer Wegbereiter für andere, bakterielle Keime wie Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, Histophilus somni und Arcanobacterium pyogenes häufig übersehen, da eine Isolierung von M. bovis spezielle Nährmedien erfordert und dieser Erreger in der Routinediagnostik daher häufig nicht erfasst wird (ARCANGIOLI et al. 2007;

HEWICKER-TRAUTWEIN et al. 2003; NICHOLAS u. AYLING 2003). M. bovis gilt als streng wirtsspezifisch, wobei natürliche Infektionen sowohl bei Rindern, als auch bei Schafen nachgewiesen werden (PFÜTZNER u. SACHSE 1996). RODRĺGUEZ et al.

(2000) bechreiben zudem eine erfolgreiche, experimentelle Infektion bei Ziegen.

Bakteriologische Untersuchungen an klinisch gesunden Kälbern und Rindern haben

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gezeigt, dass M. bovis über Monate und Jahre im Respirationstrakt beherbergt werden kann und mit dem Nasenschleim ausgeschieden wird (PFÜTZNER u.

SACHSE 1996). Die Entstehung von Polyarthritiden bei Kälbern und Rindern ist auf eine hämatogene Streuung des Erregers infolge einer Bronchopneumonie zurückzuführen, weshalb ROMAVÁRY et al. (1979) für dieses Krankheitsbild die Bezeichnung „Pneumonie-Arthritis-Syndrom“ einführten. Außer Mastitiden, Pneumonien und Arthritiden zählen noch Orchitis, Vesikulitis, Endometritis, Salpingitis, Aborte, Retentio secundinarum, Keratokonjunktivitis, Otitis media, Meningitis und subkutane Dekubitalabszesse zu den Erkrankungen, die durch M. bovis ausgelöst werden können (ADEGBOYE et al. 1995; GOURLAY et al. 1989).

2.1.3.1 Infektion des Respirationstraktes

Die ersten klinischen Symptome einer respiratorischen Erkrankung treten zwischen der ersten und der dritten Lebenswoche auf und erreichen ihr Maximum nach zehn bis fünfzehn Tagen nach der Infektion. Die klinische Symptomatik ist gekennzeichnet durch Husten, Dyspnoe und Nasenausfluss unterschiedlicher Stärke. Fieber, Inappetenz und allgemeine Schwäche sowie Gewichtsverlust treten ebenfalls bei der Mehrzahl der erkrankten Tiere über mehrere Tage hinweg auf (BOCKLISCH et al.

1983; STIPKOVITS et al. 2000b).

Die in der Lunge von Kälbern im Rahmen einer spontanen oder experimentellen Infektion mit M. bovis beschriebenen Lungenläsionen variieren zwischen interstitiellen pneumonischen Veränderungen, katarrhalisch-eitrigen Bronchopneumonien bis hin zu schwerwiegenden Pneumonien, bei denen obliterierende Bronchiolitiden und multiple Nekroseherde im Lungenparenchym auftreten (THOMAS et al. 1975; GOURLAY et al. 1989; ADEGBOYE et al. 1995;

RODRÍGUEZ et al. 1996; HEWICKER-TRAUTWEIN et al. 2002; BUCHENAU 2003).

Bei der histologischen Untersuchung finden RODRĺGUEZ et al. (1996) exsudative Bronchopneumonien, von Entzündungszellen umgebene Koagulationsnekrosen und eitrige Bronchiolitiden. Die bronchiolären und alveolären Lumina sind mit einem purulenten Exsudat gefüllt, das Makrophagen, neutrophile Granulozyten und Zelldetritus enthält. Peribronchiolär verzeichnen RODRĺGUEZ et al. (1996) eine

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mononukleäre Zellinfiltration im Zusammenhang mit einer nekrotisierenden Bronchiolitis, die durch Infiltration des Bronchialepithels mit neutrophilen Granulozyten und Makrophagen gekennzeichnet ist. Die Alveolarsepten sind durch Ödeme und Entzündungszellinfiltrate verdickt, und in den Alveolarräumen finden sich Ansammlungen von Makrophagen und neutrophilen Granulozyten. Die Koagulationsnekrosen sind zentral durch ein amorphes, eosinophiles Material gekennzeichnet, das von einem schmalen Saum aus zerfallenden Zellen und einem breiteren Saum aus Makrophagen und Plasmazellen umgeben wird. RODRĺGUEZ et al. (1996) beschreiben Makrophagen als die hauptsächlich beteiligten Entzündungszellen in den Alveolen des entzündlich veränderten Lungengewebes bei Kälbern nach Infektion mit M. bovis. ADEGBOYE et al. (1995) beschreiben in einer histologischen Studie durch M. bovis hervorgerufene Lungenveränderungen, die durch ödematisierte und mit Entzündungszellen infiltrierte Alveolarsepten, eine Füllung der Bronchiolen und der Alveolearräume mit zerfallenden, neutrophilen Granulozyten und Makrophagen sowie eine graduell unterschiedliche, peribronchioläre, lymphozytäre Hyperplasie charakterisiert sind. Multipel auftretende Abszesse mit zentralem, nekrotischem Material sind von einer pyogranulomatösen Entzündung und dichten Bindegewebswällen umgeben (ADEGBOYE et al. 1995).

KHODAKARAM-TAFTI u. LÓPEZ (2004) unterscheiden in einer histologischen Studie zwei unterschiedliche Nekrosetypen in Lungen von Kälbern mit natürlicher M. bovis-Infektion, die gleichzeitig in den Lungen der Tiere beobachtet wurden. Zum einen werden große, irreguläre Koagulationsnekrosen festgestellt, die von einem Saum aus zerfallenden, neutrophilen Granulozyten umgeben werden. Der zweite Nekrosetyp ist durch runde, verkäsende Areale, die aus granulärem, eosinophilem Material bestehen, charakterisiert. Diese Nekroseareale werden von einem Saum aus Granulationsgewebe umrandet. M. bovis-Antigen konnte in den Nekrosen, dem peribronchiolären lymphatischen Gewebe sowie in alveolären und interstitiellen Makrophagen immunhistochemisch nachgewiesen werden. KHODAKARAM-TAFTI u. LÓPEZ (2004) gehen davon aus, dass beide Nekrosetypen primär durch M. bovis verursacht werden, allerdings muss beim Vorliegen von Koagulationsnekrosen eine

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Koinfektion mit Mannheimia haemolytica und Histophilus somni differentialdiagnostisch berücksichtigt werden.

Bei Kälbern, die experimentell mit M. bovis-Stämmen infiziert wurden, konnten ähnliche klinische Symptome ausgelöst werden, wie sie bei einer natürlichen Infektion mit M. bovis beschrieben werden (GOURLAY et al. 1976; RODRĺGUEZ et al. 1996).

Die pathologisch-anatomischen Lungenveränderungen sind in der Studie von MARTIN et al. (1983) hauptsächlich durch eine Verfestigung des Lungenparenchyms der Spitzenlappen sowie der kranioventralen Anteile der Hauptlappen gekennzeichnet. Histologisch zeigen die Kälber dieser Studie ein überwiegend aus neutrophilen Granulozyten bestehendes Exsudat in den Bronchiallumina. Akzentuiert um die Bronchien wird eine interstitielle Pneumonie sowie eine Proliferation der Lymphfollikel des Bronchus-assoziierten lymphatischen Gewebes (BALT) verzeichnet. Tiere mit schwerwiegenderen Läsionen zeigen teilweise konfluierende, katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonien, lobuläre eitrige Bronchopneumonien mit Tendenz zur Gewebseinschmelzung sowie fibrinöse Exsudationen und Abszessbildungen. In diesen Fällen werden außer M. bovis meist noch weitere Bakterien wie Mannheimia haemolytica aus den veränderten Lungenarealen isoliert.

HOWARD et al. (1983, 1987a,b) und STIPKOVITS et al. (2000a) können bei experimentell infizierten Kälbern Koagulationsnekrosen nachweisen, deren Zentrum von einem schmalen Saum zerfallender Zellen und einem breiteren Saum von mononukleären Entzündungszellen umschlossen wird. THOMAS et al. (1986) beschreiben gleichartige Nekrosen sowie große Nekroseareale mit Überresten von Alveolen und kleinen Bronchioli, die als „ghost lung structures“ bezeichnet werden.

Von den genannten Autoren wird eine unterschiedlich ausgeprägte Hyperplasie des BALT beschrieben. Umgibt das BALT die Bronchien oder Bronchioli vollständig, wird von einer cuff-Bildung gesprochen (BRYS et al. 1989; RODRĺGUEZ et al. 1996).

STIPKOVITS et al. (2000a) stellen außerdem mikroskopisch Zellverluste sowie degenerative Veränderungen zilientragender Bronchialepithelzellen bei experimentell mit M. bovis infizierten Kälbern fest.

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2.2 Makrophagen in der Lunge

Pulmonale Makrophagen besitzen wichtige phagozytäre, mikrobizide und sekretorische Funktionen und spielen eine Rolle bei der Entstehung von Entzündungen und der Immunabwehr in der Lunge (NELSON u. SUMMER 1998;

ZHANG et al. 2000). Makrophagen sind ein Teil der angeborenen und der erworbenen Immunabwehr in der Lunge und tragen dazu bei, Mikroorganismen zu eliminieren (DECLAUX u. AZOULAY 2003). Im adulten Lungengewebe werden Makrophagen je nach ihrer anatomischen Lokalisation in verschiedene Makrophagentypen eingeteilt: Pulmonale, alveoläre Makrophagen (PAMs), pulmonale, intravaskuläre Makrophagen (PIMs) und interstitielle Makrophagen (PABST 1996; POULTER 1997; DECLAUX u. AZOULAY 2003).

Interstitielle Makrophagen können zu PAMs werden, wenn sie aus dem Septum interalveolare in die Alveolarräume einwandern. PAMs und Makrophagen in den Luftwegen sind in der Lage, wieder in das Lungenparenchym zurückzuwandern, sich durch das Lungengewebe zu bewegen oder durch die Lymphgefäße in die Lungenlymphknoten zu migrieren (STAUB 1994; POULTER 1997). Die Makrophagenpopulation der Lunge ist demnach nicht stationär, sondern besitzt motile Kapazitäten.

PIMs sind in den Lungenkapillaren von Rindern, Schafen, Ziegen, Schweinen, Pferden und Katzen, jedoch nur selten beim Menschen und bei Ratten zu finden (CHITKO-McKOWN et al. 1991; CHITKO-McKOWN 1992; STAUB 1994; PABST 1996; POULTER 1997; CARRASCO et al. 2004; PARBHAKAR et al. 2004; SINGH et al. 2004). PIMs befinden sich in den Kapillargefäßen im Septum interalveolare der Lunge. Von dort können sie in die Interalveolarsepten und in die Alveolarräume auswandern. Ein Teil der PIMs verbleibt im Lumen der kleinen Kapillargefäße der interalveolären Septen und wandert durch die Mikrozirkulation in den systemischen Kreislauf. Bei akuter oder chronischer Endotoxinbelastung werden die PIMs aktiviert und sind in der Lage, sich temporär an das Endothel der Kapillaren zu heften und Phagozytose zu betreiben (STAUB 1994; PABST 1996; SINGH et al. 2004). ATWAL et al. (2001) zeigen in einer ultrastrukturellen Untersuchung, dass bovine PIMs

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adhäsive Verbindungen (adhesive junctions) mit den Endothelzellen der Lunge eingehen und sich diese pulmonalen Mikrokapillaren insbesondere im Septum interalveolare befinden. ACKERMANN et al. (1994) und THOMASMEYER (2006) weisen PIMs in den Kapillaren der interalveolären Septen und PAMs in Alveolarräumen immunhistochemisch mit dem Makrophagenmarker CD68 in der bovinen Lunge nach. In vitro-Untersuchungen zeigen, dass bovine und caprine PIMs Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α), Interleukin-1 (IL-1) und Arachidonsäure- metaboliten sezernieren (CHITKO-McKOWN et al. 1992; SINGH et al. 2004). SINGH et al. (2004) stellen fest, dass PIMs bei Kälbern in vivo nach einer Infektion mit Mannheimia haemolytica TNF-α sezernieren und durch das Anlocken von Entzündungszellen eine akute Pneumonie auslösen.

PAMs stellen die erste Abwehr gegen Lungenerkrankungen dar, die durch infektiöse Erreger oder inhalierte Partikel hervorgerufen werden (COONROD 1989; LI et al.

1997; POULTER 1997; DECLAUX u. AZOULAY 2003). Wenn kleine, inhalierte Partikel bis in die Alveolarräume der Lunge gelangen, treffen sie dort auf PAMs, die diese Partikel erkennen und phagozytieren (POULTER 1997; DECLAUX u.

AZOULAY 2003). Dieser Prozess wird zum Teil durch Makrophagenrezeptoren vermittelt, die terminale Mannose-Zucker-Moleküle von Mikroorganismen erkennen können. PAMs exprimieren den Rezeptor C3b, der die Komplementkaskade und Fibronektin-Rezeptoren aktiviert. Fibronektin-Rezeptoren können PAMs dazu befähigen, sich um die Alveolen und den Bronchialbaum zu bewegen, da Bronchialepithelzellen Fibronektin sezernieren können (POULTER 1997; ZHANG et al. 2000). Den PIMs werden, im Gegensatz zu den PAMs, eher zytolytische Eigenschaften zugesprochen. PAMs hingegen besitzen hauptsächlich phagozytäre Fähigkeiten (CHITKO-McKOWN et al. 1991; PABST 1996). Neben diesen können PAMs durch bakterielle Produkte indirekt stimuliert werden und proinflammatorische Zytokine wie IL-8, IL-1β und TNF-α sezernieren (DECLAUX u. AZOULAY 2003).

TNF-α initiiert die Aufregulierung von Adhäsionsmolekülen, die in der Lage sind, neutrophile Granulozyten aus den Lungengefäßen in die Alveolarräume zu locken (ZHANG et al. 2000; NELSON 2001; DECLAUX u. AZOULAY 2003). TNF-α und IL- 1β können außer ihren direkten, chemotaktischen Fähigkeiten ebenso die Produktion

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von IL-8, dem wichtigsten chemotaktischen Faktor für neutrophile Granulozyten, in Alveolarmakrophagen, Typ II-Pneumozyten und Fibroblasten der Lunge induzieren (WARE u. MATTHAY 2000; DECLAUX u. AZOULAY 2003).

Makrophagen, insbesondere die der Luftwege, sind in der Lage, reaktive Sauerstoffspezies wie Stickstoffmonoxid (NO) zu bilden und in ihrer unmittelbaren Umgebung freizusetzen (MONCADA u. HIGGS 1993; POULTER 1997; WIDDISON et al. 2007). NO ist ein zusätzlicher Mediator der angeborenen Immunabwehr und kann in die Zytokinsynthese der Alveolarmakrophagen eingreifen.

Alveolarmakrophagen antworten auf virale Infektionen, indem sie Interferon-α und -β sezernieren, um eine virale Infektion der umliegenden Zellen zu verhindern (POULTER 1997).

Makrophagen spielen auch bei der erworbenen Immunantwort eine wichtige Rolle in der Lunge. Pulmonale Makrophagen werden durch Interferon-γ (IFN-γ), IL-3, IL-4 und GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor), welcher von lokalen, aktivierten T-Zellen produziert wird, stimuliert und in die Lage versetzt, ihre mikrobiziden Kapazitäten zu entfalten. Die Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies von Makrophagen wird durch IFN-γ, GM-CSF, TNF-α, dem Leukotrien LTB4 und IgG- Immunkomplexe gesteuert und unterstützt (LOHMANN-MATTHES et al. 1994). LTB4

wiederum besitzt eine starke chemotaktische Wirkung auf neutrophile Granulozyten (WHITELEY et al. 1991). Reaktive Sauerstoffspezies können eine Entzündung unterhalten und lokale Gewebeschädigungen verursachen. Prostaglandine, Thromboxane und Leukotriene werden ebenfalls von aktivierten Makrophagen sezerniert und induzieren eine akute Entzündungsantwort, indem sie polymorphkernige Zellen anlocken (POULTER 1997). Aktivierte PAMs setzen IL-8 und MIP 1 und 2 (macrophage inflammatory proteins) frei, welche eine chemotaktische Wirkung auf polymorphkernige Leukozyten ausüben. Andere Zytokine wie TGF-β (transforming growth factor-β), TNF-α und Fibronektin regen die Proliferation von Fibroblasten an (GORDON et al. 1992). In vitro-Untersuchungen zeigen, dass bovine PAMs nach einer Stimulation mit bakteriellem Lipopolysaccharid (LPS) größere Mengen an TNF-α und Stickstoffmonoxid (NO) bilden als PIMs.

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Unstimulierte bovine PIMs und PAMs sezernieren TNF-α und NO dagegen in gleichen Mengen (CHITKO-McKOWN et al. 1992).

2.3 Induzierbare Stickoxid-Synthase, Nitrotyrosin, Mangan- Superoxid-Dismutase

2.3.1 Induzierbare Stickoxid-Synthase

Stickstoffmonoxid (NO) ist ein kleines Molekül, dessen Freisetzung aus Endothelzellen erstmals 1987 beschrieben wurde (PALMER et al. 1987). Es konnte gezeigt werden, dass NO mit dem seit Anfang der 80er Jahre bekannten

„endothelium-derived relaxing factor“ identisch ist (MONCADA et al. 1991). Seine ungerade Elektronenzahl macht NO zu einer äußerst reaktiven Verbindung mit Radikalcharakter (BECKMANN u. KOPPENOL 1996). NO wird aus der Aminosäure L-Arginin durch die NO-Synthasen (NOS) synthetisiert. Es werden insgesamt drei verschiedene Isoformen (Typ I bis III) von NO-Synthasen unterschieden (MONCADA u. HIGGS 1993; DONNELLY u. BARNES 2002). Die neuronale NO-Synthase (nNOS, Typ I) und die endotheliale NO-Synthase (eNOS, Typ III) zählen zu den konstitutiven NO-Synthasen und sind beide Ca²⁺-abhängig, das heißt sie werden durch einen erhöhten Kalziumspiegel induziert. Die dritte Isoform ist die Ca²⁺- unabhängige, induzierbare NO-Synthase (iNOS, Typ II), die in Entzündungen durch proinflammatorische Zytokine, immunologische Stimuli, Bakterien, bakterielle Produkte oder Verbindungen wie Lipopolysaccharide (LPS) überwiegend durch Transkriptionsinduktion aktiviert wird (KNOWLES u. MONCADA 1994; MacMICKING et al. 1997; DONNELLY u. BARNES 2002). Zu den proinflammatorischen Zytokinen, die eine iNOS-Produktion triggern und somit zu einer erheblichen Freisetzung von NO führen, gehören vor allem TNF-α, IL-1β und IFN-γ (ROBBINS et al. 1994). NO wird während der Immunabwehr von iNOS in aktivierten Makrophagen in großen Mengen produziert, da es zytotoxische Eigenschaften besitzt und ihm eine wichtige Rolle bei der Immunabwehr, der Apoptoseregulation und dem Abtöten intrazellulärer Pathogene zugesprochen wird (MONCADA u. HIGGS 1993; WIDDISON et al. 2007).

NO besitzt außerdem ein breites Spektrum an antimikrobiellen Fähigkeiten und wird

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von Epithelzellen des Respirationstraktes und von Entzündungszellen synthetisiert (BOGDAN 2001; DECLAUX u. AZOULAY 2003).

2.3.1.1 Reaktive Sauerstoffspezies

Zu den reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) gehören freie Radikale wie das Superoxid-Anion O2.-, das hochreaktive Hydroxyl-Radikal OH^., das Peroxylradikal LOO^. und das Alkoxylradikal LO^. von Lipiden sowie stabile molekulare Oxidantien wie Wasserstoffperoxid (H2O2), Lipidhydroxyperoxid (LOOH), Ozon (O3) und die Hypochlorige Säure OCl^- und angeregte Sauerstoffmoleküle (Singulett- Sauerstoff ¹O2). Im Organismus entstehen reaktive Sauerstoffspezies (vor allem NO) in den Mitochondrien als Nebenprodukt der Zellatmung, aber auch durch Entzündungszellen, um so Viren und Bakterien zu schädigen (RUTKOWSKI et al.

2007). ROS können unter anderem über den Argininstoffwechsel entstehen (Abbildung 1), wobei L-Arginin von der durch Zytokine induzierbaren NOS zu NO und Citrullin metabolisiert wird (MONCADA u. HIGGS 1993). NO bildet mit Superoxid (O2˙-) das reaktive Peroxynitritanion ONOO^-, welches die Oxidantien ۟OH und NO2

bilden kann. Reagiert das Peroxynitritanion mit der Aminosäure Tyrosin, entsteht Nitrotyrosin (NT) (ISCHIROPOULOS et al. 1992; BECKMANN u. KOPPENOL 1996).

Peroxynitrit wird zusammen mit NO als reaktive Stickstoffspezies (reactive nitrogen species, RNS) bezeichnet. ROS und RNS sind somit wichtige Oxidantien, denen im Körper z.B. antioxidative Enzyme wie die Superoxid-Dismutasen (SOD) entgegenwirken (PRYOR et al. 2006; RUTKOWSKI et al. 2007). iNOS ist in der Lage, große Mengen an NO zu produzieren, welches mit Superoxid reagieren kann und zu Peroxynitrit umgewandelt wird. Peroxynitrit ist ein äußerst stabiles Oxidans, das zytotoxische Eigenschaften besitzt (ISCHIROPOULOS et al. 1992; BECKMANN u. KOPPENOL 1996). Es wird diskutiert, dass Peroxynitrit die zytotoxischen Effekte des NO vermittelt und somit eine schädigende Wirkung auf Proteine und Zellmembranbestandteile, eisenhaltige Enzyme der Atmungskette und die DNA ausübt sowie durch S-Nitrosylierung irreversible Proteinmodifikationen hervorrufen kann (MASON et al. 1997). ROS können durch antioxidative Enzymsysteme, wie z.B.

SOD, die jede Zelle zum Schutz vor Oxidationsreaktionen in unterschiedlich hohen

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Konzentrationen besitzt, abgefangen werden (BECKMANN u. KOPPENOL 1996;

PRYOR et al. 2006). Entsteht eine überschießende Produktion von Peroxynitrit durch die oben genannten Mechanismen, ist die SOD kaum noch in der Lage, Peroxynitrit zu neutralisieren. Das Gleichgewicht im Körper verschiebt sich dann zugunsten der oxidationsfördernden Prozesse (BECKMANN u. KOPPENOL 1996; VAN DER VLIET et al. 1999), und es kommt zum sogenannten oxidativen Stress (oxidative stress;

respiratory burst).

Abbildung 1: Bildung reaktiver Sauerstoff- bzw. Stickstoffverbindungen (modifiziert nach:

FORMAN u. TORRES 2001)

NADPH = Nicotinamidadenindinukleotidphosphat; O2 = Sauerstoff; O2.- = Superoxid; H⁺ = Wasserstoff;

.NO = Stickstoffmonoxid; H2O2 = Wasserstoffperoxid; ONOO¯ = Peroxynitrit

2.3.2 Nitrotyrosin

Nitrotyrosin (NT) ist eine stabile Verbindung, die durch die Reaktion von Peroxynitrit mit der in Proteinen vorkommenden Aminosäure Tyrosin gebildet wird. Diese Reaktion geschieht entweder spontan oder wird durch die Superoxid-Dismutase katalysiert (ISCHIROPOULOS et al. 1992). Der Nachweis von NT stellt einen wichtigen Marker für in vivo entstandenes Peroxynitrit dar und kann somit als Indikator für oxidativen Stress angesehen werden (ISCHIROPOULOS et al. 1992;

BECKMANN u. KOPPENOL 1996; VAN DER VLIET et al. 1999). Das durch die

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Reaktion von Superoxid und NO entstehende Peroxynitrit modifiziert als starkes Oxidans Tyrosin-Reste in Proteinen durch die Bindung einer Nitrogruppe (NO2) an eine ortho-Position des Tyrosins. EISERICH et al. (1998) beschreiben noch einen anderen Entstehungsweg von NT durch die Reaktion von Nitrit mit Hypochloriger Säure und durch die Reaktion der Myeloperoxidase mit Hydrogenperoxid. Die so entstehenden, nitrotyrosinylierten Proteine können als 3-Nitrotyrosin immunhistochemisch nachgewiesen werden (ISCHIROPOULOS et al. 1992;

BECKMANN u. KOPPENOL 1996). Eine Nitration von Tyrosinresiduen in Proteinen kann deren Funktion beeinträchtigen und Signalübertragungswege beeinflussen (MacMILLAN-CROW et al. 1998).

2.3.3 Mangan-Superoxid-Dismutase

Superoxid-Dismutasen sind antioxidantische Enzyme, die eukaryotische Zellen vor der reaktiven Sauerstoffverbindung Superoxid schützen. Superoxid entsteht entweder als Nebenprodukt der Atmungskette oder über den Argininstoffwechsel (Kapitel 2.3.1.1; ISCHIROPOULOS et al. 1992; MONCADA u. HIGGS 1993;

BECKMANN u. KOPPENOL 1996). Die oxidierte Form des Enzyms reagiert mit einem Superoxidion unter Bildung von Sauerstoff und der reduzierten Form des Enzyms. Diese Form reagiert weiter mit einem zweiten Superoxidion und zwei Protonen, wobei Wasserstoffperoxid sowie die oxidierte Form des Enzyms entstehen. ISCHIROPOULOS et al. (1992) beschreiben die Superoxid-Dismutase als Katalysator bei der Nitration von Tyrosin durch Peroxynitrit.

Drei Formen der Superoxid-Dismutase werden beim Menschen beschrieben: Die zytosolische Superoxid-Dismutase (CuZn-SOD, SOD 1), die mitochondriale Superoxid-Dismutase (Mn-SOD, SOD 2) und die extrazelluläre Superoxid-Dismutase (EC-SOD, SOD 3) (McCORD u. FRIDOVICH 1969; WEISINGER u. FRIDOVICH 1973; FRIDOVICH 1986). Nitration und Inaktivierung der Mn-SOD bewirken einen dramatischen Anstieg des mitochondrialen Superoxids, der wiederum zu einem ansteigenden Peroxynitritlevel führt und somit eine verstärkte Nitration und Oxidation anderer mitochondrialer Proteine bewirkt (MacMILLAN-CROW et al. 1998).

(28)

2.4 iNOS, NT und Mn-SOD im Respirationstrakt

2.4.1 iNOS im Respirationstrakt

Die iNOS ist kalziumunabhängig und wird durch inflammatorische Stimuli wie Zytokine und Interleukine, immunologische Stimuli sowie bakterielle Produkte induziert (XIE et al. 1992; KNOWLES u. MONCADA 1994). iNOS kommt u.a. in Makrophagen des Menschen, der Maus, der Ratte, des Pferdes, des Rindes, der kleinen Wiederkäuer und des Huhnes vor (MacMICKING et al. 1997). XIE et al.

(1992) beschreiben das Vorkommen von iNOS in immunstimulierten Mäusemakrophagen und folgern, dass Makrophagen die prototypischen Zellen sind, die iNOS exprimieren. In Makrophagen von Ratten kann eine NO-Synthase isoliert werden, die in Abwesenheit von Kalzium oder Calmodulin eine vollkommene Aktivität zeigt (KNOWLES u. MONCADA 1994). KOBZIK et al. (1993) lokalisieren iNOS in fixiertem, gesundem Lungengewebe von Ratte und Mensch, wobei beide Spezies iNOS im Epithel der Luftwege exprimieren (ASANO et al. 1994; GUO et al. 1995). In der Lunge wird NO eine Funktion als Neurotransmitter, Vaso- und Bronchodilatator sowie eine Effektormolekülfunktion beim Entzündungsprozess zugesprochen (MASON et al. 1997; MacMILLAN-CROW et al. 1998). Alveoläre Makrophagen sind in der Lunge des Menschen ein wichtiger Erzeuger von Zytokinen, die eventuell von NO modifiziert werden (SPERANZA et al. 2007). Mit IL-1β, TNF-α und IFN-γ stimulierte, humane Bronchialepithelzellen exprimieren iNOS und setzen NO in vitro frei (ASANO et al. 1994; ROBBINS et al. 1994; DONNELLY u. BARNES 2002).

SHERMAN et al. (1999) beschreiben das Vorkommen von iNOS in der glatten Muskulatur der Lunge und der Lungengefäße sowie im Epithel der oberen und unteren Atemwege in fetalem, neonatalem und adultem Lungengewebe von Lämmern und Schafen und vermuten, dass iNOS eine wichtige Quelle für vom Lungenepithel gebildetes NO ist. RADI et al. (2001) finden eine positive iNOS- Expression bei lungengesunden Kälbern in bronchiolären und alveolären Epithelzellen, in Chondrozyten des Bronchialknorpels, in Alveolarmakrophagen sowie in der glatten Muskulatur der Lunge.

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2.4.2 iNOS und bovine Alveolarmakrophagen

Bei entzündlichen oder infektiösen Prozessen wird iNOS zur Produktion von NO angeregt. Eine anhaltende Produktion von NO stattet Makrophagen mit zytotoxischen und zytostatischen Eigenschaften gegen Viren, Bakterien, Pilze, Protozoen, Helminthen und Tumorzellen aus (JUNGI et al. 1999). Diese Eigenschaften werden durch andere Produkte von Makrophagen wie Säuren, Glutathion, Cystein, Hydrogenperoxid und Superoxid zusätzlich verstärkt (MacMICKING et al. 1997).

WIDDISON et al. (2007) isolieren mittels PCR ein Transkript aus 3471 Basenpaaren von iNOS aus der RNA von bovinen Alveolarmakrophagen, die zuvor mit dem intrazellulären Pathogen Mycobacterium bovis stimuliert wurden. Diese Autoren finden eine enge phylogenetische Beziehung der iNOS-Proteine unterschiedlicher Spezies. Die iNOS des Pferdes besitzt die größte Ähnlichkeit mit der bovinen iNOS, die humanen und kaninen iNOS-Proteine zeigen ebenfalls eine große Übereinstimmung, wobei die humane iNOS der bovinen iNOS ähnlicher ist als der murinen iNOS. Dies bedeutet, dass das Rind möglicherweise ein Modell für iNOS/NO beim Menschen darstellen kann. JUNGI et al. (1996a) kultivieren bovine Makrophagen unterschiedlicher Herkunft (Kochenmark, BAL und peripheres Blut) und zeigen, dass diese bei bestimmter Stimulation durch bakterielle Produkte und LPS iNOS exprimieren. Unstimulierte, bovine Makrophagen exprimieren größere Mengen iNOS als stimulierte Makrophagen von Ziegen, Menschen, Schweinen und Kaninchen (JUNGI et al. 1996a). In bovinen Alveolarmakrophagen wird eine starke Produktion hoher NO-Konzentrationen nach Stimulation durch verschiedene, pathogene Mykoplasmenstämme von M. mycoides ssp. mycoides SC und M. bovis in vitro festgestellt. Eine Aufregulierung von NO durch einen nicht-pathogenen Mykoplasmenstamm (M. bovirhinis) tritt nicht auf (JUNGI et al. 1996c). Gramnegative und grampositive Bakterien sind in der Lage, eine NO-Synthese in niedrigen Konzentrationen in bovinen, von Monozyten abstammenden Makrophagen zu induzieren, allerdings erweisen sich gramnegative Bakterien als die stärkeren Stimuli. Mit grampositiven Bakterien stimulierte Makrophagen müssen zusätzlich mit IFN-γ kostimuliert werden, um eine adäquate NO-Produktion nachweisen zu können.

(30)

Die Autoren vermuten, dass das LPS gramnegativer Bakterien für die Aktivierung von iNOS in bovinen Makrophagen verantwortlich ist (JUNGI et al. 1999). JUNGI et al. (1997b) untersuchen die Auf- und Abregulierung des durch Listeria monocytogenes stimulierten, von bovinen Makrophagen produzierten NO. ADLER et al. (1996) aktivieren bovine Makrophagen mit LPS oder Salmonella dublin und weisen eine Expression großer Mengen von iNOS-mRNA, iNOS-Protein und iNOS- Enzymaktivität in vitro nach, wobei analog kultivierte caprine Makrophagen nur auf LPS mit einer zwar erhöhten, im Gegensatz zu den bovinen Makrophagen allerdings deutlich niedrigeren NO-Freisetzung und Expression von iNOS reagieren. In einem Vergleich der iNOS-Expression von murinen und bovinen Makrophagen nach Stimulation mit Salmonella dublin können ADLER et al. (1995) keine Aktivierung von iNOS durch IFN-γ, TNF-α, IL-1 und IL-2 in Makrophagen von Rindern feststellen. In bovinen Alveolarmakrophagen lässt sich jedoch eine durch iNOS regulierte Produktion von NO nach Stimulation mit rekombinantem (rb) IFN-γ, rbIL-1β, rbTNF-α und LPS zeigen, wobei IL-4 die iNOS-Expression hemmt (MASON et al. 1996). YOO et al. (1996) finden eine iNOS-Expression und erhöhte Mengen von NO in bovinen Alveolarmakrophagen nach Stimulation durch LPS von einem Pasteurella haemolytica-Stamm (jetzt Mannheimia haemolytica, M. haemolytica nach ANGEN et al. 1999). In Granulomen, die durch Mycobacterium bovis hervorgerufen werden, wird das Makrophagenprotein (natural resistance associated macrophage protein 1, NRAMP1) detektiert, das die Aufregulierung von iNOS bewirkt (ESTRADA-CHÁVEZ et al. 2001; PEREIRA-SUÁREZ et al. 2006). BOGDAN et al. (1997) kommen zu dem Schluss, dass Stimuli verschiedener Bakterien eine unterschiedlich hohe Produktion von iNOS in vitro in pulmonalen Alveolarmakrophagen von Schafen hervorrufen.

HICKMAN-DAVIS et al. (1998) finden eine deutlich erhöhte NO-Produktion in Alveolarmakrophagen von Mäusen mit Mycoplasma (M.) pulmonis-Infektion. Sechs Stunden nach Versuchsbeginn kann eine Abnahme der koloniebildenden Einheiten (colony-forming units, CFUs) von M. pulmonis verzeichnet werden, sodass der durch Surfactant-Protein-A vermittelte Abwehrmechanismus möglicherweise durch NO und Peroxynitrit initiiert wird (HICKMAN-DAVIS et al. 1999). Eine in vitro-Produktion von iNOS und eine Bildung von NO durch Alveolarmakrophagen wird außerdem bei

(31)

zahlreichen Erkrankungen wie z.B. Asthma, Tuberkulose und chronischer Pneumonie sowie nach Stimulation mit bakteriellen Proteinen bei verschiedenen Spezies wie Mensch, Ratte und Maus beschrieben (KOBZIK et al. 1993; ROBBINS et al. 1994; NICHOLSON et al. 1996; HICKMAN-DAVIS et al. 1998; DONNELLY u.

BARNES 2002; RUBOVITCH et al. 2007).

2.4.3 iNOS im Respirationstrakt bei Pneumopathien

Menschen und Labortiere produzieren während einer Infektion stark erhöhte Mengen NO, dessen Synthese durch iNOS katalysiert wird. Eine Stimulation von iNOS erfolgt durch verschiedene Zytokin- und Immunstimuli in infiziertem Gewebe und kann dort direkt nachgewiesen werden (OCHOA et al. 1991; WEINBERG 1999; LOWENSTEIN et al. 1996; NICHOLSON et al. 1996).

MASON et al. (1997) und McDERMOTT et al. (1997) finden immunhistochemisch eine deutliche Expression von iNOS und NT in entzündlich verändertem Bronchialepithel und in Entzündungszellen von Menschen mit obliterierender Bronchiolitis nach Lungentransplantation. Das Verteilungsmuster von iNOS ist eng mit den entzündlichen Lungenveränderungen assoziiert, wobei in Arealen mit verändertem, balloniertem Bronchialepithel, Bindegewebsproliferationen und luminaler bindegewebiger Verlegung eine starke iNOS-Expression beobachtet wird.

In Lungenparenchymanteilen, im Lumen vieler Luftwege und peribronchiolär zeigt eine große Zahl von Entzündungszellen eine iNOS-positive Reaktion. In vollständig obliterierten Bronchioli ist hingegen keine iNOS-Expression mehr nachweisbar. Das Reaktionsmuster von NT deckt sich in allen Phasen der obliterierenden Bronchiolitis vollständig mit dem von iNOS. MASON et al. (1997) stellen die Hypothese auf, dass die durch iNOS katalysierte Produktion von NO zur Zellschädigung und insbesondere zur Schädigung des Lungenepithels beiträgt, da NT als ein Marker für eine stattgefundene Bildung von Peroxynitrit gelten kann. Auch GABBAY et al. (2000) stellen mittels Immunhistochemie (IHC) eine erhöhte iNOS-Expression im Bronchialepithel und in der Lamina propria in Lungengewebebioptaten von Patienten mit Bronchiolitis obliterans-Syndrom (BOS), oder bakteriell bedingter Pneumonie nach Lungentransplantation im Vergleich zu Lungengewebebioptaten von Patienten

(32)

mit komplikationsloser Transplantation fest. Ebenso ist bei diesen Patienten ein Anstieg von NO in der Atemluft gemessen worden, welcher präventiv als Indikator für ein beginnendes BOS genutzt werden könne. Auch andere Autoren beschreiben, dass der in der Atemluft gemessene Gehalt an NO am höchsten bei Patienten mit akutem BOS ist und wieder abnimmt, je länger die Erkrankung besteht (FISHER et al. 1998). Im Lungengewebe von Patienten mit akuter Abstoßungsreaktion wird keine aufregulierte iNOS-Reaktion im Bronchialepithel verzeichnet (MASON et al. 1997).

FACCHETTI et al. (1999) finden eine immunhistochemisch positive iNOS- und NT- Expression in epitheloiden Zellen und mehrkernigen Riesenzellen bei Patienten mit Lungengranulomen unterschiedlichster Ätiologie (Tuberkulose, Sarkoidose, Toxoplasmose, Kryptokokkose, Leishmaniose und Bartonellose). Da mittels einer RT-Polymerase-Kettenreaktion (real time-polymerase chain reaction, RT-PCR) die Zytokine IFN-γ, IL-2 und TNF-α nachgewiesen werden können, liegt eine von T- Helferzellen-1 (Th-1) stimulierte Immunantwort und iNOS-Induktion nahe. Zytokine der T-Helferzellen-2 (Th-2), wie z.B. IL-4 unterdrücken dagegen eine iNOS- Expression. CHOI et al. (2002) untersuchen das Vorkommen von iNOS und NT mittels Immunhistochemie in humaner, pulmonärer Tuberkulose und weisen eine Expression in epitheloiden Makrophagen und Riesenzellen der tuberkulösen Granulome sowie in Alveolarmakrophagen und Epithelzellen in Lungenregionen mit Pneumonie nach. Gleichzeitig wird in diesen Zellen eine Expression von TNF-α verzeichnet. Bei experimentell mit Mycobacterium tuberculosis infizierten Mäusen können ARRIAGA et al. (2002) mittels RT-PCR hohe Mengen von TNF-α, iNOS, IL-2 und IFN-γ ermitteln. HERNANDEZ-PANDO et al. (2001) detektieren immunhistologisch iNOS- und NT-positive Makrophagen in Lungengranulomen von Mäusen in der frühen Infektionsphase der Tuberkulose. In der späten Phase der Infektion werden Lungennekrosen beobachtet, die eine verminderte iNOS- und eine erhöhte NT-Expression zeigen. SPEYER et al. (2003) beschreiben eine verstärkte Entzündungsantwort in mit LPS inokulierten iNOS-knockout Mäusen (iNOS¯^/¯) und vermuten, dass iNOS eine Rolle bei der Zytokin-Regulierung der pulmonalen Immunantwort spielen müsse. Bei Mäusen mit Asthma wird von TAKEMOTO et al.

(2007) eine verstärkte, immunhistologische Expression von iNOS in infiltrierenden

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Granulozyten und Bronchialepithelzellen gezeigt. Für NT sind außerdem Typ II Pneumozyten und Alveolarmakrophagen positiv.

CHO und CHAE (2002) weisen iNOS immunhistochemisch in fixiertem Lungengewebe von Schweinen mit fibrinöser Pleuropneumonie, ausgelöst durch eine natürliche Actinobacillus pleuropneumoniae-Infektion, nach. Eine iNOS- Expression wird in Makrophagen und neutrophilen Granulozyten in Alveolarräumen und in sogenannten Haferzellen (oat cells) beobachtet. Haferzellen sind dichtgedrängte, langgestreckte Zellen, die sich fischzugartig um durch Actinobacillus pleuropneumoniae hervorgerufene Koagulationsnekrosen im Lungengewebe anordnen und aus degenerierenden Leukozyten bestehen (HÄNI et al. 1973; CHEN 1997). Die Entzündungszellen in Blutgefäßen und in unveränderten Lungenbereichen infizierter Tiere und der Kontrolltiere zeigen keine Reaktion für iNOS. CHO und CHAE (2002) gehen davon aus, dass eine hochgradige Freisetzung von NO durch iNOS für die Gewebeläsionen verantwortlich sein könnte. In den meisten Lungenarealen, in denen iNOS-positive Zellen auftreten, wird mittels in situ- Hybridisierung eine hohe Anzahl DNA-positiver Zellen für Actinobacillus pleuropneumoniae beobachtet (CHO u. CHAE 2003a). Ebenso beschreiben CHO und CHAE (2003a) eine Korrelation von iNOS-positiven Zellen mit NT- exprimierenden Zellen, die überwiegend in der Peripherie entzündlich veränderter Lungenbereiche zu finden sind. Auch eine in vitro-Aktivierung von Alveolarmakrophagen mit Actinobacillus pleuropneumoniae und IFN-γ hat eine erhöhte Produktion von NO zur Folge, die iNOS-abhängig zu sein scheint (CHO u.

CHAE 2003b). CHO und CHAE (2004b) finden eine enge Assoziation von NF-ĸB und iNOS in Lungengewebeproben von natürlich mit Actinobacillus pleuropneumoniae- infizierten Schweinen. NF-ĸB ist ein wichtiges Protein in der transkriptionalen Induktion des iNOS-Genes in verschiedenen Zelltypen einschließlich Makrophagen (BOGDAN et al. 1995; ODDIS u. FINKEL 1996). Neutrophile Granulozyten und Makrophagen zeigen in der in situ-Hybridisierung und in der Immunhistologie eine iNOS- sowie eine Cyclooxygenase-2 (COX-2)-Expression im Lungengewebe von Schweinen mit experimenteller Actinobacillus pleuropneumoniae-Infektion, die eng mit Actinobacillus pleuropneumoniae-DNA-positiven Zellen assoziert ist. Zusätzlich

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wird NO und Prostaglandin E2 (PGE2) in der BAL-Füssigkeit in vivo festgestellt (CHO u. CHAE 2003b). Von iNOS produziertes NO aktiviert COX-2, die wiederum PGE2

synthetisiert. NO und PGE2 können demnach eine synergistische Rolle bei der durch eine Actinobacillus pleuropneumoniae-Infektion hervorgerufenen Immunantwort spielen (CHO u. CHAE 2003b; CHO u. CHAE 2004a).Entzündungsmediatoren in der Lunge stimulieren COX-2, deren Aktivierung vor allem zu einer Mehrbildung von PGE2 führt, das eine Bronchodilatation bewirkt (KOSTIKAS et al. 2003).

RADI et al. (2001) beschreiben eine Abnahme der iNOS-Expression in Bronchialepithelzellen in Lungengewebeproben neonataler Kälber mit Mannheimia haemolytica-Infektion, wenn gleichzeitig eine hochgradige iNOS-positive Leukozyteninfiltration vorlag. Eine starke Reaktion für iNOS und NT wird in den multifokalen Infiltraten aus neutrophilen Granulozyten und Makrophagen im Lungengewebe der mit Mannheimia haemolytica infizierten Kälber verzeichnet, wobei sich Kontrollkälber und infizierte Tiere in ihrem Expressionsmuster für NT ansonsten nicht unterscheiden. PALMER et al. (2007) inokulieren Kälber mit Mycobacterium bovis und finden immunhistochemisch iNOS-positive und CD68- positive Makrophagen und mehrkernige Riesenzellen ausschließlich in Granulomen in der frühen und mittleren Infektionsphase, aber nicht mehr gegen Versuchsende (Tag 90 p.i.). In Granulomen, die nekrotische Zentren aufweisen, ist die iNOS- Expression limitiert und nur in der Zellzone zu verzeichnen, die direkt an die nekrotischen Areale angrenzt. iNOS wird außerdem von Zellen mit spindelförmiger Morphologie exprimiert, bei denen es sich um Fibroblasten handeln könnte.

PERREIRA-SUÁREZ et al. (2006) detektieren iNOS mittels IHC in epitheloiden Makrophagen und mehrkernigen Riesenzellen vom Langhans-Typ in Lungengranulomen von Kälbern mit natürlicher Mycobacterium bovis-Infektion. Eine Akkumulation von NT wird ebenfalls in mehrkernigen Riesenzellen vom Langhans- Typ festgestellt.

FLIGGER et al. (1999) beschreiben eine iNOS-Expression in Lungengewebeproben von Rindern, die mit Arcanobacterium pyogenes und Pasteurella haemolytica (jetzt Mannheimia haemolytica nach ANGEN et al. 1999) infiziert wurden. Bei Tieren, die infolge einer Infektion mit Escherichia coli eine akute oder chronische, interstitielle

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Pneumonie entwickeln, wird keine iNOS-Expression verzeichnet. Um nekrotische Herde im Lungengewebe von Rindern mit Bronchopneumonie, die mit Arcanobacterium pyogenes oder Mannheimia haemolytica infiziert sind, finden die Autoren mittels IHC stark iNOS-exprimierende Zellen. Einige Zellen in den Alveolarräumen und in den Bronchiallumina in weniger stark entzündlich veränderten Lungenbereichen sowie einzelne Chondrozyten des Bronchialknorpels zeigen eine positive Reaktion für iNOS. In entzündlich veränderten Lungen von Rindern mit Bronchopneumonie nach einer Mannheimia haemolytica-Infektion können ebenfalls iNOS-exprimierende Zellen in der die Nekrosen umgebenden Zellzone nachgewiesen werden. In verstreut liegenden Zellen innerhalb nichtnekrotischer Alveolarräume und Bronchien wird ebenfalls eine positive iNOS-Reaktion verzeichnet. Da keine iNOS-Expression in Lungen von Rindern mit interstitieller Pneumonie festgestellt wird, vermuten die Autoren, dass iNOS hauptsächlich bei durch Arcanobacterium pyogenes und Mannheimia haemolytica hervorgerufener, nekrotisierender Bronchopneumonie gebildet wird. Um die iNOS-positiven Zellen im entzündlich veränderten Lungengewebe näher zu charakterisieren, führten die Autoren Doppelfärbungen mit MHC-II, dem Makrophagenmarker CD68 und den Phagozytenmarkern S100A8 und S100A9 durch, die zeigen, dass die Mehrheit der iNOS-exprimierenden Zellen negativ für die genannten Marker ist. Auch in einer Studie, in der die iNOS-Expression in Gehirnen von Ziegen, Schafen und Rindern mit einer Listeria monocytogenes-Infektion untersucht wird, sind die meisten iNOS- positiven Zellen negativ für S100A8 und S100A9 (JUNGI et al. 1997b).

2.4.4 NT im Respirationstrakt bei Pneumopathien

NT kann als Marker für eine NO-Produktion durch iNOS in entzündlich veränderten Geweben verwendet werden, da das Vorkommen von NT für eine stattgefundene Bildung von Peroxynitrit spricht (MASON et al. 1997; CHO u. CHAE et al. 2003a;

TANAKA et al. 2001).

Im Schrifttum werden iNOS und NT immunhistochemisch im Lungengewebe von Menschen und Versuchstieren mit verschiedenen Erkrankungen wie z.B.

Tuberkulose, Asthma und Zytomegalievirus-Infektion beschrieben (MASON et al.

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1997; YAMAZAKI et al. 1998; HERNANDEZ-PANDO et al. 2001; TANAKA et al.

2001; CHOI et al. 2002; TAKEMOTO et al. 2007).

MASON et al. (1997) untersuchen mittels IHC die Expression von iNOS und NT in Lungengewebeproben von Menschen mit obliterierender Bronchiolitis nach Lungentransplantation. Die Expression von NT ist stark mit der Expression von iNOS verknüpft und wird in vakuolisiertem Bronchialepithel und bindegewebig verlegten Lumina von Bronchioli nachgewiesen. Zusätzlich werden iNOS und NT von Entzündungszellen in Bronchiallumina, im Lungenparenchym und peribronchiolär exprimiert. In vollständig obliterierten Bronchioli ist hingegen keine Expression für iNOS und NT mehr nachweisbar (Kapitel 2.4.3).

Mittels IHC wird NT in epitheloiden Makrophagen und mehrkernigen Riesenzellen humaner, tuberkulöser Granulome sowie in Alveolarmakrophagen und Epithelzellen in entzündlich veränderten Lungenregionen nachgewiesen (CHOI et al. 2002;

Kapitel 2.4.3).

TAKEMOTO et al. (2007) beschreiben bei Mäusen mit Asthma eine verstärkte, immunhistologische Expression von NT in infiltrierenden Granulozyten, Bronchialepithelzellen, Typ II Pneumozyten und Alveolarmakrophagen (Kapitel 2.4.3). Bei Mäusen mit experimenteller Zytomegalievirus-Infektion (MCMV, murine cytomegalovirus) können TANAKA et al. (2001) NT immunhistologisch in Bronchialepithelzellen darstellen. In der späten Infektionsphase von Mäusen mit Tuberkulose geht in den, die Lungennekrosen demarkierenden, Makrophagen die iNOS-Expression zugunsten der NT-Expression zurück (HERNANDEZ-PANDO et al.

2001; Kapitel 2.4.3). YAMAZAKI et al. (1998) detektieren eine deutliche Reaktion für NT in alveolären Makrophagen von Mäusen, bei denen eine interstitielle Pneumonie durch Bleomycin hervorgerufen wurde.

Im veterinärmedizinischen Schrifttum gibt es bislang lediglich Beschreibungen über eine Expression von NT in Lungen von Schweinen nach Infektion mit Actinobacillus pleuropneumoniae und in Lungen von Rindern mit Bronchopneumonie oder nach Infektion mit Mycobacterium bovis (RADI et al. 2001; CHO u. CHAE 2003a;

PERREIRA-SUÁREZ et al. 2006). CHO und CHAE (2003a) weisen NT in

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neutrophilen Granulozyten und Makrophagen in der Peripherie entzündlich veränderter Lungenbereiche von Schweinen mit fibrinöser Pleuropneumonie durch natürliche Actinobacillus pleuropneumoniae-Infektion nach (Kapitel 2.4.3). NT ist in allen pneumonisch veränderten Lungenbereichen mit neutrophilen Granulozyten und Makrophagen assoziiert, in nicht entzündlich veränderten Lungenbereichen findet sich hingegen nur eine minimale NT-Expression.

RADI et al. (2001) beschreiben bei neonatalen Kälbern mit fibrinopurulenter Bronchopneumonie, hervorgerufen durch Mannheimia haemolytica, eine starke Expression von NT in multifokalen Infiltraten aus neutrophilen Granulozyten und Makrophagen (Kapitel 2.4.3). PERREIRA-SUÁREZ et al. (2006) detektieren NT mittels IHC in mehrkernigen Riesenzellen vom Langhans-Typ in Lungengranulomen von Kälbern mit natürlicher Mycobacterium bovis-Infektion, wobei die epitheloiden Makrophagen der Lungengranulome zusätzlich eine positive Reaktion für iNOS zeigen.

2.4.5 Mn-SOD im Respirationstrakt bei Pneumopathien

Mn-SOD ist ein wichtiges antioxidantisches Enzym, dem möglicherweise eine zentrale Rolle in Bezug auf die Abwehrmechanismen der Lunge zuzuschreiben ist (LAKARI et al. 2000).

Eine Expression von Mn-SOD in der erkrankten Lunge von Menschen und Versuchstieren in vivo wird von verschiedenen Autoren beschrieben (OBERLEY et al. 1993; LEE et al. 1994; OHBAYASHI et al. 1997; LAKARI et al. 2000; WELLER et al. 2000; HEUNGNAM et al. 2007), allerdings gibt es bislang keine Publikationen über immunhistochemische Untersuchungen mit Mn-SOD an Lungengewebeproben von Schweinen und Rindern.

LAKARI et al. (2000) verzeichnen mittels IHC eine Mn-SOD-Expression in Typ II- Pneumozyten und Alveolarmakrophagen bei Patienten mit interstitieller Pneumonie.

In metaplastischen alveolären und bronchiolären Epithelzellen liegt eine gegenüber normalem Alveolar- und Bronchialepithel erhöhte Expression von Mn-SOD vor. In Lungengewebeproben von Patienten mit Sarkoidose finden sich Mn-SOD-positive