Expression von iNOS, NT und Mn-SOD im entzündlich veränderten

Im Vergleich zu den Kontrolltieren fand sich bei allen experimentell mit M. bovis infizierten Tieren eine erhöhte Expression für iNOS, NT und Mn-SOD in den entzündlich veränderten Lungenarealen. Eine starke Reaktion wurde insbesondere in Makrophagen festgestellt. Es lag eine positive Korrelation zwischen dem Schweregrad der entzündlichen Lungenveränderungen und der Anzahl der im H&E-Schnitt ermittelten, infiltrierenden Makrophagen vor.

Bei Kälbern mit interstitieller Pneumonie ließ sich eine geringgradig erhöhte Expression von iNOS, NT und Mn-SOD in den Makrophagen des Septum interalveolare feststellen. Bei allen infizierten Kälbern lag im Vergleich zu den Kontrolltieren eine erhöhte Zahl an PAMs vor, die zum größten Teil iNOS, NT und Mn-SOD exprimierten. In den Makrophagen der interalveolären Septen, die

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unmittelbar an Alveolarräume, die mit Makrophagen angefüllt waren, grenzten, wurde keine Reaktion für iNOS, NT und Mn-SOD verzeichnet. Die fehlende Expression dieser Marker im Septum interalveolare in Bereichen mit deutlicher Alveolarhistiozytose könnte durch eine mögliche Auswanderung von Makrophagen aus den Kapillargefäßen der Interalveolarsepten und Makrophagen aus dem Septum interalveolare selbst in die Alveolarräume erklärt werden (CRYSTAL 1991;

ACKERMANN et al. 1994; POULTER 1997). FLIGGER et al. (1999) beobachten bei Rindern, die nach einer Infektion mit Escherichia coli eine akute interstitielle Pneumonie entwickeln, oder bei denen eine subakute oder chronische interstitielle Pneumonie vorliegt, im Gegensatz zu den vorliegenden Untersuchungsergebnissen keine iNOS-Expression. Die Autoren verzeichnen ausschließlich iNOS-exprimierende Zellen im Lungengewebe von Rindern mit Bronchopneumonie oder nekrotisierender Pneumonie nach Infektion mit Arcanobacterium pyogenes oder Mannheimia haemolytica und gehen von einer möglichen Koexpression anderer, unbekannter, iNOS-induzierender Faktoren in den Nekroseregionen aus.

Bei den Kälbern mit Nekrosen, bei denen mehrheitlich gleichzeitig eine katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie vorlag, wurde im Vergleich zu Tieren ohne Nekrosen eine deutlich erhöhte Zahl an Makrophagen im entzündlich veränderten Lungenparenchym festgestellt. Hier fanden sich diffus im Lungenparenchym verteilte, iNOS-, NT- und Mn-SOD-positive Makrophagen, die sich zum Teil um nesterartig angeordnete Ansammlungen neutrophiler Granulozyten gruppierten. Eine geringe Anzahl neutrophiler Granulozyten zeigte in diesen Lungenarealen ebenfalls eine positive Reaktion für iNOS und NT. Zu einem ähnlichen Ergebnis kommen RADI et al. (2001), die bei Kälbern nach Infektion mit Mannheimia haemolytica eine Expression von iNOS und NT in neutrophilen Granulozyten und Makrophagen im infiltrierten Lungengewebe von Kälbern mit akuter Bronchopneumonie feststellen.

In der Lamina propria mucosae der Bronchien bei Kälbern mit und ohne Nekrosen wurde im Vergleich zu den Kontrolltieren eine signifikant erhöhte Zahl an Makrophagen verzeichnet, von denen ein Teil iNOS, NT und Mn-SOD exprimierte.

Insbesondere bei Tieren mit katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonie und eitriger

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Bronchitis/-iolitis konnte eine deutlich erhöhte Infiltration der Lamina propria mucosae sowie der Bronchiallumina mit Makrophagen und neutrophilen Granulozyten verzeichnet werden, von denen sich jeweils ein Teil der infiltrierten Zellen positiv für iNOS und NT darstellte (Kapitel 4.2). Mn-SOD wurde im Gegensatz zu iNOS und NT ausschließlich von Makrophagen exprimiert und nicht von neutrophilen Granulozyten.

FLIGGER et al. (1999) beschreiben ebenfalls eine iNOS-Expression der Entzündungszellen in den Luftwegen bei Rindern nach einer Infektion mit Arcanobacterium pyogenes.

Der die Nekrosen ringförmig umschließende Wall aus Makrophagen zeigte bei allen Kälbern eine starke Expression für iNOS, NT und Mn-SOD. Das äußere Drittel des sich an den Makrophagensaum anschließenden Ringes aus neutrophilen Granulozyten wies ebenfalls bei der Mehrzahl der Kälber eine Expression für iNOS und NT auf. Das aus Zelldetritus bestehende Zentrum der Nekrosen zeigte bei drei der elf Kälber eine diffuse, positive Reaktion für iNOS und NT. In den zumeist komplett verdichteten, infiltrierten Lungenbereichen um die Nekrosen fanden sich bei nahezu allen Tieren diffus verteilte iNOS-, NT- und Mn-SOD-positive Makrophagen.

In der vorliegenden Untersuchung wurden, ähnlich wie von KHODAKARAM-TAFTI und LÓPEZ (2004) beschrieben, zwei Arten von Nekrosen festgestellt. Bei der Mehrzahl der mit M. bovis infizierten Kälber lag ein einheitlicher Aufbau der Nekrosen mit zentralem, eosinophilem, amorphem, azellulärem Material vor, das von teilweise untergehenden neutrophilen Granulozyten und einem sich anschließenden Saum aus Makrophagen und einzelnen Fibroblasten umgeben wurde. KHODAKARAM-TAFTI und LÓPEZ (2004) beobachten in Lungen von Kälbern nach natürlicher M. bovis-Infektion verkäsende Nekrosen aus granulärem, eosinophilem Material, die von einem Saum aus Granulationsgewebe umrandet werden. Ein ähnlicher Aufbau der Nekrosen wird auch von anderen Autoren beschrieben (RODRĺGUEZ et al. 1996;

SHAHRIAR et al. 2002; KHODAKARAM-TAFTI u. LÓPEZ 2004). Der zweite Nekrosetyp, der bei einigen Kälbern dieser Untersuchung festgestellt wurde, glich den von KHODAKARAM-TAFTI und LÓPEZ (2004) beschriebenen, großen Koagulationsnekrosen aus nekrotischen Alveolarstrukturen, die von einem Saum aus zerfallenden neutrophilen Granulozyten umgeben sind. Die Autoren gehen davon

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aus, dass die verkäsenden Nekrosen charakteristisch für eine M. bovis-Infektion sind und beim Vorliegen von Koagulationsnekrosen eine Koinfektion mit Mannheimia haemolytica, Histophilus somni, Arcanobacterium pyogenes und/oder Pasteurella multocida differentialdiagnostisch berücksichtigt werden muss. In der vorliegenden Arbeit wurden bei der Mehrzahl der Tiere mit Nekrosen (7/11) außer M. bovis weitere Erreger wie Pasteurella multocida, Arcanobacterium pyogenes und Mannheimia haemolytica isoliert. In früheren Untersuchungen konnte mittels IHC und in situ-Hybridisierung jedoch bei der Mehrzahl der Kälber mit Nekrosen (10/11) M. bovis-Antigen und/oder M. bovis-DNA nachgewiesen werden (JACOBSEN 2006). Daher kann vermutet werden, dass M. bovis eine pathogenetische Rolle bei der Entstehung der Nekrosen zukommt.

Über die Faktoren, die an der Entstehung der Nekrosen durch M. bovis beteiligt sind, ist bisher wenig bekannt. Wie schon an anderer Stelle beschrieben (Kapitel 5.3), bildet M. bovis toxische Stoffwechselnebenprodukte wie Hydrogenperoxid und Superoxid-Radikale, die vermutlich zur Entstehung von Nekrosen beitragen können.

Mannheimia haemolytica ist in der Lage, Leukotoxine, die zytolytische Aktivitäten gegen Granulozyten, Monozyten, Gewebsmakrophagen und Lymphozyten richten, zu bilden. Weiterhin induziert Mannheimia haemolytica die Hämolyse boviner Erythrozyten (EWERS et al. 2004). Arcanobacterium pyogenes besitzt ein Cholesterol-abhängiges Zytolysin und Pyolysin (JOST et al. 2003). Diese Toxine sind u.a. wie Mannheimia haemolytica in der Lage, den oxidativen Burst in Phagozyten zu hemmen und sind zytotoxisch für Granulozyten und Makrophagen (JOST et al. 2003;

EWERS etal. 2004). Pasteurella multocida bildet ebenfalls ein Toxin, das Phagozyten lysieren kann und die Antikörperbildung unterdrückt (HARPER et al.

2006).

Bisher ist der Mechanismus, der bei einer Infektion mit M. bovis zu der Entstehung von Nekrosen führt, unklar. In den Fällen, in denen Sekundärinfektionen nachgewiesen wurden, tragen die von Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida und Arcanobacterium pyogenes gebildeten Toxine möglicherweise zu der Entstehung von Nekrosen bei. Über eine mögliche Stimulation von iNOS, NT und

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Mn-SOD sowie deren Bedeutung bei der Entstehung der Nekrosen wird in einem späteren Kapitel näher eingegangen (Kapitel 5.3).

In der vorliegenden Untersuchung konnte gezeigt werden, dass iNOS, NT und Mn-SOD größtenteils von den Makrophagen, die die Nekrosen umgeben, exprimiert wurde. BUCHENAU (2003) und JACOBSEN (2006) beschreiben mittels IHC und in situ-Hybridisierung M. bovis-Antigen bzw. M. bovis-DNA in den Randbereichen der Nekrosen infizierter Kälber. Demnach ist bei durch M. bovis hervorgerufenen Nekrosen von einer Kolokalisation des Erregers und der Expression von iNOS, NT und Mn-SOD auszugehen. Über eine gleichzeitige, mittels IHC festgestellte Expression von iNOS und dem Vorhandensein von Erregern bzw. der Erreger-DNA in nekrotischen Lungenarealen beim Rind und beim Schwein nach natürlicher und experimenteller Infektion mit verschiedenen Bakterien wird auch von FLIGGER et al.

(1999) und CHO und CHAE (2003a) berichtet.

In den die Nekrosen demarkierenden Makrophagen bei experimentell mit M. bovis infizierten Kälbern wurde in der vorliegenden Untersuchung eine hochgradige Expression von iNOS, NT, Mn-SOD, CD68, S100A8 und S100A9 beobachtet. CHO und CHAE (2002) weisen iNOS in sogenannten Haferzellen, die sich um durch Actinobacillus pleuropneumoniae hervorgerufene Koagulationsnekrosen in der Lunge von Schweinen anordnen, immunhistochemisch nach. In den meisten Lungenarealen, in denen iNOS-positive Zellen auftreten, wird in der in situ-Hybridisierung eine Kolokalisation mit der DNA von Actinobacillus pleuropneumoniae beobachtet (CHO u. CHAE 2003a). CHO und CHAE (2003a) finden ebenso wie in der vorliegenden Untersuchung beobachtet, eine enge Assoziation von iNOS- und NT-exprimierenden Zellen, insbesondere in der Peripherie entzündlich veränderter Lungenbereiche. FLIGGER et al. (1999) detektieren iNOS-exprimierende Zellen um nekrotische Herde im Lungengewebe von Rindern mit Bronchopneumonie nach einer Infektion mit Arcanobacterium pyogenes und Mannheimia haemolytica, jedoch wird bei der Mehrheit der iNOS-exprimierenden Zellen keine Reaktion für CD68, S100A8 und S100A9 festgestellt. JUNGI et al. (1997b) und PFISTER et al. (2002) weisen iNOS und NT in einer Subpopulation von Makrophagen um zerebrale Mikroabszesse nach Infektion mit Listeria monocytogenes bei Rindern und kleinen Wiederkäuern in

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vivo nach. JUNGI et al. (1997b) untersuchen zusätzlich die Expression von S100A8 und S100A9 und stellen fest, dass die Makrophagen um die zerebralen Mikroabszesse entweder eine starke Expression für iNOS oder S100A8 und/oder S100A9 zeigen. JUNGI et al. (1997b) vermuten, dass iNOS, S100A8 und S100A9 unabhängig voneinander reguliert werden und bekräftigen diese Hypothese mit einer in vitro-Untersuchung, in der gezeigt werden konnte, dass Makrophagen natürlicherweise S100A9 exprimieren, S100A8 dagegen erst nach Stimulation der Makrophagen durch Bakterien oder IFN-γ exprimiert wird. Um die Funktion und die Regulation dieser Ca²⁺-bindenden S100-Proteine in Entzündungszellen besser zu verstehen, werden weitere Forschungsarbeiten erforderlich sein (JUNGI et al.

1997b). Warum die iNOS-exprimierenden Makrophagen in den Untersuchungen von JUNGI et al. (1997b), FLIGGER et al. (1999) und PFISTER et al. (2002) im Gegensatz zu den eigenen Befunden größtenteils keine Reaktion für CD68, S100A8 und S100A9 zeigen, bleibt letztendlich unklar. Ob das Vorliegen anderer Erreger im entzündlich veränderten Gewebe hierbei eine Rolle spielt, ist fraglich.

FACCHETTI et al. (1999) und CHO und CHAE (2004b) beobachten eine Korrelation zwischen iNOS- und NF-ĸB-exprimierenden Entzündungszellen in der Lunge und vermuten, dass NF-ĸB eine Expression von iNOS in Lungen von Schweinen mit Actinobacillus pleuropneumoniae-Infektion initiiert. Um nähere Aufschlüsse über eine Koexpression von iNOS und NF-ĸB in Entzündungszellen und insbesondere in Makrophagen im Lungengewebe von experimentell mit M. bovis infizierten Kälbern zu erhalten, wären entsprechende immunhistochemische Untersuchungen angebracht.

Eine obliterierende Bronchiolitis konnte am häufigsten bei Kälbern mit nekrotisierender Pneumonie (6/11) beobachtet werden. Das ballonierte Epithel der obliterierten Bronchioli sowie zwischen den lumenverlegenden Fibroblasten und Kollagenfasern gelegene Makrophagen wiesen in allen Fällen eine positive Reaktion für iNOS, NT und Mn-SOD auf, während die dort befindlichen neutrophilen Granulozyten lediglich eine Expression für iNOS und NT zeigten. Bisher gibt es keine Untersuchungen über die Expression von iNOS, NT und Mn-SOD bei Rindern mit obliterierender Bronchiolitis. Über das Auftreten von obliterierenden Bronchiolitiden

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bei Kälbern mit M. bovis-Infektion gibt es im einschlägigen Schrifttum bislang keine Publikationen.

In der Humanmedizin wird eine starke Expression von iNOS und NT bei Menschen mit obliterierender Bronchiolitis nach Lungentransplantation beobachtet (MASON et al. 1997; McDERMOTT et al. 1997). Wie in der vorliegenden Untersuchung beobachtet, überschneidet sich das Verteilungsmuster von iNOS und NT und wird im veränderten, ballonierten Bronchialepithel, in den Bindegewebsproliferationen und luminaler, bindegewebiger Verlegung sowie peribronchiolär gelegenen Entzündungszellen verzeichnet. In komplett obliterierten Luftwegen wird keine Expression für iNOS und NT festgestellt. Die Autoren vermuten einen durch Peroxynitrit hervorgerufenen, gewebeschädigenden Effekt. Die Fähigkeit von NO, eisenhaltige Enzyme der Atmungskette und die DNA-Synthese zu hemmen, reduziert die Zellteilung und somit die Zellerneuerung nach einer Gewebeschädigung. Auch GABBAY et al. (2000) stellen eine erhöhte iNOS-Expression im Bronchialepithel sowie in der Lamina propria mucosae in Lungengewebebioptaten bei Patienten mit Bronchiolitis obliterans und bakterieller Pneumonie nach Lungentransplantation fest.

Da die Expression von iNOS und NT in obliterierten Bronchioli bei den in dieser Arbeit untersuchten Kälbern ein ähnliches Muster aufweist wie in transplantierten Lungen beim Menschen, darf vermutet werden, dass NO und Peroxynitrit möglicherweise an der Entstehung dieser nach M. bovis-Infektion auftretenden Alterationen beteiligt sind.

RADI et al. (2001) beschreiben eine Abnahme der iNOS-Expression bei Kälbern nach Infektion mit Mannheimia haemolytica in pulmonalen Epithelzellen und parenchymalen Zellen der Lunge bei starker Entzündungszellinfiltration. Die Autoren diskutieren das Vorliegen eines negativen Feedback-Mechanismus und vermuten, dass von Entzündungszellen freigesetzte Superoxid-Radikale die iNOS-Produktion der pulmonalen Epithelzellen hemmen (MATERA 1998). Dieser Mechanismus könnte eine überschießende Freisetzung von NO und anderen freien Radikalen im Gewebe verhindern. Im Gegensatz zu den Befunden von RADI et al. (2001) ergab sich bei keinem der mit M. bovis infizierten Tiere eine bezüglich der Expression von

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iNOS, NT und Mn-SOD in den Epithelzellen der Bronchien und Bronchioli Abweichung im Vergleich zu den Kontrolltieren.