2.3.1 Induzierbare Stickoxid-Synthase
Stickstoffmonoxid (NO) ist ein kleines Molekül, dessen Freisetzung aus Endothelzellen erstmals 1987 beschrieben wurde (PALMER et al. 1987). Es konnte gezeigt werden, dass NO mit dem seit Anfang der 80er Jahre bekannten
„endothelium-derived relaxing factor“ identisch ist (MONCADA et al. 1991). Seine ungerade Elektronenzahl macht NO zu einer äußerst reaktiven Verbindung mit Radikalcharakter (BECKMANN u. KOPPENOL 1996). NO wird aus der Aminosäure L-Arginin durch die NO-Synthasen (NOS) synthetisiert. Es werden insgesamt drei verschiedene Isoformen (Typ I bis III) von NO-Synthasen unterschieden (MONCADA u. HIGGS 1993; DONNELLY u. BARNES 2002). Die neuronale NO-Synthase (nNOS, Typ I) und die endotheliale NO-Synthase (eNOS, Typ III) zählen zu den konstitutiven NO-Synthasen und sind beide Ca2+-abhängig, das heißt sie werden durch einen erhöhten Kalziumspiegel induziert. Die dritte Isoform ist die Ca2+ -unabhängige, induzierbare NO-Synthase (iNOS, Typ II), die in Entzündungen durch proinflammatorische Zytokine, immunologische Stimuli, Bakterien, bakterielle Produkte oder Verbindungen wie Lipopolysaccharide (LPS) überwiegend durch Transkriptionsinduktion aktiviert wird (KNOWLES u. MONCADA 1994; MacMICKING et al. 1997; DONNELLY u. BARNES 2002). Zu den proinflammatorischen Zytokinen, die eine iNOS-Produktion triggern und somit zu einer erheblichen Freisetzung von NO führen, gehören vor allem TNF-α, IL-1β und IFN-γ (ROBBINS et al. 1994). NO wird während der Immunabwehr von iNOS in aktivierten Makrophagen in großen Mengen produziert, da es zytotoxische Eigenschaften besitzt und ihm eine wichtige Rolle bei der Immunabwehr, der Apoptoseregulation und dem Abtöten intrazellulärer Pathogene zugesprochen wird (MONCADA u. HIGGS 1993; WIDDISON et al. 2007).
NO besitzt außerdem ein breites Spektrum an antimikrobiellen Fähigkeiten und wird
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von Epithelzellen des Respirationstraktes und von Entzündungszellen synthetisiert (BOGDAN 2001; DECLAUX u. AZOULAY 2003).
2.3.1.1 Reaktive Sauerstoffspezies
Zu den reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) gehören freie Radikale wie das Superoxid-Anion O2.-, das hochreaktive Hydroxyl-Radikal OH., das Peroxylradikal LOO. und das Alkoxylradikal LO. von Lipiden sowie stabile molekulare Oxidantien wie Wasserstoffperoxid (H2O2), Lipidhydroxyperoxid (LOOH), Ozon (O3) und die Hypochlorige Säure OCl- und angeregte Sauerstoffmoleküle (Singulett-Sauerstoff 1O2). Im Organismus entstehen reaktive Sauerstoffspezies (vor allem NO) in den Mitochondrien als Nebenprodukt der Zellatmung, aber auch durch Entzündungszellen, um so Viren und Bakterien zu schädigen (RUTKOWSKI et al.
2007). ROS können unter anderem über den Argininstoffwechsel entstehen (Abbildung 1), wobei L-Arginin von der durch Zytokine induzierbaren NOS zu NO und Citrullin metabolisiert wird (MONCADA u. HIGGS 1993). NO bildet mit Superoxid (O2˙-) das reaktive Peroxynitritanion ONOO-, welches die Oxidantien ۟OH und NO2
bilden kann. Reagiert das Peroxynitritanion mit der Aminosäure Tyrosin, entsteht Nitrotyrosin (NT) (ISCHIROPOULOS et al. 1992; BECKMANN u. KOPPENOL 1996).
Peroxynitrit wird zusammen mit NO als reaktive Stickstoffspezies (reactive nitrogen species, RNS) bezeichnet. ROS und RNS sind somit wichtige Oxidantien, denen im Körper z.B. antioxidative Enzyme wie die Superoxid-Dismutasen (SOD) entgegenwirken (PRYOR et al. 2006; RUTKOWSKI et al. 2007). iNOS ist in der Lage, große Mengen an NO zu produzieren, welches mit Superoxid reagieren kann und zu Peroxynitrit umgewandelt wird. Peroxynitrit ist ein äußerst stabiles Oxidans, das zytotoxische Eigenschaften besitzt (ISCHIROPOULOS et al. 1992; BECKMANN u. KOPPENOL 1996). Es wird diskutiert, dass Peroxynitrit die zytotoxischen Effekte des NO vermittelt und somit eine schädigende Wirkung auf Proteine und Zellmembranbestandteile, eisenhaltige Enzyme der Atmungskette und die DNA ausübt sowie durch S-Nitrosylierung irreversible Proteinmodifikationen hervorrufen kann (MASON et al. 1997). ROS können durch antioxidative Enzymsysteme, wie z.B.
SOD, die jede Zelle zum Schutz vor Oxidationsreaktionen in unterschiedlich hohen
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Konzentrationen besitzt, abgefangen werden (BECKMANN u. KOPPENOL 1996;
PRYOR et al. 2006). Entsteht eine überschießende Produktion von Peroxynitrit durch die oben genannten Mechanismen, ist die SOD kaum noch in der Lage, Peroxynitrit zu neutralisieren. Das Gleichgewicht im Körper verschiebt sich dann zugunsten der oxidationsfördernden Prozesse (BECKMANN u. KOPPENOL 1996; VAN DER VLIET et al. 1999), und es kommt zum sogenannten oxidativen Stress (oxidative stress;
respiratory burst).
Abbildung 1: Bildung reaktiver Sauerstoff- bzw. Stickstoffverbindungen (modifiziert nach:
FORMAN u. TORRES 2001)
NADPH = Nicotinamidadenindinukleotidphosphat; O2 = Sauerstoff; O2.- = Superoxid; H+ = Wasserstoff;
.NO = Stickstoffmonoxid; H2O2 = Wasserstoffperoxid; ONOO¯ = Peroxynitrit
2.3.2 Nitrotyrosin
Nitrotyrosin (NT) ist eine stabile Verbindung, die durch die Reaktion von Peroxynitrit mit der in Proteinen vorkommenden Aminosäure Tyrosin gebildet wird. Diese Reaktion geschieht entweder spontan oder wird durch die Superoxid-Dismutase katalysiert (ISCHIROPOULOS et al. 1992). Der Nachweis von NT stellt einen wichtigen Marker für in vivo entstandenes Peroxynitrit dar und kann somit als Indikator für oxidativen Stress angesehen werden (ISCHIROPOULOS et al. 1992;
BECKMANN u. KOPPENOL 1996; VAN DER VLIET et al. 1999). Das durch die
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Reaktion von Superoxid und NO entstehende Peroxynitrit modifiziert als starkes Oxidans Tyrosin-Reste in Proteinen durch die Bindung einer Nitrogruppe (NO2) an eine ortho-Position des Tyrosins. EISERICH et al. (1998) beschreiben noch einen anderen Entstehungsweg von NT durch die Reaktion von Nitrit mit Hypochloriger Säure und durch die Reaktion der Myeloperoxidase mit Hydrogenperoxid. Die so entstehenden, nitrotyrosinylierten Proteine können als 3-Nitrotyrosin immunhistochemisch nachgewiesen werden (ISCHIROPOULOS et al. 1992;
BECKMANN u. KOPPENOL 1996). Eine Nitration von Tyrosinresiduen in Proteinen kann deren Funktion beeinträchtigen und Signalübertragungswege beeinflussen (MacMILLAN-CROW et al. 1998).
2.3.3 Mangan-Superoxid-Dismutase
Superoxid-Dismutasen sind antioxidantische Enzyme, die eukaryotische Zellen vor der reaktiven Sauerstoffverbindung Superoxid schützen. Superoxid entsteht entweder als Nebenprodukt der Atmungskette oder über den Argininstoffwechsel (Kapitel 2.3.1.1; ISCHIROPOULOS et al. 1992; MONCADA u. HIGGS 1993;
BECKMANN u. KOPPENOL 1996). Die oxidierte Form des Enzyms reagiert mit einem Superoxidion unter Bildung von Sauerstoff und der reduzierten Form des Enzyms. Diese Form reagiert weiter mit einem zweiten Superoxidion und zwei Protonen, wobei Wasserstoffperoxid sowie die oxidierte Form des Enzyms entstehen. ISCHIROPOULOS et al. (1992) beschreiben die Superoxid-Dismutase als Katalysator bei der Nitration von Tyrosin durch Peroxynitrit.
Drei Formen der Superoxid-Dismutase werden beim Menschen beschrieben: Die zytosolische Superoxid-Dismutase (CuZn-SOD, SOD 1), die mitochondriale Superoxid-Dismutase (Mn-SOD, SOD 2) und die extrazelluläre Superoxid-Dismutase (EC-SOD, SOD 3) (McCORD u. FRIDOVICH 1969; WEISINGER u. FRIDOVICH 1973; FRIDOVICH 1986). Nitration und Inaktivierung der Mn-SOD bewirken einen dramatischen Anstieg des mitochondrialen Superoxids, der wiederum zu einem ansteigenden Peroxynitritlevel führt und somit eine verstärkte Nitration und Oxidation anderer mitochondrialer Proteine bewirkt (MacMILLAN-CROW et al. 1998).
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