Siriusrot-Färbung F3B Technik

Um eine Unterscheidung von neutrophilen Granulozyten von eosinophilen Granulozyten zu gewährleisten, wurden unklare Fälle mit der Siriusrot-Färbung F3B Technik nach BOGOMOLETZ (1980) gefärbt. Hierbei stellen sich die Granula der eosinophilen Granulozyten intensiv rot dar.

1. Entparaffinieren der Schnitte in absteigender Alkoholreihe (dreimal 5 Min. in Roti®-Histol, 5 Min. in Isopropanol, 2 bis 3 Min. in 96%igem Ethanol,

2 bis 3 Min. in 70%igem Ethanol, anschließend in Aqua dest.;

2. 5 Min. in Aqua dest. Spülen;

3. ca. dreimal in 70%igem Ethanol tauchen bis keine Schlieren mehr auf dem Objektträger sichtbar sind;

4. 24 Stunden Siriusrot-Farblösung bei Raumtemperatur;

5. 10 Min. Spülen in Aqua dest.;

6. einmal in frisches Hämalaun nach Mayer (Fa. Roth GmbH, Karlsruhe) tauchen;

7. ca. 5 Min. Wässern unter Leitungswasser bis der Schnitt leicht bläulich ist;

8. einmal in 70%iges Ethanol tauchen;

9. 2 Min in 80%iges Ethanol;

10. 30 Sek. in 96%iges Ethanol;

11. 30 Sek. in Isopropanol;

12. 5 Min. in Essigsäurebutylester (EBE);

13. Eindecken mit Corbit-Balsam (Fa. Hecht, Kiel).

3.5 In situ-Hybridisierung 3.5.1 Sondensynthese

Für die Untersuchung mittels in situ-Hybridisierung wurde in Zusammenarbeit mit dem Institut für Bakteriologie, Mykologie und Hygiene der Veterinärmedizinischen Universität in Wien eine Digoxigenin (DIG)-markierte Sonde zum Nachweis von M.

bovis-DNA synthetisiert. Hierfür wurde die von LYSNYANSKY et al. (1996, 2001a) veröffentlichte Sequenz des VspA-Gens des M. bovis-Stammes PG45 zu Grunde gelegt.

Material und Methoden 33

3.5.2 Primer

Es wurden Primer mit folgender Sequenz produziert:

Zunächst wurde ein vorwärts gerichteter Primer (3´ nach 5´) mit der Bezeichnung vsp-69/26m synthetisiert. Dieser kodiert in der vis-box, der Region der vsp inversion sequence, (Position ab -69 N-terminales Ende nach LYSNYANSKY et al. 2001a) und besitzt die Sequenz GATATTTATTGATAGATTTATAAAGC.

Als zweites wurde ein vorwärts gerichteter Primer (3´ nach 5´) mit der Bezeichnung ON25m hergestellt. Dieser kodiert in der Region vor der vis-box (sofern ein Vsp angeschaltet ist, Position -115 nach LYSNYANSKY et al. 2001a) und besitzt die Sequenz GTTTGATTAAGCTTTTATTTAGTTC.

Als rückwärts gerichteter Primer (5´ nach 3´) wurde ein Primer mit der Bezeichnung Vsp+100/24m synthetisiert. Dieser kodiert am Ende der Signalsequenz ab der Position +102 nach LYSNYANSKY et al. (2001a) bzw. ab der Position +162 nach LYSNYANSKY et al. (1996) und trägt die Sequenz TGGTTTATTTTCTTCTTTGGTCTC.

Daraus entstanden zwei unterschiedlich große mögliche Sonden: Zum einen ergab die Primerkombination vsp-69/26m und vsp+100/24m eine Sonde von 171bp Größe (bezeichnet mit VspAI) zum anderen die Primerkombination ON25m und vsp+100/24m eine Sonde von 217bp Größe (bezeichnet mit VspAII). Während VspAI lediglich Anteile der Sequenz nachwies, die für Proteinstrukturen des Oberflächenantigens codieren, detektierte VspAII zusätzlich die vorgeschaltete Sequenz des vspA-Gens, welche benötigt wird, wenn das VspA auf der Oberfläche von M. bovis exprimiert werden soll, also „eingeschaltet“ ist.

3.5.3 PCR

Die Bedingungen für die PCR mit den jeweiligen Primerpaaren für spezifische Banden aus M. bovis-DNA lagen bei 94°C für 2 Min. mit anschließend 30 Zyklen mit einer Denaturierungstemperatur von 94°C für 1 Min., einer Anlagerungstemperatur

von 56°C für 70 Sek. und einer Verlängerungstemperatur von 72°C für 20 Sek. Die Konzentration von Magnesium lag bei 2,5 mM.

Während der PCR wurden die regulären Nukleotide desoxy-Adenin-Tri-Phosphat (dATP), desoxy-Cytosin-Tri-Phosphat (dCTP) und desoxy-Guanin-Tri-Phosphat (dGTP) in der Konzentration von 1 mM und desoxy-Thymin-Tri-Phosphat (dTTP) in der Konzentration von 0,65 mM zugegeben. Zusätzlich wurde Digoxigenin-11-desoxy-Uracil-Tri-Phosphat (Digoxigenin-dUTP) in der Konzentration von 0,35 mM zugefügt. Dieses wird teilweise an Stelle der Pyrimidinbase dTTP in den neu synthetisierten DNA-Strang eingebaut.

3.5.4 Sondentests

3.5.4.1 Hybridisierung im Southern Blot

Für eine Hybridisierung im Southern Blot wurde M. bovis-DNA isoliert, enzymatisch mit HindIII gespalten und in einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Die aufgetrennte DNA wurde anschließend auf eine Nitrozellulosemembran übertragen (geblottet). Die Nitrozellulosemembran wurde für 16 Stunden in 10 ml eines 4 µl VspAI-Sonde enthaltenden Church-Puffers bei 50°C hybridisiert. Anschließend wurde die Membran 2 x 5 Min. bei Raumtemperatur in 0,1%iger SDS in 2 x SSC gewaschen. Es folgten zwei weitere Waschschritte für 20 Min. in 0,1%iger SDS in 0,5 x SSC bei 50°C. Die Visualisierung der hybridisierten Sonde erfolgte analog zu dem Protokoll der in situ-Hybridisierung (siehe dort) mit alkalischer Phosphatase-gekoppelten, gegen Digoxigenin gerichteten Antikörpern.

3.5.4.2 Ausschluss von Kreuzreaktionen

Um auch mögliche Kreuzreaktivitäten der Sonden mit anderen Bakterien, speziell den bei einigen Kälbern nachgewiesenen Keimen der Spezies Arcanobacterium pyogenes, Pasteurella multocida und M. bovirhinis ausschließen zu können, wurde von diesen Bakterien sowie von weiteren nachgewiesenen Keimen ebenfalls DNA extrahiert, mittels HindIII enzymatisch verdaut und einer Hybridisierung mit den Sonden VspAI und VspAII in einem Southern Blot-Verfahren unterzogen. Um sicherzustellen, dass sich DNA dieser Bakterien im Blot befanden, wurde mit einer DIG-markierten Sonde hybridisiert, welche die bei allen Bakterien vorhandene

Material und Methoden 35

eubakterische 16S rDNA nachweist („universal eubacterial“ 16S rDNA). Diese Sonde wurde nach LANE (1991) mit den Primern 27f und 1492r synthetisiert.

3.5.5 Durchführung der in situ-Hybridisierung

Die Durchführung der in situ-Hybridisierung erfolgte nach einem speziell für den Nachweis von M. bovis-DNA mittels der erwähnten VspA-Sonden modifizierten Protokoll der von KWON und CHAE (1999) beschriebenen Methode. Alle Lösungen und Puffer wurden vor Gebrauch autoklaviert und die Glaswaren mit Heißluft sterilisiert. Während der Durchführung wurden Einmal-Handschuhe getragen. Die Inkubation erfolgte bei Raumtemperatur in Standküvetten mit bis zu 16 Schnitten. Bei von der Raumtemperatur abweichenden Temperaturen wurden die entsprechenden Lösungen im Wasserbad vorgewärmt und die Inkubation in diesem durchgeführt. Die Herstellung aller verwendeten Puffer und Lösungen ist im Anhang beschrieben.

3.5.6 Chromogen

Als Chromogen wurde Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NTB) eingesetzt. Es wurden eine NBT-Stammlösung aus 1 g Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NBT; Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) und 13 ml 70%igem Dimethylformamid (30 ml Aqua bidest. + 70 ml Dimethylformamid, Fa. Merck KGaA, Darmstadt), sowie eine 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat- (Phosphat, BCIP) Stammlösung aus 500 mg X-Phosphat (Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) und 10 ml 100%igem Dimethylformamid hergestellt. Beide Lösungen wurden nicht autoklaviert und während der in situ-Hybridisierung wie folgt weiterverarbeitet: 270 µl NBT und 210 µl BCIP sowie 15 mg Levamisol (Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) werden mit Puffer 3 auf 60 ml aufgefüllt. Durch die an dem gegen Digoxigenin gerichteten Antikörper gekoppelte alkalische Phosphatase (Anti-Digoxigenin-AP, Fa.

Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) wird das Gemisch NBT/BCIP zu einem violetten Reaktionsprodukt umgewandelt. Dieser Farbniederschlag ist sehr stabil und lagert sich in unmittelbarer Nähe des Entstehungsortes ab.

3.5.7 Kontrollmaterial

Als positives Kontrollmaterial wurde zum Nachweis der M. bovis-DNA unverändertes bovines Lungengewebe vom Schlachthof (Fa. Vossding, Gleidingen) verwendet.

Dieses stammte von einem männlichen, lungengesunden Rind mit einem Alter von 23 Monaten. Hiervon wurden in Anlehnung an BOYE et al. (2001) Lungenproben mit konzentrierter M. bovis-Suspension injiziert. Die Mykoplasmensuspension wurde freundlicherweise von dem Institut für Bakteriologie, Mykologie und Hygiene, Veterinärmedizinische Universität Wien, zur Verfügung gestellt. Diese wurde zuvor mehrmals zentrifugiert und mit 1 x PBS gewaschen, um eine möglichst konzentrierte Mykoplasmensuspension zu erhalten. Anschließend wurden die Lungenproben routinemäßig in Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Als Negativkontrolle wurde von jeder Gewebelokalisation zusätzlich ein Kontrollschnitt mit Hybridisierungspuffer ohne Sondenzusatz inkubiert.

3.5.8 Protokoll für die in situ-Hybridisierung

1. Paraffinschnitte auf Superfrost® plus Objektträger aufziehen und im Wärmeschrank bei 70°C 60 Min. trocknen lassen;

2. Entparaffinierung der Schnitte, dreimal für 5 Min. in Roti®-Histol und je 5 Min. in Isopropanol, 96%igem und 70%igem Ethanol, anschließend für 5 Min. und dann 1 Min. in Aqua bidest. (ab Aqua bidest. in Standküvette verbringen);

3. Spülen der Schnitte, einmal für 5 Min. in 1 x PBS;

4. zum Aufschluss der Zellmembranen Inkubation für 20 Min. in 0,2 M HCl;

5. Spülen der Schnitte, zweimal für 30 Min. mit 2 x SSC + 5 mM EDTA-Na2 bei 50°C;

6. Proteolyse mit 7,5 µg/ml Proteinase K für 15 Min. bei 37°C (1 ml 1 M Tris, pH 8,0 + 1 ml 0,1 M CaCl2 + 22,5 µl Proteinase K ad 60 ml Aqua bidest.);

7. Abstoppen der Proteolyse durch Inkubation in 0,2%igem Glycin-PBS für 5 Min.;

8. Nachfixierung der Schnitte in 4%igem Paraformaldehyd für 4 Min.;

9. Spülen der Schnitte, zweimal für 1 Min. in 1 x PBS;

Material und Methoden 37

10. Spülen der Schnitte für 15 Min. mit 1 x PBS + 5 mM MgCl2 (frisch herstellen);

11. Azetylierung in 0,25%igem Azetanhydrid in 0,1 M Triethanolamin, pH 7,5, für 10 Min. (frisch herstellen);

12. Spülen der Schnitte, zweimal für 1 Min. und anschließend für 15 Min. in 1 x PBS;

13. Prähybridisierung für mindestens 60 Min. bei 37°C im

Prähybridisierungspuffer (unter Verwendung einer eingefrorenen Stammlösung frisch herstellen);

14. Hybridisierungspuffer herstellen (unter Verwendung einer eingefrorenen Stammlösung, frisch) mit bzw. ohne den Zusatz der spezifischen Sonde und Überschichten der Schnitte mit 35 µl; mit Gel-bond®-Film (Fa. FMCR®

bioproducts, Göttingen) abdecken und mit Fix-O-Gum® (Fa. Marabuwerke GmbH & Co KG, Tamm) gut abdichten;

15. Denaturieren für 10 Min. waagrecht auf einer Heizplatte mit 95°C;

16. Hybridisierung für 16 Stunden bei 37°C im Wärmeschrank und feuchter Kammer;

17. Posthybridisierungswaschung (nach Abheben des Gel-bond®-Films und des Fix-O-Gum® mit einer Pinzette) zweimal für 15 Min. bei 42°C mit

6 x SSC+45%iges Formamid (frisch herstellen);

18. Spülen der Schnitte, zweimal für 5 Min. mit 2 x SSC;

19. Spülen der Schnitte, zweimal für 15 Min. mit 0,2 x SSC bei 42°C;

20. Spülen der Schnitte, für 1 Min. mit Puffer 1;

21. Inkubation für 30 Min. mit Block-Lösung (Puffer 2, frisch herstellen);

22. Inkubation der Schnitte für 2 Stunden mit Anti-DIG-Antikörper (Fa. Roche Diagnostics GmbH, Mannheim; alkalische Phosphatase-konjugiert) 1:200 verdünnt in Antikörperpuffer (frisch herstellen);

23. Spülen der Schnitte, zweimal für 15 Min. mit Puffer 1;

24. Spülen der Schnitte, zweimal für 5 Min. mit Puffer 3;

25. Inkubation der Schnitte mit der Färbelösung (s. Abschnitt 3.5.6) für ca.

16 Stunden im Dunkeln (Färbelösung frisch herstellen aus Stammlösung);

26. Abstoppen der enzymatischen Reaktion in Puffer 4, zweimal für 10 Min.;

27. Spülen der Schnitte für zweimal 2 Min. in Aqua bidest. und anschließend unter fließendem Leitungswasser;

28. Gegenfärben mit Hämalaun nach Mayer (Fa. Roth GmbH, Karlsruhe) für 15 Sekunden;

29. Wässern und Bläuen unter fließendem Leitungswasser für 15 Min.;

30. Eindecken mit auf 50°C vorgewärmtem Glycergel® (Fa. DakoCytomation GmbH, Hamburg).

3.5.9 Kontrolle der endogenen Peroxidasen

Um sicherzustellen, dass das nachgewiesene Präzipitat des durch alkalische Phosphatase katalysierten Chromogens NBT/BCIP nicht durch endogene Peroxidasen katalysiert wurde, wurde während der Etablierung der Methode versuchsweise eine Vorbehandlung der Schnitte mit einer 0,5%igen Wasserstoffperoxidlösung durchgeführt. Diese führt zu einer Hemmung der vorhandenen Peroxidasen. Hierfür wurden die Schnitte zunächst entparaffiniert und dann für 30 Min. in 85%igem Ethanol und 0,5%iger Wasserstoffperoxidlösung inkubiert und anschließend mit 1 x PBS gespült. Es folgte das Protokoll der ISH wie oben aufgeführt ab Punkt 4.

3.5.10 Auswertung

Als positiv gewertet wurden NBT-Präzipitate, die sich in derselben Ebene wie der Schnitt befanden und in den nur mit Hybridisierungspuffer inkubierten, negativen Kontrollen nicht vorhanden waren.

3.6 Immunhistochemie 3.6.1 Antikörper

Für die immunhistologische Darstellung von M. bovis-Antigen wurde ein monoklonaler Maus-anti-Mycoplasma bovis-Antikörper verwendet. Dieser wurde erstmalig von ADEGBOYE et al. (1995a) beschrieben und ist unter der Bezeichnung MAB970 kommerziell erhältlich (Fa. Chemicon international, Temecula, USA). Der Antikörper der Subklasse IgG wurde mit dem M. bovis-Stamm M23 produziert und

Material und Methoden 39

richtet sich gegen nicht genauer definierte Epitope von M. bovis (ADEGBOYE et al.

(1995a). Das Protokoll für die Verwendung am Formalin-fixierten und Paraffin-eingebetteten Material wurde in Anlehnung an die von ADEGBOYE et al. (1995b) beschriebene Methode als Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex-Methode modifiziert.

Die Verdünnung des Antikörpers betrug 1:1000.

3.6.2 Chromogen

Als Chromogen für die immunhistochemische Untersuchung diente 3,3’-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid (DAB, Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) in PBS-Puffer. Dieses wird durch die an den sekundären Antikörper angelagerte Peroxidase des Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplexes unter Zusatz von Wasserstoffperoxid (H2O2, Fa. Sigma-Aldrich) zu einem braunen Reaktionsprodukt umgewandelt. Dieser Farbniederschlag ist sehr stabil und lagert sich in unmittelbarer Nähe des Entstehungsortes ab.

3.6.3 Kontrollen

Als positives Kontrollmaterial wurde zum Nachweis von M. bovis-Antigen analog zu der ISH Lungenmaterial vom Schlachthof (Fa. Vossding, Gleidingen) verwendet.

Hiervon wurden Lungenproben mit konzentrierter M. bovis-Suspension injiziert. Die Mykoplasmensuspension wurde freundlicherweise von dem Institut für Bakteriologie, Mykologie und Hygiene, Veterinärmedizinische Universität Wien zur Verfügung gestellt. Von jedem Gewebe wurde als Negativkontrolle zusätzlich ein Kontrollschnitt nach gleichem Protokoll behandelt, indem anstelle des primären Antikörpers mit Aszitesflüssigkeit von nicht-immunisierten Balb/C Mäusen (Balb/C-Serum, Fa.

Biologo, Kronshagen) in einer Konzentration von 1:10000 inkubiert wurde.

3.6.4 Protokoll für die Immunhistochemie mit MAB970

1. Entparaffinierung der Schnitte, dreimal für 5 Min. in Roti®-Histol und je 5 Min. in Isopropanol, 96%igem und 70%igem Ethanol;

2. Hemmung der endogenen Peroxidase in 0,5%igem H2O2 in 85%igem Alkohol für 30 Min. bei Raumtemperatur auf einem Magnetrührer;

3. dreimaliges Waschen der Schnitte in 1 x PBS für je 5 Min.;

4. Demaskierung: Proteolytische Vorbehandlung in 0,05%iger Protease XIV-Lösung in vorgewärmter 1 x PBS (Protease XIV, Fa. Merck KGaA,

Darmstadt) mit 0,02% CaCl2, pH 7,4;

5. dreimaliges Waschen der Schnitte in 1 x PBS für je 5 Min.;

6. Verbringen der Schnitte in Coverplates^TM und Sequenza^®-Einsätze (Thermo Electron GmbH, Dreieich);

7. Überschichten mit 1:5 verdünntem inaktiviertem Ziegen-Normalserum (normal goat serum, NGS) in 1 x PBS für 20 Min.;

8. Auftragen des Primärantikörpers Maus-anti-Mycolasma bovis monoklonaler Antikörper MAB970 (Fa. Chemicon international, Temecula, USA) verdünnt 1:1000 in 1 x PBS mit 1%igem bovinem Serumalbumin (BSA) und

Inkubation der Schnitte für 16 Stunden bei 4°C im Kühlschrank;

9. dreimaliges Waschen der Schnitte in 1 x PBS mit 0,05% Tween 20 für je 5 Min.;

10. Auftragen des Sekundärantikörpers biotiniliertes Ziege-anti-Maus-Serum (GAM-b, BA-9200, Fa. Vector, Burlingame, USA) 1:200 verdünnt in 1 x PBS und Inkubation für 30 Min.;

11. dreimaliges Waschen der Schnitte in 1 x PBS mit 0,05% Tween 20 für je 5 Min., anschließend noch einmal in reinem 1 x PBS für 5 Min.;

12. Inkubation der Schnitte mit dem Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex

Vectastain Elite ABC Kit (PK-6100, Fa. Vector, Burlingame, USA) für 30 Min.

bei Raumtemperatur (Herstellung des ABC-Komplexes mindestens 30 Min.

vor Gebrauch);

13. dreimaliges Waschen der Schnitte in 1 x PBS für je 5 Min.;

14. Inkubation der Schnitte mit 0,05% 3,3’-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid (DAB) in 1 x PBS, pH 7,2, mit Zusatz von 3%iger H2O2-Lösung

(Endkonzentration 0,03%) für 5 Min. auf dem Magnetrührer bei Raumtemperatur;

15. dreimaliges Waschen der Schnitte in 1 x PBS für je 5 Min.;

16. Spülen der Schnitte unter fließendem Leitungswasser;

Material und Methoden 41

17. Färben der Schnitte für einige Sekunden (ca. 15 bis 20 Sekunden) bis zur gewünschten Farbintensität in Hämalaun nach Mayer (Fa. Roth GmbH, Karlsruhe);

18. Bläuen der Schnitte unter fließendem Leitungswasser für 15 Min.;

19. Entwässern der Schnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe: 50%iger, 70%iger, 96%iger Alkohol für jeweils 3 Min., Isopropylalkohol (5 Min.), Roti®-Histol dreimal je 5 Min.;

20. Eindecken mit Corbit-Balsam (Fa. Hecht, Kiel).;

3.6.5 Auswertung

Als positiv gewertet wurden braune Pigmentablagerungen, die sich in derselben Ebene wie der Schnitt befanden und in den nur mit Balb/C inkubierten negativen Kontrollen nicht vorhanden waren.

3.7 Befunderhebung und Auswertung der Daten

Die Schnittpräparate der Untersuchungen mittels HE-Färbung, Azan-Färbung, ISH und IHC wurden mit Hilfe eines Standard-Binokular-Lichtmikroskops (Fa. Carl Zeiss AG, Oberkochen) lichtmikroskopisch ausgewertet. Die Schnitte wurden mäanderförmig abgefahren und die histopathologischen Veränderungen bzw.

positiven Signale semiquantitativ nach ihrem geschätzten Schweregrad (0 = keine, 1 = vereinzelt, 2 = geringgradige, 3 = mittelgradige, 4 = hochgradige Veränderungen) bzw. nach ihrem Vorhandensein (j = Signal vorhanden, n = kein Signal detektierbar) ausgewertet. Vorhandene Nekrosen wurden zur besseren Orientierung im Schnitt nach ihrer Ausdehnung eingeteilt, gezählt und jeweils durchnummeriert. Zwecks Einteilung nach Größe wurden unter 5 mm Durchmesser, 5 bis 10 mm Durchmesser und über 10 mm Durchmesser festgelegt.

Die fotographische Dokumentation erfolgte mit einem Mikroskop Axiophot (Fa. Carl Zeiss AG, Oberkochen) und mit Elite Chrome 160 T Diafilmen (Fa. Kodak GmbH, Stuttgart).

Ergebnisse 43

4 Ergebnisse

4.1 Ergebnisse der Sondentestung

4.1.1 Nachweis von Mycoplasma bovis-DNA im Southern Blot Die mittels HindIII gespaltene DNA von M. bovis PG45 wurde einem Southern Blot Verfahren unterzogen und anschließend mit in Church-Puffer zugefügten VspAI- bzw. VspAII-Sonden hybridisiert. Hierbei konnten positive Signale in einzelnen Banden der aufgetrennten M. bovis-DNA nachgewiesen werden. Somit konnte gezeigt werden, dass die Sonde spezifisch mit M. bovis-DNA hybridisierte. Das Ergebnis des Southern Blots für die Sonde VspAI ist in Abbildung 2b Spur 10 dargestellt.

Genomische DNA von 1: Histophilus somni 2: Arcanobacterium pyogenes

3: Acholeplasma laidlawii 4: Enterococcus sp.

5: M. bovirhinis

6: Pasteurella multocida 7: α-hämolysierende Streptococcus spp.

8: Staphylococcus spp.

9: Mannheimia haemolytica 10: M. bovis PG45

Abbildung 2: Southern Blot (DNA verdaut mit HindIII):

a) DIG-markierte Sonde für „universal eubacterial“ 16S rDNA, b) VspAI-Sonde

DIG: Digoxigenin; M.: Mycoplasma; spp.: species;

4.1.2 Spezifitätstest

Ebenfalls mittels HindIII wurde die DNA von allen sonstigen in den Proben von den Tieren der Gruppen 3 und 4 nachgewiesenen Keimen enzymatisch gespalten und ebenfalls im Southern Blot Verfahren untersucht. Hierzu gehörten unter anderem Arcanobacterium pyogenes, Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida und M.

bovirhinis. Mit der Sonde für „universal eubacterial“ 16S rDNA konnte gezeigt werden, dass sich aufgetrennte DNA im Blot befand. Mit der Sonde VspAI konnten nur bei der parallel erfolgten Kontrolle von aufgetrennter M. bovis-DNA Signale detektiert werden. Die Ergebnisse der jeweiligen Southern Blots sind in Abbildung 2a und b zu sehen.

4.2 Histopathologische Ergebnisse

Für die Auswertung der histopathologischen Ergebnisse dienten HE-gefärbte Schnitte sowie mit Spezialfärbungen in Form von Azan- und Siriusrot-Färbung behandelte Schnitte. Die Anzahl der untersuchten Blöcke, sowie die Anzahl der Blöcke mit Lungenveränderungen in Form von Nekrosen, katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonie und obliterierender Bronchiolitis der einzelnen Kälber sind in den Tabelle 6 bis Tabelle 9 im Anhang zusammengefasst.

4.2.1 Gruppe 1 (Kontrollgruppe)

In der Kontrollgruppe zeigten zwei Tiere (E2934/00 und E2935/00) keine histopathologischen Veränderungen. Die Tiere E1504/99, E1505/99 und E1650/99 wiesen vereinzelte bis geringgradige, in einem Fall (E1650/99) auch mittelgradige, katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonien in mehreren Lokalisationen auf. Des Weiteren fand sich in allen untersuchten Lokalisationen eine geringgradige, interstitielle Pneumonie. Bei Tier E1505/99 konnten zudem in einer Lokalisation obliterierende Bronchiolitiden nachgewiesen werden. Hierbei wird das Lumen des Bronchiolus durch Bindegewebszubildungen nach Alteration des Epithels verlegt (Abbildung 28, Kap. 4.5). Der Nachweis des neu gebildeten Bindegewebes erfolgte mit der Azanfärbung. Diese führt zu einer blauen Färbung des extrazellulär gelegenen Kollagens (Abbildung 29, Kap. 4.5). Zusätzlich fand sich bei Tier E1505/99 in einer Lokalisation eine über 10 mm im Durchmesser messende Nekrose. Diese zeigte ein wolkiges Erscheinungsbild, deren einzelne Unterregionen

Ergebnisse 45

durch dünne Bindegewebssepten abgeteilt wurden. Dadurch ergab sich eine Formation, die an ehemalige Alveolen erinnerte. An der Peripherie der nekrotischen Areale fanden sich wenige Bindegewebsfasern mit einzelnen Makrophagen und neutrophilen Granulozyten. Die gesamte Nekrose war sehr fibrinreich, welches besonders an den Grenzen zu gesundem Gewebe zu beobachten war. Dieses entspricht dem Bild einer fibrinösen Pneumonie (siehe Abbildung 9, Kap.4.5).

4.2.2 Gruppe 2

Bei den Tieren der Gruppe 2 wies das Tier mit der Nummer 5 in mehreren Lokalisationen nekrotische Areale auf (5 von 10) (Abbildung 9, Kap. 4.5). Diese zeigten ein wolkiges Erscheinungsbild, deren einzelnen Unterregionen durch dünne Bindegewebssepten abgeteilt wurden. Dadurch ergab sich eine Formation, die an ehemalige Alveolen erinnerte (Abbildung 10 und Abbildung 11, Kap. 4.5). An der Peripherie der nekrotischen Areale fanden sich wenige Bindegewebsfasern mit einzelnen Makrophagen und neutrophilen Granulozyten. Fünf Tiere (2, 5, 10, 12 und 13) zeigten in mehreren Lokalisationen eine bis zu mittelgradige, katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie. Eine interstitielle Pneumonie fand sich in nahezu allen untersuchten Lokalisationen. Hierbei war diese zum Teil mittelgradig, wobei bei Tier 5 einmal eine hochgradige, interstitielle Pneumonie diagnostiziert wurde.

Obliterierende Bronchiolitiden konnten bei keinem der Tiere nachgewiesen werden.

4.2.3 Gruppe 3

Die Tiere dieser Gruppe wiesen ein sehr heterogenes histopathologisches Bild auf.

Zum einen zeigte Tier Nummer E2936/00 Nekrosen (Abbildung 15, Kap. 4.5) in mehreren Blöcken verschiedener Lokalisationen (10 von 18). Die Nekrosen zeigten eine deutliche bindegewebige Kapsel (Abbildung 16 und Abbildung 14, Kap. 4.5), umgeben von einem Wall von Makrophagen, der von Lymphozyten und Plasmazellen infiltriert wurde (Abbildung 13, Kap. 4.5). Die nächste Schicht wurde durch zahlreiche neutrophile Granulozyten gebildet, die sich zum Teil im Untergang befanden. Zentral zeigte sich eine amorphe, in der HE-Färbung eosinophile Masse (Abbildung 12, Kap. 4.5). Gleichartige Nekrosen fanden sich auch bei den Tieren E1507/99 und E1512/99, die mit einer hohen Dosis einer Mykoplasmensuspension infiziert wurden (10¹⁰ CFU/ml). Von den Tieren, die mit einer niedrigeren Dosis an

Mykoplasmensuspension infiziert wurden (10 CFU /ml), konnte nur bei Tier 1511/99 in einer Lokalisation eine Nekrose nachgewiesen werden. Am häufigsten wurden Nekrosen unter 5 mm gefunden (88 von 135), gefolgt von Nekrosen zwischen 5 und 10 mm (37 von 135). Am wenigsten waren über 10 mm große Nekrosen vorhanden (10 von 135). Die meisten Nekrosen fanden sich mit 85 von 135 in den mittleren Lungenabschnitten (Lokalisation 2 und 5). Die prozentuale Verteilung der Nekrosen bezogen auf die einzelnen Lokalisationen und Nekrosengrößen ist in Abbildung 3 dargestellt.

< 5 mm 5 -10

mm 10 mm Summe 0.00%

10.00%

20.00%

30.00%

40.00%

50.00%

60.00%

70.00%

Lok. 3/4 Lok. 2/5 Lok. 1/6

Abbildung 3: Prozentuale Verteilung der Nekrosen (n = 135) in Gruppe 3.

Lok.: Lungenlokalisationen (vergleiche Abbildung 1)

Eine katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie zeigte sich bei allen Tieren in mehreren Lokalisationen. Diese war meist gering- bis mittelgradig, vereinzelt auch hochgradig, wobei zum einen die vorderen Lokalisationen (Lokalisation 1 und 6 sowie 2 und 5) häufiger betroffen waren als die kaudalen (Lokalisation 3 und 4). Zum anderen wiesen die Tiere mit der höheren Infektionsdosis häufiger und stärkere

Eine katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie zeigte sich bei allen Tieren in mehreren Lokalisationen. Diese war meist gering- bis mittelgradig, vereinzelt auch hochgradig, wobei zum einen die vorderen Lokalisationen (Lokalisation 1 und 6 sowie 2 und 5) häufiger betroffen waren als die kaudalen (Lokalisation 3 und 4). Zum anderen wiesen die Tiere mit der höheren Infektionsdosis häufiger und stärkere

Im Dokument Nachweis von Mycoplasma bovis in der Lunge von experimentell infizierten Kälbern mittels in situ-Hybridisierung (Seite 48-0)