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Untersuchungen zum Vorkommen von Fledermaus-assoziierten Virusinfektionen in Deutschland und zur Diagnostik und molekularen
Pathogenese Flughund-assoziierter zoonotischer Paramyxoviren
I
NAUGURAL– D
ISSERTATIONzur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )
vorgelegt von
Linda Cecile Kwasnitschka München
Hannover 2016
Wissenschaftliche Betreuung apl. Prof. Dr. Martin H. Groschup Tierärztliche Hochschule Hannover Friedrich-Loeffler-Institut, Riems PD Dr. Anne Balkema-Buschmann Friedrich-Loeffler-Institut, Riems
1. Gutachter Prof. Dr. Martin H. Groschup
2. Gutachter Prof. Dr. Paul Becher
Tag der mündlichen Prüfung: 23.05.2016
Meiner Familie
Inhaltsverzeichnis
I Einleitung ... 1
II Literaturübersicht ... 2
1 Fledertiere als Virusreservoir ... 2
2 Bedeutung und Prävalenzen der untersuchten Viren ... 3
2.1 Coronaviren ... 3
2.2 Adenoviren ... 5
2.3 Astroviren ... 5
2.4 Henipaviren ... 6
2.4.1 Rezeptorbindung des Hendravirus – Anlagerung und Membranfusion ... 10
III Material und Methoden ... 12
1 Fledermäuse ... 12
1.1 Fledermausschutz ... 12
1.2 Herkunft der Fledermäuse ... 12
2 Probenahme und Probenumfang ... 14
3 Molekularbiologische Untersuchung ... 16
3.1 Nukleinsäureextraktion ... 16
3.2 Polymerase Kettenreaktion (PCR) ... 17
3.2.1 Nested RT-PCR zur Detektion von Coronaviren ... 17
3.2.2 Nested PCR zur Detektion von Adenoviren ... 18
3.2.3 Seminested RT-PCR zu Detektion von Astroviren ... 19
3.2.4 Seminested RT-PCR zur Detektion von Paramyxoviren ... 19
3.3 Analyse der PCR-Produkte im Agarosegel und Aufreinigung der DNA ... 20
3.4 Sequenzierung und phylogenetische Analysen ... 21
3.4.1 TOPO TA Cloning... 21
3.4.2 Sanger Sequenzierung ... 23
3.4.3 Auswertung der Sequenzen und phylogenetische Analysen ... 24
4 Anzuchtversuche für deutsche Fledermaus-Paramyxoviren ... 25
5 Generierung und Validierung polyklonaler und monoklonaler Antikörper gegen Proteine des Hendravirus ... 27
5.1 Peptide des Attachment- und des Fusions-Proteins ... 27
5.2 Synthese und Aufreinigung von Matrix- und Nukleokapsidprotein ... 28
5.3 Immunisierung von Kaninchen zur Serumgewinnung gegen das Hendra Fusions- Attachment-, Matrix- und Nukleokapsidprotein ... 31
5.4 Validierung monoklonaler Antikörper gegen das Matrixprotein und das Nukleokapsidprotein des Hendravirus ... 32
6 Testmethoden zum Nachweis der Antikörperbindung ... 32
6.1 Zelltransfektion ... 32
6.2. Indirekte Immunfluoreszenz ... 33
6.3 Western Blot ... 35
7 Indirekter speziesunabhängiger IgG ELISA auf Grundlage des Hendravirus Nukleokapsidproteins ... 36
8 Untersuchungen zu Rezeptorbindung und Synzytienformation durch das Fusions- und das Attachment-Protein des Hendravirus sowie deren Inhibition ... 38
8.1 Synzytieninduktion in HEK293T- und BSR T7-Zellen ... 38
8.2 Klonierung und Expression von Ephrin B2 ... 39
8.3 Fusionsversuche in Zellen ohne endogene Ephrin-Expression (HeLa-Zellen) ... 43
8.3.2 Transfektion von Ephrin-negativen Hela-Zellen ... 43
8.3.3 Fusionsversuche in HeLa-Zellen ... 44
8.4 Fusionsversuche in Zellen mit endogener Ephrin-Expression (HEK293T-Zellen) 44 8.4.1 Synzytieninhibition durch Peptide... 44
8.4.2 Fusionsversuche mit HEK293T-Zellen - Luziferaseassay ... 45
IV Ergebnisse ... 48
1 Untersuchte Tiere und Proben ... 48
2 Resultate der Untersuchung von Fledermaus-Feldproben auf Coronaviren ... 53
2.1 Prävalenzen ... 53
2.2 Phylogenetische Charakterisierung ... 54
3 Resultate der Untersuchung von Fledermaus-Feldproben auf Adenoviren ... 55
3.1 Prävalenzen ... 55
3.2 Phylogenetische Charakterisierung ... 55
4 Resultate der Untersuchung von Fledermaus-Feldproben auf Astroviren ... 56
4.1 Prävalenzen ... 56
4.2 Phylogenetische Charakterisierung ... 62
5 Resultate der Untersuchung von Fledermaus-Feldproben auf Paramyxoviren ... 67
5.1 Wahl der Primerpaare zu Detektion von Paramyxoviren nach Tong et. al, 2008 . 67 5.2 Prävalenzen ... 69
5.3 Phylogenetische Charakterisierung ... 71
6 Resultate der Anzuchtversuche für europäische Fledermaus-Paramyxoviren ... 74
7 Synthese und Aufreinigung des Nukleokapsidproteins des Hendravirus ... 75
8 Polyklonale Antikörper ... 76
8.1 Peptidseren gegen das Fusionsprotein F und das Attachment-Protein G des Hendravirus ... 76
8.2 Serum zur Detektion des Matrixproteins des Hendravirus ... 78
8.3 Serum zur Detektion des Nukleokapsidproteins des Hendravirus ... 80
9 Monoklonale Antikörper ... 84
9.1 Monoklonaler Antikörper gegen das Matrixprotein ... 84
9.2 Monoklonale Antikörper gegen das Nukleokapsidprotein ... 85
10 Etablierung eines indirekten ELISA ... 88
11 Synzytienformation in HEK293T sowie BSRT7-Zellen ... 93
12 Expression der Hendraproteine sowie von Ephrin B2 zur Induktion von Synzytien in Ephrin-defizienten Zellen (HeLa eph-Zellen) ... 95
13 Etablierung eines quantitativen Fusionsassays in HEK293T-Zellen ... 98
13.1 Synzytieninhibition durch Peptide ... 98
13.2 Luziferaseassay ... 99
V Diskussion ... 106
1 Bedeutung viraler Nukleinsäuresequenzen und deren Prävalenzen in Feldproben europäischer Fledermausarten ... 106
1.1 Coronaviren ... 107
1.2 Adenoviren ... 107
1.3 Astroviren ... 108
1.4 Paramyxoviren ... 109
2 Anzucht von europäischen Fledermaus-Paramyxoviren ... 112
3 Generierung und Validierung Hendravirus-spezifischer Antikörper ... 113
4 Etablierung eines indirekten, speziesunabhängigen Henipa-Virus ELISA für Pferde-
und Schweineseren ... 116
5 Effekte der Expression der Glykoproteine und des Matrixproteins des Hendravirus sowie des zellulären Rezeptors der Henipaviren Ephrin B2 auf eukaryotische Zellen ... 118
6 Quantifizierung von Zellfusion und deren Hemmung in einem Luziferaseassay ... 120
VI Zusammenfassung ... 122
VI Summary ... 124
VIIILiteraturverzeichnis ... 126
IX Tabellen ... 145
X Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen ... 154
XI Zellinien ... 160
XII Puffer und Medien ... 161
XIII Abkürzungsverzeichnis ... 164
XIII Danksagung ... 167
I Einleitung
Sowohl bei Flughunden (Unterordnung Megachiroptera) als auch bei Fledermäusen (Unterordnung Microchiroptera) verlaufen viele Infektionen mit für den Menschen potenziell tödliche Erkrankungen hervorrufenden Erregern offenbar asymptomatisch. Fledertiere der Unterordnungen Mega- und Microchiroptera werden aus diesem Grund als Reservoirwirte für Fledermaustollwut, Ebola-, Marburg-, SARS-Corona- und Henipaviren diskutiert. Das Vorkommen und die Weiterverbreitung von Virusinfektionen bei einheimischen Fledertieren sind in weiten Bereichen unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde deshalb eine diesbezügliche Monitoring-Untersuchung durchgeführt. Virologische Daten wurden ferner mit populationsdynamischen Daten verknüpft, um Aussagen über mögliche Übertragungswege zwischen verschiedenen Individuen einer Art oder auch über Speziesbarrieren hinweg zu machen. Hierzu wurden geeignete Viren und Fledermausspezies bzw. Lokalisationen ausgewählt, die anhand ihrer Prävalenzen und genetischen Diversität weiterführende Analysen für die folgenden Jahre ermöglichten.
Kürzlich publizierte serologische und molekularbiologische Nachweise von exotischen Henipaviren bei Flughunden außerhalb der eigentlichen Endemiegebiete in Australien und Südostasien warfen ferner die Frage auf, ob solche Viren auch bei europäischen Fledertieren vorkommen. Zu diesem Zweck wurden molekularbiologische (RT-PCR) und serologische (ELISAs unter Verwendung eines rekombinanten Nukleokapsidproteins sowie neuer poly- und monoklonaler Antikörper) Methoden zum diagnostischen Nachweis von Henipa- Virusinfektionen entwickelt bzw. etabliert, die nun für Monitoring-Studien und für diagnostische Untersuchungen zur Verfügung stehen.
Darüber hinaus wurden Untersuchungen zur zellulären Pathogenese bei Henipa- Virusinfektionen durchgeführt, indem die Interaktion des Proteinkomplexes aus den viralen Bindungs- und Fusionsproteinen mit dem zugehörigen zellulären Virusrezeptor anhand der daraus resultierenden Synzytienbildung in infizierten Zellen analysiert wurde. Zur Darstellung der hieran beteiligten Proteine konnten neu generierte poly- und monoklonale Antikörper eingesetzt werden. Ziel dieser Arbeiten war es, diesen Mechanismus in einem zu entwickelnden Zellkultur-Modell nachzustellen, um die Einflussnahme auf diesen für die
Zellinfektion verantwortlichen Komplex quantifizieren zu können und damit die Grundlagen für weiterführende Untersuchungen zu legen.
Da die Ergebnisse der vorgenannten Untersuchungen zum Zeitpunkt der Abgabe der Dissertationsschrift noch nicht als zur Veröffentlichung eingereichte Manuskripte vorlagen, wurde das klassische prosaische Format statt einer kumulativen Arbeit für die Darstellung der Arbeiten gewählt.
II Literaturübersicht
1 Fledertiere als Virusreservoir
Fledertiere sind neben der Tollwutinfektion durch Lyssaviren in jüngerer Zeit als Reservoirwirte mit asymptomatischen Infektionsverlauf für bei Primaten fatal verlaufende zoonotische Erkrankungen in den Fokus von Wissenschaft und Öffentlichkeit gerückt. So wurden sie als salvatisches Reservoir für schwerwiegende zoonotische Erreger wie dem Ebola-, Marburg-, SARS-Corona- (Severe Acute Respiratory Syndrome) und den Henipaviren diskutiert bzw. identifiziert (Calisher et al. 2006; Leroy et al. 2005; Hayman et al. 2010; Ge et al. 2013; Towner et al. 2009; Paweska et al. 2012; Halpin et al. 2000; Chua et al. 2002). Eine anlässlich dieser Beobachtungen durchgeführte Studie zeigt, dass Fledertiere in der Tat in signifikant überdurchschnittlichem Maße Wirte zoonotischer Viren sind, wobei die genauen Gründe und Mechanismen dabei noch nicht aufgeklärt sind (Luis et al. 2013). So werden eine lange Koevolution von Erreger und Wirt sowie besondere immunologische Eigenschaften und biologische Verhaltensmuster als begünstigende Faktoren diskutiert (Calisher et al. 2006). Zum einen scheint das Teilen von Lebensraum bzw. Quartieren durch verschiedene Fledermausspezies die Prävalenz und Diversität zoonotischer Viren innerhalb und zwischen den Spezies stark zu begünstigen. Der Einfluss von Torpor (Tagesstarre) und Überwinterung bedarf dabei jedoch noch weiterer Klärung. Auch verhindert die im Vergleich zu Nagetieren geringe Reproduktionsrate mit maximal drei Reproduktionszyklen bzw.
Jungtieren im Jahr einen kontinuierlichen Nachschub an naiven Individuen und reduziert somit die Viruslast in der Population (Luis et al. 2013). Der Einfluss des Reproduktionszyklus auf die Transmission von Henipaviren wurde bei Fledertieren in Form einer erhöhten
Serokonversionsrate der weiblichen Tiere während der späten Gravidität und Laktation beschrieben (Plowright et al 2008; Baker et al. 2013a). Dieser Effekt fällt in einer Studie mit individuell markierten und wiederholt getesteten Tieren zeitlich zusammen mit dem Abbau der maternalen Antikörper der Jungtiere aus dem Vorjahr, sodass es zu einer erhöhten horizontalen Transmission innerhalb der Kolonie kommt. Dabei sind die adulten Männchen nicht von dieser Fluktuation der Ausscheidung betroffen (Baker et al. 2013a).
2 Bedeutung und Prävalenzen der untersuchten Viren
Sowohl bei den aus der Literatur entnommenen als auch in dieser Arbeit generierten Daten zu den Prävalenzen der unterschiedlichen Viren muss beachtet werden, dass es sich hierbei in der Regel um Prävalenz- bzw. Nachweisraten handelt, da zum einen nicht die gesamte Fledermauspopulation an einem Ort oder gar in einem Land untersucht wurde und es zum anderen die bislang zur Verfügung stehende Methodik nicht erlaubt, sämtliche möglichen Virusspezies und Subspezies gleichzeitig und zuverlässig nachzuweisen. Auch wurden meist nur serologische Nachweise oder Nukleinsäurenachweise durchgeführt, was zu einer weiteren Ungenauigkeit bei der Einschätzung des tatsächlichen Vorhandenseins der untersuchten Viren zum einem gegebenen Zeitpunkt führt.
2.1 Coronaviren
Die Familie Coronaviridae hat mit dem Ausbruch der SARS-Pandemie 2002/2003 eine neue Bedeutung in der Erforschung zoonotischer Erkrankungen erhalten, als ein bis dahin unbekanntes Coronavirus als infektiöses Agens identifiziert wurde (Ksiazek et al. 2003; Peiris et al. 2003). Die SARS-Infektion löste im Menschen eine progressive Lungenentzündung aus, die je nach Dauer der Erkrankung zu einem Lungenödem mit der Bildung hyaliner Membranen und späteren proliferativen diffusen alveolären Schäden führt. Hierbei dominiert die Proliferation der Makrophagen. Hämophagozytose in der Lunge ist ein weiteres typisches Bild der Erkrankung (Nicholls et al. 2003). Der für das SARS-Coronavirus verantwortliche Rezeptor für den Zelleintritt ist das Angiotensin Converting Enzyme 2 (ACE2, Li et al. 2003).
SARS-ähnliche Coronaviren wurden im Gegensatz zu den Henipaviren vorwiegend in der Familie der Hufeisennasen (Rhinolphidae) aus der Unterordnung Microchiroptera nachgewiesen (Lau et al 2005). Erst vor kurzem konnte aus Fledermäusen der Spezies
Rhinolophus sinicus ein Coronavirus isoliert werden, welches neben einer hohen Sequenzübereinstimmung des Genoms den für das SARS-Coronavirus typischen Rezeptor nutzt (Ge et al. 2013). Der Nukleinsäurenachweis von SARS-ähnlichen Coronaviren in europäischen Fledermäusen gelang mit Nachweisraten von 26 % in Bulgarien in Rhinolophus spp. (Drexer et al. 2010). In Deutschland wurden dagegen bisher keine SARS-ähnlichen Viren nachgewiesen. In Norddeutschland liegen aus dem Jahr 2007 Nachweise von Coronaviren in Myotis dasycneme, Myotis daubentonii, Pipistrellus nathusii und Pipistrellus pygmaeus zwischen 5,2 % und 25,4 % vor, wobei aber nicht an allen Fangorten Virus nachweisbar war. Dabei konnte eine Spezifität der aufgefundenen Coronaviren für bestimmte Fledermausspezies beobachtet werden, wobei eine Übertragbarkeit zwischen Myotis dasycneme und Myotis bechsteinii vermutet wird (Gloza-Rausch et al. 2008). In einer Kolonie von Myotis myotis in Rheinland-Pfalz wurden Prävalenzen für Coronaviren von 10 – 100 % innerhalb der Kolonie zu verschiedenen Beprobungszeiten über drei Jahre hinweg (2008 – 2010) festgestellt (Drexler et al. 2011).
Im Jahr 2012 führte ein bis dahin nicht beschriebenes Coronavirus bei einem Patienten nach einem Aufenthalt in Saudi-Arabien zu respiratorischen Symptomen und Nierenversagen (Zaki et al. 2012; Bermingham et al. 2012). Die nächsten phylogenetischen Verwandten zu diesem Virus schienen die asiatischen Fledermaus-Coronaviren HKU4 und HKU5 (Woo et al. 2006) zu sein (Zaki et al. 2012; Bermingham et al. 2012; Lau et al. 2013). Weitere diesem mittlerweile als MERS Coronavirus (Middle Eastern Respiratory Syndrome, de Groot et al.
2013) bezeichnetem Erreger ähnlichen Virus wurden auch bei Fledertieren in Afrika und Europa gefunden (Annan et al. 2013). Jüngste Untersuchungen lassen eine zoonotische Infektionsquelle für den Menschen in Dromedaren vermuten (Nowotny und Koloziejek 2014;
Algaili et al. 2014; Briese et al. 2014; Memish et al. 2014). Bis Dezember 2015 sind weltweit 1621 humane Fälle bestätigt, von denen 584 fatal verliefen (World Health Organisation 2015).
2.2 Adenoviren
Adenoviren verursachen beim Menschen in der Regel mild verlaufende Infektionen des Magen-Darm-Traktes, des Atmungsapparates sowie der Augen. Jedoch sind mittlerweile auch Serotypen bekannt, die auch schwere Erkrankungen auslösen können (Lewis et al. 2009).
Zoonotische Infektionen im Kontext mit nicht-humanen Primaten werden ebenfalls vermutet (Chen et al. 2011). Fledermausassoziierte Adenoviren haben dagegen bislang keine zoonotische Bedeutung. In Deutschland gelang die Anzucht eines fledermausspezifischen Adenovirus aus Organen von moribunden Pipistrellus pipistrellus. Da keine Sekundärerreger nachweisbar waren, wurde ein krankmachendes Potential für Fledermäuse diskutiert (Sonntag et al. 2009). Eine auf diese Untersuchung aufbauende histopathologische und molekularbiologische Studie an Organproben von insgesamt 330 Tieren ergab eine Nukleinsäureprävalenz von 3,6 % und eine vermutlich milde Manifestation der Infektion.
Nachweise gelangen bei elf Exemplaren von Pipistrellus pipistrellus und einem von Pipistrellus nathusii (Kohl et al. 2012). Zugleich legten phylogenetische Analysen nahe, dass fledermausassoziierte Adenoviren Vorfahren der caninen Adenoviren 1 und 2 sind. Dies könnte die vergleichsweise hohe Pathogenität des caninen Adenovirus 1 und dessen erweitertes Wirtsspektrum innerhalb karnivorer Spezies durch eine ungenügende Anpassung des Virus an den neuen Wirt nach Wirtswechsel erklären (Jánoska et al. 2011; Kohl et al.
2012). Bei deutschen Fledermäusen der Spezies Myotis myotis wurde fledermausassoziiertes Adenovirus dagegen im Kot mit Häufigkeiten von 22,9 % bis 67,5 % nachgewiesen (Drexler et al. 2011).
2.3 Astroviren
Humane Astroviren können vor allem bei Neugeborenen und kleinen Kindern gastrointestinale Infektionen mit zum Teil schwerem Verlauf hervorrufen (Sirinavin et al.
2006, Bagic et al. 2010). In der Unterordnung Microchiroptera wurden Astroviren zwar nachgewiesen, jedoch ist eine zoonotische Bedeutung bislang unbekannt. Bei augenscheinlich gesunden Fledermäusen in China lagen bei 6 % der Tiere Koinfektionen mit Coronaviren vor, ohne dass jedoch eine kausale Beziehung erkennbar war. Interessanterweise gab es erhebliche Unterschiede hinsichtlich der nachgewiesenen Ausscheidungsfrequenzen bei oralen und analen Tupfern. So lagen die Prävalenzen der oralen Tupfer bei 2 % für Myotis magnater und
bei 15 % für Myotis pusillus. Aus analen Tupfern konnten dagegen Prävalenzen von 54 % bzw. 55 % für die entsprechenden Tierarten verzeichnet werden (Chu et al. 2008). Für Deutschland wurden Nachweisraten im Kot von Fledermäusen von 22,2 – 100 % innerhalb einer Kolonie beschrieben (Drexler et al. 2011).
2.4 Henipaviren
In der Erstbeschreibung des Hendravirus nach dem Auftreten klinischer Fälle im Jahre 1994 in Australien wurde das Virus zunächst als equines Morbillivirus angesprochen (Murray et al.
1995). Weiterführende molekularbiologische Untersuchungen zeigten jedoch bald, dass das Virus aufgrund eines unter den Paramyxoviren einmaligen Rezeptorspektrums, eines größeren Genomumfangs und aufgrund spezifischer Unterschiede in konservierten Regionen des Genoms ein eigenständiges Genus innerhalb der Familie der Paramyxoviren darstellt (Bonaparte et al. 2005; Negrete et al. 2006; Wang et al. 2000; Harcourt et al. 2001). Hierzu gehört auch als zweiter Vertreter das Ende der 90er Jahre in Malaysia aufgetretene Nipahvirus (Chua et al. 1999; Wang et al. 2001). Kürzlich wurde ein weiteres, anscheinend apathogenes Mitglied dieses Genus aus dem Urin australischer Flughunde isoliert, das Cedarvirus (Marsh et al. 2012).
Hendra- und Nipahviren lösen schwerwiegende Erkrankungen bei Mensch und Tier aus. Da die Infektion beim Menschen tödlich verlaufen kann und bisher weder Impfstoffe noch eine wirksame spezifische Therapie verfügbar sind, wurden sie als BSL-4 (Biosafety Level) Erreger eingestuft. Im Fall des Hendravirus erfolgt die Übertragung auf den Menschen durch erkrankte Pferde, beim Nipahvirus durch infizierte Schweine (Murray et al. 1995; Hanna et al.
2006; Playford et al. 2010; Chua et al. 1999). Für Nipahviren ist aber auch die direkte Übertragung von Mensch zu Mensch (Hsu et al. 2004; Gurley et al. 2007) und die Ansteckung durch den Kontakt mit Ausscheidungen von Flughunden (z.B. kontaminierter Dattelpalmsaft) beschrieben (Luby et al. 2006; Rahman et al. 2012).
Für das Hendravirus wurden bis zum Dezember 2015 insgesamt 47 Ausbrüche in Pferdehaltungen gezählt, 37 davon ab dem Jahr 2011 (Australian Veterinary Association 2015). Betroffene Pferde zeigten hierbei eine fiebrige Erkrankung mit ausgeprägten pulmonalen Symptomen wie blutigem Schaum in den Atemwegen, ausgelöst durch eine akute
interstitielle Pneumonie mit alveolärem Ödem, Thrombosen und Gewebsuntergang in der Lunge. Histologisch war vor allem die Bildung von Synzytien im Endothel der Kapillargefäße und Arteriolen der Lunge zu beobachten. Bei experimentellen Infektionen traten Läsionen auch im Gehirn, in den Nieren, der Milz und im Magen auf (Murray et al. 1995).
Neurologische Symptome wie Unruhe, Depression, Ataxien und Paresen traten ebenfalls auf, teilweise traten sie sogar in den Vordergrund (Field et al. 2010; Marsh et al. 2011). Im Verlauf von vier Ausbrüchen bei Pferden kam es auch zur Infektion von Menschen, wobei vier von sieben der betroffenen Personen starben. Die Infektion kann dabei grippeähnliche Symptome mit interstitieller Pneumonie sowie eine akute oder relapsierende Meningoenzephalitis in unterschiedlich starker Ausprägung auslösen (Murray et al. 1995;
Hanna et al. 2006; Wong et al. 2009; Playford et al. 2010; Nakka et al. 2012).
Seit dem 1. November 2012 ist in Australien eine Vakzine (Equivac® HeV, Zoetis, ehem.
Pfizer Animal Health) für Pferde in gefährdeten Gebieten erhältlich. Diese Vakzine basiert auf dem Glykoprotein G des Hendravirus (Middelton et al. 2014).
Bei den initialen Ausbrüchen des Nipahvirus 1998/99 in Malaysia und Singapur galt das Schwein als Infektionsquelle für den Menschen. Zunächst wurden die humanen Erkrankungen fälschlicherweise als Japan-Enzephalitis-Virus-Fälle diagnostiziert. Dass der Krankheit ein neuartiges Paramyxovirus zugrunde lag, wurde erst durch die serologische Kreuzreaktion mit dem Hendravirus gezeigt (CDC 1999a; CDC 1999b; Chua et al. 1999; Paton et al. 1999). Im Schwein verursachte die Erkrankung je nach betroffener Altersgruppe eine akute fiebrige Erkrankung mit unterschiedlich stark ausgeprägten neurologischen und respiratorischen Symptomen. Sauen und Eber zeigten erschwerte Atmung mit oronasalem Ausfluss sowie Agitation, Kopfdrücken und Muskelkrämpfe. Die mittlere Altersgruppe zwischen vier Wochen und sechs Monaten zeigte ähnliche neurologische Symptome, hier war aber vor allem ein bellender Husten das prominente Symptom. Die Infektionsrate bei Schweinen lag bei bis zu 100 %, die Mortalität jedoch lediglich bei 1-5 %. Bei Saugferkeln betrug sie dagegen bis zu 40 %. Zur Ausmerzung der Infektion in Malaysia wurden vom 28. Februar bis 26. April 1999 nahezu eine Million Schweine gekeult (Mohd Nor et al. 2000).
Auch beim Menschen löst das Virus eine akut verlaufende fiebrige Erkrankung aus, bei der überwiegend entzündliche Gefäßveränderungen mit Thrombosen und Gewebsuntergang im
ZNS (Zentralen Nervensystem) im Vordergrund stehen. Bei den initialen Fällen in Malaysia und Singapur waren 265 Menschen betroffen, von denen annähernd 40 % verstarben (Wong et al. 2002). Es traten neurologische Symptome wie reduziertes Bewusstsein und Reflexe, Krämpfe sowie Hirnstammdysfunktionen mit Tachykardie und Bluthochdruck auf. Vereinzelt wurden auch Krankheitsverläufe mit relapsierender Enzephalitis nach initial milden Symptomen beschrieben (Goh et al. 2000). Die entzündlichen Gefäßveränderungen waren jedoch nicht ausschließlich auf das ZNS beschränkt und lösten vor allem in Bangladesch in vielen Fällen respiratorische Symptome aus (Paton et al. 1999; Wong et al. 2002).
Nach den initialen Ausbrüchen in Malaysia und Singapur kommt es seit 2001 auch in Bangladesch und Indien wiederholt zu Krankheitsausbrüchen durch das Nipahvirus, wobei hier vermutlich auch Übertragungen von Mensch zu Mensch vorkommen (Hsu et al. 2004;
Gurley et al. 2007; Chadha et al. 2006). Bei diesen Ausbrüchen treten Mortalitäten von bis zu 75 % auf (Gurley et al. 2007). Allein im Zeitraum von Dezember 2013 bis Februar 2015 kam es in Bangladesch zu 31 humanen Fällen, 20 davon mit fatalem Verlauf (Institute of Epidemiology, Disease Control and Research (IEDCR), Bangladesh).
In Studien zur Klärung der geographischen Verbreitung und der Identifizierung von Reservoirwirten der Henipaviren wurden neben der Gattung Pteropus in Australien weitere Flughundarten der Gattungen Rousettus und Eidolon in Ghana und auf Madagaskar als Träger von Henipaviren identifiziert (Iehlé et al. 2007; Hayman et al. 2008; Drexler et al. 2012). Bei diesen Studien wurden eine Reihe neuer Paramyxoviren gefunden: Tioman-Virus, Tuhoko- Virus, Menangle-Virus, Cedar-Virus und Achimota-Virus (Chua et al. 2001; Lau et al. 2010;
Barr et al. 2012; Marsh et al. 2012; Baker et al. 2013b). Mittlerweile existieren nahezu weltweit Nachweise für Paramyxovirus-Infektionen bei Fledertieren (Drexler et al. 2012).
Flughunde erkranken selbst nach experimenteller Infektion mit Henipaviren nicht klinisch (Williamson et al. 1998; Middelton et al. 2007; Halpin et al. 2011). Es wurde jedoch beschrieben, dass unter natürlichen Bedingungen hormonaler oder sozialer Stress das Infektionsrisiko für Flughunde erhöhen kann (Plowright et al. 2008). In Malaysia wurde die Intensivierung der Landwirtschaft als auslösender Faktor für das seuchenartige Auftreten der Nipahvirus-Erkrankung bei Mensch und Schwein diskutiert. Erst seit den 70er Jahren wurden Schweine dort als landwirtschaftliche Nutztiere gehalten und die Haltung wurde zunehmend
intensiviert. In vielen Betrieben wurde parallel zur Schweinehaltung der Anbau von Baumfrüchten wie Mangos betrieben. Diese stellen attraktive Nahrungsquellen für Flughunde dar, die diese Bäume auf ihren nächtlichen Streifzügen aus den benachbarten Urwaldgebieten aufsuchen. Hierdurch kam es zu einem engen Kontakt zwischen Flughund und Schwein, was eine Infektion der Schweine begünstigte. Durch den Kontakt mit infizierten Schweinen kam es zu einer zoonotischen Übertragung des Virus auf Menschen, die mit diesen Tieren Umgang hatten (Pulliam et al. 2012).
Das Spektrum der Reservoirwirte der Henipaviren scheint jedoch nicht auf Megachiroptera beschränkt zu sein. Serologische Nachweise liegen auch für Microchiroptera in Asien, unter anderem auch für in Europa vorkommende Arten vor (Li et al. 2008; Johara et al. 2001).
Für Henipavirus-Infektionen liegen serologische Prävalenzen für das Hendravirus in Australien bei Pteropus scapulatus bei 23,6 % (Plowright et al. 2008). In Malaysia sind in Abhängigkeit von der Pteropus-Spezies Seroprävalenzen für Nipah von 4 % bis 31 % (Johara et al. 2001) beschrieben. In nicht endemischen Gebieten wie Afrika sind Seroprävalenzen von bis zu 39 % für Henipavirus-ähnliche Viren in Eidolon helvum beschrieben (Hayman et al.
2008). Virologische Untersuchungen gepoolter Urinproben zu Ermittlung von Prävalenzen innerhalb ganzer Kolonien von Pteropus-Flughunden zwischen 2008 und 2011 in Australien ergaben, dass die Tiere prinzipiell jederzeit Virus ausscheiden können, die Ausscheidungsrate jedoch variiert. Im Mittel lag die Prävalenz von Virusnukleinsäure-positiven Proben innerhalb positiver Beprobungsereignisse bei 8,5 %; das Spektrum reichte hierbei von 3-33 % (Field et al. 2011).
Die Seroprävalenzen in Fledermäusen der Unterordnung Microchiroptera scheinen dagegen niedriger. Für Fledermäuse in Malaysia sind Prävalenzen von 3 % in Skotophilus khulii beschrieben (Johara et al. 2001). Untersuchungen in China ergaben neben anderen positiv getesteten Tieren der Unterordnung Microchiroptera unter anderem auch 3 (n=22) reaktive Tiere der Spezies Myotis daubentonii (Li et al. 2008). Diese Art ist auch in Europa weit verbreitet.
In Afrika sind ebenfalls zunehmend Nachweise von Henipavirus-ähnlichen Viren vorhanden.
Für Ghana liegen Nukleinsäurenachweise bei Palmenflughunden vor (Drexler et al. 2009). In
einer späteren Studie wurde bei ca. 5 % der Ghanaischen Schweine Antikörper gegen Henipa- oder Henipavirus-ähnlichen Viren nachgewiesen (Hayman et al. 2011). Für Palmenflughunde aus der Demokratische Republik Kongo sind ebenfalls Prävalenzraten von 26 % an Henipavirus-ähnlichen Nukleinsäuresequenzen bekannt. Diese wurden aus Palmenflughunden isoliert, die als sog. Bushmeat für den menschlichen Verzehr gedacht waren (Weiß et al.
2012). Aus einem Ghanaischen Palmenflughund konnte überdies eine Vollgenomsequenz eines Henipavirus-verwandten Virus isoliert werden (Drexler et al. 2012). In Kamerun wurde eine Rate von 48 % an seropositiven Palmenflughunden nachgewiesen, zusätzlich liegen hier deutliche Hinweise dafür vor, dass es durch den direkten Kontakt mit den Flughunden zu einer Übertragung auf den Menschen kommen kann (Pernet et al. 2014).
In Deutschland liegen die Nukleinsäurenachweise für weitläufige Henipavirus-verwandte apathogene Paramyxoviren im Kot von Fledermäusen vergleichsweise niedrig: 0,4 % für Myotis daubentonii, 2,1 % für Myotis myotis, 2,7 % für Myotis bechsteinii und 5,5 % für Myotis mystacinus (Drexler et al. 2012). Zusätzlich liegen einzelne Nachweise aus Organproben für Myotis mystacinus, Pipistrellus pipistrellus sowie Nyctalus noctula vor (Kurth et al. 2012).
2.4.1 Rezeptorbindung des Hendravirus – Anlagerung und Membranfusion
Die für die Bindung (Attachment) des Virus an die Zelle sowie die Fusion des Virus mit der Wirtszelle bzw. infizierter Zellen untereinander (Synzytienformation) essenziellen Glykoproteine sind das Attachment-Protein der Henipaviren (Glykoprotein G) sowie das Fusionsprotein F, welche beide in die Virushülle eingebaut vorliegen (Bossart et al. 2001;
Bossart et al. 2002; Tamin et al. 2002).
Die zellulären Rezeptoren des Hendravirus und Nipahvirus sind die Ephrin B2 und Ephrin B3 Liganden (Bonaparte et al. 2005, Negrete et al. 2006; Bishop et al. 2007). Hierbei wurden für das Glykoprotein G des Hendra- und Nipahvirus ähnliche Bindungsaffinitäten zu den Ephrin- Liganden von Mensch, Pferd, Schwein, Hund, Katze, Maus und Flughund beobachtet, wobei das Protein G des Hendravirus eine geringere Affinität als das des Nipahvirus zu Ephrin B2 zu haben scheint (Bossart et al. 2008). Ephrin B3 kann darüber hinaus vermutlich in Abhängigkeit vom vorliegenden Isolat effektiver vom Nipahvirus genutzt werden (Negrete et
al. 2007). Dies kann dadurch erklärt werden, das sich einzelne an der Rezeptorbindung beteiligte Aminosäurereste beider Viren beziehungsweise auch innerhalb einzelner Virusstämme unterscheiden und so ggf. durch geringere hydrophile Eigenschaften eine schwächere Bindung bewirken (Negrete et al. 2007; Xu et al. 2012). Darüber hinaus scheint die Bindung des Protein G des Hendravirus an Ephrin B2 durch Aminosäureaustausche weniger störanfällig zu sein als die Bindung zu Ephrin B3 (Xu et al. 2012). Diese an der Zellbindung durch Henipaviren beteiligten Ephrine sind Liganden von Ephrin-Rezeptor- Tyrosinkinasen und spielen vor allem eine Rolle bei der Gefäßdifferenzierung und neuronalen Entwicklung. So liegt Ephrin B2 im Mausmodell vor allem in Endothel und glatter Muskulatur des arteriellen Gefäßsystems (Gale et al. 2001; Shin et al. 2001) vor. Ephrin B2 wird aber auch in den Nervenzellen von Großhirnrinde, Kleinhirn und Hippocampus exprimiert und in unterschiedlichem Maße im olfaktorischen System nachgewiesen (Migani et al. 2007). Ephrin B3 wird ebenfalls im Rhinencephalon sowie - im Gegensatz zu Ephrin B2 - im Corpus callosum und Rückenmark exprimiert (Liebl et al. 2003; Benson et al. 2005).
Die Bindung an den Wirtszellrezeptor erfolgt durch die extrazellulär gelegene globuläre Kopfregion des Protein G (Bowden et al. 2008; Bowden et al. 2010; Xu et al. 2012), welches in Dimeren und vermutlich auch in Tetrameren (aus zwei der über Disulfidbrücken verbundenen Dimere) gelagert ist (Bossart et al. 2005; Bowden et al. 2010; Xu et al. 2012).
Die Bindung an den Wirtszellrezeptor ist dabei mit einer Konformationsänderung des Protein G verbunden. Dies ist vermutlich der Auslöser dafür, dass das Fusionsprotein in seinen fusionsaktiven, stabilen Zustand überführt wird (Chan et al. 2012; Xu et al. 2012).
Das Fusionsprotein bedarf zuvor einer enzymatischen Spaltung aus der inaktiven Vorstufe F0
in die ausgereifte Form. Diese umfasst die beiden Untereinheiten F1 und F2, welche über eine Disulfidbrücke miteinander verbunden sind. Diese katalytische Reaktion erfolgt nach Endozytose der inaktiven Form des Proteins von der Zelloberfläche durch das zelluläre Enzym Cathepsin L im endosomalen Kompartiment der Wirtszelle (Pager und Dutch 2005;
Meulendyke et al. 2005). Hier erfolgt die Spaltung mit anschließender Rezirkulation des ausgereiften Proteins an die Zelloberfläche (Popa et al. 2012).
Nach Rezeptorbindung durch das Glykoprotein G löst das aktivierte Fusionsprotein F, welches in Trimeren vorliegt (Gardner und Dutch 2007; Whitman et al. 2008), durch
komplexe Konformationsänderungen mit Insertion eines Fusionspeptides in die Zielmembran die Fusion von Zell- und Virusmembran aus (Smith et al. 2012).
III Material und Methoden 1 Fledermäuse
1.1 Fledermausschutz
Fledermäuse sind sowohl laut Bundesnaturschutzgesetz als auch EU-weit gemäß Anhang IV der Flora-Fauna-Habitat Richtlinie (Richtlinie 92/43/EWG) vom 21.05.1992 streng geschützte Arten. Eine negative Beeinflussung, was auch eine Störung der Tiere einschließt, ist untersagt. Aus diesem Grund fanden die Probenahmen im Rahmen routinemäßiger Kontrollen zum Zustand der Kolonien mit Unterstützung der autorisierten Personen statt. Dies sind für die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Kolonien in Bayern und Mecklenburg- Vorpommern Prof. Gerald Kerth, Institut für Zoologie, Ernst-Moritz-Arndt Universität Greifswald und für die Kolonien in Sachsen-Anhalt Bernd Ohlendorf von der Landesreferenzstelle für Fledermausschutz Sachsen-Anhalt. In Rumänien wurden die Probennahmen mit freundlicher Unterstützung von Richard Hoffmann (Fledermausschutzverein Rumänien e.V., Arad, Rumänien) durchgeführt.
Die Probengewinnung erfolgte nicht-invasiv durch Entnahme von Tupferproben, die Tiere wurden nach der biologischen Erfassung und Beprobung am Fangort entlassen.
1.2 Herkunft der Fledermäuse
Die untersuchten Tiere stammen aus mehreren Bundesländern der Bundesrepublik Deutschland sowie aus Rumänien. Die Probennahmen erfolgten von 2010 bis 2012 im Rahmen regelmäßiger Populationsuntersuchungen, bei denen Spezies, Gewicht, Geschlecht, Alter, Reproduktionszustand sowie die Unterarmlänge der Tiere bestimmt werden. Zusätzlich wurden die Tiere deutscher Kolonien mit Ausnahme weniger Einzeltiere individuell markiert.
Bei den Tieren aus Bayern erfolgte dies durch subkutane Implantation von Transpondern (passive integrated transponder, sogenannte PIT-tags), die Tiere aus anderen Bundesländern wurden dagegen lediglich mit Markierungsklammern aus Aluminium versehen. Auf diese
Weise ist es möglich, die Proben einzelnen Tieren zuzuordnen und wiederholte Probennahmen zu dokumentieren. Dies ermöglicht eine Verknüpfung der virologischen mit den zoologischen Daten für die jeweiligen Kolonien.
In Mecklenburg-Vorpommern wurden Tiere an drei nahe beieinander liegenden Lokationen am südlichen Rand des Naturparks Nossentiner/Schwinzer Heide untersucht. In Sachsen- Anhalt wurden Proben an elf über vier Regionen des Landes verteilten Orten gewonnen. In Bayern beschränkte sich das Untersuchungsgebiet auf den Raum Würzburg. In Rumänien erfolgte die Probenahme im Naturpark Eisernes Tor (Abb. 1).
Die Habitate an den ausgewählten Standorten sind unterschiedlich: In Mansfeld wurden Tiere in unterirdischen Gewölben des Schlosses Mansfeld und der Rammelburg beprobt.
Büchenberg ist ein ehemaliges Eisenbergwerk nahe Elbingerode und beliebter Rückzugsort und Winterquartier für Fledermäuse. Die übrigen Standorte sind bewaldete Gebiete.
Abbildung 1 Geographische Verteilung der Probennahmeorte in Deutschland, die Kartengrundlage wurde zur Verfügung gestellt von Patrick Wysocki, FLI Riems
2 Probenahme und Probenumfang
Die Zeitpunkte der Probennahmen passten sich dem Jahresrhythmus der Tiere an. Sie fanden im April, Mai, Juli und August statt. Die erste Probennahmephase fand im April und Mai statt. Während dieser Zeit beziehen die trächtigen Weibchen ihre Wochenstuben und es findet
hier je nach Spezies eine mehr oder weniger starke Geschlechtertrennung statt (Dietz et al.
2007). Ab Ende Mai kommen die Jungen zur Welt und zu dieser Zeit ist keine Störung der Tiere erlaubt. Die zweite Probennahmephase fand von Juli bis August statt. Zu dieser Zeit sind die Jungen bereits flugfähig (ebd.). Bei einer Gelegenheit wurden Proben während der Winterruhe der Tiere genommen. Da ein Stören der Tiere während der Hibernation jedoch nicht unumstritten ist, blieb es bei diesem einmaligen Ereignis. Die Tiere wurden entweder in speziellen Netzen während der nächtlichen Flugphase gefangen oder tagsüber ihren Wochenstuben und Tagesquartieren entnommen und nach Abschluss der Untersuchung, Markierung und Probenahme umgehend am Ort des Fangs wieder freigelassen.
Für die Probenahme wurden sterile Urethraltupfer aus der Humanmedizin verwendet (MW121 DryswabTM Fine Tipp, MWE Medical Wire). Diese wurden nach Aufnahme von Probenmaterial in vorbereitete 2 ml Eppendorf-Tubes (Eppendorf) überführt und so abgebrochen, so dass der Tupferkopf im Gefäß verblieb. Die Tubes enthielten jeweils 500 µl Zellkulturmedium mit 10% FKS. Dem Medium wurden 1 g/l Enrofloxacin (Baytril® 10%, Bayer), 50 mg/l Gentamicin (10 mg/ml, GIBCO® Invitrogen GmbH, Karlsruhe) sowie 250 mg/l Lincomycin und 500 mg/l Spectinomycin (50 mg + 100 mg Licospectin®, Pfizer) zugesetzt um ein bakterielles Überwachsen der Probe zu verhindern. Die Probennahme im Mai 2010 und im Januar 2011 wurde mit antibiotikafreiem Medium durchgeführt.
Von den Tieren wurden orale Tupfer, Urintupfer sowie Kotproben entnommen. Die oralen Tupferproben wurden vorwiegend unter der Zunge entnommen, da hier die größte Menge an Speichel vorliegt. Der Tupfer wurde hierzu einige Male behutsam im Maul des Tieres gedreht, um möglichst viel Material aufnehmen zu können. Urin und frischer Kot konnten gesammelt werden, sofern ihn die Tiere während des Untersuchungszeitraums abgaben.
Die Proben wurden bis zur Rückkehr ins Labor in mit Kühlakkus versehenen Styroporboxen gelagert. Dort wurden sie bis zur weiteren Verarbeitung bei -70 bis -80°C aufbewahrt. Falls ein direkter Rücktransport nicht möglich war, wurden die Proben bei -20°C zwischengelagert.
3 Molekularbiologische Untersuchung 3.1 Nukleinsäureextraktion
Die Proben wurden mittels Vortexgerät durchmischt und je 140 µl Flüssigkeit für die Nukleinsäureisolation entnommen. Die Nukleinsäurepräparationen erfolgten mit dem QIAmp® Viral RNA mini Kit über eine Kieselgelmembran (Qiagen GmbH, Hilden 52904).
Das Probenmaterial wurde hierbei in 560 µl Puffer AVL lysiert. Diesem Puffer ist Carrier RNA zugesetzt, welches als Schutz der RNA in der Probe vor RNAsen dient und die Bindung der RNA an die Kieselgelmembran erhöht. Probe und Puffer wurden durchmischt und für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Proben kurz anzentrifugiert um Flüssigkeiten von der Deckelinnenseite des Reaktionsgefäßes zu entfernen. Dies ist notwendig um mögliche Kontaminationen zwischen den Proben durch eine Verschleppung von Flüssigkeit beim Öffnen der Gefäße zu verhindern. Daraufhin wurde das lysierte Probenmaterial mit 560 µl Ethanol (≥99,8 %, p.a. Roth 9065.3) versetzt und durchmischt.
Hieran schloss sich der Bindungsschritt an die Kieselmembran an. Das Probenmaterial wurde hierzu in zwei Schritten zu je 630 µl auf die Membran gegeben und bei 8000 rpm (Biofuge Fresco, Heraeus 75005521) für eine Minute zentrifugiert. Hierbei bindet die Nukleinsäure an die Membran, die überschüssige Flüssigkeit wurde abzentrifugiert und verworfen. Hieran schlossen sich zwei Waschschritte an, bei denen jeweils 500 µl Waschpuffer durch die Membran zentrifugiert wurden. Der erste Waschpuffer (AW1) wurde hierbei für eine Minute bei 8000 rpm, der zweite Waschpuffer (AW2) für 3 Minuten bei 13000 rpm durch die Membran zentrifugiert. Bei dieser Art der Aufreinigung wird nicht zwischen DNA und RNA unterschieden und somit beides extrahiert. Dies ermöglicht die Untersuchung auf DNA- (Adenoviren) und RNA- (Astro-, Corona-, Paramyxoviren) Viren. Die Nukleinsäuren wurden abschließend mit 60 µl Elutionspuffer während einer Minute Inkubationszeit in der Membran resuspendiert und durch Zentrifugation bei 8000 rpm für eine Minute aus der Membran gelöst. Die Lagerung erfolgte bei -80°C.
3.2 Polymerase Kettenreaktion (PCR)
Publizierte Protokolle für nested- bzw. seminested PCRs wurden für die Anwendung in dieser Arbeit modifiziert. Um möglichst viele Virusspezies oder –subspezies mit der PCR erfassen zu können, wurden Primer mit degenerierten Positionen bzw. Primermischungen eingesetzt.
Die verwendeten Positivkontrollen stammen aus der Virusbank des Friedrich-Loeffler- Institutes. Als Negativkontrolle wurden bei jedem Durchgang sogenannte Wasserkontrollen bestehend aus dem Mastermix mit Zugabe von Wasser anstelle von Proben-Nukleinsäure mitgeführt.
Sowohl die reverse Transkription der RNA-Viren als auch die eigentlichen Polymerase- Kettenreaktionen wurden in einem Biometra T3-Thermocycler (Analytik Jena AG, Jena) durchgeführt. Reverse Transkription und die erste PCR mit dem äußeren Primerpaar wurden mit dem SuperScriptTM III One Step RT-PCR-System unter Verwendung der Platinum® Taq DNA Polymerase (Invitrogen GmbH, Karlsruhe 12574) im Ein-Schritt-Verfahren im selben Reaktionsgefäß durchgeführt. Bei der zweiten PCR mit den inneren Primern kam die PWO DNA-Polymerase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim 11644955001) zur Anwendung. Die Deoxynukleotide für diese PCR stammen ebenfalls von der Firma Roche (Deoxynucleoside Triphosphate Set PCR Grade, Roche 11969064001). Um pro Reaktion ein Volumen von 50 µl zu erreichen, wurden die Reagenzien mit DNase freiem Wasser (GIBCO® Invitrogen GmbH 10977) ergänzt.
3.2.1 Nested RT-PCR zur Detektion von Coronaviren
Die verwendete PCR zur Detektion von Coronaviren zielt auf die RNA abhängige Polymerase ab und detektiert ein breites Spektrum von Coronaviren. Unter anderem ist diese PCR auch in der Lage das SARS-Coronavirus zu detektieren (de Souza Luna et al. 2007). Verwendet werden hierbei acht verschiedene Primer in unterschiedlichen Konzentrationen. Teilweise handelt es sich um Primer-Kombinationen gleicher Molarität (Tab. 1). Die Primer wurden von MWG Eurofins Operon, Ebersberg, synthetisiert. Die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches wird in den Tabellen 2 und 3 aufgeführt.
Die Reverse Transkription erfolgte bei 50°C, gefolgt von zwei Minuten Denaturierungsphase bei 94°C, an welche sich 10 Zyklen von 15 Sekunden Denaturierung bei 94°C, Primeranlagerung für 30 Sekunden und Temperaturabstieg von 1°C pro Zyklus, beginnend bei 62°C, anschlossen. Die Elongation erfolgte für 40 Sekunden bei 72°C. Hieran schlossen sich 30 Zyklen mit je 15 Sekunden bei 95°C, Primeranlagerung bei 52°C für 30 Sekunden und Elongation bei 72°C für 40 Sekunden an. Die finale Elongation wurde auf sieben Minuten eingestellt.
Die nested PCR wurde wie folgt durchgeführt: Zwei Minuten bei 94°C für die initiale Denaturierung, gefolgt von 30 Zyklen aus 15 Sekunden Denaturierung bei 94°C.
Primeranlagerung für 30 Sekunden bei 60°C und Elongation für ebenfalls 30 Sekunden bei 72°C. Die finale Elongation betrug wiederum sieben Minuten. Als Positivkontrolle wurde RNA des Virus der Transmissiblen Gastroenteritis des Schweines (TGEV, Virusbank Insel Riems RVB-001) mitgeführt. Aus einem Alignment des Primerpaares für die innere PCR mit TGEV (Accession Nr. DQ811789.2) unter Verwendung der BioEdit Software v.7.1.7 (Hall 1999) ergab sich eine erwartete Fragmentgröße von 455 bp.
3.2.2 Nested PCR zur Detektion von Adenoviren
Diese PCR detektiert durch degenerierte Primer die DNA-Polymerase der Genera Atadenovirus, Mastadenovirus sowie Aviadenovirus (Wellehan et al. 2004, Tab. 4).
Verwendet wurde für beide PCR-Schritte die PWO DNA-Polymerase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim 11644955001). Die Zusammensetzung der Reaktionsgemische wird in Tabelle 5 aufgeführt.
Die erste PCR begann mit einer initialen Denaturierung bei 94°C für zwei Minuten. Daran schlossen sich 45 Zyklen aus 15 Sekunden Denaturierung, Primeranlagerung für 30 Sekunden bei 46°C und Elongation bei 72°C für 45 Sekunden an. Hierauf folgte eine finale Elongation von sieben Minuten. Die nested PCR Runde verlief nach demselben Protokoll. Das erwartete PCR Fragment umfasste 318-324bp (Wellehan et al. 2004). Als Positivkontrolle wurde bovines Adenovirus 1 (Adeno 9 IV 17 091) verwendet.
3.2.3 Seminested RT-PCR zu Detektion von Astroviren
Die PCR zum Nachweis von Astroviren dient ebenfalls dem Nachweis der RNA-abhängigen Polymerase mittels degenerierter Primer (Chu et al. 2008, Tab. 6). Die jeweils zwei forward- Primer werden in äquimolaren Verhältnis angewandt, alle Primer wurden von MWG Eurofins Operon, Ebersberg, synthetisiert. Die Zusammensetzung der Reaktionsgemische wird in den Tabellen 7 und 8 angegeben.
Die Reverse Transkription wurde bei 50°C für 30 Minuten durchgeführt. Hieran schlossen sich nach initialer Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten 30 Amplifikationszyklen an. Diese umfassten eine Denaturierung bei 94°C für 15 Sekunden, eine Primeranlagerung für 30 Sekunden bei 50°C eine Elongation bei 72°C für 40 Sekunden. Eine letzte Elongation von 7 Minuten schloss diese PCR ab. Die seminested PCR umfasste nach initialer Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten 40 Zyklen von je 15 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden Primeranlagerung bei 50°C und Elongation für 40 Sekunden bei 72°C. Das zu erwartende PCR Fragment hatte eine Größe von 422bp (Chu et al. 2008).
3.2.4 Seminested RT-PCR zur Detektion von Paramyxoviren
Die PCR zur Detektion von Paramyxoviren enthält verschiedene Sets degenerierter Primer für die Unterfamilien Paramyxovirinae und Pneumovirinae bzw. Gruppen von Genera innerhalb dieser Unterfamilien. Sie dienen der Durchführung einer seminested RT-PCR. Die Primersets für die verschiedenen Untergruppen detektieren lediglich näher verwandte Genera und sind damit spezifischer und sensitiver als die Primer für die beiden oben genannten Unterfamilien.
Alle Primersets detektieren das Polymerase-Gen (Tong et al. 2008, Tab. 9). Die verwendeten Primer wurden von der Invitrogen GmbH Karlsruhe synthetisiert. Die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches wird in den Tabellen 10 und 11 aufgeführt.
Die Entfaltung der Sekundärstruktur der RNA, Primeranlagerung und die reverse Transkription erfolgten während einer Minute bei 60°C, gefolgt von 30 Minuten bei 55°C.
Die Aktivierung der Taq-Polymerase und Denaturierung des cDNA-Strangs erfolgte zwei Minuten bei 94°C. Hieran schlossen sich 40 Zyklen von 15 Sekunden Denaturierung bei 94°C, 30 Sekunden Primeranlagerung bei 46,5°C (PAR-Primer), 44°C (RES-MOR-HEN- Primer), 50,5°C (PNE-Primer) bzw. 46°C (AVU-RUB Primer) und einer Minute Elongation
bei 72°C an. Die Dauer der finalen Elongation als letztem Schritt der PCR betrug sieben Minuten.
Der seminested Ansatz unter Verwendung des inneren Forward Primers und desselben reversen Primers wie für den ersten Schritt erfolgte unter Verwendung von 5 µl des Produkts der ersten PCR als Template. Nach initiale Denaturierung der cDNA für zwei Minuten bei 94°C schlossen sich 40 Zyklen von 15 Sekunden Denaturierung, 30 Sekunden Anlagerung der Primer bei 48°C (PAR-Primer), 43,5°C (RES-MOR-HEN-Primer), 44,5°C (PNE-Primer) bzw. 47,5°C (AVU-RUB-Primer) und einer Minute Elongation an. Die finale Elongation nach diesen Zyklen betrug sieben Minuten. Aus einem Alignment des Primerpaares für die innere PCR mit dem Hendravirus (Accession Nr. AF017149) unter Verwendung der BioEdit Software v.7.1.7 (Hall 1999) ergab sich eine erwartete Fragmentgröße für die PAR-Primer von 584 bp und für die RES-MOR-HEN-Primer von 494 bp. Das Alignment der AVU-RUB Primer mit einem Newcastle Disease Virus (NDV, Accession Nr. HM117720.1) ließ eine Fragmentgröße von 224 bp erwarten. Als routinemäßige Positivkontrolle für die RES-MOR- HEN PCR wurde RNA der bovinen Parainfluenza 3 (BPIV3, Virusbank Insel Riems RVB 028) mitgeführt.
3.3 Analyse der PCR-Produkte im Agarosegel und Aufreinigung der DNA
5 µl der PCR Produkte der nested- bzw. seminested PCR Runde wurden mit 5µl DNase freiem Wasser (dH2O, GIBCO® Invitrogen 10977) verdünnt und mit 1 µl 10x Stopp-Puffer gemischt (Je nach erwarteter Fragmentgröße wurden die PCR-Produkte im 1 - 1,5 % igen Agararosegel (UltraPureTMAgarose, Invitrogen 1650050) bei 110 V elektrophoretisch aufgetrennt. Hierbei wurde das SubCell System von Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories GmbH, München) verwendet. Zur Abschätzung der Fragmentgröße wurden die peqGOLD 100 bp und 1 kb DNA Leiter (PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen 252010 bzw. 252030) sowie der Lambda DNA/Eco47I (AvaIII) Marker 13, und der geneRulerTM 100 bp DNA Marker (Thermo Fisher Sientific Inc., Langenselbold ehemals Fermentas SM1051 bzw. SM0242) verwendet. Nach Färbung der PCR Produkte im Ethidiumbromidbad (0,0001 %; Merck 1.11608.0030) wurden diese unter UV Licht beurteilt. Aufgereinigt wurde die DNA mit dem QIAquick® Gel Extraction Kit oder dem MinElute® PCR Purification Kit (Qiagen GmbH, Hilden 28704 bzw. 28006). Die Wahl der Aufreinigungsmethode ergab sich aus der Reinheit
des PCR Produktes, welche im Agarosegel beurteilt wurde. PCR Produkte, die lediglich die Bande in der erwarteten Größe zeigten wurden mit dem MinElute® PCR Purification Kit aufgereinigt. Sofern die Gelanalyse zusätzliche unspezifische Banden zeigte, wurde die Bande in der gesuchten Größe ausgeschnitten und mit dem QIAquick® Gel Extraction Kit aufgereinigt. Bei beiden Methoden wird die DNA unter Verwendung einer Kieselgelmembran gebunden. Alle Zentrifugationsschritte erfolgten in den Eppendorf-Tischzentrifugen 5417R bzw. 5430R (Eppendorf AG, Hamburg) bei 13000 rpm für eine Minute. Bei der Verwendung des MinElute® PCR Purification Kits wurde das PCR Produkt mit dem fünffachen Volumen an Puffer PB versetzt. Dieses Gemisch wurde auf die Membran überführt, wobei die DNA an die Kieselgelmembran gebunden wurde. Anschließend wurde die Pufferlösung abzentrifugiert. Daraufhin wurde zum Waschen der DNA 750 µl Puffer PE auf die Membran pipettiert und anschließend abzentrifugiert. Danach erfolgte ein zusätzlicher Zentrifugationsschritt um restliche Flüssigkeit zu entfernen. Bei der Verwendung des QIAquick® Gel Extraction Kit wurde das Gelstück zunächst im ca. dreifachen (mg Gelstück/µl Puffer) an Puffer QG bei 50°C für 10 Minuten lysiert. Anschließend wurde der Lösung das einfache Volumen (mg Gelstück/µl Puffer) Isopropanol (Roth 6752.3) zugesetzt.
Diese Mischung wurde daraufhin durch die Membran zentrifugiert. Hierauf wurden weitere 500 µl Puffer QG durch die Membran zentrifugiert. Das weitere Vorgehen entsprach dem des MinElute® PCR Purification Kits. Zur Elution wurden entsprechend der Stärke der Bande im Agarosegel 40 µl DNase freies dH2O (GIBCO® Invitrogen 10977) auf die Säule pipettiert, eine Minute inkubiert und anschließend abzentrifugiert. Schwache Banden mit geringerem DNA Gehalt wurden dabei mit 30 µl eluiert, um die DNA aufzukonzentrieren.
3.4 Sequenzierung und phylogenetische Analysen
Die Sanger-Sequenzierung beider cDNA Stränge der aufgereinigten DNA erfolgte überwiegend direkt.
3.4.1 TOPO TA Cloning
Mit DNA aus zwei PCR positiven Proben zum einen aus Speichel von Myotis brandtii, Ringnummer B77253 vom 23.05.2011 am Fangort Kreuzhorst sowie zum anderen aus einer Urinprobe von Myotis bechsteinii, PIT Nummer 5EBF3C vom 18.05.2011 am Fangort
Unteraltertheim wurde die Sequenzierung nach TOPO TA Cloning® (Invitrogen GmbH, Karlsruhe) durchgeführt. Hierzu wurde 1 µl aufgereinigte DNA erneut in der nested Runde der RMH-PCR amplifiziert. Diesem Reaktionsgemisch wurden nach Beendigung der PCR 0,4 µl dATP (100 mM Deoxynucleoside Triphosphate Set, PCR Grade, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim 11969064001), 1,25 U Platinum® Taq DNA Polymerase (Invitrogen GmbH, Karlsruhe 10966) sowie 0,6 µl dH2O (GIBCO® Invitrogen GmbH, Karlsruhe) zugegeben. Diese Reaktion wurde für 10 Minuten bei 95°C und anschließend für ebenfalls 10 Minuten bei 71°C inkubiert, um den erforderlichen Deoxyadenosinüberhang am 3‘ Ende des PCR Produktes zu erhalten. Für das TOPO TA Cloning® wurde der pCR 2.1-TOPO Vektor sowie chemisch kompetente TOP 10 E. coli-Zellen (Invitrogen K4500) verwendet. Für die Klonierungsreaktion wurden 3 µl des Reaktionsproduktes mit 1 µl Salt Solution (TOPO TA Cloning® Kit), einem µl TOPO Vektor sowie 1 µl dH2O (GIBCO® Invitrogen GmbH, Karlsruhe) für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Zur Transformation der Zellen wurden diese mit 2 µl des Klonierungsprodukts für eine halbe Stunde auf Eis inkubiert.
Daraufhin wurden die Zellen für 30 Sekunden bei 42°C einem Hitzeschock ausgesetzt und hierauf wieder auf Eis abgekühlt. Anschließend wurden den Zellen 250 µl Nährmedium zugesetzt (S.O.C. Invitrogen 15544-034) und darin für 1 Stunde bei 37°C und 300 rpm im Thermomixer vorkultiviert. Hierauf wurden 40 µl der transformierten Zellen mit zusätzlichen 40 µl S.O.C. Medium auf einer LB-Agarplatte (15 g Bacteriological Grade Agar [ICN Biomedicals 9002-18-]/l LB Medium) ausplattiert und bei 37°C über Nacht inkubiert. Zur Selektion enthielten die Platten 100 mg/l Ampicillin (Sigma A9518). Mit der übrigen Zellsuspension wurde unter Zusatz von 50 µl S.O.C. Medium identisch verfahren. Die DNA aus den gewachsenen Kolonien wurde mit dem QIAprep® Spin Miniprep Kit (Qiagen GmbH, Hilden 27104) aufgereinigt. Dabei werden die Bakterien unter basischen Bedingen lysiert und die DNA übe die Bindung an eine Kieselgelmembran aufgereinigt. Hierzu wurden zunächst jeweils 10 der gewachsenen Kolonien gepickt und mit je 3 ml LB Medium mit 100 mg/l Ampicillin (Sigma A9518) über Nacht bei 37°C bei 200 rpm im Bakterienschüttler (MaxQ 8000, Thermo Sientific) angezogen. Im Anschluss daran wurden je 2 ml jeder Übernachtkultur entnommen und die Bakterien bei 4°C für 20 Minuten pelletiert. Der Überstand wurde daraufhin verworfen und das Pellet mit 250 µl P1 resuspendiert. Der Suspension wurde anschließend 250 µl Puffer P2 zugesetzt und durch invertieren vermischt.
Hierauf wurden 350 µl Puffer N3 zugesetzt ebenfalls durch invertieren vermengt. Die hierdurch lysierten und denaturierten Zellbestandteile wurden anschließend durch Zentrifugation für 20 Minuten bei 4°C pelletiert. Der die Nukleinsäure enthaltende Überstand wurde anschließend während einer Minute über die Kieselgelmembran zentrifugiert. Danach wurde die dort gebundene DNA mit 750 µl Puffer PE währen einer weiteren Minute Zentrifugation gewaschen. Pufferreste wurden durch Wiederholung des Zentrifugationsschrittes entfernt. Die Elution erfolgte mit 50 µl DNase freiem dH2O (GIBCO® Invitrogen GmbH, Karlsruhe). Diese wurde während einer Minute auf der Membran inkubiert, anschließend erfolgte die letzte Zentrifugation für eine weitere Minute.
Alle Zentrifugationsschritte erfolgten in der Eppendorf Zentrifuge 5430R (Eppendorf AG, Hamburg) bei 13000 rpm. Mit der so gewonnenen DNA wurde ein Restriktionsverdau durchgeführt um möglicherweise positive Klone zu ermitteln. Hierzu wurden 5 µl DNA mit 20 U EcoRI (New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main R0101S) 2 h bei 37°C geschnitten und anschließend im Agarosegel analysiert. EcoRI schneidet den Vektor wenige Basenpaare vom 3´und 5´ Ende des Inserts entfernt. Klone mit Insert in der erwarteten Fragmentgröße des einligierten PCR Produktes wurden durch MWG (MWG Eurofins Operon, Ebersberg) sequenziert.
3.4.2 Sanger Sequenzierung
Bei der direkten Sequenzierung mit fluoreszenzmarkierten Didesoxynukleotiden wurde das BigDye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit verwendet (Applied Biosystems® Life Technologies GmbH, Darmstadt 4337451). Die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches wird in Tabelle 12 angegeben.
Diese Sequenzierungsreaktion erfolgte im Thermocycler Biometra T3 (Analytik Jena AG, Jena) für eine Minute bei 96°C, gefolgt von 30 Zyklen aus 15 Sekunden bei 96°C, 15 Sekunden bei 50°C und 90 Sekunden bei 60°C. Aufgereinigt wurde das Produkt anschließend mittels SigmaSpinTM Post Reaction Purification Columns (Sigma-Aldrich Biochemie GmbH, Hamburg S5059-70EA). Hierbei wurde zunächst der auf den Säulen vorhandene Puffer während zwei Minuten abzentrifugiert. Anschließend wurden die Proben aufgetragen und während weiterer drei Minuten durch die Gelmatrix der Säulen zentrifugiert. Hierdurch
wurden Salze und DNA Fragmente entfernt, die kleiner als 20 bp waren. Zentrifugiert wurde in der Eppendorf-Tischzentrifuge 5417R (Eppendorf AG, Hamburg) bei 2300 rpm. Vor der Auftrennung der generierten Sequenzabbrüche durch Kappilarelekrophorese wurde das Eluat in einem Volumenverhältnis von 1:1 mit dem Solvens Formamid (Hi-Di Formamide, Applied Biosystems® Life Technologies GmbH, Darmstadt 4404307) versetzt. Die Auftrennung und anschließende Analyse der Sequenzinformation durch Anregung der fluoreszenmarkierten Nukleotide und Übertragung der chromatographischen Signale in Sequenzinformation erfolgte im Applied Biosystems® 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems® Life Technologies GmbH, Darmstadt) im Labor für automatisierte Nukleinsäureextraktion und Sequenzierlabor unter Leitung von Herrn Dipl. Chem. Günter Strebelow (FLI Insel Riems).
Alternativ wurde die aufgereinigte DNA durch MWG im Auftrag sequenziert (MWG Eurofins Operon, Ebersberg).
3.4.3 Auswertung der Sequenzen und phylogenetische Analysen
Erhaltene Sequenzen wurden mit Hilfe des Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) unter Verwendung des Blastn Algorithmus des NCBI (National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine, Bethesda, USA) mit dessen Datenbank verglichen. Berücksichtigt wurden nur Treffer mit einem expected value < 0,001 (Victoria et al. 2009; Li et al. 2010). Für die weitergehenden phylogenetischen Analysen wurden mit der Codon Code Aligner Software v. 4.0.3 (CodonCode Corporation, Centerville, USA) aus den Sequenzen beider cDNA Stränge eine Konsensussequenz (Contig) generiert. Hierbei wurden die Enden der Sequenzen durch das Programm unter Grundeinstellung gekürzt, um Sequenzabschnitte minderwertiger Qualität zu entfernen. Es wurden nur Sequenzen mit eindeutiger Basenfolge als positiv in die Bewertung mit einbezogen. Die so erhaltenen Contigs wurden erneut wie oben einer Blastn Analyse unterzogen. Für die Erstellung Phylogenetischer Dendrogramme wurden die Contigs mit der BioEdit Software v.7.1.7 (Hall 1999) und dem Clustal W Algorithmus (Thompson et al. 1994) miteinander und an Sequenzen aus der NCBI Datenbank ausgerichtet (Tab 13-16) und auf eine Länge gekürzt.
Diese Alignements dienten als Grundlage für die Berechnung der Dendrogramme. Die Dendrogramme wurden mit dem Programm Mega 5 erstellt (Tamura et al. 2011). Dabei
wurden sie mit der distanzbasierten Neighbour Joining Methode berechnet (Saitou und Nei 1987). Die Wahrscheinlichkeit des richtigen Ergebnisses für das errechnete Dendrogramm wurde mit dem Interior Branch Test über Bootsrapping ermittelt (Dopazo 1994; Rzhetsky und Nei 1992). Die errechneten Werte wurden an den Astgabeln der Dendrogramme angegeben.
Als Substiutionsmodell für die statistische Wertung der Sequenzunterschiede wurde für die Dendrogramme aus Sequenzen von Paramyxo- Corona- und Astroviren das Tamura Nei Modell verwendet (Tamura und Nei 1993). Bei der Berechnung des Dendrogramms für Adenoviren kam das hierfür in der Literatur bereits verwendete (Sonntag et al. 2009) p- Distanzmodell zur Anwendung (Nei und Kumar 2000). Die Astlängen der Dendrogramme wurden in Einheiten angegeben, die sich aus den Basenunterschieden pro Position im Alignement der Sequenzen ergeben.
4 Anzuchtversuche für deutsche Fledermaus-Paramyxoviren
Um die detektierten Paramyxoviren anzuzüchten wurden verschiedene Zellinien eingesetzt, die mit Pools aus PCR-positivem Probenmaterial infiziert wurden. Diese Pools stammten vom Fangort Kreuzhorst und wurden nach Probenart, d.h. Speichel, Urin oder Kot sortiert. Es wurden Pools bzw. Proben aus allen drei Jahren in zwei Versuchsansätzen verwendet. Hierbei kamen die Zelllinien FLNID (immortalisierte Nierenzelllinie von Eptesicus serotinus), BHK 21, RK 13, sowie Vero 76 zur Anwendung. Diese Zellinien stammten aus der Zellbank des FLI auf der Insel Riems (Sammlung von Zellkulturen für die Veterinärmedizin (CCLV). Alle verwendeten Kultivierungsmedien wurden dort zentral hergestellt und hatten einen pH-Wert von 7,2. Die Kultivierung erfolgte bei 37°C und 5 % CO2 (Sanyo CO2 Incubator). Den Kultivierungsmedien wurden 97,65 U/ml Penicillin G Natriumsalz (Roth HP48.3) sowie 31,25 µg/ml Streptomycinsulfat (Roth HP 66.2) zugesetzt. Die Fledermauszellen wurden in einem Gemisch im Verhältnis von 1:1 aus Ham's F12 (PAA E15-016) und IMDM (Iscoves Modified Dulbeccos Medium, PAA E15-018) und 6,1 ml einer 200 mM Stammlösung (1,2 mM Endkonzentration) von L-Glutamin (Serva, 22942) angezogen. Für BHK 21-Zellen wurde modifiziertes Glasgow Minimal Essential Medium BHK21 mit 10 % [v/v] FKS (Zellbank Insel Riems) verwendet. RK13-Zellen wurden in MEM Medium angezogen (10,63 g/l MEM Eagle Hank's Salze, [Sigma M4642], 0,85 g/l NaHCO3 [Roth 6885.1]). Vero 76- Zellen wurden in MEM (Modified Eagel´s Medium) mit einem Gemisch aus Hank´s und
Earles´s Salzen kultiviert (10% [v/v] FKS, 5,32 g/l Hank´s Salze [Sigma M4642], 4,76 g/l Earles´s Salze [Gibco/Invitrogen 61100], 1,25 g/l NaHCO3 [Roth 68851.1], 1 % [v/v] nicht essentielle Aminosäuren [Biochrom K 0293, 100fach konzentriert]).
Die Zellen wurden in Monolayern in 25 cm² Zellkulturflaschen (Corning 430372) infiziert. 1- 1,5 h vor der Infektion wurden sie mit einem Milliliter serumfreien Medium (9,9 g/l Dulbecco's Modified Eagle Medium [Gibco 31600-091], 3,7 g/l NaHCO3 [Roth 68851.1]) inkubiert. Der zweite Anzuchtsversuch erfolgt an diesem Punkt ohne Zusatz von Antibiotika.
Im ersten Anzuchtsversuch kamen BHK 21, FLN-ID und RK 13-Zellen zum Einsatz. Es wurden Pools aus Speichel und Urinproben verwendet, die bereits positiv auf paramyxovirale Nukleinsäuresequenzen getestet wurden und somit bereits mehrere Gefrier- und Auftauzyklen hinter sich hatten. Die Zellen wurden in diesem Versuchsansatz mit je 100 µl gepooltem Material infiziert. Da die Fledermauszellen aufgrund der näheren Verwandtschaft der Spendertierart zu den beprobten Tieren als vielversprechender Nährboden angesehen wurden, wurde hier das restliche Probenmaterial verwendet um die Möglichkeit einer erfolgreichen Infektion zusätzlich zu erhöhen. Dies waren 190 µl Speichelpobenpool und 160 µl Urinpool Im zweiten Anzuchtversuch wurden BHK 21, RK 13 sowie Vero 76-Zellen verwendet. Diese wurden mit frischen Pools von Speichel, Kot und Urinproben infiziert, die am Tag zuvor gesammelt und bis zur weiteren Bearbeitung gekühlt worden waren. Die Proben wurden nach dem Poolen steril filtriert (MILLEX®-GP 0,22 µm, Millipore SLGP033RS). Von diesen Probenpools wurden 900 µl je 25 cm3 Zellkulturflasche verwendet.
Nach Zugabe des Probenmaterials wurden die Zellen für eine Stunde bei 37°C und 5% CO2
inkubiert, wobei sie alle 15 Minuten behutsam geschwenkt wurden. Nach Infektion der Zellen wurden diese unter Zusatz von je 4 ml Erhaltungsmedium inkubiert. Diese Erhaltungsmedien entsprachen den zellspezifischen Anzuchtsmedien, wiesen jedoch einen reduzierten Gehalt an FKS auf. Das Medium für Fledermauszellen enthielt 2 % FKS, dasjenige für die BHK 21 und RK 13-Zellen 3 % FKS. Das Erhaltungsmedium der Vero 76-Zellen enthielt dagegen kein Serum.
Die Zellen wurden täglich auf ihren Gesundheitszustand und eventuelle zytopathogene Effekte hin beurteilt. Im ersten Anzuchtsversuch wurden die Zellen je nach
Gesundheitszustand nach 3-6 Tagen durch wiederholtes Einfrieren bei -70°C und Auftauen geerntet und 500 µl Lysat wurden auf neue Zellen passagiert. Das erste Zelllysat wurde durch Abschaben der Zellen mit einem Zellschaber (Sarstedt 83.1830) gewonnen. Im zweiten Anzuchtsversuch wurden die Zellen drei Tage nach Infektion durch den oben beschriebenen Gefrierzyklus geerntet und es wurden 1 ml Lysat zur Infektion frischer Zellen verwendet. Es wurden jeweils fünf Passagen durchgeführt.
Des Weiteren wurden jeweils 100 µl aus dem Urin- und Kotprobenpools des zweiten Anzuchtversuchs zur Infektion von embryonierten Hühnereiern eingesetzt. Die Pools wurden bis vor der Infektion bei – 80 °C zwischengelagert. Diese Arbeiten wurden im Nationalen Referenzlabor (NRL) für Newcastle Krankheit unter der Leitung von Dr. Christian Grund (FLI Insel Riems) durchgeführt. Nach zwei Wochen wurde Eiflüssigkeit gewonnen und passagiert. Gegebenenfalls wurde Eiflüssigkeit noch einmal im Triplet mit je 200 µl passagiert und nach 140 h gewonnen.
Es wurden jeder Passage je 140 µl Zelllysat bzw. Eiflüssigkeit entnommen und eine RNA- Extraktion mit anschließender PCR- und Sequenzanalyse wie unter Punkt 3 für Paramyxoviren beschrieben durchgeführt.
5 Generierung und Validierung polyklonaler und monoklonaler Antikörper gegen Proteine des Hendravirus
5.1 Peptide des Attachment- und des Fusions-Proteins
Zur Immunisierung von Kaninchen gegen das Attachment-Protein (Glykoprotein G) und das Fusionsprotein des Hendravirus wurden kommerziell synthetisierte und aufgereinigte Peptide verwendet (EMC microcollections GmbH, Tübingen). Die Peptide waren zur Verbesserung der Immunantwort der Kaninchen am C-Terminus über die Aminosäure Cystein an den hochmolekularen Proteinkomplex Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH; aus Megathura crenulata) gekoppelt. Mit Ausnahme des Peptides F21 wurde hierzu dem C-Terminus der Peptide ein Cystein hinzusynthetisiert.
Das Peptid F1 umfasst das Fusionspeptid, eine hydrophobe Region der F1 Untereinheit des Fusionsproteins (UniProt knowledgebase/Swiss-Prot protein database; UniProt Consortium
