Luziferaseassay

Um einen quantitativen Test zur Messung der Synzytienformation zu etablieren, wurden zunächst bekannte Komponenten eingesetzt. Die oben beschriebenen Peptide dienten hierbei als positive, d.h. vollständig die Synzytienbildung inhibierende Kontrolle und wurden daher

in einer Konzentration von 10 µM eingesetzt. Zum anderen wurde der Aktivator der Reporter-Luziferase, das Plasmid zur Expression des UL 46 des Pseudorabiesvirus, in einem weiteren Kontrollansatz weggelassen. Da gerade kleinere Synzytien, wie sie beim Einsatz der Peptide (s.o.) auftreten können, lichtmikroskopisch schwer erkennbar sind, wurden Kontrollaufnahmen am konfokalen Mikroskop wie im Absatz 6.2 (Indirekte Immunfluoreszenz) beschrieben, durchgeführt. Hierbei bestätigte sich die Abwesenheit von Synzytien in den durch Peptide fusionsinhibierten Zellpopulationen im Gegensatz zu den nicht inhibierten Populationen. In dieser Positivkontrolle zeigten sich überdies wie erwartet Fusionen der Populationen „Jäger“ und „Beute“ sowie auch Fusionen innerhalb der Population „Jäger“, welche lediglich eine grüne Fluoreszenz für das Matrixprotein aufwiesen (Abb. 30).

Abbildung 30 (A-D) Immunfluoreszenz-Darstellung der durch Peptide gehemmten Fusion im Luziferaseassay, Fluoreszenz für das Matrixprotein des Hendravirus grün, für den UL46 des Pseudorabiesvirus rot; (A) Positivkontrolle mit ungehemmter Synzytiumsformation; (B) Negativkontrolle mit ausbleibender

Synzytiumsformation durch das Fehlen des Fusionsproteins im Transfektionsansatz; (C) Fusionsinhibition durch das Hendravirus-Peptid; (D) Fusionsinhibition durch das Peptid des humanen Parainfluenzavirus;

Zum besseren Vergleich der Luziferaseaktivität in der Positivkontrolle zu der in den verschiedenen Negativkontrollen wurde die Reaktion zu unterschiedlichen Zeitpunkten gestoppt, um den zeitlichen Verlauf der Luziferaseaktivität darzustellen und so ggf. den Zeitpunkt des Expressionsoptimums zu ermitteln. Zur Messung von vier Zeitpunkten wurden

die Zellen so im Vierfachansatz transfiziert, gemischt und in neue Kulturschalen ausgesät, um möglichst gleiche Ausgangspopulationen zu erhalten. Durch Variationen in Zellwachstum sowie Transfektions- und Expressionseffizienz waren die Werte der einzelnen Versuchsdurchläufe nicht mittelbar und mussten daher einzeln betrachtet werden. So wurde der Verlauf der Messwerte und das Verhältnis der Messwerte zueinander beurteilt.

Im Messansatz mit allen Transfektions-Kombinationen und Parallelansätzen zur Darstellung des zeitlichen Expressionsverlaufs wurde zur Reduktion der erforderlichen Ansätze lediglich das Peptid des humanen Parainfluenzavirus als Inhibitor eingesetzt. Hier ergaben sich deutlich höhere Messwerte der Reporter-Luziferase für die Positivkontrolle sowie geringere Werte für die Ansätze ohne das Matrixprotein. Die niedrigsten Werte wurden in den inhibierten Kontrollansätzen und denen ohne UL 46 gemessen (Abb. 31).

Abbildung 31 Zeitlicher Verlauf der Expression der Reporter-Luziferase (Renilla)

Der höchste Messwert für die der Reporter-Luziferase (Renilla) in der Positivkontrolle wurde in diesem Ansatz nach 48 Stunden erreicht. Der gemessene Wert der Renilla-Luziferase lag mit 133.502 RLU/s 21,2-fach über dem Wert der Kontrolle ohne das Fusionsprotein (6.283

0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000

12h 24h 36h 48h

RLU/s

Zeitpunkt post Transfektion

Reporter (Renilla)

Positivkontrolle ohne HeV M HPIV Peptid 10µM ohne UL 46 ohne HeV F

RLU/s), 5,9-fach über dem Wert der Kontrolle ohne UL46 (22.808 RLU/s) und 1,8-fach über dem Wert der Zellpopulation ohne das Matrixprotein (74.557 RLU/s).

Diese Werte müssen jedoch im Zusammenspiel mit denen der internen Kontrolle betrachtet werden, wobei möglichst ähnliche Verläufe in allen Zellpopulationen erwartet wurden. Die Werte der internen Kontrolle in der Zellpopulation ohne UL46 bleiben dabei jedoch zu allen vier Zeitpunkten unter den Werten der anderen Zellpopulationen (Abb. 32).

Abbildung 32Zeitlicher Verlauf der Expression der Kontroll-Luziferase (Firefly)

Um den beobachteten Effekt einer reduzierten Expression der internen Kontrolle (Firefly-Luziferase) der Zellpopulation ohne UL 46 (Neg K) im Vergleich zur Positivkontrolle zu bestätigen, wurden weitere Versuchsansätze unter Verwendung von Positiv- und Negativkontrollen (Ansatz ohne UL 46) durchgeführt, wobei der beschriebene Effekt reproduziert wurde (Abb. 33)

0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000

12h 24h 36h 48h

Interne Kontrolle (Firefly)

Positivkontrolle ohne HeV M HPIV Peptid 10µM ohne UL 46 ohne HeV F

Abbildung 33 Wiederholungsexperiment zur unterschiedlichen Expression der internen Kontrolle (Firefly)

In einem weiteren Ansatz wurde der zeitliche Verlauf der Luziferase-Expression in Zellpopulationen untersucht, die in Zellzahlen im Verhältnis 1:1 und 1:2 zur Ausgangszellzahl ausgesät wurden, um unterschiedliche Zellwachstumsbedingungen zu erhalten. Überdies wurde die Inkubationszeit auf 63 h verlängert (Abb. 34).

Abbildung 34 Verlängerung der Zeitachse und Vergleich einer unterschiedlichen Ausgangszellzahl 0

Auch hier zeigten sich niedrigere Werte für die Expression der internen Kontrolle in der Zellpopulation ohne UL46.

Zudem wurden die Positiv- und Negativkontrollen nochmals in drei Parallelansätzen zu zwei Zeitpunkten gemessen, um eine Abweichung eines einzelnen Wertes ausschließen zu können (Abb. 35).

Abbildung 35Luziferase-Expression in Paralellansätzen (1-3) zu zwei verschiedenen Messzeitpunkten

In allen Versuchsansätzen konnte somit ein verminderter Nachweis der internen Kontrolle in den Zellpopulationen ohne UL 46 gezeigt werden.

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V Diskussion

1 Bedeutung viraler Nukleinsäuresequenzen und deren Prävalenzen in Feldproben europäischer Fledermausarten

Ziel der Untersuchungen war es einerseits zu bestimmen, ob mitteleuropäische Fledermäuse neben den bereits bekannten Fledermaus-assoziierten Lyssaviren weitere Viren mit zoonotischem bzw. krankmachendem Potential ausscheiden. Der Nachweis von viraler Nukleinsäure ist zwar nicht beweisend für eine tatsächliche Ausscheidung vermehrungsfähiger Viren, dennoch geben solche Ergebnisse Hinweise auf Erreger-Übertragungen innerhalb und zwischen Fledermauskolonien sowie für eine potenzielle Exposition des Menschen. Zweifelsfrei beweisend für die Ausscheidung vermehrungsfähiger Viren ist nur ein erfolgreicher Anzuchtversuch von Viren in der Zellkultur oder im embryonierten Hühnerei (siehe Kapitel 2). Ein weiteres Ziel war es, Viren mit ausreichend hoher Prävalenz und ggf. Diversität zu finden, um diese virologischen Daten mit sozioökologischen Daten zu den Tieren in der jeweiligen Fledermauskolonie zu vergleichen und so ihre Eignung für die Beurteilung sozialer Interaktionen/Übertragungen zwischen Fledermausindividuen bzw. Arten und Kolonien zu ermessen.

Bei der Beurteilung der gefundenen Sequenzen ist zu beachten, dass es sich lediglich um wenige hundert Basenpaare umfassende Sequenzabschnitte des Polymerase-Gens der untersuchten Viren handelte, deren Genom insgesamt mehrere Kilobasenpaare einnimmt. So umfasst beispielsweise das Genom des Hendravirus 18.234 Nukleotide (GeneBank Accession Nr. NC_001906.3) und dasjenige des SARS-Coronavirus sogar 29.751 Nukleotide (GeneBank Accession Nr. NC_0047183). Folglich ist es nicht möglich, eine Aussage über den Grad der Ähnlichkeit des gesamten Genoms oder zumindest größerer Genomabschnitte zu treffen. Aussagen über das biologische Verhalten der detektierten Viren sind anhand der bloßen Sequenzinformation partieller Abschnitte ebenfalls nicht möglich. Es wurden zunächst lediglich einfache distanzbasierte Dendrogramme errechnet, die in erster Linie der Orientierung dienen sollen. Die generierten Daten ermöglichen eine Kategorisierung der detektierten Viren bezüglich einer näheren Verwandtschaft zu Pathogenen sowie ihrer Eignung als biologische Marker.

1.1 Coronaviren

Bei der Analyse der Coronavirus-Sequenzen ist keine Verwandtschaft zu pathogenen zoonotischen Taxonen wie dem SARS-Coronavirus oder dem MERS-Coronavirus erkennbar.

Es besteht auch keine Verwandtschaft zu Fledermaus-assoziierten Viren wie dem Bat coronavirus HKU4 oder dem Bat coronavirus HKU5, die sich wie das SARS- und MERS-Coronavirus den ß-Coronaviren zuordnen lassen (Woo et al. 2006) und als Verwandte des MERS-Coronavirus diskutiert wurden (Lau et al. 2013). Die generierten Sequenzen clustern mit weiteren Sequenzen, welche den α-Coronaviren zugeordnet wurden und aus norddeutschen Fledermäusen der Spezies Pipistrellus nathusii amplifiziert wurden (Gloza-Rausch et al. 2008). Dadurch scheint sich eine weitgehende Monophylie der Coronaviren innerhalb der einzelnen Arten auch in erweiterten geographischen Maßstäben zu bestätigen (Gloza-Rausch et al. 2008). Die hier nachgewiesenen Fledermaus-Coronaviren lassen sich somit vermutlich ebenfalls den α-Coronaviren zuordnen.

Mit dem Nachweis von lediglich zwei positiven Proben und einer Nachweisrate von 1 % eigneten sich die Coronaviren in den untersuchten Kolonien nicht für detaillierte Analysen möglicher Übertragungswege, vor allem da in den am besten charakterisierten bayerischen Fledermauskolonien keine Coronavirus-RNA nachweisbar war.

1.2 Adenoviren

Die generierten adenoviralen Sequenzen lassen sich gemäß der Blastn-Analyse und im phylogenetischen Dendrogramm am ehesten den Mastadenoviren zuordnen. Die in dieser Arbeit generierten Sequenzen weisen keine nähere Übereinstimmung mit dem deutschen Isolat PPIV1 auf, welches als Ursprung der caninen Adenoviren 1 und 2 diskutiert wird (Jánoska et al. 2011, Kohl et al. 2012). Die größte Ähnlichkeit der Sequenz aus einer in dieser Arbeit untersuchten deutschen Fledermaus der Gattung Plecotus besteht zu einer ungarischen Sequenz aus derselben Gattung. Die zweite Sequenz aus Myotis bechsteinii lässt sich am ehesten einer Sequenz einer chinesischen Fledermaus der Spezies Myotis horsfildii zuordnen.

Eine Koevolution von Wirt und Virus wird daher bei Adenoviren vermutet (Jánoska et al.

2011), obgleich hierfür auch durchaus Ausnahmen bestehen, da die Diversität von adenoviralen Sequenzen, die aus Individuen derselben Spezies isoliert wurden, mitunter hoch

ist (Li et al. 2010). Leider standen zum Zeitpunkt der Untersuchung keine Vergleichssequenzen aus anderen von Myotis bechsteinii bzw. Plecotus auritus stammenden Proben zur Verfügung, um die Daten umfassender vergleichen zu können. Die Heterogenität der Fledermaus-assoziierten Adenoviren könnte sie zu einem geeigneten Untersuchungsmodell für intra- und interspeziesspezifische Übertragungswege machen, allerdings ist die Nachweisrate von 1 % zu gering, um als Marker für biologische Interaktionen bei Fledermäusen zu dienen.

1.3 Astroviren

Bislang wurden keine fledermausassoziierten Astroviren detektiert, die eine Verwandtschaft zu pathogenen bzw. zoonotischen Krankheitserregern aufweisen. Einige aus Proben chinesischer Fledermäuse generierte Sequenzen weisen eine geringe Ähnlichkeit zu humanen Astroviren auf (Chu et al. 2008). Auch einige in dieser Arbeit generierte Astrovirussequenzen lassen sich laut Blastn-Analyse und phylogenetischem Dendrogramm am ehesten den humanen Astroviren zuordnen. Ob es sich hierbei aber tatsächlich um humane Astroviren handelt, die in Fledermauspopulationen zirkulieren, oder ob es sich eventuell um eine Kontamination von Probenmaterial durch den menschlichen Probenehmer handelte, kann zum jetzigen Zeitpunkt der Untersuchung nicht abschließend beurteilt werden. Ähnliches gilt für weitere im Rahmen dieser Arbeit gefundene Sequenzen, die sich am ehesten den aviären Astroviren zuordnen lassen und bei denen eine Kontamination mit vogelassoziierten Viren nicht ausgeschlossen werden kann. Diese Befunde sollen Gegenstand weiterführender Untersuchungen sein.

Darüber hinaus lassen sich jedoch gerade in den gut charakterisierten Fledermauskolonien im Würzburger Raum mehrere im Hinblick auf eine Verwendung von Astroviren als biologische Marker vielversprechende Beobachtungen machen. Zum einen wurden hier an mehreren Beprobungsorten Prävalenzen von über 30 und 40 % festgestellt. Zudem weisen die gefundenen Sequenzen Variabilitäten auf, die in Zusammenhang mit der untersuchten Fledermausspezies, dem Probenahmeort und dem Zeitpunkt der Probenahme zu stehen scheinen. Astrovirale Sequenzen konnten in Kot, Urin und Speichelproben nachgewiesen werden. Hierbei ist auffällig, dass bei Tieren, von denen positive Proben vorliegen, weitere gleichzeitig gewonnene Proben(arten) nicht zwangsläufig ebenfalls positiv waren. Dies

könnte auf ein zeitlich gestaffeltes Ausscheidungsmuster von Astroviren hindeuten. Die Tatsache, dass positive Tiere bei späteren Wiederholungs-Probenahmen negativ getestet wurden, spricht für eine Eliminierung der Infektion durch die individuellen Fledermäuse.

Eines der beiden auch zu einem zweiten Probenahmezeitpunkt positiv getesteten Tiere wies sogar bei der zweiten Untersuchung einen anderen Sequenztyp auf. Die Schwankungen der Nachweisraten und der Sequenzidentitäten zwischen den unterschiedlichen Spezies, Lokalisationen und Zeitpunkten können ohne die dazugehörigen biologischen Daten über Interaktionen und Verhaltensweisen der Tiere in dieser Arbeit nicht weiter aufgeklärt werden.

Hierfür ist die Analyse der Daten in Zusammenhang mit den dazugehörigen biologischen Informationen zu den Fledermäusen in einem Kooperationsprojekt mit Prof. G. Kerth (Zoologisches Institut der Universität Greifswald) geplant. In Kombination mit einer theoretisch möglichen Wiederfangquote von 100 % (Gerald Kerth, persönliche Mitteilung) können so weiterführende Untersuchungen zu Übertragungswegen der Astroviren durchgeführt werden.