Paramyxoviren

Paramyxovirale RNA konnte sowohl in Speichel als auch in Kot- und Urinproben nachgewiesen werden. Ausgehend von den vorhandenen Sequenzinformationen zeigte sich bei der Untersuchung auf Paramyxoviren weder bei der Blastn-Analyse noch bei der Darstellung der möglichen Verwandtschaften im phylogenetischen Dendrogramm eine unmittelbare Verwandtschaft der generierten Sequenzen mit Henipa- oder Henipa-ähnlichen Viren. Eine Ähnlichkeit besteht am ehesten zu Morbilli-ähnlichen und unklassifizierten Viren wie dem J- und Beilongvirus (Jack et al., 2005; Li et al. 2006). Die größte Ähnlichkeit besteht zu weiteren in Europa aus Fledermausproben generierten Sequenzen, die ebenfalls zu den Morbilli-ähnlichen Viren gerechnet werden können, aber nicht zu oder Henipa-ähnlichen oder sonstigen Paramyxoviren von bekanntem zoonotischen oder krankmachendem Potential (Drexler et al. 2011; Kurth et al. 2012; Drexler et al. 2012). Von diesen europäischen Fledermaus-Paramyxoviren existieren bisher keine Vollgenomsequenzen oder Isolate. Aus diesem Grund wurde eine Virusisolation aus positivem Probenmaterial angestrebt (siehe unten). Des Weiteren ist zu beachten, dass durch die verwendeten PCR-Protokolle nicht alle Paramyxovirus-Genera abgedeckt werden. So gelang es bereits weltweit, und auch

in deutschen Fledermäusen, Sequenzinformationen nachzuweisen, die sich dem Genus Rubulavirus zuordnen lassen (Drexler et al. 2012; Baker et al. 2012; Kurth et al. 2012). Dies war jedoch nicht Gegenstand dieser Arbeit. Überdies gelang es, Sequenzen fledermausassoziierter Mumps-ähnlicher Viren in Urinproben von Eidolon helvum Flughunden in Ghana nachzuweisen (Baker et al. 2012). Aus der Milz eines Epauletten-Flughundes (Epomorphus spp.) aus der Demokratischen Republik Kongo konnte sogar eine Vollgenomsequenz eines Mumps-ähnlichen Virus isoliert werden (Drexler et al. 2012).

Weiterhin wurden im Serum von Palmenflughunden (Eidolon helvum) in Ghana kreuzreaktive Antikörper gegen Nipah- und Hendraviren nachgewiesen (Hayman et al. 2008).

Im Rahmen dieser Arbeit wurden am Probenahmeort Kreuzhorst in Sachsen-Anhalt Prävalenzen positiver Proben von bis zu 20,0 % detektiert. Die positiven Befunde aus dieser Lokalisation bedingen wiederum die hohen Prävalenzwerte bei Fledermäusen der Spezies Pipistrellus pipistrellus und Myotis brandtii. Die Nachweisraten positiver Proben blieben über alle drei Probenahmejahre hinweg bei über 10 %. An allen anderen Probenahmeorten in Sachsen-Anhalt, Bayern und Rumänien fanden sich lediglich einzelne positive Tiere. Hierfür ist keine offensichtliche Erklärung vorhanden. So liegen zum Beispiel an der Lokalisation Cheiner Moor in Sachsen-Anhalt ähnliche Habitatbedingungen (Bewaldung in Gewässernähe) und ein vergleichbares Speziesspektrum vor. Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass die

„Befallsrate“ innerhalb deutscher Fledermauspopulationen durchaus heterogen ist, und dass sich die Infektion innerhalb einer Population über mehrere Jahre halten kann. Dies bestätigt die für Fledertiere beschriebene, weitgehende Apathogenität von Paramyxoviren für ihre Träger.

Bezüglich der phylogenetischen Verwandtschaftsverhältnisse fällt auf, dass (mit Ausnahme der in Proben der Spezies Myotis bechsteinii nachgewiesenen Sequenzen) Sequenzen von Fledermäusen derselben Gattung bzw. Art auch bei großer geographischer Entfernung der Fledermauskolonien Sequenzgruppen bilden. Somit scheinen die detektierten Viren speziesspezifisch zu sein, was dafür spricht, dass hier eine Ko-Evolution stattgefunden hat.

Eine weitere Auffälligkeit besteht darin, dass die Sequenzen von Pipistrellus pipistrellus und Myotis brandtii von der Lokalisation Kreuzhorst eine Sequenzgruppe bilden. Dies kann eventuell dadurch erklärt werden, dass beide Arten während ihrer Tagesstarre (Torpor)

vergesellschaftet in denselben Fledermauskästen verbringen und somit neben Körperkontakt auch in hohem Maße Kontakt zu den Ausscheidungen der jeweils anderen Spezies haben.

Eine Übertragung der Viren zwischen verschiedenen Fledermausspezies scheint somit prinzipiell möglich.

Um diese Beobachtungen weitergehend zu untersuchen wäre es notwendig, die Tierbewegungen und Interaktionen der Tiere genauer zu kennen. Derart detaillierte Informationen liegen jedoch nur für die Kolonien aus dem Raum Würzburg vor. In diesen Kolonien ist jedoch die Nachweisrate an detektierter paramyxoviraler RNA deutlich geringer, sodass Aussagen über mögliche Transmissionswege kaum getroffen werden können.

Zusammenfassend ist zu bemerken, dass europäische Fledermausarten anscheinend apathogene Paramyxoviren und Astroviren über Speichel, Kot und Urin ausscheiden.

Sequenzen von Adeno- und Coronaviren konnten dagegen nur im Kot nachgewiesen werden.

Zum einen wäre hier jedoch eine tiefergehende phylogenetische Analyse eventuell sogar unter Einbeziehung zusätzlich generierter Sequenzinformation für eine weiterführende Beurteilung sinnvoll. Des Weiteren wären möglichst konstante Probenzahlen und Probenarten mit einem hohen Anteil an Wiederfängen für eine statistisch absicherbare Auswertung hilfreich.

Zudem sind die ermittelten Nachweisraten nicht als absolute Zahlen zu werten, da die Proben in dieser Arbeit mit vergleichsweise weniger sensitiven, aber dafür ein breites Erregerspektrum detektierenden PCR-Protokollen getestet wurden. Die tatsächliche Anzahl positiver Tiere ist bei der Verwendung sensitiverer PCR-Methoden vermutlich höher. Daher wurden in anderen Studien im Anschluss an eine erste ein breites Spektrum von Virusstämmen und -subtypen detektierende PCR eine zweite PCR mit einer höheren Spezifität und Sensitivität eingesetzt (Sonntag et al. 2009; Drexler et al. 2011). Hierbei wurde die gewonnene Sequenzinformation aus der ersten PCR-Analyse dazu verwendet, sequenzspezifische real time PCR-Protokolle zu entwickeln. Dieses Vorgehen, die Feldproben zunächst mit einer Breitspektrum-PCR zu testen um neue Viren und Virustypen zu detektieren und anschließend die Prävalenzen möglichst genau mittels spezifischer PCR-Protokolle zu bestimmen, scheint die exakteste Methode zu sein. Sie schließt allerdings auch nicht die Möglichkeit aus, dass in der ersten PCR bestimmte Virusarten und -subtypen von vornherein nicht erkannt werden. Zusätzlich ist diese zweistufige Methode mit einem

deutlichen Mehraufwand verbunden. Überdies können einige relevante Viren nicht mit den verwendeten Protokollen nachgewiesen werden. Ein Nachweis von Rubulaviren und somit eventuell mit dem Mumpsvirus verwandten Paramyxoviren wurde so bislang nicht angestrengt. Hierbei könnte das entsprechende bereits etablierte Protokoll verwendet werden.

Zudem ist denkbar, dass persistente Virusinfektionen durch die Imunantwort der Fledermäuse derart beherrscht werden, dass es zu keiner nachweisbaren Ausscheidung kommt.

2 Anzucht von europäischen Fledermaus-Paramyxoviren

Eine Isolierung von Viren aus den gewonnenen Fledermausproben hätte deren Ausscheidung und Übertragbarkeit auf andere Tiere am eindeutigsten bewiesen. Darüber hinaus würde ein solches Isolat weitergehende Sequenzanalysen erlauben, die bisher auf einen kleinen Bereich im Polymerase-Gen beschränkt sind. Zudem wäre es anhand der gewonnenen Informationen möglich, weitere Testverfahren wie z.B. serologische Testmethoden zu entwickeln. Dadurch könnten Kreuzreaktionen mit pathogenen Paramyxoviren wie den Henipaviren getestet werden. Gegebenenfalls könnten die offenbar avirulenten europäischen Fledermaus-Paramyxoviren als Werkzeuge für die Entwicklung weiterer Diagnostika und ggf.

Therapeutika für Henipaviren dienen.

Bislang gelangen Isolierungen von Fledertier-Paramyxoviren am häufigsten aus Urinproben größerer Flughunde (Chua et al. 2001, Chua et al. 2002, Rahman et al. 2010, Marsh et al.

2012, Barr et al. 2012). Die Kultur erfolgte dabei in Verozellen (Chua et al. 2001, Chua et al.

2002, Rahman et al. 2010) bzw. in einer primären Zellinie aus Nierengewebe eines Flughundes der Spezies Pteropus alecto (Marsh et al. 2012; Barr et al. 2012). Aus Proben von Microchiroptera-Spezies aus Europa konnten bisher keine Paramyxoviren isoliert werden.

Aus zum Zweck der Organgewinnung getöteten freilebenden Fledermäusen aus der Familie der Miniopteridae gelang es, Paramyxoviren in Verozellen anzuzüchten. Diese Fledermausfamilie wird zu den insektivoren Microchiroptera gerechnet. Die Tiere stammten dabei aus Madagaskar (Miniopterus soroculus) und den Komoren (Miniopterus griveaudi).

Der gewonnenen Sequenzinformation nach lassen sich die detektierten Viren ebenfalls den Morbilli-verwandten Paramyxoviren zuordnen (Wilkinson et al. 2012). Aufgrund des

gefährdeten bzw. geschützten Status einheimischer Fledermäuse besteht keine Möglichkeit Viren aus frischen Organen von hierfür getöteten Wildfängen anzuzüchten.

Der bislang vielversprechendste Isolierungsversuch mit Probenmaterial aus dieser Arbeit wurde im NRL für Newcastle Krankheit unter der Leitung von Dr. C. Grund (FLI Insel Riems) in embryonierten Hühnereiern durchgeführt. Hier war es bei einem Ansatz möglich, paramyxovirale Sequenzen mittels PCR und Sequenzierung in der Allantoisflüssigkeit eines Eies nachzuweisen. Ein Wiederholungsversuch mit frischem Probenmaterial und erfolgreicher Passage steht allerdings noch aus. Das betreffende Ei wurde mit einem Pool aus Urinproben inokuliert. Daher stellt diese Anzuchtsmethode möglicherweise eine Alternative zur Zellkultur dar. Anhand der Literatur und dieses Ergebnisses sind Urinproben von Tieren aus Standorten mit hohen Paramyxovirus-Nachweisraten (wie dem Kreuzhorst in Sachsen-Anhalt oder den Lokalisationen in Mecklenburg-Vorpommern) für Anzuchtversuche am besten geeignet.

3 Generierung und Validierung Hendravirus-spezifischer Antikörper

Im Zuge dieser Arbeit wurden polyklonale Antikörper gegen das Fusionsprotein, das Matrixprotein und das Nukleokapsidprotein des Hendravirus generiert. Monoklonale Antikörper konnten für das Matrix- und das Nukleokapsidprotein validiert werden.

Die Immunisierung von Kaninchen mit KLH-gekoppelten Peptiden des Attachment-Proteins (Glykoprotein G) und Fusionsprotein war nur teilweise erfolgreich. Eine spezifische Antikörperreaktion konnte nur für das Peptid F22 nachgewiesen werden. Die Immunsierungen mit aufgereinigtem Protein aus der Expression rekombinanter Baculoviren in SF9-Zellen war dagegen in beiden Fällen auf Anhieb erfolgreich.

Die vier Proteine wurden zur Generierung von Antikörpern gewählt, um serologische Diagnostika zu entwickeln. Dies gilt vor allem für die Oberflächenglykoproteine, das Attachment-Protein G und das Fusionsprotein F. Gegen diese Proteine werden in infizierten Tieren und Menschen neutralisierende Antikörper gebildet (Defang et al. 2010), weshalb sie auch bei der Entwicklung von Henipa-Vakzinen Verwendung fanden (Guillaume et al. 2004;

Weingartl et al. 2006; Lo et al. 2014; Middelton et al. 2014).

In dieser Arbeit war es nicht möglich, mit in vitro exprimierten und aufgereinigten Glykoproteinen zu arbeiten, da die Etablierung bzw. Optimierung eines entsprechenden Expressionssystems noch aussteht. Dies wird Gegenstand zukünftiger Arbeiten sein. Aus diesem Grund wurde auf synthetisch generierte Peptide zurückgegriffen. Diese haben den Nachteil, dass Sie aufgrund ihrer geringen Größe weit weniger immunogen sind als größere Proteine. Zudem ist das Spektrum der generierten Antikörper auf nur eine kurze Aminosäuresequenz mit einem linearen Epitop beschränkt, sodass komplexe konformationelle Epitope ebenfalls nicht dargestellt werden können. Hieraus und bei Mutationen im Zielepitop bei unterschiedlichen Virusstämmen ergeben sich ggf.

Sensitivitätsverluste. Aus diesem Grund wurde die Generierung eines funktionsfähigen Antiserums als Teilerfolg gewertet und weitere Immunsierungen ausgesetzt bis aufgereinigtes gesamt- oder ggf. trunkiertes Protein zur Verfügung stehen. Das generierte Serum eignet sich für die Immunfluoreszenz- und Westernblot-Untersuchung transfizierter Zelllysate. Im Westernblot zum Nachweis des Fusionsproteins unter Verwendung des generierten Kaninchenserums wurde neben einer Bande bei 60 kDa, welches dem Molekulargewicht von 59,8 kDa (UniProt Datenbank, Accession Nr. O89342) der ungespaltenen Form des Fusionsproteins entspricht, eine Bande von gut 20 kDa sichtbar, was dem erwarteten Molekulargewicht von 19-23 kDa für die F2-Untereinheit des Fusionsproteins entspricht (Wang et al. 2001).

Für die serologische Diagnostik von Henipavirus-Infektionen wurden bereits mehrere Ansätze auf der Basis des Nukleokapsidproteins beschrieben, wobei das Protein sowohl in E. coli (Yu et al. 2006; Chen et al. 2006), in Hefe (Juozapaitis et al. 2006) und in Insektenzellen (Eshagi et al. 2004) erfolgreich exprimiert wurde. Aufgrund der hierbei, sofern untersuchten, bestätigten Kreuzreaktionen zwischen Hendra- und Nipah-Virus (Chen et al. 2006;

Juozapaitis et al. 2006) wurde das Nukleoprotein als vielversprechendster Kandidat für die Verwendung als ELISA-Antigen und zur Immunisierung eines Kaninchens exprimiert und aufgereinigt. Die erfolgreiche Expression des Nukleoproteins wurde vor Immunisierung des Kaninchens im Labor Dr. S. Finke mittels His tag spezifischem Antikörper bestätigt. Das generierte Serum eignet sich für die Immunfluoreszenz von mit pCAGGS-HeV N transfizierten HEK 293T-Zellen, jedoch nicht für die Westernblot-Analyse hieraus gewonnener Lysate. Hierbei verhindern zu viele unspezifische Banden auch auf Höhe des

gesuchten Proteins in transfizierten und nicht-transfiziertem Material ein auswertbares Ergebnis. Hier müssen gegebenenfalls andere Zelllinien auf eine bessere Eignung hin überprüft werden. So ergaben sich bei Verwendung von Protein aus SF9-Zellen im Vergleich zu analog aufgereinigtem GFP keine unspezifischen Reaktionen. Die Doppelbande, die sowohl hier als auch im Comassie Gel zum Nachweis des aufgereinigten Nukleoproteins detektiert wird, spricht für einen möglichen Zerfall des Proteins, da die Proteinspektren beider Banden im Labor Dr. Axel Karger (FLI Insel Riems) als Hendravirus-Nukleoprotein identifiziert wurden. Die größere der beiden Banden besaß hierbei mit knapp 60 kDa das erwartetete Molekulargewicht des undegradierten Proteins von 58 kDa (Wang et al. 2001).

Bei dem im Rahmen dieser Arbeit etablierten indirekten ELISA auf Grundlage des aufgereinigten Nukleoproteins wird das so generierte Kaninchenserum als Positivkontrolle eingesetzt. Ebenfalls primär für diagnostische Zwecke wurde die Generierung monoklonaler Antikörper gegen das Nukleoprotein angestrebt. Deren Verwendung könnte ggf. auch zur Entwicklung von Diagnostika mit höherer Sensitivität und Spezifität führen. Ein Klon des gegen das Nukleokapsidprotein gerichteten monoklonalen Antikörpers zeigte neben guter Antigen-Erkennung in der Immunfluoreszenz und schwächerer im Westernblot bei der Anwendung im ELISA eine positive, spezifische Reaktion. Auf die serologischen Testergebnisse wird bei der späteren Diskussion des ELISAs noch näher eingegangen.

Der zweite Verwendungszweck der Seren ist die Nutzung in molekularbiologischen Studien.

Diese umfassen sowohl die in dieser Arbeit durchgeführten als auch weitere Projekte zur Analyse des Kerntransports des Matrixproteins (Bauer et al. 2014). Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Seren vor allem zur Dokumentation der Expression und Lokalisation der Hendravirus-Proteine mittels Immunfluoreszenztest und Westernblot verwendet.

Hierbei waren vor allem die Antikörper gegen das Fusions- und Matrixprotein von Bedeutung, worauf im folgenden Abschnitt zur Bewertung der durchgeführten molekularbiologischen Assays eingegangen wird. Auch Antikörper gegen das Attachment-Protein wären hierbei hilfreich gewesen, standen jedoch nicht zur Verfügung, da die Immunisierung der Kaninchen mit den entsprechenden Peptiden nicht erfolgreich war. Die polyklonalen und monoklonalen Antikörper gegen das Matrixprotein erwiesen sich sowohl für die Anwendung in der Immunfluoreszenz als auch im Westernblot mit Lysat transfizierter

Zellen als funktionell. Im Lysat der verwendeten transfizierten HEK293T-Zellen wurde dabei neben einer Bande bei ca. 60 kDa, die auch in den nicht-transfizierten Zellen detektiert wurde und daher eine unspezifische Reaktion darstellte, nur im Lysat transfizierter Zellen eine Bande bei ca. 37 kDa detektiert. Diese Bande entsprach damit dem errechneten Molekulargewicht des Matrixproteins von 39,8 kDa (Wang et al. 2001). Die Generierung monoklonaler Antikörper gegen das Matrixprotein ermöglichte zunächst eine sehr hintergrundarme Immunfluoreszenz. Darüber hinaus eignete sich dieser Antikörper auch für die Durchführung doppelter Immunfluoreszenzen mit Kaninchenantikörpern, da hier zwei verschiedene Sekundärantikörper eingesetzt werden konnten, die zum einen gegen Maus- und zum anderen gegen Kaninchenantikörper gerichtet waren. Der gegen das Matrixprotein gerichtete monoklonale Antikörper schien zudem eine hohe Bindungsspezifität aufzuweisen, da im Westernblot keine unspezifischen Banden erkennbar waren.

Des Weiteren wurde eine Kreuzreaktion der polyklonalen Kaninchenseren gegen das Matrix- und das Nukleoprotein beobachtet. Dieser Effekt bedarf weiterer Untersuchungen, da Kreuzreaktionen zwischen diesen beiden Proteinen bislang nicht bekannt sind. Um die hier beobachtete Kreuzreaktion bestätigen zu können, wäre es sinnvoll, weitere Kaninchen zur Antikörpergewinnung zu immunisieren, um auf diese Weise die Reproduzierbarkeit des Effektes zu überprüfen.

4 Etablierung eines indirekten, speziesunabhängigen Henipa-Virus ELISA für Pferde- und Schweineseren

Der bereits erwähnte Hendra-ELISA auf der Basis des aufgereinigten Nukleoproteins wurde angesichts der bereits für den Immunfluoreszenztest bekannten Kreuzreaktivitäten (Marsh et al. 2012) sowohl für die Detektion von Nipah- als auch Hendravirus-Antikörper eingesetzt.

Tests mit Seren deutscher Pferde, bei denen keine Antikörper gegen Henipaviren zu erwarten sind, zeigten bis zur Verdünnungsstufe von 1:1000 OD-Werte von über 0,2. Dies korrelierte mit Erfahrungen mit Ringtestproben aus dem Jahr 2010. Hier wurde ein indirekter ELISA (HeV iELISA, Daniels et al. 2001; McNabb et al. 2014), der auf inaktiviertem Lysat infizierter Zellen basiert, ebenfalls mit 1:1000 verdünnten Seren verwendet. Zur Testung der Ringversuchsseren im am FLI-etablierten Hendra-ELISA standen jeweils nur 1-2 µl zu Verfügung, somit war lediglich nur ein erster Orientierungstest möglich. Hierbei wurden alle

positiven und negativen Seren korrekt erkannt, mit Ausnahme des am schwächsten positiven (bzw. des am stärksten verdünnten) Serums. Dieses fiel unter den gesetzten Grenzwert (OD 0,2). In späteren Untersuchungen konnten Seren aus dem Ringversuch 2012 getestet werden.

Diese Seren lagen, bedingt durch die Anpassung an einen weiteren am CSIRO entwickelten ELISA stärker verdünnt vor als im Ringtest 2010. Diesem neuen ELISA liegt das Attachment-Protein des Hendravirus zugrunde (sG iELISA, McNabb et al. 2014). Da mit den ursprünglichen Parametern des Nukleoprotein-ELISAs nur noch 5 der 16 positiven Proben detektiert werden konnten, wurde versucht, die Sensitivität des Protokolls zu erhöhen, indem nur noch Serum-Verdünnungen von 1:100 eingesetzt und die Detergenz-Konzentrationen in den Wasch- und Verdünnungspuffern erhöht wurde. Dies führte jedoch zu Spezifitätsverlusten mit unspezifischen Reaktionen einiger Kontrollseren, deren OD-Werte die der stark verdünnten bekannt positiven Seren übertrafen. Die tatsächliche Spezifität solcher ELISA-Ergebnisse wird üblicherweise im Virusneutralisationstest (VNT) überprüft.

Der Hendra-VNT konnte jedoch aufgrund der noch nicht stattgefundenen Inbetriebnahme des BSL4-Labors am FLI nicht durchgeführt werden. Da bislang mit den Ringtestseren nur verschiedene Verdünnungen einzelner Proben getestet wurden, wäre es von Vorteil noch weitere Pferdeseren aus endemischen und freien Gebieten sowie Seren aus Infektionsversuchen zu testen, um das Verhalten des Testes besser beurteilen und ihn validieren zu können.

Zur Überprüfung der Verwendbarkeit des Nukleoprotein-basierten ELISA-Tests als speziesunabhängiges serologisches Nachweisverfahren für Infektionen mit Henipaviren wurden Schweineseren eingesetzt. Die Seren positiver Tiere stammen dabei aus verschiedenen am National Centre for Foreign Animal Disease (Winnipeg, Canada) durchgeführten Infektions- und Immunisierungsversuchen mit Nipah- und Hendraviren bzw.

Vakzinen. Hierbei war der Infektions- bzw. Immunisierungszeitpunkt der Tiere bekannt. Die bisherigen Ergebnisse sprechen dafür, dass infizierte Tiere ab 20 Tagen nach Infektion nachweisbare Antikörper gegen das Nukleokapsidprotein bilden. Negative Schweineseren bzw. Schweineseren mit unbekanntem Status stammen aus Deutschland und Afrika. Bei den Tests der Schweineseren kam es vereinzelt zu offenbar unspezifischen Reaktionen der Seren mit Bestandteilen aus SF9-Zellen oder Baculovirus-Proteinen. Hierbei überschritten die OD Werte sowohl beim Detektionsantigen (HeV N) als auch dem Kontrollantigen (GFP) den

Grenzwert von 0,2. Somit ist auch hier noch eine weitere Optimierung des Testes notwendig bzw. die Entwicklung einer zweiten Kontrolltestmethode wie einem VNT hilfreich.

Es konnte somit gezeigt werden, dass das im Rahmen dieser Arbeit etablierte auf das N-Protein des Hendravirus basierende indirekte ELISA-System geeignet ist, Antikörper gegen Henipaviren sowohl in Pferde-, als auch in Schweineseren nachzuweisen. Die Optimierung zur weiteren Erhöhung der Sensitivität und Spezifität des Testsystems konnte noch nicht abgeschlossen werden, da hierzu eine weitaus größere Anzahl von definierten negativen und positiven Seren aus Tierversuch oder Feld zu untersuchen wären.

Nach Validierung des Testes könnten so in Zukunft auch weitere aus Afrika stammende Schweineseren getestet werden. So konnten in Schweinen in Ghana bereits Antikörper gegen Henipa- oder Henipa-ähnliche Viren detektiert werden (Hayman et al. 2011), über die geografische Verbreitung dieser Befunde liegen jedoch bisher kaum Informationen vor.

Ebenso kann der Test zu Untersuchung weiterer Spezies wie Hunde und Flughunde herangezogen werden. Auch hier liegen bisher keine Informationen zur Spezifität und Sensitivität des Testsystems vor.

5 Effekte der Expression der Glykoproteine und des Matrixproteins des Hendravirus sowie des zellulären Rezeptors der Henipaviren Ephrin B2 auf eukaryotische Zellen

Wie weiter oben beschrieben, sind die Glykoproteine (Fusionsprotein F und Attachment-Protein G) des Hendravirus ausreichend, um das Attachment und die Membran-Fusion in Ephrin B2- oder B3-exprimierenden Zellen auszulösen. Anhand der Bildung von Synzytien kann dadurch die funktionale Expression und Interaktion beider Proteine in Zellkultur überprüft werden. Darauf aufbauend können inhibierende Einflüsse auf diesen für die Zellinfektion notwendigen Prozess untersucht werden.

Dazu wurde zum einen die Synzytienformation durch Transfektion von HEK293T-Zellen sowie BSRT7-Zellen mit dem Attachment-Protein G sowie dem Fusionsprotein F ausgelöst.

In beiden Zelllinien konnte die Formation von Synzytien bei Koexpression beider Hendraproteine beobachtet werden, wobei der Effekt in HEK293T-Zellen unter gleichen Transfektionsbedingungen stärker ausgeprägt schien. Für HEK293T-Zellen wurde die

Bildung von Synzytien durch die Expression des G- und F-Proteins bereits beschrieben (Bossart et al. 2001).

Sowohl im Labor Dr. Finke als auch im Labor Dr. Keil wurde in dort durchgeführten Experimenten eine verstärkte Synzytienformation beobachtet, sofern zusätzlich zu den Glykoproteinen F und G das Matrixprotein des Hendravirus koexprimiert wurde.

Das Matrixprotein spielt durch die Organisation der viralen Proteine vermutlich eine wichtige Rolle für die weitere Formierung der Virionen. Die Expression dieses Proteins in

Das Matrixprotein spielt durch die Organisation der viralen Proteine vermutlich eine wichtige Rolle für die weitere Formierung der Virionen. Die Expression dieses Proteins in