3 Molekularbiologische Untersuchung
2.2 Phylogenetische Charakterisierung
Anhand der generierten Sequenzen konnte ein phylogenetisches Dendrogramm erstellt werden (Abb. 2). Hierbei konnten aus in Wooster Teerofen / MV entnommenen Proben generierten Sequenzen solche zugeordnet werden, welche ebenfalls aus Norddeutschland und ebenfalls aus Pipistrellus nathusii (Rauhautfledermaus) stammten (Gloza-Rausch et al. 2008).
Diese Sequenzen ließen sich wiederum den α - Coronaviren zuordnen (Drexler et al. 2011).
Abbildung 2 Phylogenetisches Dendrogramm für auf Grundlage eines partiellen Genabschnitts der RNA abhängigen Polymerase (344 Positionen) der Coronaviren, in dieser Arbeit generierte Sequenzen sind mit einem Punkt (●) markiert.
5452 Wooster Teerofen P.nat. Juli 12 O81058 feces m EU375869.1| Bat coronavirus P.nat/Germany/D5.73/2007
5442 Wooster Teerofen P.nat. Juli 12 O81048 feces f EU375864.1| Bat coronavirus P.nat/Germany/D5.16/2007 DQ249214.1| Bat coronavirus HKU4 isolate HKU4-1 DQ249217.1| Bat coronavirus HKU5 isolate HKU5-1
JX869059.2 Human betacoronavirus 2c EMC/2012 KF192507.1 Middle East respiratory syndrome coronavirus
beta Coronaviren
3 Resultate der Untersuchung von Fledermaus-Feldproben auf Adenoviren 3.1 Prävalenzen
Für die Untersuchung auf Adenoviren wurden ebenfalls die Proben aus Bayern und Mecklenburg-Vorpommern verwendet. Adenovirale RNA konnte dabei lediglich in zwei Kotproben aus Bayern nachgewiesen werden. Somit liegt die Prävalenz bezogen auf die gesamte Proben- bzw. Tierzahl wie bei den Coronaviren bei 0,6 bzw. 1 %. Eine der Sequenzen stammte aus Plecotus auritus (Braunes Langohr) vom Fangort Blutsee (BY) aus dem Mai 2011. Für dieses Datum lag bei 19 beprobten Tieren somit eine Prävalenz von 5,2 % innerhalb dieser Spezies vor. Da bei dieser Gelegenheit lediglich eine Kotprobe von Plecotus auritus gesammelt wurde, lag die Nachweisrate unter diesem Gesichtspunkt bei 100 %. In den gleichzeitig von diesem Tier entnommenen Urin- und Speichelproben konnte keine adenovirale RNA detektiert werden. Im darauffolgenden Mai 2012 wurde eine Urinprobe von diesem Tier ebenfalls mit negativem Ergebnis untersucht. Die einzige Kotprobe aus dem Mai und zwei weitere aus dem August 2012 waren ebenfalls negativ.
Die zweite Adenovirussequenz stammte aus einer Kotprobe von Myotis bechsteinii aus der Lokalisation Unteraltertheim (BY) im Mai 2011. An dieser Lokalisation wurden nur Bechsteinfledermäuse untersucht. Bei den insgesamt fünf gesammelten Kotproben lag die Nachweisrate somit bei 20 %. Eine gleichzeitig entnommene Urinprobe war negativ. Bei den darauffolgenden Beprobungen im August 2011 konnte keine positive Kotprobe (n = 4) detektiert werden, obwohl auch eine Kotprobe des im Mai positiven Tieres darunter war.
Dasselbe gilt auch für den August 2012, hier wurden ebenfalls alle vier gesammelten Kotproben mit negativem Ergebnis untersucht. Hierbei stammten zwei der insgesamt vier untersuchten Proben von dem im Mai 2011 positiv getesteten Tier. Im Mai 2012 fand hier keine Probennahme statt.
3.2 Phylogenetische Charakterisierung
Die generierten adenoviralen Sequenzen ließen sich im phylogenetischen Dendrogramm dem Genus Mastadenovirus zuordnen. Hierbei lagerte sich die aus Myotis bechsteinii nachgewiesene Sequenz zu einer weiteren partiellen Sequenz aus Myotis horsfildii, einer in Süd- und Südostasien vorkommenden Mausohr-Spezies (Accession Nr. GU226951.1), welche
gemäß Blastn-Analyse den scheinbar nächsten Verwandten darstellt und sich laut Literatur (Li et al., 2010) den Mastadenoviren zuordnen lässt.
Die aus einer Plecotus auritus- (Braunes Langohr) Fledermaus nachgewiesene Sequenz aus der Lokalisation Blutsee (BY) lagerte sich zu einer aus einer Plecotus austriacus- (Graues Langohr) Fledermaus aus Ungarn (Vidovszky, M.Z. and Boldogh, S.; Detection of adenoviruses in north-Hungarian bat fauna; nicht publiziert) stammenden Sequenz (Abb. 3).
Abbildung 3 Phylogenetisches Dendrogramm auf Grundlage der partiellen (200 Positionen) adenoviralen DNA Polymerase, die in dieser Arbeit generierten Sequenzen sind mit einem Punkt (●) markiert
4 Resultate der Untersuchung von Fledermaus-Feldproben auf Astroviren 4.1 Prävalenzen
Astroviren wiesen die höchsten Prävalenzen der in dieser Arbeit detektieren viralen Sequenzen auf. Insgesamt konnten aus 78 Proben Sequenzen generiert werden. Dies bedeutet
GU226970.1|Bat adenovirus TJM, complete genome JN252129.1| Bat adenovirus 2 strain PPV1 AC_000020.1| Canine adenovirus type 2 AC_000003.1| Canine adenovirus 1
NC_001460.1| Human adenovirus A JX065125.1| Bat adenovirus isolate Nylas_K01508
JN167523.1| Grey long-eared bat adenovirus Kupa/2010 5006 Blutsee P. aur. Mai 2011 0587 feces f GU226951.1| Bat adenovirus isolate 1213-HN-Mh
5148 Unteraltertheim M.bech. Mai 2011 C073 feces f AB303301.1| Bat adenovirus FBV1
AF036092.3| Bovine adenovirus 4 strain THT/62 NC_002685.2| Bovine adenovirus D
Atadenoviren
bei einer Gesamtprobenzahl von 316 Proben eine durchschnittliche Nachweisrate von 24,8 %.
Die Prävalenzen an den untersuchten Probenahmeorten variiert dabei zwischen 0 und 46,7 % (Abb. 4).
Abbildung 4 Prävalenzen der Astrovirussequenzen an den untersuchten Probenahmeorten
Die nachgewiesenen Sequenzen stammten von 66 verschiedenen Tieren und ergaben somit bei einer Gesamttierzahl von 201 Tieren eine Prävalenz von 32,8%. Die Prävalenz bei den untersuchten Tierarten war hierbei variabel, die höchste Nachweisrate fand sich bei Myotis nattereri (Fransenfledermaus). Hier konnten in über 50 % der Proben Astrovirus-Sequenzen nachgewiesen werden (Abb. 5).
0 20 40 60 80 100 120 140
Anzahl Proben mit positiven Proben
Probenahmeort mit Prävalenz (%)
Anzahl Proben
Anzahl positive Proben
Abbildung 5 Prävalenzen von Astrovirus Sequenzen in den untersuchten Spezies
Die Fledermauspopulationen im Raum Würzburg wurden 2011 und 2012 jeweils im Mai und August beprobt. Hierbei schwankten jedoch sowohl die beprobten Tierzahlen als auch die Resultate der Untersuchung auf Astroviren (Tab. 27). In dieser Aufstellung blieb die Spezies Myotis myotis (Großes Mausohr) aufgrund der geringen beprobten Tierzahl (n = 5) unberücksichtigt.
Tiere des Spezies Myotis bechsteinii (Bechsteinfledermaus) wurden zu allen vier Zeitpunkten beprobt. An den Lokalisation Unteraltertheim und Höchberg wurden zu jedem beprobten Zeitpunkt positive Tiere nachgewiesen. An den Lokalisationen Brandwiese und Gramschatz wurde nur zu einem Zeitpunkt beprobt, wobei positive Tiere detektiert werden konnten. An der Lokalisation Guttenberg wurden nur im Mai 2011, aber weder im August 2011 noch im August 2012 positive Tiere nachgewiesen. Ähnliches gilt für die Lokalisation Blutsee. Hier konnte nur im August 2011 RNA von Astroviren detektiert werden.
Fledermäuse der Spezies Plecotus auritus (Braunes Langohr) wurden nur an den Lokalisationen Blutsee und Irtenberg beprobt. An der Lokalisation Blutsee konnte bei einer
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Anzahl Proben mit positiven Proben
Spezies mit Prävalenz (%)
Anzahl Proben Anzahl positive Proben
von drei Probenahmen positive Tiere nachgewiesen werden. An der Lokalisation Irtenberg konnte im Mai 2011 ein positives Tier festgestellt werden.
Fledermäuse der Spezies Myotis nattereri (Fransenfledermaus) wurden nur an der Lokalisation Blutsee beprobt. Hier konnten zu allen Probenahmedaten positive Tiere nachgewiesen werden.
Die unterschiedlichen Tierzahlen und Ergebnisse spiegelten sich in den ermittelten Nukleinsäurenachweisen wieder. So lagen die Nachweisraten je nach Probenahmezeitpunkt und Probenahmeort für Myotis bechsteinii zwischen 0,0 % und 83,3 %. Die Nachweisraten für Plecotus auritus lagen zwischen 0,0 % und 47,4 %. Die Nachweisraten für Myotis nattereri lagen dagegen zwischen 41,7 % und 86,7 %.
Tabelle 27 Verteilung der positiven Tiere an den unterschiedlichen Probenahmeorten und Zeitpunkten. Grau hinterlegte Felder markieren Zeitpunkte, an denen keine Probenahme erfolgte.
Lokalisation
positive Tiere/ Anzahl Tiere
Myotis bechsteinii Plecotus auritus Myotis nattereri
2011 2012 2011 2012 2011 2012
Mai Aug Mai Aug Mai Aug Mai Aug Mai Aug Mai Aug
Blutsee 0/4 1/2 0/11 9/19 0/4 0/18 13/15 3/6 5/12
Brandwiese 7/13
Guttenberg 1/13 0/5 0/16
Gramschatz 2/8
Höchberg 2/13 2/6 1/12
Irtenberg 1/7
Prosselsheim 0/1
Unteraltertheim 10/12 2/11 1/7
Betrachtet man die Verteilung der positiven Proben in Bezug auf die Probenarten, lässt sich feststellen, dass sich die positiven Proben zu unterschiedlichen Nachweisraten den verschiedenen Probenarten zuordnen lassen (Tab. 28).
Tabelle 28 Verteilung der positiven Probenarten an den unterschiedlichen Probenahmeorten und Zeitpunkten. Grau hinterlegte Felder markieren Zeitpunkte, an denen keine Probenahme erfolgte.
Lokalisation
positive Tiere / Anzahl Tiere
Myotis bechsteinii Plecotus auritus Myotis nattereri
2011 2012 2011 2012 2011 2012
Zusätzlich zeigte sich, dass nicht in allen Proben eines positiv getesteten Tieres Astrovirus-RNA nachgewiesen werden konnte, auch wenn diese am selben Tage genommen wurden.
Ebenso zeigte sich, dass positiv getestete Tiere bei späteren Probenahmen bis auf zwei Ausnahmen (Tiere 2ACE und C073) negativ getestet wurden (Tab 29).
Tabelle 29 Zusammenstellung aller positiv getesteter Tiere, von denen mehrere Proben vorliegen
Tier-kennung Speichel Kot Urin
1A0D n.v. pos. 18.05.11 pos. 18.05.11
3F49 pos. 19.05.11 neg. 19.05.11 n.v.
4D10 neg. 18.05.11 neg. 18.05.11 pos. 18.08.11
5EBF3C pos. 18.05.11 pos. 18.05.11 neg. 18.05.11
61B2 pos. 18.05.11 neg. 06.08.12 pos. 18.05.11/neg. 18.08.11
8F2E pos. 18.05.11 neg. 09.08.12 n.v.
94D3 neg. 18.05.11 neg. 18.05.11 pos. 18.05.11
A0CF pos. 18.05.11 pos. 18.05.11 neg. 18.08.11
A1B5 neg. 18.05.11 neg. 09.08.12 pos. 18.05.11
A1D2 neg. 18.05.11 pos. 18.05.11 neg. 18.05.11/neg. 06.08.12
A7B1 neg. 18.05.11 n.v. neg. 18.05.11/pos. 09.08.12
C073 n.v. pos. 18.05.11/pos. 18.08.11/neg. 06.08.12 pos. 18.05.11
CA32 neg. 18.05.11 n.v. pos. 18.05.11
3D2A n.v. pos. 18.05.11/neg. 19.08.11 pos. 18.05.11
0B12 pos. 17.05.11 n.v. neg. 17.05.11
4.2 Phylogenetische Charakterisierung
Bei der phylogenetischen Analyse von 270 Positionen der Astrovirus-Sequenzen (Abb. 6) zeigte sich, dass die meisten der generierten Sequenzen mit weiteren aus Fledermäusen stammenden Genabschnitten zusammenlagern (clustern). Hierbei waren deutliche Unterschiede in der Sequenzübereinstimmung sowohl zwischen als auch innerhalb der einzelnen Spezies erkennbar. Bis auf wenige Ausnahmen lagerten sich die aus Myotis bechsteinii-Fledermäusen nachgewiesenen Sequenzen zusammen. Auf Nukleinsäureebene bedeutete dies eine Sequenzübereinstimmung von 100 % im untersuchten Bereich (270 Positionen) für den Ast a) Myotis bechsteinii im Unterbaum A (Abb. 6 A). Diese Sequenzen stammten alle aus dem Mai und August 2011. Dagegen zeigen sich drei unterschiedliche Gruppen für die aus Myotis nattereri-Fledermäusen nachgewiesenen Sequenzen. Eine Untergruppe, Ast b) im Unterbaum A, zeigte dabei eine größere Nähe zum Myotis bechsteinii-Cluster und beinhaltete auch eine Sequenz aus der genannten Spezies. Auf Nukleinsäureebene zeigten diese Sequenzen eine Übereinstimmung von 99,6 % mit einer Sequenz aus dem Mai 2011 von einer Myotis nattereri-Fledermaus aus dieser Gruppe und 100
%iger Übereinstimmung zu den restlichen Sequenzen vom August 2012 aus dieser Gruppe.
Die Überstimmung mit den aus Myotis bechsteinii-Fledermäusen nachgewiesenen Sequenzen aus Ast a) betrug hierbei 71,3 - 71,7 %. Zwei weitere Myotis nattereri Cluster wurden in Unterbaum B in den Ästen c) und d) genauer dargestellt. Die Sequenzen aus Ast c), welche alle aus dem August 2011 stammen, wiesen hierbei untereinander eine 100 %ige Übereinstimmung auf. Die Übereinstimmung mit den Sequenzen aus Ast d) lag bei 78,9 %.
Die Übereinstimmungen dieser Sequenzen untereinander lag bei 98,4 % für eine Sequenz aus Wooster Teerofen (MV) vom Juli 2012 und bei 100 % für die weiteren Sequenzen von der Würzburger Lokalisation Blutsee aus dem Mai 2011 und August 2012. Die aus Plecotus auritus-Fledermäusen nachgewiesenen Sequenzen bildeten einen Cluster, der auch drei aus Myotis bechsteinii-Fledermäusen nachgewiesenen Sequenzen einschloss. Die Sequenzen stammten aus dem Mai 2011 und zeigten eine Übereinstimmung der Sequenzen innerhalb dieser Gruppe von 99,5 – 100 %.
Generell ließ sich beobachten, dass sich Sequenzen, die aus verschiedenen Probenarten, aber von demselben Tier und demselben Probenahmezeitpunkt stammten, im phylogenetischen
Dendrogramm zusammen lagerten. Dagegen fiel auf, dass bei einem Tier (Tier 2ACE, Myotis nattereri), das auch zu einem späteren Zeitpunkt wieder positiv war, zu beiden Beprobungszeitpunkten unterschiedliche Sequenztypen vorlagen. So clusterte die Sequenz vom Mai 2011 in die Gruppe c) und die Sequenz vom August 2011 in die Gruppe d) der Myotis nattereri-Gruppen (Abb. 6 [B]).
Die Sequenzen aus Mecklenburg-Vorpommern bildeten keinen eigenständigen Cluster und ließen sich auch keinem der bestehenden Cluster eindeutig zuordnen. Viele dieser, aber auch mehrere aus Bayern stammende Sequenzen wiesen laut Blastn-Analyse und im phylogenetischen Dendrogramm ersichtliche Ähnlichkeiten mit humanen (markiert mit einem
●) oder aviären (markiert mit einem ▲) Astroviren auf.
Abbildung 6 Phylogenetisches Dendrogramm auf Grundlage der partiellen (270 Positionen) astroviralen Polymerase;
zur besseren Darstellung werden die verschiedenen Cluster der generierten Sequenzen separat in den Darstellungen A; B und C gezeigt
a) Myotis bechsteinii
b) Myotis nattereri (Myotis bechsteinii)
FJ571136.1| Bat astrovirus Hl/Guangxi/PX05/2007 FJ571137.1| Bat astrovirus Ha/Guangxi/TD03/2007
5159 Blutsee M.nat. Mai 11 0B41 urine m
5444 Wooster Teerofen P.nat. Juli 2012 O81049 feces f
c) Myotis nattereri
5059 Gramschatz M.myo. August 11 xxxx urine m HM368172.1| Bat astrovirus N78-49/Germany/2008 HM368173.1| Bat astrovirus N78-46/Germany/2008
d) Myotis nattereri
e) Plecotus auritus (Myotis bechsteinii)
EU847157.1| Bat astrovirus 1 isolate WCF8 GQ441190.1| HMO Astrovirus B
GQ441188.1| HMO Astrovirus A NC_004579.1| Mink astrovirus
NC_002469.1| Ovine astrovirus 5456 Wooster Teerofen M.nat. Juli 2012 O40844 feces f 5535 Höchberg M.bech. August 12 A7B1 urine f AF141381.1|Human astrovirus
FJ755404.1|Human astrovirus 1 Beijing/291/2007/CHN
gb|DQ070852.1|:2787-4334 Human astrovirus 4 isolate Goiania/GO/12/95/Brazil 5001 Blutsee P.aur. Mai 11 BE7E oral f
5445 Wooster Teerofen P.nat. Juli 2012 O66822 feces f 5452 Wooster Teerofen P.nat. Juli 2012 O81058 feces m
Mamastroviren
JX985670.1| Avastrovirus 2 isolate KG119
FR727146.1 Feral pigeon astrovirus Avastroviren
5449 Wooster Teerofen P.nat. Juli 2012 O81053 feces f 5450 Wooster Teerofen P.nat. Juli 2012 O81054 feces f
5501 Unteraltertheim M.bech. August 12 5440 feces f 5075 Brantwiese M.bech. August 11 xxxx feces f 5521 Gramschatz M.bech. August 12 xxxx feces f
A
B
C
DQ070852.1|Human astrovirus 4 isolate Goiania/GO/12/95/Brazil
5262 Höchberg M.bech. August 11 xxxx feces f 5265 Höchberg M.bech. August 11 xxxx urine f 5261 Höchberg M.bech. August 11 xxxx urine f 5149 Unteraltertheim M.bech. Mai 11 E5BF3C urine f 5148 Unteraltertheim M.bech. Mai 11 C073 feces f 5147 Unteraltertheim M.bech. Mai 11 C073 urine f 5145 Unteraltertheim M.bech. Mai 11 A1D2 feces f 5143 Unteraltertheim M.bech. Mai 11 1A0D feces f 5142 Unteraltertheim M.bech. Mai 11 1A0D urine f 5141 Unteraltertheim M.bech. Mai 11 A0CF oral f 5140 Unteraltertheim M.bech. Mai 11 A0CF feces f 5137 Unteraltertheim M.bech. Mai 11 4D10 urine f 5135 Unteraltertheim M.bech. Mai 11 CA32 urine f 5134 Unteraltertheim M.bech. Mai 11 5EBF3C oral f 5132 Unteraltertheim M.bech. Mai 11 5EBF3C feces f 5130 Unteraltertheim M.bech. Mai 11 94D3 urine f 5129 Unteraltertheim M.bech. Mai 11 61B2 oral f 5128 Unteraltertheim M.bech. Mai 11 61B2 urine f 5098 Blutsee M. bech. August 11 xxxx urine f
5085 Unteraltertheim M.bech. August 11 2999 feces/urine f 5080 Unteraltertheim M.bech. August 11 C073 feces f 5074 Brantwiese M.bech. August 11 xxxx feces m 5071 Brantwiese M.bech. August 11 xxxx urine m 5069 Brantwiese M.bech. August 11 xxxx feces f 5068 Brantwiese M.bech. August 11 xxxx urine f 5066 Brantwiese M.bech. August 11 xxxx feces f 5067 Brantwiese M.bech. August 11 xxxx feces f
a)
5192 Blutsee M.nat. Mai 11 1408 urine f 5509 Blutsee August 12 M.nat. xxxx feces m 5511 Blutsee August 12 M.nat. xxxx feces m 5513 Blutsee August 12 M.nat. 3B21 urine f 5522 Gramschatz M.bech. August 12 xxxx urine f 5562 Blutsee M.nat. August 12 xxxx urine m
b)
FJ571136.1| Bat astrovirus Hl/Guangxi/PX05/2007 FJ571137.1| Bat astrovirus Ha/Guangxi/TD03/2007
5159 Blutsee M.nat. Mai 11 0B41 urine m
b) Myotis nattereri (Myotis bechsteinii)
A
a) Myotis bechsteinii
5444 Wooster Teerofen P.nat. Juli 2012 O81049 feces f 5258 Blutsee M.nat. August 11 2ACE feces f 5259 Blutsee M.nat. August 11 32AD feces f 5095 Blutsee M.nat. August 11 xxxx feces m
c) Myotis nattereri
5059 Gramschatz M.myo. August 11 xxxx urine m HM368172.1| Bat astrovirus N78-49/Germany/2008 HM368173.1| Bat astrovirus N78-46/Germany/2008
5462 Wooster Teerofen M.nat. Juli 2012 O81090 urine f 5152 Blutsee M.nat. Mai 11 3BE1 urine f
5153 Blutsee M.nat. Mai 11 3BE1 feces 5157 Blutsee M.nat. Mai 11 370A feces f 5162 Blutsee M.nat. Mai 11 199B urine f 5164 Blutsee M.nat. Mai 11 3BE1 1C19 urine f 5165 Blutsee M.nat. Mai 11 1C19 feces f 5167 Blutsee M.nat. Mai 11 1F7F urine f 5172 Blutsee M.nat. Mai 11 189D feces f 5174 Blutsee M.nat. Mai 11 260B feces f 5177 Blutsee M.nat. Mai 11 0696 urine f 5180 Blutsee M.nat. Mai 11 2ACE urine f 5186 Blutsee M.nat. Mai 11 3D2A urine f 5188 Blutsee M.nat. Mai 11 3D2A feces f 5196 Blutsee M.nat. Mai 11 26B0 urine f 5557 Blutsee M.nat August 12 9027 urine f
d) Myotis nattereri
5204 Guttenberg M.bech. Mai 11 3F49 oral f 5034 Blutsee P.aur. Mai 11 7D8B urine f 5122 Höchberg M.bech. Mai 11 A1B5 urine f 5101 Höchberg M.bech. Mai 11 8F2E oral f 5038 Irtenberg P.aur. Mai 11 O758 urine f 5036 Blutsee P.aur. Mai 11 9BE8 urine f 5032 Blutsee P.aur. Mai 11 D7F6 oral f 5031 Blutsee P.aur. Mai 11 D7F6 urine f 5029 Blutsee P.aur. Mai 11 AD8A urine f 5025 Blutsee P.aur. Mai 11 3389 urine m 5023 Blutsee P.aur. Mai 11 81D3 oral f 5019 Blutsee P.aur. Mai 11 0B12 oral m 5016 Blutsee P.aur. Mai 11 1681 oral f
e) Plecotus auritus (Myotis bechsteinii)
EU847157.1| Bat astrovirus 1 isolate WCF8 GQ441190.1| HMO Astrovirus B
5 Resultate der Untersuchung von Fledermaus-Feldproben auf Paramyxoviren 5.1 Wahl der Primerpaare zu Detektion von Paramyxoviren nach Tong et. al, 2008 Die hier verwendete PCR umfasste verschiedene Primer-Sets für eine seminested RT-PCR zum Nachweis des Polymerase- (L-) Gens von Paramyxoviren. Zu Beginn der Untersuchungen wurde die Reaktivität der PCR für Henipaviren mit RNA aus einem Ringtest von 2010 (CSIRO, Australien) bestätigt. Die Hendravirus RNA reagierte hierbei mit den dafür vorgesehenen Primersets, den panParamyxovirinae Primern (PAR-Primer), welche in der Lage sind, alle Mitglieder der Unterfamilie der Paramyxovirinae nachzuweisen und dem Primerset für die Genera Respirovirus, Morbillivirus und Henipavirus (RES-MOR-HEN Primer). Die PAR-Primer waren darüber hinaus auch in der Lage, RNA des Newcastle Disease Virus (NDV, zur Verfügung gestellt vom NRL für Newcastle Krankheit, Leiter Dr.
Christian Grund, FLI Insel Riems) nachzuweisen. Die RES-MOR-HEN-Primer reagierten dagegen erwartungsgemäß nicht mit RNA des NDV. Mit den Primern für die Genera Avulavirus und Rubulavirus (AVU-RUB Primer) ließ sich diese RNA jedoch entsprechend nachweisen. Mit den Primern für die Unterfamilie Pneumovirinae (PNE-Primer) hat die NDV-RNA erwartungsgemäß nicht reagiert (Abb. 7).
Abbildung 7 Reaktivität und Spezifität der verwendeten Primerpaare nach Tong et al., 2008
Zu Beginn der Untersuchung von Fledermausfeldproben auf Paramyxoviren im Herbst 2010 wurde mit den sog. panParamyxovirinae Primern (PAR-Primer) eine Vorstudie durchgeführt, um zu ermitteln, ob virale RNA nachweisbar ist und wenn ja, welchem Genus sie am ehesten zuzuordnen ist. In zwei von 67 Proben konnte Paramyxovirus-Nukleinsäuren nachgewiesen werden, die in der BLASTn-Analyse Ähnlichkeit mit dem J-virus und somit eine Zuordnung zu Morbillivirus-ähnlichen Viren vermuten ließen. Aufgrund der suboptimalen Qualität dieser Sequenzen waren aber keine weiterführenden Analysen möglich. Eine Nachuntersuchung dieses initialen Probensets mit den Primern für die Genera Respirovirus, Morbillivirus und Henipavirus (RES-MOR-HEN Primer) ergab eine deutlich höhere Prävalenz von sieben Proben mit positivem Sequenzierungsergebnis.
Aus den Ergebnissen der Voruntersuchung ergab sich aufgrund der höheren Sensitivität gegenüber den PAR-Primern und der Tatsache, dass auf das Vorhandensein von Henipaviren getestet werden sollte, die Wahl des Primersets für die Genera Respirovirus, Morbillivirus und Henipavirus (RES-MOR-HEN Primer).
5.2 Prävalenzen
Es wurden alle 1066 erhaltenen Proben auf das Vorhandensein paramyxoviraler RNA untersucht. Es wurden dabei insgesamt 46 positive Proben aus neun Lokalisationen detektiert.
Dies bedeutet auf den gesamten Zeitraum und Probenumfang gesehen eine Prävalenz von 4,3
%, wobei jedoch deutliche Unterschiede in den Nachweisraten zwischen 0 und 15,1 % an den einzelnen Lokalisationen feststellbar waren. Der überwiegende Teil der positiven Sequenzen stammte dabei aus dem Kreuzhorst nahe Magdeburg (SA). Hier lag die Prävalenz positiver Proben bei 15,1 % (Abb. 8).
Abbildung 8 Probenzahlen mit Prävalenzen an den Probenahmeorten 0
25 50 75 100 125 150 175 200 225 250
Anzahl Proben mit positiven Proben
Probenahmeorte mit Prävalenz (%)
Anzahl Proben Positive Proben
Mecklenburg-Vorpommern
Sachsen-Anhalt Bayern
Am Probenahmeort Kreuzhorst wurden Proben jeweils im Mai 2010, 2011 und 2012 gesammelt. Die Prävalenz positiver Proben variierte hierbei zwischen 10,5 % in 2010, 20,0 % in 2011 und 15,1 % in 2012 und lag damit in allen drei Jahren deutlich über dem Gesamtdurchschnitt.
Des Weiteren lassen sich die Befunde auch hinsichtlich der Prävalenzen innerhalb der verschiedenen Fledermaus-Spezies vergleichen. So konnte in sechs der insgesamt 24 untersuchten Spezies paramyxovirale RNA nachgewiesen werden. Die Nukleinsäurenachweise variierten hierbei zwischen 1,1 % in Myotis bechsteinii (Bechstein-Fledermaus) und 14,9 % in Pipistrellus pygmaeus (Mückenfledermaus) (Abb. 9).
Abbildung 9 Probenzahlen mit Prävalenzen der verschiedenen Fledermausspezies 0
25 50 75 100 125 150 175 200 225
Anzahl Proben mit positiven Proben
Spezies mit Prävalenz (%)
Anzahl Proben Positive Proben
Die positiven Proben setzen sich aus 10 Kot-, 26 Speichel- und 10 Urinproben zusammen.
Dies bedeutet Prävalenzen von 6,1 % in den Kotproben, 3,9 % in den Speichelproben sowie 4,5 % in den Urinproben. Mischproben wurden bei dieser Aufstellung nicht berücksichtigt.
(Abb. 10).
Abbildung 10 Anzahl der Probenarten mit positiven Proben
5.3 Phylogenetische Charakterisierung
Die erhaltenen Konsensussequenzen der Paramyxovirus-Sequenzen wurden verglichen (aligned) und ein phylogenetisches Dendrogramm wurde erstellt (Abb. 11).
0 100 200 300 400 500 600 700 800
Anzahl Proben mit positiven Proben
Probenarten mit Prävalenz (%) Anzahl Proben Anzahl positive Proben
a)
Gruppe Pipistrellus spezies und Myotis brandtii
JN086951.2 Paramyxovirus bat/E95/2009 9 Romania M.alc. Mai 11 xxxx feces m
HQ660163.1 Bat Paramyxovirus Myo_alc/3-320/BGR/2009 28 Büchenberg M.myot. Jan 11 A192767 urine m HQ660166.1 Bat Paramyxovirus Myo_myo/N78-14/GER/2008
5023 Blutsee P.aur. Mai 11 81D3 oral f
5133 Unteraltertheim M.bech. Mai 11 5E BF3C urine f 5062 Brandwiese M.bech. August 11 mixed feces 5455 Wooster Teerofen M.nat. Juli 12 O66415 feces m
5456 Wooster Teerofen M.nat. Juli 12 O40844 feces f 5461 Serrahn M.nat. Juli 12 B69849 feces f AY900001.1 J-virus
DQ100461.1 Beilong virus FJ362497.1 Nariva virus
NC_005339.1 Mossman virus
Unklassifizierte Paramyxoviren
AF164967.1 Canine distemper virus
NC_001498.1 Measles virus Morbilliviren HQ660129.1 Bat Paramyxovirus Eid_hel/GH-M74a/GHA/2009 JQ001776.1Cedar virus isolate CG1a
AF212302.2 Nipah virus AF017149.2 Hendra virus
Henipa und Henipa-ähnliche Viren
Respirovirus HQ530153.1 Bovine parainfluenza virus 3
Avulavirus HM188399.1 Newcastle disease virus
b)
Abbildung 11 a) Phylogenetisches Dendrogramm auf Grundlage partieller L-Gen Sequenzen (271 Positionen). Die in dieser Arbeit aus Fledermausproben generierten Sequenzen sind mit einer Raute (♦) markiert. b) Detailansicht der Cluster der Sequenzen aus Proben von Pipistrellus spp. und Myotis brandtii.
27 Kreuzhorst P.pyg. Mai 10 C45956 oral 33 Kreuzhorst P.pyg. Mai 10 C45962 oral f 1693 Kreuzhorst P.pyg. Mai 12 C47867 feces f
5470 Truppenübungsplatz P.pip. Juli 12 C46484 urine f 5469 Truppenübungsplatz P.pip. Juli 12 C46482 feces f 45 Kreuzhorst P.pyg. Mai 10 B77305 oral
46 Kreuhorst P.pyg. Mai 10 C45965 urine 32 Romania P.pyg. Mai 11 xxxx feces f 1742 Kreuzhorst P.pyg. Mai 12 C49273 urine f 264 Kreuzhorst M.bra. Mai 11 O64883 oral f
1678 Kreuzhorst P.pyg. Mai 12 C47858 urine f 1711 Kreuzhorst P.pyg. Mai 12 O40800 feces f 282 Kreuzhorst M.bra. Mai 11 O60426 oral f 288 Kreuzhorst P.pyg. Mai 11 O40752 oral f 296 Kreuzhorst M.bra. Mai 11 O28875 oral f 299 Kreuzhorst P.pyg. Mai 11 O46140 oral f 289 Kreuzhorst M.bra. Mai 11 O28883 oral f
290 Kreuzhorst P.pyg. Mai 11 O60592 oral f 286 Kreuzhorst P.pyg. Mai 11 C45960 oral f
1744 Kreuzhorst P.pyg. Mai 12 O46223 urine f 294 Kreuzhorst P.pyg. Mai 11 O54639 oral f 1668 Kreuzhorst P.pyg. Mai 12 C47852 feces f 275 Kreuzhorst M.bra. Mai 11 B77253 oral f 17 Kreuzhorst P.pyg. Mai 10 O40762 oral 19 Kreuzhorst P.pyg. Mai 10 C45950 oral f 21 Kreuzhorst P.pyg. Mai 10 C45952 oral
1743 Kreuzhorst P.pyg. Mai 12 C49273 oral f 274 Kreuzhorst P.pyg. Mai 11 C44859 oral f 1717 Kreuzhorst P.pyg. Mai 12 C49235 oral f
1722 Kreuzhorst P.pyg. Mai 12 C47875 oral f 1676 Kreuzhorst P.pyg. Mai 12 C47856 oral f 1721 Kreuzhorst P.pyg. Mai 12 C47874 oral f 1733 Kreuzhorst P.pyg. Mai 12 C47881 urine f
298 Kreuzhorst P.pyg. Mai 11 C45930 oral f 1712 Kreuzhorst P.pyg. Mai 12 C45964 urine f 1718 Kreuzhorst P.pyg. Mai 12 O46137 oral f 279 Kreuzhorst P.pyg. Mai 11 B97680 oral f
Kreuzhorst
JN086951.2 Paramyxovirus bat/E95/2009
Die Position der erhaltenen Sequenzen im phylogenetischen Dendrogramm zeigte hier eine Anordnung in einem Unterbaum mit der Bildung verschiedener Untergruppen. So lagerten alle Sequenzen zu sogenannten Clustern zusammen, die aus der Lokalisation Kreuzhorst stammten, unabhängig davon ob sie von Fledermäusen der Spezies Pipistrellus pygmaeus (Mückenfledermaus) oder Myotis brandtii (Große Bartfledermaus) stammen. In dieser Sequenzgruppe fanden sich auch zwei Sequenzen aus Pipistrellus pipistrellus (Zwergfledermaus) vom Truppenübungsplatz in Mecklenburg-Vorpommern (MV) sowie eine Sequenz aus einer rumänischen Pipistrellus pygmaeus-Fledermaus. Diese Sequenzen bilden wiederum mit einer Sequenz aus gepoolten Organen einer Pipistrellus pipistrellus Fledermaus aus Bayern (JN086951.2., Kurth et al. 2012) eine Gruppe. Zu dieser Sequenz bestand zum
Die Position der erhaltenen Sequenzen im phylogenetischen Dendrogramm zeigte hier eine Anordnung in einem Unterbaum mit der Bildung verschiedener Untergruppen. So lagerten alle Sequenzen zu sogenannten Clustern zusammen, die aus der Lokalisation Kreuzhorst stammten, unabhängig davon ob sie von Fledermäusen der Spezies Pipistrellus pygmaeus (Mückenfledermaus) oder Myotis brandtii (Große Bartfledermaus) stammen. In dieser Sequenzgruppe fanden sich auch zwei Sequenzen aus Pipistrellus pipistrellus (Zwergfledermaus) vom Truppenübungsplatz in Mecklenburg-Vorpommern (MV) sowie eine Sequenz aus einer rumänischen Pipistrellus pygmaeus-Fledermaus. Diese Sequenzen bilden wiederum mit einer Sequenz aus gepoolten Organen einer Pipistrellus pipistrellus Fledermaus aus Bayern (JN086951.2., Kurth et al. 2012) eine Gruppe. Zu dieser Sequenz bestand zum