Validierung monoklonaler Antikörper gegen das Matrixprotein und das

Die Immunisierung der Mäuse, die Fusion von Milz- und Myelomzellen sowie Anzucht der Hybridomazellen, gefolgt von der Ernte und Konservierung der Überstände mit Natriumazid (1%⁰ [w/v] ) und gegebenenfalls die Subklonierung positiver Klone wurde durchgeführt von Tomás Korytář (Labor Dr. Bernd Köllner, FLI Insel Riems).

Die Mäuse wurden intraperitoneal immunisiert, wobei unmittelbar vor der initialen Immunisierung komplettes Freundsches Adjuvanz und vor den folgenden Injektionen inkomplettes Freundsches Adjuvanz im Verhältnis 1:1 zugesetzt wurde. Um ein Applikationsvolumen von 100 µl nicht zu überschreiten, wurde das Protein bis zur gewünschten Konzentration unter Vakuumeinwirkung (Concentrator 5301, Eppendorf) eingeengt. Bei der ersten Immunisierung wurden 50 µg Protein appliziert, die folgenden Boosterungen an Tag 14, 28, 31, 32 und 33 enthielten je 25 µg Protein. Die Fusion von Milz- und Myelomazellen erfolgte an Tag 34. Die Zellkulturüberstände der verschiedenen Klone wurden 10 Tage später in einer Verdünnung von 1:3 in der indirekten Immunfluoreszenz getestet.

6 Testmethoden zum Nachweis der Antikörperbindung 6.1 Zelltransfektion

Die die Sequenzen der hier bearbeiteten Proteine des Hendravirus enthaltenden eukaryotischen Expressionsvektoren wurden freundlicherweise von Dr. Stefan Finke (FLI Insel Riems) zur Verfügung gestellt, als Plasmidrückrat diente der Vektor pCAGGS. Die proteinkodierende RNA wurde wie bereits erwähnt von Dr. Hana Weingartl, National Centre for Foreign Animal Disease (Winnipeg, Canada) zur Verfügung gestellt. Die in dieser Arbeit verwendeten Anzuchtsmedien in der Zellkultur enthielten 97,65 U/ml Penicillin G Natriumsalz (Roth HP48.3) sowie 31,25 µg/ml Streptomycinsulfat (Roth HP 66.2).

Die Transfektionen wurden überwiegend in HEK293T-Zellen (Zellbank Insel Riems) durchgeführt. Die Zellen wurden hierzu 24 h vor Transfektion ausgesät, um zum Zeitpunkt der Transfektion eine Zelldichte von 80-90 % zu erreichen. In sechs-Loch-Platten (Corning 3516) wurden somit 1 x 10⁶ Zellen pro Vertiefung transfiziert. Eine Stunde vor der eigentlichen Transfektion wurde das Anzuchtsmedium durch 1 ml serumfreies Medium ersetzt. Zur Untersuchung der Bindungsaffinität der generierten polyklonalen Kaninchen- und monoklonalen Maus-Antikörper wurden pro Vertiefung 6 µg Plasmid DNA und die doppelte Menge an dem Transfektionsreagenz Polyethylenimin (PEI) (Sigma-Aldrich 408727) eingesetzt. DNA und PEI wurden in je 200 µl serumfreiem Medium verdünnt. Das Transfektionsreagenz wurde hierbei für 5 min im Medium bei Raumtemperatur vorinkubiert.

Anschließend wurden beide Lösungen gemischt. In den folgenden 20 min erfolgte die Kondensation der DNA durch das PEI zu positiv geladenen Partikeln. Darufhin wurden 400 µl dieses Reaktionsgemisches auf die Zellen gegeben. Während der nächsten 3,5 h erfolgte die Aufnahme der DNA durch Endozytose, anschließend wurde der Transfektionsmix abgenommen und durch Nährmedium ersetzt. Für das Screening der Antikörper in 96-Loch-Platten (Corning 3599) wurden die Zellen mit Alsever's Trypsin-Versen-Lösung (Zellbank Insel Riems) abgelöst und anschließend in einer Dichte von 3,3 x 10⁴ Zellen pro Vertiefung in Nährmedium ausgesät. Vor dem Aussähen der Zellen wurden die Platten mit einer 1 %igen (v/v) Poly-L-Lysin Lösung (Sigma-Aldrich P8920) beschichtet um die Adhäsion der Zellen zu verbessern. Die Inkubation erfolgte anschließend bei 37°C und 5 % CO2 (Sanyo CO2

Incubator) für 42 h.

Die so transfizierten Zellen konnten anschließend in der indirekten Immunfluoreszenz oder im Western Blot weitergehend untersucht werden.

6.2. Indirekte Immunfluoreszenz

Die transfizierten Zellen und die jeweiligen Kontrollen lagen hierzu in 6, 24 oder 96 Loch-Platten (Corning 3516, 3524, 3599) vor. Dementsprechend variierten die Volumina der verwendeten Puffer und Reagenzien entsprechend der Größe der Plattenvertiefungen zwischen 100, 500 und 1000 µl. HEK293T-Zellen wurden mit PBS gespült und mit 3 % [w/v]

Paraformaldehyd [Roth 0335.2] in PBS für 30 min fixiert. Anschließend wurde das Paraformaldehyd durch 50 mM NH4Cl (Roth K298.1) in PBS während weiterer 30 min

neutralisiert, um nachteilige Effekte auf die Antikörperbindung zu verhindern. Daraufhin wurde der Zellrasen mit PBS gewaschen und die Zellen wurden durch Zugabe von 0,5 % Triton X 100 (Roth 3051.2) für 15 min permeabilisiert. Im Anschluss hieran erfolgte ein Blockierungsschritt mit 0,25 % [w/v] Magermilchlösung (Difco™ Skim Milk, Becton, Dickinson and Company 232100) in PBS für 20 min. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Antikörperverdünnungen in PBS für 1 h inkubiert. Zur Validierung und der Bestimmung der optimalen Verdünnung der Kaninchen- und Mäuseseren wurden Verdünnungsreihen im 96 Loch Format angelegt. Hierbei werden die Seren in den Verdünnungen 1:100, 1:500, 1:1000, 1:2000, 1:3000 und 1:5000 in einem Volumen von 75 µl PBS eingesetzt. Sofern Immunfluoreszenzen in anderen Formaten durchgeführt wurden, konnte das Volumen der Antikörperverdünnungen auf 300 µl für 24 Loch Platten und auf 750 µl für 6 Loch Platten reduziert werden um die benötigte Menge an Antikörper zu reduzieren.

Das Screening der Zellkulturüberstände zur Bestimmung positiver Klone fand in einer Verdünnung von 1:3 statt.

Nach weiterem dreimaligem Waschen erfolgte anschließend die Inkubation mit dem fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper Cy™3GoatαRabbit bzw. Cy™3GoatαMouse (Dianova 111-165-003 und 115-165-003) in einer Verdünnung in PBS von 1:1000 für 1 h.

Doppelte Immunfluoreszenzen wurden mit den Alexa Fluor fluoreszenzmarkierten Antikörpern GoatαRabbit 568 und DonkeyαMouse 488 (Molecular Probes® Life Technologies A-11011 bzw. A-21202) in einer Verdünnung von 1:1000 verwendet.

Nach abschließendem dreimaligen Waschen erfolgt die Beurteilung unter dem inversen Fluoreszenzmikroskop (Nikon Eclipse Ti-S). Eine Dokumentation erfolgt gegebenenfalls mit der dazugehörigen NIS Software (Basic Research Version 4.0, Nikon Instruments Europe B.V., Düsseldorf).

Für Aufnahmen am Konfokalen Laser Scan Mikroskop wurden Zellpräparate auf Objektträgern hergestellt. Zu diesem Zweck wurden die Zellen auf Deckgläschen (18 x 18 mm, Menzel BB018018A1) ausgesät, die in 6 Loch-Platten verbracht wurden. Die Inkubation der Antikörper erfolgte in einer feuchten Kammer, wobei 200 µl der entsprechenden (s.o.) Antikörperverdünnung je Deckglas appliziert wurden. Nach dem finalen Waschschritt wurden die Deckgläser kurz in Reinstwasser (Milli-Q Advantage A10, Merck Millipore, Darmstadt).

getaucht, überschüssige Flüssigkeit durch vorsichtiges Abtupfen der Ränder entfernt, und mit dem Zellrasen nach unten auf Objektträger gelegt (VWR 631-9461). Auf diese wurden vorher für jedes Deckglas separat 5 µl Fluoreszenzerhaltungsmedium getropft. Die Deckgläschen wurden mit je einem Tupfer klarem Nagellack an jeder Seite fixiert. Die Aufnahmen werden mit Hilfe eines Leica SP5 Konfokalen Laser Scanning Mikroskops (Leica Mikrosysteme Vertrieb GmbH, Wetzlar) von Dr. Stefan Finke (FLI Insel Riems) erstellt. Die Bildbearbeitung erfolgt mit dem Programm ImageJ (Version 1.48b, Schneider et al. 2012).

6.3 Western Blot

Als Antigen für die Westernblotanalysen wurde aufgereinigtes Protein aus SF9-Zellen (s.o.

5.2) oder Lysate aus transfizierten HEK293T-Zellen verwendet. Für die Lysate wurden HEK293T-Zellen in 6 Loch-Platten transfiziert (s.o. 6.1) und nach 42 h geerntet. Hierzu wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit einem Zellschaber (Sarstedt 83.1830) in 500 µl PBS mechanisch lysiert. Die Protein- bzw. Lysatproben wurden in einem Verhältnis von 1:1 [v/v] in Protein Lyse Mix aufgenommen und in einer SDS Gelelektrophorese (s.o. 5.2) aufgetrennt. Die Zelllysate wurden zusätzlich vor dem Erhitzen und Auftragen auf das SDS Gel für 2 Minuten je 10 Pulsen Ultraschall bei 80 % Leistung ausgesetzt (Bandelin Sonoplus 2200, BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin) und nach dem Erhitzen für 2 Minuten bei 17949 x g (Eppendorf Centrifuge 5430R, Eppendorf AG, Hamburg) zentrifugiert. Für die Analyse der gegen die Peptide der F2 Untereinheit des Fusionsproteins generierten Antikörper wurden 10 und 15 %ige Trenngele verwendet. Der Transfer wurde im halbtrockenen Verfahren (Trans-Blot^® SD Semi-Dry Transfer Cell, Biorad Laboratories GmbH München) für 90 min bei 24 V auf eine Nitrocellulosemembran (Whatman^®Protran^® 10401396) durchgeführt. Membran und Gel wurden vor dem Transfer in Transferpuffer equilibriert. Mit diesem Puffer getränktes Filterpapier (Biorad 1703969) an den Kontaktflächen des Gerätes sorgte für die erforderliche Leitfähigkeit des Aufbaus.

Anschließend wurde die Membran in 5 %iger [w/v] Magermilchlösung (MAMIPU Magermilch-Sprühpulver, Hobbybäcker Versand, 89287 Bellenberg) in PBST (0,05 % [v/v]

Tween® 20, Sigma P1379) für 30 min blockiert. Anschließend wurden die Antikörperverdünnungen in PBST über Nacht bei 4°C inkubiert. Vor einem weiteren Blockierungsschritt in Magermilchlösung wurde die Membran dreimal mit PBST gewaschen.

Daraufhin erfolgte die Inkubation mit dem Peroxidase-markierten Zweitantikörper für 1,5 h in einer Verdünnung von 1:25000 (αRabbitPOD bzw. αMousePOD, Dianova 111-035-003 und 115-035-003) in PBST. Der Marker wurde separat mit dem StrepTactin Konjugat in einer Verdünnung von 1:5000 inkubiert (BioRad 161-0380). Nach abgeschlossener Inkubation wurde die Membran weitere drei Mal mit PBST gewaschen. Die Entwicklung erfolgte mittels SuperSignal^® West Pico Chemoluminescent Peroxidasesubstrat (Thermo Sientific 34080) im Versadoc 4000 MP Imaging System (Biorad Laboratories GmbH München) und der Quantity One Software (Version 4.6.9., Biorad^®). Die Belichtungszeit betrug 120 Sekunden unter der Chemi Ultra Sensitive Kanaleinstellung.

7 Indirekter speziesunabhängiger IgG ELISA auf Grundlage des Hendravirus Nukleokapsidproteins

Die Entwicklung eines in-house IgG ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) zum Nachweis von Antikörpern gegen das Nukleokapsidprotein des Hendravirus diente zunächst der Analyse der in dieser Arbeit generierten Antikörper auf ihre Funktionalität. Darüber hinaus sollte ein speziesunabhängiger IgG ELISA zum Nachweis von Antikörpern gegen das Nukleokapsidprotein des Hendravirus in Serumproben verschiedener Spezies entwickelt werden. Hierzu wurden Maxisorp™ Nunc™ 96 Loch-Platten (Sigma M9410-1CS) mit 100 ng Protein pro Vertiefung in PBS über Nacht bei 4°C oder für 1 h bei 37°C beschichtet.

Ungebundenes Protein wurde in drei Waschschritten mit 200 µl PBST (0,05 % bzw. 0,1%

[v/v] Tween® 20, Sigma P1379) entfernt. Während der späteren Optimierung des Protokolls für die Analyse von Schweine- und Pferdeseren wurde die Konzentration des Tween von auf 1,0 % erhöht. Hieran schloss sich ein Blockierungsschritt mit 10 % [w/v] Magermilch (Difco™ Skim Milk, Becton, Dickinson and Company 232100) in PBS oder PBST (0,1 %) für 1 h bei 37°C an. Nach weiterem dreimaligen Waschen wurden die Antikörperverdünnungen in 2 % [w/v] Magermilchlösung in PBST (0,05 oder 0,1 %) in einem Volumen von 75 µl pro Vertiefung für 1 h bei 37°C inkubiert. Das Peroxidase-gekoppelte Konjugat (Protein G Peroxidase Konjugat [Calbiochem 539322] wurde nach weiterem dreimaligen Waschen in einer Verdünnung von 1:5000 ebenfalls in PBST (0,05 oder im später im Rahmen der Protokolloptimierung 0,1 %) in einem Volumen von 75 µl für 1 h bei 37°C inkubiert. Nach drei abschließenden Waschschritten wurden 100 µl eines

Peroxidasesubstrats (ABTS Solution, Roche 11 684 302 001) pro Vertiefung zugesetzt und für 30 min bei Raumtemperatur in Dunkelheit inkubiert. Um die Substratumsetzung zu stoppen wurden pro Well 100 µl einer 1 % [w/v] SDS-Lösung [Natriumdodecylsulfat, Roth 2326.2] hinzugegeben. Anschließend wurde die optische Dichte (OD) in einem Tecan infinite 200Pro ELISA Reader (Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim) bei 405 nm Wellenlänge bestimmt. Die Seren wurden im Doppelansatz getestet. Mittlere OD - Werte von über 0,2 werden hierbei als positiv bewertet. Die Wahl des Schwellwertes lehnte sich an ein Australisches Ringversuchsprotokoll von 2010 vom Australian Animal Health Laboratory (Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation [CSIRO] Livestock Industries, Geelong, Australia) an.

Es wurde stets eine Vertiefung mit einer Konjugatkontrolle mitgeführt. Hier wurde kein Serum, sondern lediglich das Konjugat zugesetzt, um unspezifische und somit eventuell falsch positive Reaktionen des Konjugats auf das Antigen auszuschließen.

Als Negativkontrollantigen wurde analog zum Nukleokapsidprotein exprimiertes und aufgereinigtes Green Fluorescent Protein (GFP) verwendet. Die entsprechenden Baculovirusstocks wurden freundlicherweise von Dr. Günther Keil, FLI Insel Riems, zur Verfügung gestellt.

Als Negativkontrollseren wurden deutsche Pferdeseren aus dem Jahr 2007 verwendet. Diese wurden zur Verfügung gestellt von Dr. Ute Ziegler (FLI Insel Riems). Es wurden insgesamt 48 Seren getestet.

Inaktivierte Pferdeseren, welche Antikörper gegen das Hendravirus enthalten, stammten aus einem im Jahr 2010 vom Australian Animal Health Laboratory (Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation [CSIRO] Livestock Industries, Geelong, Australia) organisierten Ringtest. Diese Testseren bestanden aus 1:5 bis 1:30 verdünnten Seren Antikörper-positiver Pferde. Die Seren aus späteren Ringtests lagen in Verdünnungen von bis zu 1:150 vor. Hierbei handelte es sich um Verdünnungen zweier Ausgangsseren aus Ausbrüchen in Queensland, Australien, von 2008.

Um die mögliche speziesübergreifende Anwendung in Hinblick auf einen serologischen Test für den Nachweis einer Infektion mit Henipaviren zu überprüfen, wurde die Reaktivität mit Schweineseren überprüft, die Antikörper gegen das Hendravirus, und gegen das Nipahvirus aufwiesen, überprüft. Diese Seren wurden zur Verfügung gestellt von Dr. Hana Weingartl

(National Centre for Foreign Animal Disease, Winnipeg, Canada). Insgesamt wurden hier Seren von 27 Schweinen aus unterschiedlichen Infektions- bzw. Vakzinierungsstudien getestet. Die Seren aus den Vakzinierungsstudien mit dem Hendra G-Protein ließen keine Reaktion im hier beschriebenen Testverfahren erwarten, da sie nicht gegen das Nukleoprotein des Hendravirus gerichtet sind. Sie waren somit als Negativkontrollen zu werten. Als weitere Negativkontrollen wurden deutsche Schweineseren aus Impfversuchen für die klassische Schweinepest eingesetzt. Hier wurden während der Validierung zunächst 17 Seren getestet.

Diese wurden vom NRL für klassische und afrikanische Schweinepest unter der Leitung von Dr. Sandra Blome, FLI Insel Riems, zur Verfügung gestellt. Weiterhin wurden zunächst acht Schweineseren aus Sierra Leone getestet, die im Rahmen einer Kooperation entnommen und dem FLI Insel Riems zugesandt worden waren. Diese Untersuchung diente dem Ziel, mögliche Antikörper gegen Henipavirus-ähnliche Paramyxoviren in afrikanischen Schweinen zu detektieren, und zuvor die Reaktivität von Seren afrikanischer Schweinerassen zu analysieren.

Im Zuge der Etablierung des ELISAs wurden die zu testenden Seren nach anfänglichen Testläufen in einer Verdünnung von 1:100 eingesetzt. Sowohl im Waschpuffer als auch im Serumverdünnungspuffer wurde eine Tweenkonzentration 0,1 % verwendet. Die mittlere OD der Konjugatkontrolle wurde hierbei von den für die einzelnen Testseren ermittelten OD-Werten abgezogen.

Die Testseren aus Kanada wurden für 60 Minuten bei 56°C erhitzt um infektiöses Virus zu zerstören. Seren aus Australien wurden durch Gamma-Bestrahlung von infektiösem Virus befreit. Diese und alle übrigen hier verwendeten Testseren zur ELISA-Etablierung wurden bei 30 Minuten für 56°C inaktiviert.

8 Untersuchungen zu Rezeptorbindung und Synzytienformation durch das Fusions- und das Attachment-Protein des Hendravirus sowie deren Inhibition 8.1 Synzytieninduktion in HEK293T- und BSR T7-Zellen

Um die glykoproteininduzierte Synzytienbildung in Zellkultur darzustellen, wurden HEK293T-Zellen und BSRT7-Zellen (Zellbank Insel Riems) mit den eukaryotischen Expressionsplasmiden für das G-Protein (Attachment) und das F-Protein (Fusion) des

Hendravirus (HeV) (pCAGGS-HeV F und pCAGGS-HeV G) in 6 Loch-Platten kotransfiziert (siehe 6.1 Zelltransfektion). Hierzu wurden je Plasmid 3 µg DNA eingesetzt. BSRT7-Zellen wurden während der Kultivierung während jeder zweiten Passage mit Geneticin (G-418 Sulphate, PAA Laboratories P02-012) selektiert. Hierbei wurden 1 mg/ml Geneticin in Anzuchtsmedium (modifiziertes Glasgow Minimal Essential Medium BHK21 mit 10 % [v/v]

FKS, Zellbank Insel Riems) angewendet. Die Zellrasen der BSRT7-Zellen wurden in einer Dichte von 80-90 % transfiziert. Die Transfektion erfolgte im Weiteren wie unter Punkt 6.1, Zelltransfektion, bereits beschrieben. Als Negativkontrollen wurden die pCAGGS-HeV F oder pCAGGS-HeV G in Kombination mit pCAGGS bzw. nur pCAGGS verwendet. Die Beurteilung erfolgt nach 18 und 42 h Inkubation bei 37°C. Zur besseren Darstellung wurde eine Kernfärbung der lebenden Zellen mit dem Hoechst 33342 (Invitrogen H1399) mit 0,1 mg/ml für 1 h durchgeführt. Die Beurteilung und Dokumentation erfolgte am inversen Fluoreszenzmikroskop (Nikon Eclipse Ti-S). Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wurde pCAGGS-HeV M zur Expression des Hendravirus Matrixproteins kotransfiziert, um die Expression des Fusionsproteins an der Zelloberfläche zu verstärken.

8.2 Klonierung und Expression von Ephrin B2

Zur Generierung eines geeigneten Expressionsplasmides wurde die entsprechende proteinkodierende Vollsequenz mittels PCR amplifiziert und in den pCAGGS Vektor kloniert. Als Ausgangssequenz diente der entsprechende bereits in einen Vektor klonierte und kommerziell erhältliche humane Genomabschnitt (Source BioSience LifeSiences, Clone IRATp970B09131). Die Primersequenzen (Tab. 18) fügen am 5´ Ende des Start- und 3´ Ende des Stoppcodons der Proteinkodierenden Sequenz (Gene Bank Accession Number BC069342) neben den erforderlichen Basenüberhängen die für die Restriktionsenzyme notwendigen Erkennungssequenzen von MfeI am Forwardprimer und NheI am Reversprimer hinzu.

Tabelle 18 Primersequenzen für die Ephrin B2 Klonierung (Basenüberhänge, Kozak-Sequenz, Restriktionssequenz, Startcodon, Stoppkodon, proteinkodierende Sequenz)

Primer Sequenz

EB 2 fw MfeI 5‘ – GCC CAA TTG GCC ACC ATG GCT GTG AGA AGG GAC – 3‘

EB2 rv NheI 5‘ – TAT ATA GCT AGC TCA GAC CTT GTA GTA AAT GTT C – 3‘

Die Amplifikation des Genomabschnittes erfolgte in einem Biometra T3 Thermocycler (Analytik Jena AG, Jena) unter folgenden Bedingungen: Nach einer Initialen Denaturierung der DNA und Aktivierung der Polymerase für 2 Minuten bei 94°C folgten 35 Zyklen aus je 15 Sekunden Denaturierung bei 94°C mit anschließender Primeranlagerung bei 60°C für 30 Sekunden. Die Elongation der Fragmente erfolgte nachfolgend bei 72°C für 75 Sekunden. Im Anschluss an die Amplifikation erfolgte die finale Elongation der Fragmente für 7 Minuten bei 72°C. Die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches wird in Tabelle 19 angegeben.

Tabelle 19 PCR Ansatz zur Amplifikation des Klonierungs-Inserts für Ephrin B2

Reagenzien Volumen

DNA Template (Plasmid DNA) 2 µl

PCR Puffer mit Magnesiumsulfat (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) 5 µl dNTP Mix (Deoxynucleoside Triphosphate Set, PCR Grade, Roche Diagnostics

GmbH, Mannheim) [10 mM]

1 µl

Primer EB 2 fw MfeI [10 pmol/µl] 1 µl

Primer rv NheI [10 pmol/µl] 1 µl

PWO DNA Polymerase [5 U/µl] (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) 0,25 µl

dH2O (GIBCO^® Invitrogen GmbH, Karlsruhe) ad 50 µl

Das PCR Produkt wurde anschließend mittels Agarosegelelektrophorese aufgereinigt und die DNA extrahiert (siehe 3.3 Analyse der PCR-Produkte im Agarosegel und Aufreinigung der DNA). Das Elutionsvolumen betrug 50 µl. Anschließend erfolgte ein Restriktionsverdau des aufgereinigten PCR-Produkts über Nacht bei 37°C in einem Thermoblock (Thermomixer comfort, Eppendorf). Durch diesen Verdau wurden die Schnittstellen für die anschließende Klonierungsreaktion freigelegt. Die Zusammensetzung des hierbei verwendeten Reaktionsgemisches wird in Tabelle 20 angegeben.

Tabelle 20 Restriktionsverdau des Klonierungs-Inserts für Ephrin B2

Reagenzien Volumen

DNA Template (PCR Produkt Ephrin B2) 30 µl

10 x BSA (New England Biolabs B9001S) 5 µl

Puffer 4 (New England Biolabs B7004S) 5 µl

15 U MfeI (New England Biolabs R0589S) 1,5 µl

15 U NheI (New England Biolabs R0131S) 1,5 µl

dH2O (GIBCO^® Invitrogen GmbH, Karlsruhe) ad 50 µl

Im Anschluss an den Restriktionsverdau wurden die abgespaltenen Nukleotide unter Verwendung des QIAquick^®Nukleotide Removal Kit (Qiagen 28304) entfernt. Hierzu wurde das zehnfache Volumen des Verdauproduktes an Puffer PN zugesetzt. Die Probe wurde anschließend auf eine Kieselgelmembran pipettiert. Während einer Zentrifugation von einer Minute bei 6000 rpm band die DNA an die Membran. Zur Entfernung von Salzen wurde die DNA mit 750 µl alkoholischem Puffer PE während einer Minute Zentrifugation bei 6000 rpm gewaschen. Zur Entfernung restlichen Puffers erfolgte ein weiterer Zentrifugationsschritt für eine Minute bei 13000 rpm. Zur Elution der DNA wurden 50 µl dH2O (GIBCO^® Invitrogen GmbH, Karlsruhe) auf die Membran pipettiert, für eine Minute inkubiert und anschließend für eine weitere Minute bei 13000 rpm zentrifugiert. Alle Zentrifugationsschritte wurden in der Eppendorf 5430R Zentrifuge durchgeführt. Die Ligation erfolgte unter Verwendung der T4 DNA Ligase nach über Nacht bei 16°C in einem Biometra T3 Thermocycler (Analytik Jena AG, Jena). Der linearisierte Vektor pCAGGS wurde freundlicherweise zur Verfügung gestellt vom Labor Dr. Finke, Insel Riems. Als Negativkontrolle wurde ein Ligationsansatz ohne Insertionsfragment mitgeführt. Die Zusammensetzung des Ligationsansatzes wird in Tabelle 21 angegeben.

Tabelle 21 Ligationsansatz für die Ephrin B2 Klonierung

Reagenzien Volumen

Vektor pCAGGS 2 µl

Ephrin B2 PCR Produkt 7 µl

Ligasepuffer (New England Biolabs B0202S) 2 µl

400 U T4 Ligase (New England Biolabs R0589S) 1 µl

dH2O (GIBCO^® Invitrogen GmbH, Karlsruhe) ad 20 µl

Nach erfolgter Ligation wurde eine Transformation mit XL1-Blue kompetenten E. coli-Zellen (Stratagene 200249) durchgeführt. Je 10 µl des Ligations- und des Kontrollansatzes wurden mit 100 µl Zellen für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Im Anschluss daran erfolgte ein Hitzeschock für 2 Minuten bei 42°C mit anschließender Kühlung auf Eis für 2 Minuten. Jeder Ansatz wurde anschließend in 1 ml LB Medium (10 g/l Casein Hydrolysat [OXOID LTD.

LP0041], 5 g/l Hefeextrakt [MP Biomedicals 103303], 10 g/l Natriumchlorid [Roth 3957.1]) bei 37°C und 200 rpm in einem Bakterienschüttler (MaxQ 8000, Thermo Sientific) für 1,5 h vorinkubiert. 200 µl dieser Vorkulturen wurden nachfolgend auf LB Agarplatten (15 g

Bacteriological Grade Agar [ICN Biomedicals 9002-18-]/l LB Medium) ausplattiert. Zu Selektionszwecken enthielten die Platten 100 mg/l Ampicillin (Sigma A9518). Die präparierten Platten wurden daraufhin für 16 h bei 37°C in einem Bakterieninkubator (Incucell, MMM Medcenter Einrichtungen GmbH München) bebrütet. Für die Präparation der DNA wurden für zunächst 30 der gewachsenen Kolonien Übernachtkulturen von je 3 ml LB Medium mit 100 mg/l Ampicillin im Bakterienschüttler angesetzt. Nach 16 h Inkubation erfolgte die Aufreinigung der Plasmid-DNA mit dem QIAprep^®SpinMiniprep Kit (Qiagen 27106 siehe Punkt 3.4.1 TOPO TA Cloning). Anschließend wurde ein Kontrollverdau der gewonnenen Plasmid-DNA durchgeführt und über Agarosegelelektrophorese (3.3 Analyse der PCR-Produkte im Agarosegel) analysiert. Hierzu wurde das Enzym EcoRI verwendet, welches die Ephrin B2 Sequenz an Position 106 und 347 schneidet (Tab. 22). Daraus resultierten bei einer Gesamtgröße des geplanten Konstrukts von 5718 bp (4716 bp pCAGGS mit 1002 bp proteinkodierendem Bereich von Ephrin B2) Restriktionsfragmente von 5476 und 242 bp.

Tabelle 22 Restriktionsverdau zur Kontrolle der Klonierung

Reagenzien Volumen

Plasmid-DNA 5 µl

20 U EcoRI (New England Biolabs R0101S ) 1 µl

EcoRI Puffer (New England Biolabs B0101S) 2 µl

dH2O (GIBCO^® Invitrogen GmbH, Karlsruhe) ad 20 µl

Zwei der Klone mit den erwarteten Fragmentgrößen wurden mit plasmidspezifischen Primern (Tab. 23, zur Verfügung gestellt von Dr. Stefan Finke, FLI Insel Riems), sequenziert, um die Identität der klonierten Sequenz und deren Übereinstimmung mit der Referenzsequenz zu überprüfen. Die Sequenzierung wurde kommerziell durchgeführt von MWG Eurofin Operon (Ebersberg). Die Überprüfung der Übereinstimmung der generierten Sequenzen und somit der klonierten Plasmid DNA mit der Referenzsequenz erfolgte mit der der BioEdit Software v.7.1.7 (Hall, 1999).

Tabelle 23 Plasmidspezifische Primer zur Sequenzierung

Primer Sequenz

CAGGS-Promotor(2) 5‘ – TGG CGG AGC CGA AAT CTG GGA – 3‘

CAGGS-Primer Rev 5‘ – ACC AAA TAC TCA TTC TGA TG – 3‘

8.3 Fusionsversuche in Zellen ohne endogene Ephrin-Expression (HeLa-Zellen) 8.3.2 Transfektion von Ephrin-negativen Hela-Zellen

Für diese Versuche konnte eine Variante von Hela-Zellen verwendet werden, die als Ephrin-defizient gilt, und somit resistent gegen eine Infektion gegen Henipaviren ist (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Andrea Maisner, Phillips Universität Marburg). Die Kultivierungsbedingungen dieser HeLa-Zellen entsprechen hierbei denen der HEK293T-Zellen (6.1 Zelltransfektion). Die Transfektionseffizienz für diese Zelllinie wurde mittels GFP-Expression (Plasmid pEGFP-N1, zur Verfügung gestellt von Dr. Stefan Finke, Insel Riems) und Immunfluoreszenzen für Fusions- und Matrix- Protein (6.2 Indirekte Immunfluoreszenz) überprüft. Zur Überprüfung der Ephrin B2 Expression wurde ein kommerzieller Aniti-EFNB2 Antikörper (Sigma-Aldrich, SAB4300456) eingesetzt. Um die Expression des Fusions- und Attachment Proteins (Glykoprotein G) an der Zelloberfläche zu verstärken wurde zusätzlich das Matrixprotein kotransfiziert. Die Transfektion wurde in einem Monolayer der Zellen von 90 % Dichte durchgeführt. Nach Optimierung von Transfektionsreagenz und eingesetzter Plasmidmenge wurde die Transfektion unter abgeänderten Bedingungen durchgeführt. Zur Transfektion in 6 Loch-Platten wurde das Lipofectamin^®2000 (Invitrogen, 11668) Reagenz in einem Verhältnis von 1 µg DNA zu 1,6 µl Lipofectamin in einem Volumen von je 250 µl serumfreiem Medium eingesetzt. DNA und

Für diese Versuche konnte eine Variante von Hela-Zellen verwendet werden, die als Ephrin-defizient gilt, und somit resistent gegen eine Infektion gegen Henipaviren ist (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Andrea Maisner, Phillips Universität Marburg). Die Kultivierungsbedingungen dieser HeLa-Zellen entsprechen hierbei denen der HEK293T-Zellen (6.1 Zelltransfektion). Die Transfektionseffizienz für diese Zelllinie wurde mittels GFP-Expression (Plasmid pEGFP-N1, zur Verfügung gestellt von Dr. Stefan Finke, Insel Riems) und Immunfluoreszenzen für Fusions- und Matrix- Protein (6.2 Indirekte Immunfluoreszenz) überprüft. Zur Überprüfung der Ephrin B2 Expression wurde ein kommerzieller Aniti-EFNB2 Antikörper (Sigma-Aldrich, SAB4300456) eingesetzt. Um die Expression des Fusions- und Attachment Proteins (Glykoprotein G) an der Zelloberfläche zu verstärken wurde zusätzlich das Matrixprotein kotransfiziert. Die Transfektion wurde in einem Monolayer der Zellen von 90 % Dichte durchgeführt. Nach Optimierung von Transfektionsreagenz und eingesetzter Plasmidmenge wurde die Transfektion unter abgeänderten Bedingungen durchgeführt. Zur Transfektion in 6 Loch-Platten wurde das Lipofectamin^®2000 (Invitrogen, 11668) Reagenz in einem Verhältnis von 1 µg DNA zu 1,6 µl Lipofectamin in einem Volumen von je 250 µl serumfreiem Medium eingesetzt. DNA und

Im Dokument Untersuchungen zum Vorkommen von Fledermaus-assoziierten Virusinfektionen in Deutschland und zur Diagnostik und molekularen Pathogenese Flughund-assoziierter zoonotischer Paramyxoviren (Seite 40-0)