Monoklonale Antikörper gegen das Nukleokapsidprotein

Zur Detektion antikörperproduzierender Klone wurden die Überstände von 1341 Hybridomakulturen analysiert. Zwei Klone zeigten hierbei eine spezifische Reaktion in der Immunfluoreszenz und wurden subkloniert. Von Klon Mab N1 stehen nun fünf Subklone zur Verfügung, von Mab N2 lediglich einer. In einer Verdünnung von 1:200 zeigten alle Klone und ihre Subklone eine gute Reaktion in der Immunfluoreszenz-Untersuchung von mit HeV N transfizierten HEK293T-Zellen (Abb. 22).

Abbildung 22 HEK293 T-Zellen; A) und B) Mab N1 auf transfizierten Zellen 18 h nach Transfektion (A) und auf nicht transfizierten Zellen (B); C) und D) Mab N2 auf transfizierten Zellen 18 h nach Transfektion (C) und auf nicht transfizierten Zellen (D); Jede Bilderreihe zeigt von links nach rechts die Aufnahme im Fluoreszenzkanal, die Überlagerung von Durchlichtmikroskopie und Fluoreszenzkanal sowie das reine lichtmikroskopische Bild. Mab N Antikörperverdünnung 1:200

Im Westernblot zeigte jedoch nur Mab N2 eine schwache Reaktion in einer Verdünnung von 1:50 (Abb. 23).

Abbildung 23 Westernblot Analyse zum Mab N2 zum Nachweis von aufgereinigtem Nukleoprotein und Green Fluorescent Protein; Antikörperverdünnung 1:50

10 Etablierung eines indirekten ELISA

Der hier beschriebene ELISA wurde zum Zweck eines speziesübergreifenden Nachweises von Antikörpern gegen Henipaviren entwickelt. Hierfür wurde aufgereinigtes Nukleoprotein aus mit rekombinanten Baculoviren infizierten SF9-Zellen als Antigen verwendet. Nach der Beschichtung der ELISA-Platten mit dem Nukleoprotein wurden die Testseren als erster Antikörper in diesem Testaufbau verwendet. Als zweiter Antikörper diente das Protein G, welches an die am Protein gebundenen IgG-Antikörper aus den Testseren bindet. An dieses Protein war eine Peroxidase gekoppelt, welche bei der Auswertung des Testes ein entsprechendes Substrat umsetzte und dadurch einen messbaren Farbumschlag auslöste, der mit der Menge an gebundenem Protein an Intensität gewinnt und die optische Dichte (OD) in den entsprechenden Reaktionsvertiefungen erhöht. Das polyklonale Kaninchenserum Anti-HeV N, das gegen dieses Protein gerichtet ist, diente hierbei als Positivkontrolle. Als Testseren wurden australische Pferdeseren, die Antikörper gegen das Hendravirus aufweisen, sowie Schweineseren aus Nipah-Virus-Infektionsstudien, die Antikörper gegen das Hendra- oder das Nipahvirus enthielten, eingesetzt. Als Negativkontrollseren wurden Schweine- und Pferdeseren aus anderen Forschungsarbeiten verwendet, die freundlicherweise für die Entwicklung des Testes zur Verfügung gestellt wurden. Als Negativkontrollantigen wurde das Green Fluorescent Protein verwendet. Dieses Protein stammt aus demselben Expressions- und Aufreinigungssystem wie das Nukleoprotein und diente dem Ausschluss unspezifisch reagierender Verunreinigungen aus den SF9-Zellen oder den Baculoviren, die akzidentiell mit aufgereinigt worden waren.

Um die zukünftige Entwicklung weiterer ELISA-Verfahren zu ermöglichen, wurden ferner weitere monoklonale Antikörper gegen das Nukleoprotein generiert und getestet.

Als vorläufiger Schwellenwert für die Unterscheidung zwischen positiven und negativen Testseren wurde eine OD von 0,2 festgelegt, um eine zufriedenstellende Trennung der bekannt positiven und negativen Seren zu erhalten. Dieser cut-off ist bis zur Testung einer ausreichenden Zahl definierter Seren vorläufig. Für die Berechnung eines variablen cut-offs lagen noch nicht genügend Daten vor. Das polyklonale Anti-HeV N-Kaninchenserum (α Rabbit HeV N zeigte im ELISA eine spezifische Reaktion mit 100 ng/Vertiefung des Nukleokapsidproteins mit OD Werten von über 0,2 bei einer Verdünnung von 1:100.000. Der monoklonale Antikörper Mab N2 zeigte bis zu einer Verdünnung von 1:5000 OD Reaktionswerte von über 0,2.

Mit einer Serumverdünnung von 1:1000 und einer Tween-Konzentration von 0,05 % in den Wasch- und Serumverdünnungspuffern konnten 6 der 7 positiven Pferdeseren aus dem australischen Hendra-Ringtest von 2010 mit einer OD von über 0,2 detektiert werden. Das am stärksten vorverdünnte Serum fiel unter den gesetzten Schwellenwert von 0,2. Alle drei negativen Ringtestproben sowie alle getesteten deutschen Pferdeseren fielen bei diesen Testbedingungen unter diesen Schwellenwert. Wiederholungsversuche waren hier aufgrund von Materialmangel der Ringtestproben nicht möglich. Daher wurden für eine weitere Optimierung zusätzliche Seren aus späteren Ringtests untersucht.

Die Verdünnung der vom Australian Animal Health Laboratory (Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation [CSIRO] Livestock Industries, Geelong, Australia) zur Verfügung gestellten Seren für den Ringtest 2010 waren an die Sensitivität des bis dahin von diesem Labor zur Verfügung gestellten ELISAs angepasst. Dieser Test (HeV sds ELISA) basierte auf inaktiviertem Hendravirus-Antigen aus Zellkultur-Lysaten. Später kam hier jedoch ein ELISA auf Basis von löslichem Glykoprotein (HeV sG iELISA) zum Einsatz, der eine höhere Sensitivität aufwies. Durch diesen Wechsel im australischen Testsystem lagen die Seren aus den späteren Tests in höheren Vorverdünnungen vor. So konnten mit den bisherigen Parametern nur 5 von 16 positiven Proben detektiert werden. Durch Verkürzung der Antigenbeschichtungszeit auf eine Stunde bei 37°C und Erhöhung der Tween-Konzentration auf 0,1 % in Wasch-, Serum- und Konjugat-Verdünnungspuffer wurde das Protokoll angepasst. Die Testseren wurden hierbei in einer Verdünnung von 1:100 eingesetzt.

Bei der Auswertung wurde hierbei der Mittelwert der Konjugatkontrolle von den

Mittelwerten der Proben abgezogen. Ein korrekter Nachweis aller australischen Proben war unter diesen Bedingungen möglich (Tab. 30). Jedoch lagen die OD Werte von drei der 15 mitgeführten deutschen Kontrollseren über dem Schwellenwert und teilweise deutlich über den OD Werten schwach-positiver Proben. Folglich sind hier noch weitere Optimierungen notwendig.

Dasselbe Protokoll kam beim der Test der Schweineseren zu Einsatz. Auch hier war eine Serumverdünnung auf 1:100 für eine ausreichende Sensitivität erfolgreich. Mit diesen Testparametern konnten ca. drei Wochen nach einer Hendra- oder Nipahvirus-Infektion von Schweinen bei diesen Antikörper gegen das Nukleokapsidprotein nachgewiesen werden (Tab.

31). Vereinzelt kam es jedoch zu unspezifischen Reaktionen der Seren mit Bestandteilen von Baculovirus oder SF9-Zellen, was durch die parallel angesetzte Testung der Seren mit Detektions- (HeV N) und Kontrollantigen (GFP) deutlich wurde. Hier wäre eine weitere Bestätigung durch z.B. den Serum-Neutralisationstest (SNT) hilfreich. Solche Untersuchungen müssen jedoch in einem Labor der Sicherheitsstufe 4 durchgeführt werden, sodass hierauf zunächst verzichtet wurde.

Tabelle 30 Mittlere OD-Werte nach Abzug der Konjugat-Kontrollwerte für Pferdeseren

Vorverdünnung

(Austral. Seren) Mittlere OD Serumbezeichnung Deutsche

1:40 0,4112 Cannonvale QLD (2008) (Thomas) 1:5 1,7184 Cannonvale QLD (2008) (Thomas) 1:40 0,5533 Redlands QLD (2008) (Tamworth) 1:30 0,5625 Cannonvale QLD (2008) (Thomas) 1:10 1,1904 Cannonvale QLD (2008) (Thomas) Neg. Serum 0,0956

1:20 0,8344 Cannonvale QLD (2008) (Thomas) unverdünnt 2,6559 Cannonvale QLD (2008) (Thomas) Neg. Serum 0,1272

1:10 1,0739 Redlands QLD (2008) (Tamworth) 1:20 0,8895 Redlands QLD (2008) (Tamworth) 1:125 0,2565 Redlands QLD (2008) (Tamworth) 1:50 0,5121 Redlands QLD (2008) (Tamworth) 1:150 0,2219 Redlands QLD (2008) (Tamworth) 1:100 0,2650 Redlands QLD (2008) (Tamworth)

Positivkontrolle / 2,8230 αRabbit HeV N

Tabelle 31 Gemittelte OD-Werte nach Abzug der Konjugat-Kontrollwerte für Schweineseren

Serum/Studie Dpi* Mittlere OD

HeV N

Afrikanische Schweine / 0,3454 0,2024

/ 0,0575 0,0429

Langzeitstudie 2010 28 2,2982 0,0021

28 2,4416 0,0045

Minipigs 2008 28 1,9457 0,0032

28 2,4137 0,0027

Vakzinestudie PRV A und B 2013

35 0,0759 0,0044

Positivkontrolle α Rabbit HeV N / 2,7909 -0,0001

* dpi: days post infection (Tage nach der Infektion)

11 Synzytienformation in HEK293T sowie BSRT7-Zellen

Um die Funktionalität der transfizierten Hendraproteine zu bestätigen und in verschiedenen gut transfizierbaren Zelllinien zu untersuchen, wurden HEK293T- und BSRT7-Zellen eingesetzt. Nach Kotransfektion von pCAGGS-HeV F und pCAGGS-HeV G konnten in HEK293T- und BSRT7-Zellen Synzytien in unterschiedlich starker Ausprägung beobachtet werden. So lagerten sich die Zellen zunächst in dichten Gruppen zusammen. Dies wurde durch die Bindung von Attachment-Proteinen in der Zellmembran einer Zelle mit Ephrin-Liganden in den Zellmembranen benachbarter Zellen ausgelöst. Im nächsten Stadium begannen die Zellmembranen zu verschmelzen und es kam zur Ausbildung der eigentlichen Synzytien. Diese konnten vor allem in HEK293T-Zellen derartig viele Zellkerne mit einbeziehen, dass diese optisch nicht mehr unterscheidbar und somit nicht mehr zählbar waren. Im noch weiter fortgeschrittenen Stadium ließen sich nur noch Lücken im Zellrasen beobachten, da die mehrkernigen Zellen zugrunde gegangen waren. Diese mehrkernigen Zellen stellten sich in der Kernfärbung als Anhäufungen von Zellkernen dar. In BSRT7-Zellen waren die beobachteten Veränderungen dezenter. Hier ließen sich vor allem in der Kernfärbung radförmig angeordnete Zellkerne beobachten (Abb. 24).

Abbildung 24 Synzytienformation 42 h nach Transfektion in HEK293T und BSRT7-Zellen in 10-facher

Vergrößerung. (A) und (B) HEK293T-Zellen, (C) und (D) BSRT7-Zellen. (A) und (C) transfiziert mit pCAGGS-HeV G und pCAGGS, (B) und (D) transfiziert mit pCAGGS-HeV G und pCAGGS-HeV F. Das lichtmikroskopische Bild ist jeweils in kleinerem Maßstab eingeblendet.

Nach zusätzlicher Kotransfektion von pCAGGS-HeV M ließ sich in der Immunfluoreszenz eine verstärkte Expression des Fusionsproteins an der Zelloberfläche beobachten. Das Protein fand sich hierbei weniger stark in kernnahen vesikulären Strukturen, sondern vermehrt im Bereich der Zellmembran. Zusätzlich schienen beide Proteine kolokalisiert zu sein, was sich in der Gelbfärbung der Immunfluoreszenz bei Überlagerung der Fluoreszenz für das Matrixprotein (grün) und dem Fusionsprotein (rot) bemerkbar machte (Abb. 25).

Abbildung 25 (A-C) Kotransfektion von pCAGGS-HeV G; pCAGGS-HeV F und pCAGGS-HeV M in HEK293T-Zellen; (D-F) Kotransfektion von pCAGGS-HeV G und pCAGGS-HeV F; (A, D) Immunfluoreszenz mit Mab E7 anti HeV M; (B, E) Immunfluoreszenz mit Pab F22; (C, F) Überlagerungsansicht beider Fluoreszenzen, Matrixprotein grün, Fusionsprotein rot

12 Expression der Hendraproteine sowie von Ephrin B2 zur Induktion von Synzytien in Ephrin-defizienten Zellen (HeLa eph-Zellen)

Um ein Modell für die Untersuchung des Zusammenspiels von Ephrin B2, Attachment-Protein und Fusionsprotein zu erhalten, sollten alle drei Komponenten in geeignete Zellen transfiziert werden. Daher wurde Ephrin B2 in einen Expressionsvektor kloniert und es wurde versucht, alle drei für die Synzytiumsformation notwendigen Elemente in Ephrin-defiziente Zellen zu transfizieren, um von endogener Proteinexpression unabhängig zu sein.

Der Restriktionsverdau des klonierten Expressionsplasmides für Ephrin B2 zeigte die erwarteten Fragmentgrößen von 5,48 kb und 0,24 kb. Der Sequenzabgleich der klonierten Ephrinsequenz zeigte eine vollständige Übereinstimmung mit der entsprechenden Referenzsequenz, was die erfolgreiche Klonierung bestätigte.

Die Expression des klonierten Ephrin-Liganden in HeLa eph-Zellen konnte mittels eines spezifischen kommerziellen Antikörpers in der Immunfluoreszenz nachgewiesen werden (Abb. 26). Ephrin B2 lag hierbei überwiegend an der Zellmembran lokalisiert vor.

Abbildung 26Transfizierte HeLa eph-Zellen; (A) pCAGGS-Ephrin B2 18 h nach Transfektion; (B) nicht transfizierte Zellen; Jede Bilderreihe zeigt von links nach rechts die Aufnahme im Fluoreszenzkanal, die Überlagerung von Durchlichtmikroskopie und Fluoreszenzkanal sowie das reine lichtmikroskopische Bild.

Zur Induktion von Synzytien wurde eine zweite Population von HeLa eph-Zellen, welche mit den Plasmiden pCAGGS-HeV G, pCAGGS-HeV F und pCAGGS-HeV M transfiziert war, mit der mit Ephrin B2 transfizierten Population vermischt und inkubiert.

Bei der Dokumentation der Transfektionskombination mit den Plasmiden pCAGGS-HeV G, pCAGGS-HeV F und pCAGGS-HeV M in der Immunfluoreszenz ließ sich im Vergleich zu den HEK293T-Zellen (vgl. 11. Synzytienformation in HEK293T sowie BSRT7-Zellen) kaum Kolokalisation der Fusions- und Matrixproteine erkennen (Abb. 27).

Abbildung 27 (A-C) Kotransfektion von pCAGGS-HeV G; pCAGGS-HeV F und pCAGGS-HeV M in HeLa eph-Zellen; (D-F) Kotransfektion von pCAGGS-HeV G und pCAGGS-HeV F; (A, D) Immunfluoreszenz mit Mab E7 anti HeV M; (B, E) Immunfluoreszenz mit Pab F22; (C, F) Überlagerungsansicht beider Fluoreszenzen, Matrixprotein grün, Fusionsprotein rot

Nach dem Mischen beider Zellpopulationen ließen während der Kultivierung der entstehenden Mischpopulation lichtmikroskopisch keinerlei Synzytien erkennen.

Aufgrund dieser Beobachtungen wurde der Einfluss des klonierten Ephrin B2 auf die Synzytienformation in Ephrin-positiven (HEK293T) Zellen untersucht. Es wurde erwartet, dass sofern das kotransfizierte Ephrin B2 funktionell ist, es zu einer verstärkten Ausbildung von Synzytien in diesen Zellen bei entsprechender Kotransfektion der Plasmide für das Attachment-Protein (Glykoprotein G) und dem Fusionsprotein kommt. Bei Kotransfektion der Plasmide für Ephrin B2, Attachment- und Fusionsprotein kam es hier jedoch im Gegensatz zur Kontrolle ebenfalls zu keiner Ausbildung von Synzytien. In einer Kombination von Immunfluoreszenz für Ephrin B2 und Zellkernfärbung zur Darstellung von Synzytien wurde dies deutlich (Abb. 28). Hier zeigte sich, dass bei vorliegender Fluoreszenz für Ephrin B2 keine Synzytien zu erkennen sind. Dieses Protein wird daher in den Zellen zwar exprimiert, scheint aber die Bildung von Synzytien zu unterbinden. In der Kontrolle wurden nur die Plasmide für das Fusions- und Attachment-Protein transfiziert, wodurch es zur Ausbildung

von Synzytien kam. Diese Beobachtungen lassen einen inhibitorischen Effekt des transfizierten Ephrin B2 auf die Synzytienformation vermuten, da dessen Expression in Zellen, welche endogenes Ephrin B2 exprimieren, dazu führt, dass keine Synzytien mehr auftreten.

Abbildung 28 HEK293T-Zellen 42 h nach Transfektion in 10facher Vergrößerung; (A und C) Kotransfektion von pCAGGS-HeV G, pCAGGS-HeV F und pCAGGS-EB 2: Die Kernfärbung (A) verdeutlicht das Fehlen von Synzytien;

der selbe Bildausschnitt (C) im Fluoreszenzkanal für Ephrin B (rot) zeigt ein deutliches Signal für dieses

kotransfizierte Protein (B und D) Kotransfektion von pCAGGS-HeV G und pCAGGS-HeV F; Die Kernfärbung bei Kotransfektion von pCAGGS-HeV G und pCAGGS-HeV F dokumentiert die Bildung von Synzytien, derselbe Bildausschnitt im Fluoreszenzkanal für Ephrin B2 (rot) zeigt kein spezifisches Signal für dieses Protein.

13 Etablierung eines quantitativen Fusionsassays in HEK293T-Zellen 13.1 Synzytieninhibition durch Peptide

Um ein Modell für eine inhibierte Formation von Synzytien zu erhalten, wurden in der Literatur beschriebene Peptide eingesetzt und ihr Einfluss in Zellkultur untersucht.

Der Effekt dieser potenziell inhibierend auf die Synzytienformation wirkenden Peptide war abhängig von der eingesetzten Peptidkonzentration. Bei einer Zugabe der Peptide in einer Konzentration von 10 mM ließen sich lichtmikroskopisch keine Synzytien mehr beobachten.

Bei einer Konzentration von 1 µM konnten zufällig auftretende Zusammenlagerungen von Zellkernen noch nicht eindeutig von der Formation von Synzytien unterschieden werden.

Unterhalb einer Konzentration von 0,1 µM ließen sich dagegen kleine Synzytien feststellen.

Dies galt vor allem für das aus dem Fusionsprotein des Hendravirus stammende Peptid. Der hemmende Einfluss des aus dem Fusionsprotein des Hendravirus stammenden Peptids war wie in der Literatur beschrieben schwächer ausgeprägt als der des entsprechenden Peptids des humanen Parainfluenza Virus (HPIV) (Porotto et al. 2006). Die Zellen wurden hierzu bis zu 42 h nach Transfektion mit den Peptiden inkubiert. Als Negativkontrolle dienten mit HeV G und pCAGGS als Positivkontrolle mit HeV G- und pCAGGS-HeV F-transfizierte Zellen (Abb. 29).

Abbildung 29 Inhibitorischer Effekt von Peptiden aus den Fusionsproteinen des Hendravirus und des humanen Parainfluenzavirus auf die Formation von Synzytien in transfizierten HEK293T-Zellen in 10-facher Vergrößerung; In einer Konzentration von 10 µM sind keine Synzytien erkennbar, bei einer Konzentration von 0,1 µM sind bereits wieder kleine Synzytien erkennbar, wobei diese beim Peptid aus dem Hendravirus (HeV) ausgeprägter sind als beim humanen Parainfluenzavirus (HPIV).

13.2 Luziferaseassay

Um einen quantitativen Test zur Messung der Synzytienformation zu etablieren, wurden zunächst bekannte Komponenten eingesetzt. Die oben beschriebenen Peptide dienten hierbei als positive, d.h. vollständig die Synzytienbildung inhibierende Kontrolle und wurden daher

in einer Konzentration von 10 µM eingesetzt. Zum anderen wurde der Aktivator der Reporter-Luziferase, das Plasmid zur Expression des UL 46 des Pseudorabiesvirus, in einem weiteren Kontrollansatz weggelassen. Da gerade kleinere Synzytien, wie sie beim Einsatz der Peptide (s.o.) auftreten können, lichtmikroskopisch schwer erkennbar sind, wurden Kontrollaufnahmen am konfokalen Mikroskop wie im Absatz 6.2 (Indirekte Immunfluoreszenz) beschrieben, durchgeführt. Hierbei bestätigte sich die Abwesenheit von Synzytien in den durch Peptide fusionsinhibierten Zellpopulationen im Gegensatz zu den nicht inhibierten Populationen. In dieser Positivkontrolle zeigten sich überdies wie erwartet Fusionen der Populationen „Jäger“ und „Beute“ sowie auch Fusionen innerhalb der Population „Jäger“, welche lediglich eine grüne Fluoreszenz für das Matrixprotein aufwiesen (Abb. 30).

Abbildung 30 (A-D) Immunfluoreszenz-Darstellung der durch Peptide gehemmten Fusion im Luziferaseassay, Fluoreszenz für das Matrixprotein des Hendravirus grün, für den UL46 des Pseudorabiesvirus rot; (A) Positivkontrolle mit ungehemmter Synzytiumsformation; (B) Negativkontrolle mit ausbleibender

Synzytiumsformation durch das Fehlen des Fusionsproteins im Transfektionsansatz; (C) Fusionsinhibition durch das Hendravirus-Peptid; (D) Fusionsinhibition durch das Peptid des humanen Parainfluenzavirus;

Zum besseren Vergleich der Luziferaseaktivität in der Positivkontrolle zu der in den verschiedenen Negativkontrollen wurde die Reaktion zu unterschiedlichen Zeitpunkten gestoppt, um den zeitlichen Verlauf der Luziferaseaktivität darzustellen und so ggf. den Zeitpunkt des Expressionsoptimums zu ermitteln. Zur Messung von vier Zeitpunkten wurden

die Zellen so im Vierfachansatz transfiziert, gemischt und in neue Kulturschalen ausgesät, um möglichst gleiche Ausgangspopulationen zu erhalten. Durch Variationen in Zellwachstum sowie Transfektions- und Expressionseffizienz waren die Werte der einzelnen Versuchsdurchläufe nicht mittelbar und mussten daher einzeln betrachtet werden. So wurde der Verlauf der Messwerte und das Verhältnis der Messwerte zueinander beurteilt.

Im Messansatz mit allen Transfektions-Kombinationen und Parallelansätzen zur Darstellung des zeitlichen Expressionsverlaufs wurde zur Reduktion der erforderlichen Ansätze lediglich das Peptid des humanen Parainfluenzavirus als Inhibitor eingesetzt. Hier ergaben sich deutlich höhere Messwerte der Reporter-Luziferase für die Positivkontrolle sowie geringere Werte für die Ansätze ohne das Matrixprotein. Die niedrigsten Werte wurden in den inhibierten Kontrollansätzen und denen ohne UL 46 gemessen (Abb. 31).

Abbildung 31 Zeitlicher Verlauf der Expression der Reporter-Luziferase (Renilla)

Der höchste Messwert für die der Reporter-Luziferase (Renilla) in der Positivkontrolle wurde in diesem Ansatz nach 48 Stunden erreicht. Der gemessene Wert der Renilla-Luziferase lag mit 133.502 RLU/s 21,2-fach über dem Wert der Kontrolle ohne das Fusionsprotein (6.283

0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000

12h 24h 36h 48h

RLU/s

Zeitpunkt post Transfektion

Reporter (Renilla)

Positivkontrolle ohne HeV M HPIV Peptid 10µM ohne UL 46 ohne HeV F

RLU/s), 5,9-fach über dem Wert der Kontrolle ohne UL46 (22.808 RLU/s) und 1,8-fach über dem Wert der Zellpopulation ohne das Matrixprotein (74.557 RLU/s).

Diese Werte müssen jedoch im Zusammenspiel mit denen der internen Kontrolle betrachtet werden, wobei möglichst ähnliche Verläufe in allen Zellpopulationen erwartet wurden. Die Werte der internen Kontrolle in der Zellpopulation ohne UL46 bleiben dabei jedoch zu allen vier Zeitpunkten unter den Werten der anderen Zellpopulationen (Abb. 32).

Abbildung 32Zeitlicher Verlauf der Expression der Kontroll-Luziferase (Firefly)

Um den beobachteten Effekt einer reduzierten Expression der internen Kontrolle (Firefly-Luziferase) der Zellpopulation ohne UL 46 (Neg K) im Vergleich zur Positivkontrolle zu bestätigen, wurden weitere Versuchsansätze unter Verwendung von Positiv- und Negativkontrollen (Ansatz ohne UL 46) durchgeführt, wobei der beschriebene Effekt reproduziert wurde (Abb. 33)

0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000

12h 24h 36h 48h

Interne Kontrolle (Firefly)

Positivkontrolle ohne HeV M HPIV Peptid 10µM ohne UL 46 ohne HeV F

Abbildung 33 Wiederholungsexperiment zur unterschiedlichen Expression der internen Kontrolle (Firefly)

In einem weiteren Ansatz wurde der zeitliche Verlauf der Luziferase-Expression in Zellpopulationen untersucht, die in Zellzahlen im Verhältnis 1:1 und 1:2 zur Ausgangszellzahl ausgesät wurden, um unterschiedliche Zellwachstumsbedingungen zu erhalten. Überdies wurde die Inkubationszeit auf 63 h verlängert (Abb. 34).

Abbildung 34 Verlängerung der Zeitachse und Vergleich einer unterschiedlichen Ausgangszellzahl 0

Auch hier zeigten sich niedrigere Werte für die Expression der internen Kontrolle in der Zellpopulation ohne UL46.

Zudem wurden die Positiv- und Negativkontrollen nochmals in drei Parallelansätzen zu zwei Zeitpunkten gemessen, um eine Abweichung eines einzelnen Wertes ausschließen zu können (Abb. 35).

Abbildung 35Luziferase-Expression in Paralellansätzen (1-3) zu zwei verschiedenen Messzeitpunkten

In allen Versuchsansätzen konnte somit ein verminderter Nachweis der internen Kontrolle in den Zellpopulationen ohne UL 46 gezeigt werden.

0

V Diskussion

1 Bedeutung viraler Nukleinsäuresequenzen und deren Prävalenzen in Feldproben europäischer Fledermausarten

Ziel der Untersuchungen war es einerseits zu bestimmen, ob mitteleuropäische Fledermäuse neben den bereits bekannten Fledermaus-assoziierten Lyssaviren weitere Viren mit zoonotischem bzw. krankmachendem Potential ausscheiden. Der Nachweis von viraler Nukleinsäure ist zwar nicht beweisend für eine tatsächliche Ausscheidung vermehrungsfähiger Viren, dennoch geben solche Ergebnisse Hinweise auf Erreger-Übertragungen innerhalb und zwischen Fledermauskolonien sowie für eine potenzielle Exposition des Menschen. Zweifelsfrei beweisend für die Ausscheidung vermehrungsfähiger Viren ist nur ein erfolgreicher Anzuchtversuch von Viren in der Zellkultur oder im embryonierten Hühnerei (siehe Kapitel 2). Ein weiteres Ziel war es, Viren mit ausreichend hoher Prävalenz und ggf. Diversität zu finden, um diese virologischen Daten mit sozioökologischen Daten zu den Tieren in der jeweiligen Fledermauskolonie zu vergleichen und so ihre Eignung für die Beurteilung sozialer Interaktionen/Übertragungen zwischen Fledermausindividuen bzw. Arten und Kolonien zu ermessen.

Bei der Beurteilung der gefundenen Sequenzen ist zu beachten, dass es sich lediglich um wenige hundert Basenpaare umfassende Sequenzabschnitte des Polymerase-Gens der untersuchten Viren handelte, deren Genom insgesamt mehrere Kilobasenpaare einnimmt. So umfasst beispielsweise das Genom des Hendravirus 18.234 Nukleotide (GeneBank Accession Nr. NC_001906.3) und dasjenige des SARS-Coronavirus sogar 29.751 Nukleotide (GeneBank Accession Nr. NC_0047183). Folglich ist es nicht möglich, eine Aussage über den Grad der Ähnlichkeit des gesamten Genoms oder zumindest größerer Genomabschnitte zu treffen. Aussagen über das biologische Verhalten der detektierten Viren sind anhand der bloßen Sequenzinformation partieller Abschnitte ebenfalls nicht möglich. Es wurden zunächst lediglich einfache distanzbasierte Dendrogramme errechnet, die in erster Linie der Orientierung dienen sollen. Die generierten Daten ermöglichen eine Kategorisierung der detektierten Viren bezüglich einer näheren Verwandtschaft zu Pathogenen sowie ihrer Eignung als biologische Marker.

1.1 Coronaviren

Bei der Analyse der Coronavirus-Sequenzen ist keine Verwandtschaft zu pathogenen zoonotischen Taxonen wie dem SARS-Coronavirus oder dem MERS-Coronavirus erkennbar.

Es besteht auch keine Verwandtschaft zu Fledermaus-assoziierten Viren wie dem Bat coronavirus HKU4 oder dem Bat coronavirus HKU5, die sich wie das SARS- und MERS-Coronavirus den ß-Coronaviren zuordnen lassen (Woo et al. 2006) und als Verwandte des MERS-Coronavirus diskutiert wurden (Lau et al. 2013). Die generierten Sequenzen clustern

Es besteht auch keine Verwandtschaft zu Fledermaus-assoziierten Viren wie dem Bat coronavirus HKU4 oder dem Bat coronavirus HKU5, die sich wie das SARS- und MERS-Coronavirus den ß-Coronaviren zuordnen lassen (Woo et al. 2006) und als Verwandte des MERS-Coronavirus diskutiert wurden (Lau et al. 2013). Die generierten Sequenzen clustern

Im Dokument Untersuchungen zum Vorkommen von Fledermaus-assoziierten Virusinfektionen in Deutschland und zur Diagnostik und molekularen Pathogenese Flughund-assoziierter zoonotischer Paramyxoviren (Seite 93-0)