Tierärztliche Hochschule Hannover
Ultrastrukturelle Untersuchungen an zilierten Zellen
im Respirationstrakt von Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus) mit und ohne Lungenerkrankungen
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einerDOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Rebecca Marie Hoffmann Bremerhaven
Hannover 2011
Bibliografische Information der Deutschen Bibliothek
Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie;
detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. F.-J. Kaup
Deutsches Primatenzentrum Göttingen, Abteilung Infektionspathologie
1.Gutachter: Univ.-Prof. Dr. F.-J. Kaup
Tierärztliche Hochschule Hannover, Deutsches Primatenzentrum Göttingen 2.Gutachter: Univ.-Prof. B. Ohnesorge
Tierärztliche Hochschule Hannover, Klinik für Pferde Tag der mündlichen Prüfung: 17.11.2011
Hoffmann, Rebecca Marie:
Ultrastrukturelle Untersuchungen an zilierten Zellen im Respirationstrakt von Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus) mit und ohne Lungenerkrankungen
ISBN 978-3-941274-93-8 Alle Rechte vorbehalten 1. Auflage 2011, Göttingen
© Optimus Verlag
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© Coverfoto: Eye of Science GbR URL: http://www.eyeofscience.com/
Printed in Germany
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Mikroverfilmungen und die Einspeicherung und Verarbeitung in elektronischen Systemen.
Die Affen hier schulden uns nichts, aber wir ihnen alles.
J. Mahoney, Tuxedo, N.Y., 1995
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG ... 1
2. LITERATURÜBERSICHT ... 3
2.1. Der Weißbüschelaffe (Callithrix jacchus) ... 3
2.1.1. Systematik und Vorkommen ... 3
2.1.2. Weißbüschelaffen in der biomedizinischen Forschung ... 3
2.2. Epithelzellen des Respirationstraktes ... 5
2.2.1. Zilierte Zellen des Respirationstraktes ... 5
2.2.2. Morphologie der zilierten Zellen ... 6
2.2.3. Verteilung der zilierten Zellen im Respirationstrakt ... 6
2.2.4. Ultrastruktur der Zilien ... 8
2.2.5. Funktion und Bewegungsmechanismus der Zilien ... 11
2.2.6. Ziliogenese ... 12
2.2.7. Pathologische Veränderungen der Zilien ... 13
2.2.7.1. Kongenitale Defekte der ziliären Struktur ... 13
2.2.7.2. Sekundäre, erworbene Defekte der ziliären Struktur ... 15
3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN ... 21
3.1. Material und Methoden ... 21
3.1.1. Tiermaterial und Haltungsbedingungen ... 21
3.1.2. Sektion und Probengewinnung ... 21
3.1.3. Gewebepräparation ... 22
3.1.4. Elektronenmikroskopische Präparation ... 23
INHALTSVERZEICHNIS
3.1.4.1. Transmissionselektronenmikroskopische Präparation ... 23
3.1.4.2. Rasterelektronenmikroskopische Präparation ... 24
3.1.5. Histologische Präparation ... 24
3.1.6. Morphologische Auswertungen ... 25
3.1.6.1. Lichtmikroskopie ... 25
3.1.6.2. Transmissionselektronenmikroskopie ... 26
3.1.6.3. Rasterelektronenmikroskopie ... 26
3.1.7. Statistik ... 26
4. ERGEBNISSE ... 29
4.1. Lichtmikroskopie ... 29
4.2. Elektronenmikroskopie ... 32
4.2.1. Ultrastruktur der zilierten Zellen beim Weißbüschelaffen ... 32
4.2.2. Ultrastrukturelle Veränderungen der zilierten Zellen beim Weißbüschelaffen ... 34
4.2.3. Statistische Auswertungen zum Auftreten ziliärer Veränderungen ... 35
4.3. Verteilung der zilierten Zellen in der Trachea beim Weißbüschelaffen ... 52
5. DISKUSSION ... 57
6. ZUSAMMENFASSUNG ... 67
7. SUMMARY ... 69
8. LITERATURVERZEICHNIS ... 71
9. ANHANG ... 85
9.1. Anhangstabellen ... 85
9.1.1. Tiermaterial ... 85
INHALTSVERZEICHNIS
9.2. Statistische Auswertungen ... 86
9.2.1. Tabellen der ultrastrukturellen Auszählungen ... 86
9.2.2. SPSS-Auswertungen... 91
9.2.3. SAS-Auswertungen ... 98
9.3. Protokolle für die Histologie ... 99
9.3.1. Paraffin-Einbettungsprotokoll ... 99
9.3.2. Phosphatpuffer ... 99
9.3.3. Fixierlösungen ... 100
9.3.4. Histologische Färbungen an Paraffinschnitten ... 101
9.3.5. Hämalaun und Eosin-Färbung ... 101
9.4. Protokolle für die Transmissionselektronenmikroskopie ... 102
9.4.1. Eponmischung nach LUFT (1961) ... 102
9.4.2. Eponeinbettung ... 102
9.4.3. Methylenblaufärbung nach RICHARDSON et al. (1960) ... 103
9.5. Göttinger Mischung 2 ... 103
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
Abb. Abbildung
Aqua bidest. doppelt destilliertes Wasser Aqua dest. destilliertes Wasser
Aqua ad injectionem Wasser für Injektionszwecke ATPase Adenosintriphosphatase
ATP Adenosintriphosphat
BAL Bronchoalveoläre Lavage
bzw. beziehungsweise
C. adh Compound Cilia vom “adhesive type”
cAMP Cyclisches Adenosinmonophosphat C. bulg Compound Cilia vom “bulging type”
cGMP Cyclisches Guanosinmonophosphat
ciltail Ciliary tail
COPD “chronic obstructive pulmonary disease“
DPZ Deutsches Primatenzentrum
Dys Dysorientierung der mikrotubulären Struktur
EM Elektronenmikroskopie
et al. und Mitarbeiter
EV Elektronenmikroskopischer Vergrößerungsfaktor
Extratub Extratubuli
ExM Extramatrix
Geschl. Geschlecht
ggr. geringgradig
Gr. Gruppe
GS Gesundheitsstatus
HB Hauptbronchus
H.E. Hämalaun-Eosin-Färbung
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
hgr. hochgradig
Hyp-Mutation „hydrocephalic-polydactyl“-Mutation
ICS „immotile cilia syndrome“
J. Jahre
k. A. keine Angabe
KGW Körpergewicht
L Lunge
LPS Lipopolysaccharide
M. Monate
mgr. mittelgradig
ml Milliliter
mm/min Millimeter/Minute
o.b.B. ohne besonderen Befund
PCLS “Precision Cut Lung Slices“
REM Rasterelektronenmikroskopie
Tab. Tabelle
TEM Transmissionselektronenmikroskopie
T Trachea
TT Trächtigkeitstag
TNF-alpha Tumornekrosefaktor-alpha
Veränd. Veränderungen
W. Wochen
ZV Zilienveränderungen
1 EINLEITUNG
Seit geraumer Zeit ist bekannt, dass die zilierten Zellen im Respirationstrakt eine wichtige Rolle bei dem Schutz der Atemwege spielen. Aus diesem Grund wurden umfangreiche Untersuchungen zur Analyse und Charakterisierung der Funktion und Morphologie des zilierten Epithels durchgeführt. Vor allem seit der Einführung der Elektronenmikroskopie ist das mukoziliäre System Gegenstand zahlreicher Untersuchungen und Publikationen. Bei Defekten des Flimmerepithels kommt es zu einer Einschränkung der mukoziliären Clearance und damit zu einer Sekretretention.
Solche Ziliendefekte können autosomal-rezessiv vererbt werden und damit von Geburt an vorhanden sein. Darüber hinaus können diverse Noxen zu einer sekundären, erworbenen Ziliendyskinesie führen. Sekundäre Veränderungen der Zilien sind auch im Respirationstrakt gesunder Menschen und Tiere beschrieben.
In dieser Arbeit wurden die Zahl und die Morphologie der Zilien und Zilienveränderungen von 32 Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus) unterschiedlicher Altersstufen transmissionselektronenmikroskopisch untersucht. Da Marmosets in Gefangenschaftshaltung vermehrt an chronischen Atemwegserkrankungen in Form von interstitiellen Pneumonien leiden, sollte weiterhin geklärt werden, inwieweit diese auch vermehrt mit ultrastrukturellen Veränderungen an den Zilien des Respirationsepithels einhergehen. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Beantwortung der Frage, ob und wenn ja, welche Veränderungen der Zilien des respiratorischen Epithels auftreten.
Hintergrund ist die Tatsache, dass Weißbüschelaffen in der COPD/Asthma-Forschung als Tiermodelle für chronische Atemwegserkrankungen des Menschen eingesetzt werden. Dabei ist denkbar, dass im Rahmen derartiger Untersuchungen auch Biopsien mit ultrastruktureller Auswertung notwendig sind. Damit tragen die Ergebnisse dieser Arbeit zur Validierung dieses Tiermodells, zur Generierung von Referenzdaten und zur Vermeidung von Fehlinterpretationen, insbesondere in Bezug auf sekundäre Veränderungen der Zilien, bei.
2 LITERATURÜBERSICHT
2.1 Der Weißbüschelaffe (Callithrix jacchus)
2.1.1 Systematik und VorkommenDer Weißbüschelaffe, Callithrix jacchus, gehört als Vertreter der Familie der Krallenaffen (Callitrichidae) zu den vom amerikanischen Kontinent stammenden Neuweltaffen (Platyrrhini). Die Krallenaffen zeichnen sich durch die typische namensgebende Ausbildung von Krallen an allen Zehen mit Ausnahme der Großzehe aus (WOLTERS u. IMMELMANN 1988) und werden in sechs Gattungen unterteilt (NEUSSER et al. 2001). Unter dem Begriff der Marmosetten (französisch
„marmouset“, Knirps/Zwerg) werden die Gattungen Cebuella, Mico und Callithrix zusammengefasst, wobei der Weißbüschelaffe der letztgenannten Gattung angehört.
Alle drei nah miteinander verwandten Gattungen nagen zur Aufnahme zähflüssigen Baumsaftes kleine Löcher in die Baumrinde und zeichnen sich deshalb durch eine besondere Gebissform aus. Sie besitzen vergrößerte Incisivi und verkürzte Canini, so dass alle Zähne im Vordergebiss etwa gleich hoch sind (GEISSMANN 2003).
Das äußere Erscheinungsbild des Weißbüschelaffen wird durch die typischen abstehenden weißen Ohrbüschel und den weißen Stirnfleck geprägt. Das graubraune Rückenfell zeigt eine helle Querbänderung, die sich vor allem im Schwanzbereich sehr deutlich zeigt (WOLTERS u. IMMELMANN 1988). Die Körpergröße eines ausgewachsenen Weißbüschelaffen liegt bei durchschnittlich 25 cm bei einem Gewicht von 300 - 450 Gramm und die Schwanzlänge beträgt durchschnittlich 28 cm.
Der Callithrix jacchus zeigt keinen deutlichen Geschlechtsdimorphismus bezüglich Gewicht, Größe oder Erscheinungsbild (RICHTER 1984).
Weißbüschelaffen sind ursprünglich im äußersten Nordosten Brasiliens beheimatet und wurden von dort aus durch den Menschen in die atlantischen Regenwälder im Südosten Brasiliens gebracht. Aufgrund ihrer hohen Anfassungsfähigkeit gehören die Weißbüschelaffen, trotz fortschreitender Zerstörung ihres Habitats, zu den wenigen nicht vom Aussterben bedrohten Krallenaffenarten (WOLTERS u. IMMELMANN 1988).
2.1.2 Weißbüschelaffen in der biomedizinischen Forschung
Im letzten Jahrzehnt wurden die Weißbüschelaffen weltweit als Labortiere etabliert.
Die Vorteile dieser Primatenspezies liegen in ihrer hohen Anpassungsfähigkeit, dem
LITERATURÜBERSICHT
niedrigen zoonotischen Potential ihres Erregerspektrums, einer wenig kostenintensiven Haltung im Vergleich zu anderen nicht-humanen Primaten und der hohen Reproduktionsrate. Eingesetzt werden die Weißbüschelaffen vor allem im Bereich der Neurowissenschaften, der Reproduktionsbiologie, der Infektionsforschung, der Verhaltensforschung und im Rahmen von Arzneimittelstudien. Mittlerweile gibt es aufgrund zahlreicher Untersuchungen umfangreiche Informationen bezüglich der Biologie und Physiologie von Weißbüschelaffen (MANSFIELD 2003).
SURRIBAS et al. veröffentlichten 1987 eine morphologische Studie zum Respirationstrakt des Callithrix jacchus. In dieser Arbeit wurde der Respirationstrakt von sieben Weißbüschelaffen morphologisch untersucht. Die Nasenhöhle ist beim Callithrix jacchus in drei Abschnitte unterteilt: den Nasenvorhof (ausgekleidet mit nichtverhorntem Plattenepithel), den respiratorischen Abschnitt (ausgekleidet mit ziliertem Epithel und Becherzellen) und die olfaktorische Region (ausgekleidet mit ziliertem Epithel ohne Becherzellen). Die Trachea enthält ein mehrreihiges, ziliertes Zylinderepithel mit sehr wenigen Becherzellen in der proximalen Region. Die rechte Lunge besteht aus drei und die linke Lunge aus zwei Lappen, die nicht in Läppchen unterteilt werden. Das Epithel besteht, ebenso wie bei anderen Säugern, aus mehrreihigem Flimmerepithel, und die knorpeligen Anteile der luftführenden Wege setzen sich, im Gegensatz zu anderen Säugetieren, bis in die respiratorischen Bronchiolen und Alveolargänge fort (SURRIBAS u. LAWZEWITSCH 1987).
In der Abteilung Infektionspathologie des Deutschen Primatenzentrums (DPZ) beschäftigt sich die „Arbeitsgruppe Respirationskrankheiten“ mit der weiterführenden morphologischen Charakterisierung des Atmungsapparates von Weißbüschelaffen. Die ultrastrukturelle Untersuchung der zilierten Zellen des Atmungstraktes von gesunden und kranken Tieren ist Teil dieses Projektes. Zusammen mit dem Fraunhofer Institut für Toxikologie und Experimentelle Medizin (ITEM) Hannover und der Abteilung Klinische Neurobiologie des Deutschen Primatenzentrums Göttingen wird die Etablierung des Weißbüschelaffen als Tiermodell für COPD/Asthma des Menschen angestrebt. An „Precision Cut Lung Slices“ (PCLS) und nach intrabronchialer in vivo Stimulation werden die Auswirkungen von Lipopolysacchariden (LPS) auf die Zytokinsekretion und TNF-alpha Freisetzung unter unterschiedlichern Bedingungen gemessen. Die ersten Ergebnisse zeigen, dass das Lungengewebe von Marmosets größere Ähnlichkeit zum humanen Gewebe als das von anderen Labortieren zeigt und bei einer Dexamethason-Behandlung im Reaktionsmuster dem vom humanen PCLS entspricht (LAUENSTEIN et al. 2011).
Bronchokonstriktion stellt ein charakteristisches Symptom einer Vielzahl von chronisch obstruktiven pulmonären Erkrankungen, wie zum Beispiel der COPD, dar.
LITERATURÜBERSICHT
PCLS eignen sich gut, um die physiologischen Mechanismen der Bronchokonstriktion bei verschiedenen Spezies ex vivo darzustellen. SEEHASE et al. (2011) etablierten dieses ex vivo Modell für nicht-humane Primaten. Es konnte gezeigt werden, dass die Lunge vom Marmoset in Bezug auf die Bronchokonstriktion eine größere Ähnlichkeit zum humanen Gewebe zeigt als die Lunge von anderen Labortieren (SEEHASE et al.
2011).
2.2 Epithelzellen des Respirationstraktes
Das Flimmerepithel im Atmungstrakt von Säugetieren besteht aus verschiedenen Zelltypen. Neben den nicht-zilierten, sekretorischen Zellen, die in erster Linie für die Sekretion von Bestandteilen der Mukusschicht verantwortlich sind, nehmen die zilierten Zellen der oberen Luftwege eine wichtige Funktion im Rahmen des mukoziliären Clearance-Mechanismus ein. Zu den wichtigsten nicht-zilierten Zellen des Atmungstraktes gehören die Becherzellen, die einen viskösen Schleim produzieren, die Clara-Zellen, die vor allem Surfactant-Proteine sezernieren, die Basalzellen, die als pluripotente Stammzellen dienen, die neuroendokrinen Zellen, die VIP (vasoaktives intestinales Peptid), Bombesin, Serotonin und andere Botenstoffe sezernieren, und die Bürstenzellen, die basal mit Axonen assoziiert sind und Sinneszellen darstellen (TOMASHEFSKI u. FARVER 2008).
Beim Menschen existieren in der Umgebung einer mukus-produzierenden Zelle durchschnittlich fünf zilierte Zellen (ENGSTROM 1951; RHODIN 1966).
2.2.1 Zilierte Zellen des Respirationstraktes
Bei höher entwickelten Tierarten wie den Säugetieren kommen zilierte Zellen in verschiedenen Epitheltypen vor. Zu finden sind sie in der Nasenschleimhaut (mit Ausnahme der Regio olfactoria und der vorderen Nasenabschnitte), dem Tracheobronchialsystem, der Eustachischen Röhre, den Ependymzellen des zentralen Nervensystems, der Tuba uterina, der Retina, den Ductuli efferentes des Nebenhodens sowie modifiziert als Spermienschwanz (AFZELIUS 1976b).
Große Areale des Respirationstraktes sind mit ziliertem Epithel bedeckt. Nach Literaturangaben bedeckt dieses Epithel ca. 0,5 m² des humanen Atmungstraktes. Da sich auf 1 µm² ungefähr sechs Zilien befinden, beträgt die Gesamtzahl der Zilien im menschlichen Körper etwa 3 × 10 ¹² (AFZELIUS 1982; NÜßLEIN 2001).
Nach OHASHI und NAKAI (1983) werden aufgrund der unterschiedlichen Elektronendichte des Zytoplasmas zwei Typen der zilierten Zellen beschrieben. Zellen mit wenig elektronendichtem Zytoplasma werden als „clear ciliated cells“
angesprochen, während Zellen mit viel elektronendichtem Zytoplasma als „dark
LITERATURÜBERSICHT
ciliated cells“ bezeichnet werden. Während bei den „dark ciliated cells“
Ansammlungen von Mitochondrien im oberen Teil des Nukleus vorzufinden sind, findet man sie im oberen Teil des Nukleus der „clear ciliated cells“ nur selten. In diesen „clear ciliated cells“ sind die Mitochondrien eher in dem elektronendichten Zytoplasma konzentriert. Generell werden die „clear ciliated cells“ bei pathologischen Störungen, wie zum Beispiel chronischen Entzündungen, als erstes beschädigt.
2.2.2 Morphologie der zilierten Zellen
Morphologisch unterscheiden sich die zilierten Zellen des Atmungstraktes bei verschiedenen Säugetier-Spezies nur unwesentlich (KAUP et al. 1990). Im Allgemeinen erstrecken sich die zilierten Zellen von der Basalmembran bis zur luminalen Oberfläche des Epithels. Sie sind im Querschnitt polygonal, von der Basalmembran bis zur luminalen Oberfläche 20 µm hoch und in der Breite 7 µm lang.
Im basalen Bereich verjüngen sie sich auf 2 µm. Das im Vergleich zur nicht-zilierten Zelle helle Zytoplasma beinhaltet vereinzelt Ribosomen und kleine Anteile des granulären endoplasmatischen Retikulums. Die Zellkerne zeigen eine ovale Form und befinden sich im basalen, teils auch im mittleren Drittel der Zellen. Der apikale Teil der Zelle beinhaltet gelegentlich umfangreiche Ansammlungen an glattem endoplasmatischen Retikulum. In diesem Areal befinden sich auch immer zahlreiche Mitochondrien, die länglich sind und Verbindung zu anderen Mitochondrien aufnehmen. Diese Organellen tauchen auch in anderen Arealen der zilierten Zellen auf, jedoch nicht so zahlreich wie in der apikalen Region. Neben diesen Zellorganellen befinden sich außerdem noch eine große Zahl Lysosomen in den zilierten Zellen.
Diese Strukturen stellen membrangebundene Granula mit einem ausgesprochen pleomorphen inneren Membransystem dar (RHODIN 1966; FRASCA et al. 1968;
PAVELKA et al. 1976; BREEZE u. WHEELDON 1977).
Die zilierten Zellen sind an der seitlichen Oberfläche durch „tight junctions“, an der lateral parazellulären und im Basalbereich durch Desmosomen mit benachbarten Zellen verbunden (FRASCA et al. 1968). Die luminale Seite der zilierten Zelle ist mit durchschnittlich 100 - 200 Zilien (Durchmesser 0,25 µm, Länge 5 - 7 µm) versehen.
Zusätzlich ragen zwischen den Zilien Mikrovilli in unterschiedlicher Länge über die Oberfläche hinaus (RHODIN 1966; PAVELKA et al. 1976).
2.2.3 Verteilung der zilierten Zellen im Respirationstrakt
Der Atmungstrakt wird vorwiegend von einem respiratorischen Epithel ausgekleidet.
Dieses Epithel kleidet die Atemwege, mit Ausnahme von Teilen des Pharynx und des Larynx, von der Nasenhöhle bis zu den Bronchiolen aus. Es wird von einem mehrreihigen, hochprismatischen Epithel gebildet, welches von den zilierten und den
LITERATURÜBERSICHT
nicht-zilierten Zellen des Atmungstraktes gebildet wird. Die Verteilung der verschiedenen Zelltypen des respiratorischen Epithels ist sehr unterschiedlich innerhalb des Respirationstrakts. Für die Trachea des Menschen konnte gezeigt werden, dass das gesamte tracheale respiratorische Epithel eine gleichmäßige Dichte zilierter Zellen trägt (SOROKIN 1988; LEE 1991; BLOOM 1994; JUNQUEIRA et al.
1998).
Im subglottischen Bereich des Kehlkopfes wird das mehrschichtige Plattenepithel, das die Stimmbänder bedeckt, eine kurze Strecke unterhalb des Stimmbandrandes in ein mehrschichtiges, zilienloses Epithel umgewandelt. Diese zilienlosen Zellen werden als Übergangszellen bezeichnet. Die hexagonale Oberfläche dieser Übergangszellen ist von kurzen Mikrovilli bedeckt. Zwischen diesen hexagonalen Zellen findet man verstreut Flimmerepithelzellen der trachealen Schleimhaut (FUJITA et al. 1986).
Um die physiologische Verteilung der zilierten Zellen in der Trachea der Ratte zu ermitteln, untersuchten OLIVEIRA et al. (2003) mittels Rasterelektronenmikroskopie die gesamte innere Oberfläche der zervikalen Trachea zehn gesunder subadulter und adulter Ratten (Alter zwischen drei und zehn Monaten). Hierbei wurde festgestellt, dass die zilierten Zellen nicht gleichmäßig im respiratorischen Epithel der Trachea verteilt waren. In hoher Dichte konnten sie im Bereich des Trachealbandes (Ligamentum annulare tracheae) nachgewiesen werden, während im Bereich der Knorpelspangen (Cartilago trachealis) eine signifikant geringere Dichte der zilierten Zellen zu finden war. In diesem Bereich dominierten nicht-zilierte Zellen, die von den Autoren als seröse Zellen bezeichnet wurden. Die Autoren schlussfolgerten daraus, dass die lokalisierte hohe Dichte der zilierten Zellen im Bereich des Trachealbandes mit Bereichen partieller Clearance der Atemwege korrespondiert. Unter den verschiedenen Tieren konnten keine signifikanten Unterschiede in der Verteilung der Zellen festgestellt werden, so dass angenommen wurde, dass das Alter keinen Einfluss auf die lokalisierte Verteilung der zilierten Zellen hatte.
Eine von ALEXANDER et al. (1975) durchgeführte Studie erzielte ähnliche Ergebnisse. Hierfür wurde die Trachea von zwei fünf Monate alten Ratten rasterelektronenmikroskopisch untersucht. Es konnten sowohl Bereiche hoher Ziliendichte gefunden werden als auch Bereiche, in denen zilierte Zellen komplett fehlten. In diesen Arealen, wie auch von OLIVEIRA et al. (2003) beschrieben, dominierten mikrovillitragende Zellen. Eine Zuordnung dieser Verteilung zu den spezifischen Bereichen der Trachea (Pars cartilaginea, Pars membranacea) erfolgte nicht.
GABRIDGE et al. (1977) untersuchten die Verteilung der zilierten Zellen in der Trachea von gesunden, adulten Hamstern. Sie zeigten, dass auch bei dieser Labortier-
LITERATURÜBERSICHT
Spezies die zilierten Zellen in verschiedenen Regionen in unterschiedlicher Dichte vorhanden waren. So konnten Areale dargestellt werden, in denen die zilierten Zellen als der dominierende Zelltyp zu finden waren und ebenso große nicht-zilierte Areale.
In diesen Regionen waren hunderte Mikrovilli an der Zelloberfläche sichtbar. An einigen Zellen konnten Überreste von Zilien festgestellt werden, die die Autoren als Zellen, die sich in einem Differenzierungsgrad zur zilierten Zelle befanden, interpretierte. Diese morphologische Anordnung, in der große Areale des respiratorischen Epithels in der Trachea nicht von zilierten Zellen gebildet werden, wird bei anderen Säugetieren nicht beschrieben. Untersuchungen der Trachea von Maus, Katze und auch Ratte ergaben ein homogeneres Verteilungsmuster der zilierten Zellen (GABRIDGE et al. 1977). Allerdings wurde diese Aussage, bezogen auf die Verteilung der zilierten Zellen in der Trachea der Ratte, durch die eingehenden Untersuchungen von OLIVEIRA et al. (2003) widerlegt.
Ultrastrukturelle Untersuchungen des Atemwegepithels der etruskischen Spitzmaus (Suncus etruscus) zeigten, dass auch bei dieser Spezies die Verteilung der zilierten Zellen in der Trachea regional unterschiedlich waren. Im Bereich über dem dorsal gelegenen Musculus trachealis, entsprechend der Pars membranacea, kamen relativ mehr zilierte Zellen als nicht-zilierte Zellen vor, während in der Pars cartilaginea die nicht-zilierten Zellen überwogen (HATZ 2005).
2.2.4 Ultrastruktur der Zilien
Die respiratorischen Flimmerhaare sind aktiv bewegliche Zellfortsätze, die als lange, kräftige und fingerförmige Ausstülpungen an der Oberfläche von Epithelien vorkommen können. Somit stellt das Zilium eine Erweiterung der freien Zelloberfläche dar. Zilien weisen ultrastrukturell ein klassisches Organisationsmuster auf, welches sich als ein sogenanntes 9×2+2-Mikrotubuli-Muster darstellt, wobei ein zentrales Mikrotubuli-Paar von neun separaten Mikrotubuli-Duplets umgeben ist (Abb. 1) (NÜßLEIN et al. 2001; DAVENPORT u. YODER 2005).
Jedes Zilium entspringt aus einem Basalkörper (Kinetosom), das nahe der Zelloberfläche gelegen ist, enthält neun randständig gelegene Mikrotubuli-Triplets ohne zentrales Mikrotubuli-Paar (9×3-Anordnung) und ist damit ähnlich wie ein Zentriol aufgebaut. An der Zilienbasis befinden sich demzufolge neun „triplets“, während sich die neun „doublets“ des Zilienschaftes im Bereich der Zilienspitze auf neun „singlets“ reduzieren. Die zwei Zentraltubuli reduzieren sich zur Zilienspitze hin ebenfalls auf einen zentralen Tubulus (Abb. 2). Nach basal setzt sich der Basalkörper in periodisch quergestreifte Wurzelfüßchen fort (KAUP et al. 1990; SATIR u.
CHRISTENSEN 2007).
LITERATURÜBERSICHT
Die Mikrotubuli, die das 9+2-Muster bilden, werden in erster Linie aus α- und β- Heterodimeren gebildet. Das große α-Tubulin der Säugetierzilien besteht aus dem Isotyp 4, und an jedem dieser Tubuli befindet sich ein Paar armartiger Strukturen, die so genannten Dynein-Arme, die zum β-Tubulin des benachbarten Dupletts hinzeigen.
Die im Kreis angeordneten 9 Dupletts sind durch Nexinbindeglieder miteinander und durch so genannte Radialspeichen direkt mit den zwei Zentraltubuli verbunden (NÜßLEIN 2001). Neben diesen freibeweglichen 9+2-Zilien existieren außerdem Zilien nach dem sogenannten 9+0-Muster, bei denen das zentrale Mikrotubuli-Paar fehlt. Diesen Flimmerhaaren fehlen außerdem meist die Dynein-Arme, die den molekularen Motor darstellen und damit für die ziliäre Bewegung verantwortlich sind.
Diese Zilien sind somit nicht frei beweglich und werden auch als primäre Zilien bezeichnet. Während epitheliale Zellen mehrere hundert 9+2 Zilien aufweisen, lassen sich nur vereinzelt 9+0-Zilien finden (SALATHE 2007).
Abb. 1: Querschnitt durch eine Zilie (modifiziert nach NÜßLEIN et al. 2001).
LITERATURÜBERSICHT
Abb. 2: Schematischer Aufbau einer Zilie mit unterschiedlicher Ultrastruktur in den verschiedenen Querschnittsebenen (KAUP et al. 1990).
LITERATURÜBERSICHT
2.2.5 Funktion und Bewegungsmechanismus der Zilien
Die Hauptaufgabe der zilierten Zellen in der respiratorischen Mukosa besteht darin, Fremdpartikel/-organismen über den mukoziliären Clearance-Mechanismus zu entfernen. Im menschlichen Tracheobronchialbaum liegt die Schlagfrequenz der Zilien bei 15 bis 20 Zyklen pro Sekunde (AFZELIUS u. MOSSBERG 1980).
Schleimüberzogene ziliäre Systeme setzen sich aus drei Schichten zusammen. Eine epitheliale Schicht wird durch die ziliären Zellen gebildet. Periziliäre Flüssigkeit mit geringer Viskosität, welche die Zilien umgibt, stellt die zweite Schicht dar, und als dritte Schicht fungiert der oberflächliche Schleimfilm, der durch die Zilien angetrieben wird. Flimmer- und schleimbildende Zellen stellen ein aufeinander abgestimmtes funktionelles System dar. Täglich werden etwa 100 ml Schleim (zu 90 % von den submukösen Schleimdrüsen) hergestellt, der sich filmartig, in eine äußere Gel- und eine innere Solphase geschichtet, über das respiratorische Epithel ausbreitet. Die Zilien tauchen in diese Schleimdecke ein und führen im Mittel mit einer Rate von 20 Hertz einen immer wiederkehrenden Bewegungsablauf aus, der mit dem „Peitschenschlag eines Kutschers“ verglichen wird. Nach einer langsamen, in der Solphase verlaufenden Rückwärtsbewegung in gekrümmtem Zustand richtet sich die Zilie auf, greift mit ihrem hakenförmig gestalteten Ende in die Gelschicht und bewegt diese im gestreckten Zustand nach proximal oralwärts, um dann wieder in eine Rückwärtsbewegung überzugehen. Der auf diese Weise bewegte Schleimstrom beträgt im Mittel 2,5 mm/min. Er entfernt impaktierte Staubpartikel, Fasern und Bakterien, die bronchiale Entzündungsvorgänge auslösen können, und trägt dazu bei, die Physiologie der Atemwegsdynamik zu erhalten. In dieser Abwehrfunktion wird die mukoziliäre Clearance durch Alveolarmakrophagen, Surfactant-Proteine und die zahlreichen Mechanismen der sogenannten mukosa-assoziierten humoralen und zellulären Abwehr unterstützt (DRINGS et al. 2003; BRAIMAN u. PRIEL 2008).
Das respiratorische mukoziliäre Epithel ist somit ein synchronisiertes System und verfügt über höchst effektive Reinigungsmechanismen. Es nutzt Schleim als Trägerflüssigkeit, angetrieben durch schlagende Zilien, um unerwünschte eingeschlossene Partikel im Mukus vom respiratorischen System fort zu transportieren. Durch den hohen Grad an Koordination zwischen den einzelnen Zilien und durch die schnelle Reaktionsfähigkeit der Zilien auf variable Stimuli in Bezug auf die ziliäre Schlagfrequenz ist das ziliäre System in der Lage, Partikel effektiv vorwärts zu treiben. Der ziliäre Bewegungsmechanismus kann nach zwei verschiedenen Arten ablaufen: entweder mit einer niedrigen Schlagfrequenz, die nur wenig ATP und sehr wahrscheinlich auch nur den ziliären Motor benötigt, oder mit einer hohen Schlagfrequenz, bei der eine zusätzliche, bisher unbekannte Kontrolleinrichtung,
LITERATURÜBERSICHT
welche durch „second messenger“ (cAMP, cGMP) reguliert wird, beteiligt ist (MA et al. 2002; BRAIMAN u. PRIEL 2008).
Obwohl viele Autoren der Auffassung sind, dass die Verbindung der ziliären Spitze mit der Mukusschicht im Respirationstrakt entscheidend ist für die adäquate mukoziliäre Clearance, ist bis heute unklar, ob eine direkte physische Aktivität zwischen Zilie und Mukusschicht für die Beförderung des Mukus erforderlich ist.
Interessanterweise scheint die Höhe der periziliären Flüssigkeitsebene nahezu konstant bei ungefähr 7 µm zu bleiben, wenn Mukus vorhanden ist. Ein Hinzufügen von Flüssigkeit lässt zwar die Mukusschicht ansteigen, scheint aber wenig Einfluss auf das periziliäre Flüssigkeitslevel zu haben (SALATHE 2007).
2.2.6 Ziliogenese
Während der Entwicklung der Lunge bilden sich zwei unterschiedliche Arten von Zilien: rudimentäre Zilien und die Zilien des Ziliensaumes. Das rudimentäre Zilium erscheint zeitlich vor dem anderen Zilientyp und wird durch nahezu alle präsenten Zellen des respiratorischen Epithels als solitärer Fortsatz produziert, auch durch die Zellen, die in der späteren Entwicklung den Ziliensaum ausbilden. Das rudimentäre Zilium wächst unmittelbar aus einem Zentriol und scheint lediglich vorübergehend zu existieren. Da dieses Zilium ein direktes Derivat der achromatischen Zentriole darstellt und das erste aufkommende Zilium ist, wird es auch als „primär“ bezeichnet.
Demzufolge nennt man den Prozess der Formation „primäre Ziliogenese“. In einem späteren Stadium der Lungenentwicklung wird dann ein zweiter und geläufigerer Zilientyp durch die epithelialen Zellen produziert, die dazu bestimmt sind, einen Ziliensaum zu tragen. Zunächst werden zahlreiche Basalkörper (Kinetosomen) im Zytoplasma dieser Zellen sichtbar. Im Folgenden wächst dann ein langes, motiles Zilium aus jedem Basalkörper. In Studien, bei denen der Respirationstrakt von Ratten untersucht wurde, konnte festgestellt werden, dass der Ziliensaum zuerst im Epithel der Trachea und Bronchien ausgebildet wird. Dieses geschieht etwa am zwanzigsten Tag der Trächtigkeit. Bei der Entnahme von Gewebe von 15 Tage alten Feten entwickeln sich Zilien nach etwa fünf Tagen in Kultur (SOROKIN 1968).
Durch eine Studie können verschiedene Stadien der Ziliogenese durch Elektronenmikroskopie nachgewiesen werden. Bei unreifen humanen Bronchialepithelzellen liegen die Zentriolen in lateralen Regionen des apikalen Zytoplasmas. Etwa 250 µm entfernt von den jeweiligen Zentriolen liegt eine Anhäufung von fibrogranulärem Material. Dieses fibrogranuläre Material, das aus elektronendichten 50 - 100 nm großen Granula besteht, nimmt fortlaufend an Größe zu und wird zu einem charakteristischen Merkmal von apikalem und supranukleärem Zytoplasma der präzilierten und zilierten Zellen. In einem späteren Stadium sind dann
LITERATURÜBERSICHT
neben oder in den fibrogranulären Bezirken elektronendichte Strukturen, die Deuterosomen, nachweisbar. Diese Deuterosomen stellen bei der elektronenmikroskopischen Untersuchung dunkle, kugelförmige Körper ohne Membran dar, die beim Menschen 100 - 110 nm groß sind. Sie dienen als Organisationszentrum für das Wachstum von so genannten Prozentriolen, die dazu bestimmt sind, zu Kinetosomen des Ziliensaumes auszureifen. Aus diesem Basalkörper entwickeln sich schließlich die Zilien. Sie entstehen entweder direkt aus der luminalen Membran oder indirekt über ein ziliäres Vesikel, das am Ende des Basalkörpers lokalisiert ist (SOROKIN 1968).
Im Allgemeinen entsteht die Zilie erst, wenn der vollständige Reifungsprozess des Kinetosoms abgeschlossen ist. In jeder Epithelzelle sind nach dem Auftreten reifer Basalkörper zahlreiche Zilien vorhanden. Die Zilien entwickeln sich teilweise synchron und teilweise nacheinander. Die Zilienknospe entsteht am distalen Ende des Basalkörpers. Das Wachstum der Zilien scheint an den Spitzen stattzufinden, da sowohl die motilen als auch die primären Zilien in der Spitze am wenigsten organisiert sind. Sind die Zilien auf ein Drittel ihrer Länge herangewachsen, dehnen sich die internen Fasern über den gesamten Schaft aus. In diesem Stadium ähnelt die unreife Zilie in ihrer Struktur der reifen Zilie. Der Schaft ist in dieser Entwicklungsstufe beweglich, obwohl die koordinierte ziliäre Bewegung noch nicht stattfindet. Die Reifeperiode ist beendet, wenn der Ziliensaum die gesamte Anzahl beweglicher Zilien besitzt und die Bewegung koordiniert ablaufen kann. Wenn die ersten Zilien vollständig ausgereift sind, kommen ständig neue Kinetosomen hinzu (SOROKIN 1968; HAGIWARA et al. 2000).
Bei Untersuchungen zur Ziliogenese der Maus werden die ersten Zilien am 16.
Trächtigkeitstag (TT) in den terminalen Bronchiolen und am 18. TT in den proximalen Atemwegen gefunden. Außerdem kann festgestellt werden, dass am 18. TT eine signifikant höhere Anzahl an zilierten Zellen in Trachea und Hauptbronchus als in den terminalen Bronchiolen zu finden sind. Postnatal wird eine vollständige Ausreifung des Flimmerepithels der Maus am Tag 20 nach der Geburt gemessen (TOSKALA et al. 2005).
2.2.7 Pathologische Veränderungen der Zilien 2.2.7.1 Kongenitale Defekte der ziliären Struktur
Zu dieser Gruppe der pathologischen Veränderungen der Zilien gehört die primäre ziliäre Dyskinesie, früher als „immotile cilia syndrome“ (ICS) bezeichnet. Sie ist ein seit 1976 bekanntes, autosomal-rezessiv vererbtes Krankheitsbild mit einer gestörten Zilienfunktion. Die Häufigkeit wird beim Menschen auf 1:20000 geschätzt. Die
LITERATURÜBERSICHT
Leitsymptome dieser Erkrankung sind Bronchiektasien, chronische Sinusitis, Rhinitis oder Bronchitis, Ohrinfektionen und männliche Sterilität (AFZELIUS 1976a).
Eine Unterform der primären ziliären Dyskinesie bildet das sogenannte Kartagener- Syndrom des Menschen, welches in Form einer Trias durch den Schweizer Internisten Kartagener 1933 beschrieben worden ist: Situs inversus, Bronchiektasien und chronische Sinusitis (SADER et al. 1951; RUTISHAUSER 2000). Bei den erblichen Störungen ist im Gegensatz zu den sekundären ziliären Veränderungen mit einem homogenen Bild der Defekte bei der Mehrzahl der begutachteten Zilien zu rechnen.
Eine primäre ziliäre Dyskinesie liegt sicher vor, wenn mehr als 50 % der untersuchten Zilien einen übereinstimmenden typischen Defekt aufweisen (NÜßLEIN 2001).
In der Tiermedizin wird von dem ICS bisher bei 15 Hunderassen berichtet, unter anderem beim Old English Sheepdog, Chow-Chow, Bullmastiff, Rottweiler, Pudel, English Springer Spaniel, Shar-Pei, Golden Retriever und Neufundländer (AFZELIUS et al. 1984; RANDOLF u. CASTLEMAN 1984; EDWARDS et al. 1989a;
EDWARDS et al. 1989b; FOODMAN et al. 1989; HOOVER et al. 1989; WATSON et al. 1999; CLERCX et al. 2000). Außerdem berichtet ANDERSSON (2000) über das Auftreten von Spermienschwanzdefekten beim Yorkshire-Schwein. Der Autor beschreibt diese Veränderungen bei drei Wurfgeschwistern und diagnostiziert ein homogenes Erscheinungsbild des Defektes im kompletten Ejakulat, so dass man von einer kompletten Akinesie ausgehen kann. In der Humanmedizin sind diese Veränderungen mit dem Kartagener-Syndrom assoziiert. Abnormitäten der Zilien im Respirationstrakt werden vom Autor bei den untersuchten Schweinen nicht beschrieben. Ein weiterer Fall von Defekten des Spermienschwanzes ist bei einem sterilen Ayrshire-Bullen beschrieben (VIERULA 1983, 1987). ROPERTO et al.
(1991) beschreiben eine familiäre Häufung der ziliären Dyskinesie im Ovidukt von sechs Sauen.
Defekte der Dynein-Arme, vor allem im Zusammenhang mit dem Kartagener- Syndrom, werden von zahlreichen Autoren erwähnt. Diese Defekte der Dynein-Arme reichen von deren Verkürzung oder dem Fehlen der inneren oder äußeren Dynein- Arme bis hin zum vollständigen Fehlen beider Strukturen. Da die ATPase der Dynein- Arme für den Zilienschlag notwendig ist, sind Zilien mit einem solchen Defekt unbeweglich (ROSSMAN et al. 1980; AFZELIUS 1982).
Fehlende „radial spokes“ werden erstmals 1979 von STURGESS et al. beschrieben und zählen zu den angeborenen Defekten der ziliären Struktur. Anstelle der Speichen zeigen die Zilien in der Nasen- und Bronchialschleimhaut ein amorphes Material.
Durch das Fehlen dieser ordnenden Elemente kommt es zusätzlich zu einer Störung
LITERATURÜBERSICHT
der Tubuli-Anordnung. Diese Art von Defekt zeigt sich bei vielen Patienten in Zusammenhang mit Defekten der Dynein-Arme.
Ausführlich wird die mikrotubuläre Transposition von STURGESS et al. (1980) beschrieben. Bei dieser Art von Defekt fehlt das zentrale Tubuluspaar und ein äußeres Paar ist ins Zentrum transpositioniert, so dass aus der typischen 9D+2S-Struktur eine 8D+1D-Struktur entsteht.
Neben diesen drei charakteristischen ultrastrukturellen Veränderungen der ziliären Struktur können im Rahmen der primären ziliären Dyskinesie noch andere Defekte eine Rolle spielen. Dazu gehören die Störung der normalen ultrastrukturellen Organisation mit funktioneller Beeinträchtigung, zu lange Zilien, Anomalien der Basalkörper und das Fehlen bzw. die Dysorientierung von Zilien (STURGESS et al.
1980; STURGESS u. CHAO 1982; NÜßLEIN 2001).
2.2.7.2 Sekundäre, erworbene Defekte der ziliären Struktur
Den primären Veränderungen der Zilien stehen die so genannten sekundären, erworbenen ziliären Dyskinesien gegenüber. Solche sekundären ziliären Veränderungen findet man beim Menschen vor allem bei unspezifischen chronischen Bronchitiden, bei Rauchern, bei der zystischen Fibrose, bei Asthma, bei Bronchiektasien und bei wiederkehrenden bakteriellen oder viralen Infektionen des Respirationstraktes (SMALLMAN u. GREGORY 1986; RUTISHAUSER 2000).
Nicht-typisierbare Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa und Streptococcus pneumoniae führen in vitro sowohl zu einer Reduzierung der ziliären Schlagfrequenz als auch zu Schädigungen am respiratorischen Epithel. Pyocyanin, 1- Hydroxyphenazin und Phenazin-Pigmente von Pseudomonas aeruginosa, stören nachweislich die physiologische Koordination des ziliären Bewegungsmechanismus (STANNARD u. O'CALLAGHAN 2006). Die sekundären ziliären Dyskinesien können außerdem als Begleitphänomen assoziiert sein mit der oben genannten primären ziliären Dyskinesie (LUNGARELLA et al. 1983).
Die Tab. 1 gibt einen Überblick über die vielfältigen Ursachen der sekundären ziliären Dyskinesien. Allerdings konnten erworbene Abnormitäten der Zilien, sowohl in der Human- als auch in der Tiermedizin, auch bei gesunden Individuen nachwiesen werden. Es wurde festgestellt, dass 4 - 10 % der Zilien beim gesunden Menschen sekundäre ultrastrukturelle Veränderungen zeigen können und diese Veränderungen sich im physiologischen Bereich befinden. Bei chronischen Atemwegserkrankungen erhöht sich die Anzahl der Defekte auf bis zu 20 % aller Zilien (WILSMAN et al.
1982; SMALLMAN u. GREGORY 1986; ROBBERT et al. 1995; NÜßLEIN 2001;
KNIPPING et al. 2002; PLESEC et al. 2008). Sekundäre ziliäre Dyskinesien werden bei gesunden Hunden (WILSMAN et al. 1982), gesunden Pferden (BERGNER 1987;
LITERATURÜBERSICHT
GALATI et al. 1991), gesunden Schweinen (ROPERTO et al. 1996), gesunden kleinen Wiederkäuern (ROPERTO et al. 1998) und gesunden Wasserbüffeln (BRUNO et al.
1999) festgestellt.
Tabelle 1: Ursachen für sekundäre ziliäre Dyskinesien (NÜßLEIN 2001).
Mechanisch Intubation
HNO-Operationen Bronchoskopie Infektiös Virale/ bakterielle
Infektionen der Atemwege
Allergisch Asthma bronchiale Pollinosis
Medikamentös Lokalanästhetika ß-Rezeptorblocker Narkosegase Chemisch Zigarettenrauch
Schwefeldioxid Stickoxide
Nutritiv Vitamin-A-Mangel
Physikalisch Ionisierende Strahlen Hyperoxie
Niedrige
Luftfeuchtigkeit
Durch unterschiedliche Noxen im Bereich des Respirationstraktes, aber auch bei gesunden Menschen und Tieren, können eine Reihe von Abweichungen der Zilienstruktur verursacht werden. Eine genaue Aufstellung dieser Alterationen bei Mensch und Tier liefern die Tab. 2 und 3.
Compound Cilia stellen Komplexe dar, die mehr als ein 9+2-Mikrotubulus-Muster im Axonema enthalten. Es werden zwei Arten des Compound Cilium unterschieden. Der
„adhesive type“ ist charakterisiert durch dicht gepackte, parallel liegende 9+2- Mikrotubuli, während der „bulging type“ locker und zufällig verteilte Mikrotubuli
LITERATURÜBERSICHT
enthält. Die Zahl der Mikrotubuli variiert zwischen zwei und dreißig, und alle zeigen das typische 9×2+2-Muster. Je nach Anschnitt haben die Compound Cilia Verbindung zur Zellmembran oder erscheinen als runde Struktur ohne Verbindung zur Zellmembran. Weiterhin gibt es zytoplasmatische Ausstülpungen der Zilien, die sich ähnlich wie das oben beschriebene Compound Cilium darstellen. Diese Ausstülpungen beinhalten aber im Gegensatz zu dem Compound Cilium keine Mikrotubuli-Strukturen und können, ebenfalls abhängig vom Anschnitt, als Strukturen mit Verbindung oder ohne Verbindung zur Zellmembran auftreten. Da bei diesen zytoplasmatischen Ausstülpungen aber nicht ausgeschlossen werden kann, dass sie abhängig vom Anschnitt an einer anderen Lokalisation mikrotubuläre Strukturen enthalten, werden sie zu der Gruppe der Compound Cilia gezählt (TAKASAKA et al. 1980; OHASHI u.
NAKAI 1983; SMALLMAN u. GREGORY 1986).
Möglicherweise entstehen die Compound Cilia durch eine Vesikulation der Plasmamembran mit nachfolgendem partiellem oder totalem Verlust der Zilienmembran. Im Anschluss daran werden einzelne Axonemata von einer einzigen Membran umgeben (FONZI et al. 1982). GHADIALLY (1988) vertritt die Meinung, dass diese veränderten Zilien entweder durch Zusammenschluss vorher existierender Zilien oder durch die Aufnahme von mehreren Mikrotubulikomplexen in eine einzige Plasmamembranevagination zustande kommen. Wie bereits erwähnt haben die Compound Cilia Verbindung zur Zellmembran oder erscheinen als runde Struktur ohne Verbindung zur Zellmembran (GHADIALLY 1988).
Da die in dem Compound Cilium enthaltenen 9+2-Mikrotubuli keine Plasmamembran besitzen, wird ein ungenügender Speicher an Plasmamembranen für neue Zilien ebenfalls als Ursache für diese sekundären Ziliendefekte diskutiert (CHOPRA u.
COONEY 1985; KUBOTA et al. 1986).
LUNGARELLA et al. (1983) beschreibt die sekundären Veränderungen der Zilien im Zusammenhang mit chronischen Bronchitiden beim Menschen und unterstützt die These vieler Autoren, dass diese Compound Cilia sowohl beim Menschen (AILSBY u.
GHADIALLY 1973; MCDOWELL et al. 1976; NEUSTEIN et al. 1979; HOWELL et al. 1980) als auch beim Versuchstier (PURCELL 1971; HARRIS et al. 1974;
STENBACK 1977; LUNGARELLA u. FONZI 1980) sekundäre ziliäre Veränderungen darstellen, die wahrscheinlich nur in Zusammenhang mit chronischen Entzündungen des Respirationstraktes auftreten.
GAILLARD et al. (1989) beschreiben bei der Untersuchung der Ziliogenese in der Trachea humaner Feten der 9. bis 27. Schwangerschaftswoche zahlreiche, vom Autor als Megazilien bezeichnete Ausstülpungen an zilierten Zellen, die Mikrotubuli oder Fragmente der Mikrotubuli und große Mengen an Zytoplasma enthalten. Diese
LITERATURÜBERSICHT
Veränderungen werden vor allem bei Feten der 16. bis 20. Schwangerschaftswoche beschrieben und mit einem apokrinen Sekretionmodus verglichen. Solche auch unter dem Begriff Compound Cilia aufgeführten Veränderungen werden bei gesunden Individuen festgestellt (FOX et al. 1983). Dennoch zeigen vor allem Individuen mit chronischen Lungenerkrankungen und insbesondere Patienten während einer Infektion diese Veränderungen (STURGESS u. TURNER 1984). Bei Menschen könnten diese Megazilien einer Wiederherstellung der (fetalen) Ziliogenese nach einer bedeutsamen Verletzung entsprechen und sind wohl eher das Zeichen einer rapiden ziliären Differenzierung (wie bei den Embryonen) als ein Attribut der sekundären, erworbenen ziliären Abnormitäten (GAILLARD et al. 1989).
Fehlende oder überzählige Mikrotubuli („Extratubuli“) lassen sich sowohl bei den zentralen als auch bei den peripheren Mikrotubuli finden. Allerdings kommt eine physiologische Abweichung von der 9×2+2-Struktur in der Zilienspitze vor, die durch das Fehlen der B-Mikrotubuli charakterisiert ist (DALEN 1981; WILSMAN et al.
1982; AFZELIUS et al. 1984; BRYAN 1983).
Zilien, die einen Überschuss an Matrix („Extramatrix“) in einer physiologischen Membranhülle enthalten und aufgrund ihres Aussehens auch als geschwollene Zilien bezeichnet werden, und die Dysorientierung des ziliären 9×2+2-Musters können weiterhin als unspezifische, sekundäre ziliäre Veränderungen ebenfalls bei Mensch und Tier auftreten (AILSBY u. GHADIALLY 1973; TSANG et al. 2005). Sie entstehen, wenn die wachsende Zilie die apikale zytoplasmatische Matrix beim Wachstum nach außen mitführt (HAGIWARA et al. 2000).
Eine als „ciliary bleb“ bezeichnete Veränderung zeichnet sich durch eine homogene, blasenförmige Ausstülpung an einem Teil der Zilie aus. DALEN (1981) beschreibt diese Veränderungen bei der transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchung der Zilien des Meerschweinchens in allen Bereichen der Trachea und stellt unterschiedliche morphologische Stadien dar. Allerdings schließt der Autor als Ursache dieser Veränderungen Fixationsartefakte nicht aus.
Eine selten beobachtete Veränderung, die sich in Form eines schwanzähnlichen Gebildes an der Zilienmembran darstellt, wird als „ciliary tail“ bezeichnet (TSANG et al. 2005).
Die Schlagrichtung der Zilien wird durch die Basalkörperanhänge (Basalfuß und die Wurzelfasern) und durch die Verbindungslinie zwischen den beiden Zentraltubuli vorgegeben. Eine ungeordnete Ausrichtung des Basalfußes bzw. der Zentraltubuli (fehlende Orientierung) bedingt somit eine ungeordnete Schlagrichtung der Zilien in unterschiedliche Richtungen (GUIRAO u. JOANNY 2007) und zählt somit auch zu den sekundären, erworbenen Ziliendyskinesien.
LITERATURÜBERSICHT Tabelle 2: Unspezifische, sekundäre erworbene Abnormitäten der Zilien im Respirationstrakt (Nasen-, Tracheal-, Bronchialschleimhaut) beim Menschen.
Art der Zilienveränderung Klinische Diagnosen Autoren Compound Cilia Chronische Sinusitis
Neoplasien, Pneumonie
OHASHI u. NAKAI (1983) SMALLMAN u. GREGORY (1986)
Megazilien (Compound Cilia) o.b.B. (Fetale Trachea) GAILLARD et al. (1989) Compound Cilia/ Fehlende oder
überzählige periphere Mikrotubuli
Chronische Bronchitis LUNGARELLA et al. (1983)
Compound Cilia/
Dysorganisation
Bronchiektasien/
Atemwegserkrankungen
CORBEEL et al. (1981)
Compound Cilia Asthma bei Kindern CUTZ et al. (1978) Compound Cilia Atemwegserkrankungen/
Chronische Sinusitis
TOSKALA et al. (1995)
Compound Cilia o.b.B. ROSSMAN et al. (1980)
ROBBERT et al. (1995) Compound Cilia Kartagener Syndrom
Pneumonie Neoplasien
Chronische Sinusitis/Bronchitis Rhinitis
Bronchiektasien Becherzellhyperplasie Asthma bronchiale
AILSBY u. GHADIALLY (1973) MCDOWELL et al. (1976) TORIKATA et al. (1976) FOX et al. (1983) HOWELL et al. (1980)
WAKEFIELD u. WAITE (1980) CORBEEL et al. (1981)
ROSSMAN et al. (1980) HERZON (1981) ROBSON et al. (1993) Fehlende oder überzählige
periphere Mikrotubuli
Pulmonale Neoplasien, Pneumonie
Kartagener Syndrom Asthma bronchiale
Chronische Sinusitis/Bronchitis Pneumonie
Asbestose Sarkoidose
Pulmonales Adenokarzinom
SMALLMAN u. GREGORY (1986)
TORIKATA et al. (1976) HOWELL et al. (1980) LUNGARELLA et al. (1982) CANET et al. (1984)
FISCHER et al. (1984) EHOUMAN et al. (1985)
Fehlende oder überzählige Zentraltubuli
Pulmonale Neoplasien, Pneumonie
SMALLMAN u. GREGORY (1986)
Swollen cilia Neoplasie
Chronische Bronchitis Becherzellhyperplasie
AILSBY u. GHADIALLY (1973) LUNGARELLA et al. (1983) MCDOWELL et al. (1976) TORIKATA et al. (1976) GONZALEZ et al. (1985) Fehlende Orientierung der
Schlagrichtung
Kartagener Syndrom
Chronische Sinusitis/Bronchitis Pneumonie
Bronchiektasien
ELIASSON et al. (1977) HOWELL et al. (1980) VEERMAN et al. (1980) AFZELIUS (1981) HERZON (1981)
LITERATURÜBERSICHT
Tabelle 3: Unspezifische, sekundäre erworbene Abnormitäten der Zilien im Respirationstrakt (Nasen-, Tracheal-, Bronchialschleimhaut) beim Tier.
Art der Zilienveränderung Tierart Klinische Diagnosen
Autoren Abweichungen von der 9+2-
Struktur
Meerschweinchen o.b.B. DALEN (1981)
Compound Cilia Hund Tracheitis/Bronchiti
s
CASTLEMAN et al. (2010)
Hund o.b.B. WILSMAN et al.
(1982) Basalkörperstruktur-
Abweichungen
Meerschweinchen o.b.B. TORIKATA et al.
(1976)
DALEN (1981) Hund Rhinitis/Bronchitis
Situs inversus
AFZELIUS et al.
(1984) Fehlende Orientierung der
Schlagrichtung der Zilien
Hund Rhinitis/Bronchitis Situs inversus
AFZELIUS et al.
(1984)
Extratubuli Meerschweinchen o.b.B. DALEN (1981)
Hund WILSMAN et al.
(1982) Fehlende und überzählige
zentrale und periphere Tubuli
Hund Rhinitis/Bronchitis Situs inversus
AFZELIUS et al.
(1984) Fehlende und überzählige
Zentraltubuli
Maus Hyp-Mutation BRYAN (1993)
Compound Cilia Wasserbüffel o.b.B. BRUNO et al.
(1999) Compound Cilia/
Mikrotubuläre Veränderungen
Pferd o.b.B. GALATI et al.
(1991)
Extratubuli/ fehlende
„douplets“/ fehlende Orientierung der Schlagrichtung
Pferd o.b.B. BERGNER (1987)
Compound Cilia/Extratubuli/
Extramatrix/fehlende
„douplets“/ fehlende Orientierung der Schlagrichtung
ggr. - hgr. COPD
3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN 3.1 Material und Methoden
3.1.1 Tiermaterial und Haltungsbedingungen
Die Untersuchungen erfolgten an 32 Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus) (siehe Anhang 9.1.1.) aus der Zuchtkolonie des Deutschen Primatenzentrums Göttingen (DPZ) und aus einer Zuchtkolonie einer externen Labortierhaltung. Die Tiere wurden mit der „Göttinger Mischung 2“ (0,1 mg/kg KGW; genaue Zusammensetzung siehe Anhang 9.5.) intramuskulär narkotisiert und anschließend mit einer überdosierten Injektion Pentobarbital-Natrium (Narcoren®; Merial, Hallbergmoos, Deutschland) intraperitoneal oder intrakardial für verschiedene wissenschaftliche Zwecke euthanasiert.
Um die Altersstruktur der gesamten Untersuchungsgruppe zu analysieren und mögliche Unterschiede des Ausprägungsgrades und der Art der Zilienveränderungen zu untersuchen, wurden die Weißbüschelaffen in vier verschiedene Alterskategorien eingeteilt. Die erste Kategorie beinhaltete Feten (letztes Trächtigkeitsdrittel), die zweite Gruppe bildeten neugeborene Tiere (1 Tag post partum), die dritte Gruppe umfasste die juvenilen bzw. subadulten Tiere (10 Wochen bis 14 Monate), und die vierte Gruppe bildeten die adulten Tiere (3-7 Jahre, geschlechtsreif). Zusätzlich wurden bei den juvenilen und adulten Tieren aufgrund des histopathologischen Befundes der Lunge (siehe 3.1.6.1.) zwischen gesund und krank unterschieden, so dass insgesamt sechs Tiergruppen unterschieden wurden.
Die Weißbüschelaffen beider Zuchtkolonien wurden in Kleingruppen in einem Indoor- Haltungssystem gehalten. Die Imitation von Tageslicht erfolgte mit Hilfe von UV- Lampen, die von morgens 6:30 Uhr bis abends 19:30 Uhr in Betrieb waren. Das Klima war mit einer konstanten Temperatur von 26 Grad Celsius und einer Luftfeuchtigkeit von 60 % den natürlichen Umweltbedingungen des Weißbüschelaffen angepasst.
3.1.2 Sektion und Probengewinnung
Der Euthanasie folgte ein standarisierter Sektionsgang, bei dem zunächst die Entnahme der Lunge mit der Trachea erfolgte, um die optimale Fixierung der Proben für die Elektronenmikroskopie (EM) zu gewährleisten. Weitere Organe wurden für anderweitige wissenschaftliche Untersuchungen entnommen und beprobt.
EIGENE UNTERSUCHUNGEN
3.1.3 Gewebepräparation
Der linke, ventrale Lungenlappen, der linke Hauptbronchus und der mittlere Abschnitt der Trachea wurden für die elektronenmikroskopische Untersuchung in Würfel mit einer Kantenlänge von ca. 1 mm geschnitten und sofort in 2,5 %iger gepufferter Glutaraldehydlösung fixiert (siehe Anhang 9.3.3.). Der linke, dorsale Lungenlappen wurde separat zur lichtmikroskopischen Untersuchung in 4 %iger gepufferter Formalinlösung fixiert (siehe Anhang 9.3.3.). Die Lokalisationen der Probenentnahme sind in Abb. 3 dargestellt.
Abb. 3: Anatomische Darstellung des respiratorischen Systems des Callithrix jacchus.
Die Länge der Trachea bis zur Lungenspitze beträgt durchschnittlich 5,5 cm. Die beschrifteten Striche kennzeichnen die Lokalisationen der Probenentnahme für die EM.(modifiziert nach SURRIBAS u.
LAWZEWITSCH 1987).
EIGENE UNTERSUCHUNGEN
3.1.4 Elektronenmikroskopische Präparation
3.1.4.1 Transmissionselektronenmikroskopische Präparation
Im Anschluss an die Materialgewinnung und nach 24-stündiger Fixation in 2,5 %iger gepufferter Glutaraldehydlösung wurden zehn Proben der linken Lunge, sieben Proben der mittleren Trachea und fünf Proben des linken Hauptbronchus (Abb. 3) in einem Epon-Gemisch nach LUFT (1961) (siehe Anhang 9.4.1.) eingebettet. Diese Einbettung erfolgte im Lynx-Einbettautomaten (Fa. Leica, Bensheim, Deutschland) nach dem im Anhang unter Punkt 9.4.2. aufgeführten Protokoll. Danach wurden die Proben gerichtet in Flacheinbettungsformen aus Silikongummi eingebettet und ausgerichtet, um beim Anschnitt der Epon-Blöcke das Flimmerepithel darzustellen zu können. Im Anschluss daran folgte eine 24-stündige Polymerisation des Epoxidharzes bei 60 °C.
Die auspolymerisierten Epon-Blöcke wurden zunächst mit einer Fräse (Reichert, Ultratrim, Fa. Leica, Bensheim, Deutschland) auf die Größe des Gewebestreifens zugetrimmt. Am Ultramikrotom (Reichert, Ultracut S, Fa. Leica, Bensheim, Deutschland) erfolgte unter Verwendung eines Diamantmessers (Fa. Diatome, Bienne, Schweiz) die Anfertigung ca. 0,5 µm dicker Semidünnschnitte. Nach dem Aufbringen der Schnitte auf mit Silan beschichtete Objektträger (Histobond®, Fa. Paul Marienfeld GmbH, Lauda-Königshofen, Deutschland) wurden die Semidünnschnitte auf einer Wärmebank nach RICHARDSON und Mitarbeitern (1960) gefärbt (siehe Anhang 9.4.3.), mit Eukitt® (O. Kindler GmbH, Freiburg, Deutschland) eingedeckt und zur pathologisch-histologischen Untersuchung und zur Vororientierung für das Anfertigen von Ultradünnschnitten lichtmikroskopisch ausgewertet.
Nach Auswertung und fotografischer Dokumentation der Semidünnschnitte wurden ausgewählte Bereiche für die Anfertigung von Ultradünnschnitten festgelegt und zeichnerisch dargestellt. Anhand der ausgewählten Bereiche erfolgte am Ultramikrotom, unter Verwendung eines Diamantmessers (Fa. Diatome, Bienne, Schweiz), die Herstellung von 60-80 nm dicken Ultradünnschnitten. Diese Schnitte wurden auf Kupferlochblenden (single slot 1×2, Fa. Piano, Wetzlar, Deutschland) aufgezogen und von Hand mit Uranylacetat und Bleicitrat kontrastiert.
Die transmissionselektronenmikroskopische Analyse wurde am ZEISS- Elektronenmikroskop (EM 10 C, Fa. Zeiss, Oberkochen, Deutschland) bei einer Grundvergrößerung von 2.500 bis 20.000 und 60 kV durchgeführt. Die Fotodokumentation erfolgte mit einer integrierten Digitalkamera (Slow-scan CCD- Camera for TEM, Fa. Zeiss, Oberkochen, Deutschland) in Kombination mit dem Bildverarbeitungsprogramm iTEM 5.0® (Fa. Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Münster, Deutschland).
EIGENE UNTERSUCHUNGEN
3.1.4.2 Rasterelektronenmikroskopische Präparation
Für die Rasterelektronenmikroskopie (REM) wurden ausgewählte Proben der Trachea von fünf Tieren (G8210, G8216, G8217, G8219, G8210c) untersucht. Zunächst wurden die in 2,5 %iger gepufferter Glutaraldehydlösung fixierten Proben 24 Stunden in Cacodylatpufferlösung, welche fünfmal gewechselt wurde, unter ständiger Bewegung gespült. In 1 %iger Osmiumtetroxidlösung erfolgte die Nachfixierung der Proben für zwei Stunden. Die Entwässerung der Proben mit Hilfe der aufsteigenden Alkoholreihe bis zum 90 %igen Alkohol (30 %ig, 50 %ig, 70 %ig, 80 %ig, 90 %ig) erfolgte nach erneuter Spülung in Cacodylatpufferlösung für vier Stunden. Der absolute Alkohol wurde während der Entwässerung zweimal gewechselt und die Proben wurden ständig in Bewegung gehalten. Anschließend kamen die Proben unter zweimaligem Wechsel für zwei Tage in Isoamylacetat. Die Trocknung erfolgte unter Anwendung des Critical-Point-Verfahrens (Critical-Point-Drying-Apparatus, Modell E 3000, Fa. Polaron, Watford, England). Im nachfolgenden Schritt wurden die Trachealproben auf Messingpräparatehalter (d = 1 cm) mit leitfähigem Kohlenstoffkleber (Leit-C nach Göcke, Plano, Nr. G 3300) so aufgeklebt, dass das Flimmerepithel untersucht werden konnte. Im sogenannten Sputterverfahren erhielt jede Probe eine Goldschicht, welche unter Spannung im Vakuum aufgedampft wurde (Probenabstand 2,5 cm, 4 Ampere, 4 min.). Ausgewertet wurden die Proben mit einem Rasterelektronenmikroskop (DSM 940, Fa. Zeiss, Oberkochen, Deutschland) bei 10 kV.
3.1.5 Histologische Präparation
Das im Rahmen der Sektion gewonnene und in 4 %iges, neutral gepuffertes Formalin verbrachte Gewebe der linken Lunge wurde nach einer minimalen Fixationszeit von 24 Stunden zugeschnitten und in Einbettkassetten gelegt. Die Einbettung selbst erfolgte mit Hilfe eines Einbettautomaten (Shandon Excelsior ES, Fa. Thermo Fisher Scientific, Dreieich, Deutschland) nach laborüblichem Protokoll (siehe Anhang 9.3.1.).
Anschließend wurden die Proben unter Verwendung einer Paraffinausgießstation (EC 350-1, Fa. Thermo Fisher Scientific, Dreieich, Deutschland) ausgegossen und in passenden Stahlblechformen aufgeblockt. Die ausgehärteten Blöcke wurden aus den Formen gelöst und auf Eis gelegt. Anschließend wurden an einem Schlittenmikrotom (Mikrotom HM 400R, Fa. Microm, Walldorf, Deutschland) etwa 3 µm dicke Schnitte angefertigt. Diese wurden mit Hilfe eines zuvor in Eiswasser gelagerten Streifens Durchschlagpapier abgenommen, zur faltenfreien Ausdehnung in ein 40 ºC warmes Wasserbad überführt und auf Standardobjektträger (Thermo Scientific, Menzel-Gläser, Fa. Menzel GmbH, Braunschweig, Deutschland) aufgebracht.
EIGENE UNTERSUCHUNGEN
Die angefertigten Paraffinschnitte der untersuchten linken Lunge wurden im Färbeautomaten (Varistain Gemini, Fa. Thermo Fisher Scientific, Dreieich, Deutschland) nach dem unter im Anhang 9.3.5. zu findenden Protokoll der Hämalaun- Eosin- (H.E.)-Färbung gefärbt.
3.1.6 Morphologische Auswertungen 3.1.6.1 Lichtmikroskopie
Die HE-Schnitte der linken Lunge bildeten die Basis der histopathologischen Auswertung und Diagnosestellung. Mit dieser Methode war eine gute Einschätzung der Breite der interalveolären Septen und Beurteilung der Entzündungsinfiltrate möglich. Die Auswertung erfolgte bei hundertfacher Vergrößerung semiquantitativ in Graden von null (= negativ, gesund) bis drei (= hochgradig). Die Einteilung der interstitiellen Pneumonien erfolgte nach dem in Tab. 4 dargestellten Bewertungsschema. Die Messungen wurden an sieben zufällig ausgewählten Bereichen des histologischen Schnittes durchgeführt. Anhand der auf diese Weise für jedes Tier erhobenen Befunde erfolgte eine Zuordnung der entsprechenden histopathologischen Diagnosen. Die vollständigen Daten über Alter, Geschlecht, histologischen Befund der Tiere sind im Anhang 9.1.1. dargestellt. In dieser Tabelle wurde, bezogen auf die histopathologische Diagnose der Lungen im H.E.-Schnitt, zwischen gesund und krank unterschieden.
Neben der histologischen Diagnose der Lungen wurden die Semidünnschnitte der Trachea und des Hauptbronchus auf vorhandene Entzündungszellinfiltrate untersucht.
Tabelle 4: Bewertungsschema zur semiquantitativen Beurteilung interstitieller Pneumonien.
Die Breite der Alveolarsepten spiegelt die vorhandenen Entzündungsinfiltrate wider.
Die bildliche Dokumentation und Abmessung der interalveolären Septen erfolgte mit Hilfe einer in das Lichtmikroskop Axioplan 2 imaging (Fa. Zeiss, Oberkochen, Deutschland) integrierten Digitalkamera (Axiocam HR, Fa. Zeiss, Oberkochen, Deutschland) unter Verwendung der Software AxioVision 40 (Version 4.8.0.0, Fa.
Carl Zeiss Imaging Solutions GmbH, München, Deutschland).
Grad Breite der Alveolarsepten 0 = negativ 5 - 20 µm
1 = geringgradig 20 - 50 µm 2 = mittelgradig 50 - 150 µm 3 = hochgradig 150 - 250 µm
EIGENE UNTERSUCHUNGEN
3.1.6.2 Transmissionselektronenmikroskopie
Für die transmissionselektronenmikroskopische Auswertung wurden zunächst 118 Ultradünnschnitte aus der Trachea, dem linken Hauptbronchus und der linken Lunge von 32 Weißbüschelaffen durchgemustert, und auf vorhandene Zilienmissbildungen untersucht, wobei eine deskriptive Untersuchung und eine fotografische Dokumentation der ziliären Veränderungen der verschiedenen Probenlokalisationen bei allen 32 Tieren durchgeführt wurde.
Um eine homogene Anzahl an Tieren in jeder Gruppe für die statistische Untersuchung zu erhalten wurden vier Tieren jeder Gruppe zufällig ausgesucht (n = 24 Tiere; im Anhang 9.1.1. mit Stern (*) gekennzeichnet) und insgesamt 3 Ultradünnschnitte pro Tier untersucht. Hierfür wurde jeweils ein Schnitt pro Lokalisation der Probenentnahme des jeweiligen Tieres systematisch durchgemustert.
Zunächst wurden anhand der Zellgrenzen 75 zilierte Zellen in jedem Ultradünnschnitt ausgezählt. Daraufhin wurden für die Festlegung der durchschnittlichen Zilienanzahl pro Zelle für jeden einzelnen Schnitt die 25., 50., und 75. zilierte Zelle in 2.500facher Vergrößerung fotografiert. Nach dem Ausdruck der jeweiligen Fotografie mithilfe eines Standarddruckers (hp LaserJet 1200 series), wurde die Anzahl der Zilien der jeweiligen Zelle per Hand ausgezählt. Im Anschluss daran wurde der gesamte Schnitt auf Art und Anzahl der Zilienmissbildungen untersucht. Hierbei wurde nach sechs Arten der sekundären ziliären Veränderungen unterschieden: Compound Cilia („bulging type“), Compound Cilia („adhesive type“), Extramatrix, Extratubuli, ein ziliärer Schwanz und die Dysorientierung der mikrotubulären Anordnung. Die Dokumentation der verschiedenen Zilienveränderungen, der durchschnittlichen Zilienanzahl und der Anzahl der zilierten Zellen erfolgte mithilfe des Softwareprogrammes Microsoft® Office Word/Excel 2003.
3.1.6.3 Rasterelektronenmikroskopie
Für die rasterelektronenmikroskopische Auswertung wurden jeweils zwei Trachealproben von fünf Weißbüschelaffen (G8210, G8216, G8217, G8219, G8210c) ausgewertet. Die trachealen Proben wurden systematisch durchgemustert und die unterschiedliche Verteilung der Zellen des respiratorischen Epithels wurde fotografisch dokumentiert.
3.1.7 Statistik
Für die Grundlage der statistischen Auswertung wurden mit dem Tabellenkalkulationsprogramm Microsoft® Excel® 2003 Analysen zur Altersstruktur innerhalb der Untersuchungsgruppen, der Anzahl und Art der pathologischen Parameter und der mittleren Zilienanzahl in den verschiedenen Probenlokalisationen
EIGENE UNTERSUCHUNGEN
erstellt. Für die deskriptive Statistik wurde das Statistikprogramm Statistica® (Fa.
Statsoft (Europe) GmbH, Hamburg, Deutschland) genutzt.
Um mögliche Unterschiede der Zilienmissbildungen innerhalb der verschiedenen Altersgruppen, der Lokalisationen und bezüglich Art der Missbildung zu untersuchen, wurde sowohl mit der Statistiksoftware SAS® (Version 9.2, SAS Institute Inc., Cary, North Carolina, USA) als auch mit der Statistiksoftware SPSS Statistics® (Fa. IBM, Version 19, SPSS Inc., New York, USA) eine 2-faktorielle repeated measures ANOVA (Analysis of variance) durchgeführt. Eine solche Varianzanalyse untersucht, ob sich die Erwartungswerte der metrischen Zufallsvariablen in den zu untersuchten Gruppen unterscheiden. Sie wird also angewendet, wenn Unterschiede zwischen verschiedenen Gruppen herausgefunden werden sollen. Eine 2-faktorielle statistische Analyse berücksichtigt zur Erklärung der Zielvariablen zwei Faktoren. In dieser Arbeit stellten diese Faktoren die Altersstufe und die Gruppe (gesund und krank) dar. Da es sich bei den Auswertungen um jeweils drei Lokalisationen (Trachea, Hauptbronchus und Lunge) jedes Tieres handelte und deshalb Messwiederholungen durchgeführt wurden, konnte dieser Faktor durch die repeated measures-Analyse berücksichtigt werden.
