Untersuchungen zur experimentellen Infektion von Marmosets (Callithrix jacchus) mit dem Calpoxvirus

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Untersuchungen zur experimentellen Infektion von Marmosets (Callithrix jacchus) mit dem Calpoxvirus

I N A U G U R A L – D I S S E R T A T I O N zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae-

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von Anne Elisabeth Schmitt

aus Eppelborn

Hannover 2015

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Deutsches Primatenzentrum Göttingen, Abteilung Infektionspathologie

1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. F.-J. Kaup

Tierärztliche Hochschule Hannover, Deutsches Primatenzentrum Göttingen

2. Gutachter: Univ. Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein Tierärztliche Hochschule Hannover, Abteilung Infektionspathologie

Tag der mündlichen Prüfung: 9.10.2015

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I

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ... 1

2 Literaturübersicht ... 3

2.1 Orthopocken: Geschichte und Zoonosepotential ... 3

2.2 Orthopockenviren ... 4

2.2.1 Virusaufbau ... 5

2.2.2 Virusreplikation und Reifung ... 6

2.3 Orthopockenviren beim Menschen... 8

2.3.1 Humane Pockenerkrankung ... 8

2.3.2 Kuhpocken ... 9

2.3.3 Affenpocken ... 10

2.4 Immunomodulation durch Orthopockenviren ... 10

2.5 Impfstoffe gegen Orthopockenviren ... 11

2.6 Tiermodelle ... 15

3.1 Tiere und Haltungsbedingungen ... 17

3.2 Pathogenesestudie ... 20

3.3 Impfstudie ... 21

3.4 Temperaturlogger... 22

3.5 Probenentnahme... 23

3.6 Präparation für die Lichtmikroskopie ... 26

3.6.1 Histologie ... 26

3.6.2 Immunhistochemie ... 26

3.7 Transmissionselektronenmikroskopie ... 28

4 Ergebnisse ... 29

4.1 Publikation ... 30

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II

5 Diskussion ... 113

5.2.1 MVA ... 118

5.2.2 MVTT ... 119

6 Zusammenfassung ... 124

7 Summary ... 127

8 Literaturverzeichnis ... 129

9 Anhang ... 155

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III

Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

Aqua dest. destilliertes Wasser BSL2 biosafety level 2

CEV cell-associated enveloped virion DPZ Deutsches Primatenzentrum EEV extracellular enveloped virion

Fa. Firma

g Gramm

ggr. geringgradig

h Stunde

HE Hämatoxylin-Eosin hgr. hochgradig

IEV intracellular enveloped virion IHC Immunhistochemie

i. m. intramuskulär

IMV intracellular mature virus i. n. intranasal

i. v. intravenös

kg Kilogramm

mgr. mittelgradig

Mb Messbalken

Min. Minuten ml Milliliter

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IV MVA Modifiziertes Vakziniavirus Ankara MVTT Modifiziertes Vakziniavirus Tiantan

NALT nasal-associated lymphoid tissue (Nasenschleimhautimmunsystem)

nm Nanometer

PBS phosphate-buffered saline PFU plaque-forming units p. o. peroral

SABC Streptavidin-Biotin-Komplex Tab. Tabelle

TEM Transmissionselektronenmikroskopie VACV Vakziniavirus

VARV Variolavirus

Vergr. Vergrößerungsfaktor WHO World Health Organization z. B. zum Beispiel

µl Mikroliter

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1

1 Einleitung

Trotz der erfolgreichen Ausrottung der humanen Pocken durch ein globales Impfprogramm unter Federführung der World Health Organization (WHO) bleiben Orthopockenviren im Fokus der Wissenschaft. Seit dem Einstellen der weltweiten Vakzinierungen nehmen sowohl die Anzahl von zoonotischen Kuhpockeninfektionen als auch Affenpockeninfektionen zu. Des Weiteren ist nicht völlig auszuschließen, dass das Variolavirus im Rahmen eines bioterroristischen Angriffes vorsätzlich freigesetzt wird. Da die bisher verfügbaren Impfstoffe nicht zu akzeptierende Nebenwirkungen aufweisen, ist es von großer Bedeutung, anhand von repräsentativen Tiermodellen sichere Impfstoffe sowie Therapeutika zu entwickeln.

Das im Rahmen eines Krankheitsausbruches in einer privaten Tierhaltung zufällig entdeckte Calpoxvirus eignet sich hervorragend dazu, in Marmosets (Callithrix jacchus) reproduzierbar letale systemische Erkrankungen mit kutanen Pockenläsionen zu induzieren (KRAMSKI et al. 2010). Vorteile des Modells bestehen in der im Vergleich zu anderen nichthumanen Primatenmodellen sehr geringen Infektionsdosis und der intranasalen Applikationsroute, die die natürliche Übertragung der humanen Pocken simuliert. Außerdem bietet es die Möglichkeit, unter BSL2 Bedingungen zu arbeiten.

Die vorliegende Arbeit hat zum Ziel, die Frühphase der Calpoxvirusinfektion zu charakterisieren. Kenntnisse über die pathogenetischen Abläufe in der Frühphase einer Infektion sind für die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze unerlässlich.

Im Fokus dieser Studie stehen daher systematische histopathologische und elektronenmikroskopische Untersuchungen verschiedener Organsysteme. Die Untersuchungen erfolgen zu festgelegten Zeitpunkten nach intranasaler Inokulation des Calpoxvirus, um die im Infektionsverlauf auftretenden Veränderungen zu erfassen und Primärzielzellen sowie –organe zu ermitteln. Ferner soll mittels immunhistochemischer Techniken das Verteilungsmuster infizierter Zellen untersucht werden, um die Ausbreitung des Virus im Organismus darzustellen. Additiv fließen in diese Studien Ergebnisse aus einer Parallelstudie zur Testung zweier Impfstoffe (MVA und MVTT) mit ein. Von besonderem Interesse sind die bei den Impfdurchbrüchen aufgetretenen Veränderungen. Von der Auswertung dieser

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Befunde werden zusätzliche Einblicke in pathogenetische Abläufe der Calpoxvirusinfektion erwartet.

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2 Literaturübersicht

2.1 Orthopocken: Geschichte und Zoonosepotential

Bei den Pocken, die durch das Variolavirus (VARV) verursacht werden, handelt es sich um eine der ältesten den Menschen betreffende Seuche (BABKIN u. BABKINA 2015). Man unterscheidet zwei Krankheitsformen: Variola major und minor. Variola major zeichnet sich durch einen schweren, in bis zu 40 % der Fälle tödlich endenden Krankheitsverlauf aus (HENDERSON u. MOSS 1999). Die seltener vorkommende mildere Variante, Variola minor, weist eine Sterblichkeitsrate von nur 1 % auf (HENDERSON u. MOSS 1999). Bis heute gibt es keine Therapie gegen die Seuche.

In Asien und Indien war es im 16. Jahrhundert üblich, sich durch das Aufbringen von zerriebenem Schorf der Pusteln auf die Nasenschleimhaut oder durch die kutane Inokulation von Pusteln zu schützen (NEEDHAM 1980). Dieses Verfahren (Variolation genannt) wurde dann auch in Europa eingeführt. Im 18. Jahrhundert stellte man fest, dass Milchmägde, die eine Kuhpockeninfektion überstanden hatten, gegen Menschenpocken immun waren. So setzte Edward Jenner 1796 erstmals erfolgreich eine Kuhpockenvakzine ein (JENNER 1959). Im 18. Jahrhundert starben jedes Jahr 400000 Europäer an der Seuche (RADETSKY 1999), daher fand die Entdeckung Jenners regen Zuspruch unter den praktizierenden Ärzten. Da die Seuche trotzdem weltweit sehr viele Todesopfer forderte, startete die World Health Organization (WHO) 1967 eine globale erfolgreiche Impfkampagne und erklärte die Pocken am 8. Mai 1980 für ausgerottet. Seitdem existiert das Virus offiziell nur noch in zwei Institutionen: dem Vector-Institut in Novosibirsk, Russland und in den Centers for Disease Control and Prevention (CDC) in Atlanta, USA. Der überraschende Fund mehrerer mit „Variola“ beschrifteten Röhrchen in einem ungesicherten Tiefkühlschrank eines Labors in Bethesda im Juni 2014 verstärkt jedoch die Vermutung, dass die Hochsicherheitstrakte in Novosibirsk und in Atlanta nicht die einzigen Orte sind, an denen sich noch VARV befindet (REARDON 2014). Die Gefahr eines Missbrauches des Virus im Rahmen bioterroristischer Vorfälle ist also theoretisch vorhanden, insbesondere die USA halten dieses Szenario seit den Anthrax-Anschlägen 2001 für nicht unwahrscheinlich. Die North Atlantic Treaty

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Organization (NATO) zählt das Pockenvirus zu den potenziell gefährlichsten Biokampfstoffen (KORTEPETER 1999).

Neben der Variolavirusinfektion sind auch andere Orthopocken Auslöser humaner Erkrankungen. Als Zoonoseerreger gilt dies sowohl für Kuhpockenviren in Europa als auch für Affenpockenviren in Afrika, die eine emerging disease darstellen und immer häufiger den Menschen infizieren (BOURQUAIN et al. 2013). Als Hauptüberträger von Kuhpocken werden vor allem Katzen und Ratten beschrieben (BEGON et al.

1999; BONNEKOH et al. 2008). Seit den 70ern ist das Affenpockenvirus in Zentral- und Westafrika endemisch (NALCA et al. 2005; ORBA et al. 2015). In der Demokratischen Republik Kongo wurde in den letzten 30 Jahren ein dramatischer Anstieg der Inzidenz von Affenpocken beobachtet (JOHNSTON et al. 2015). Der 2003 in den USA stattfindende Affenpocken-Ausbruch zeigt, dass Affenpocken nicht auf den afrikanischen Kontinent beschränkt sein müssen (REED et al. 2004). Da vermutet wird, dass eine Pockenimpfung auch gegen Affenpocken schützt (HAMMARLUND et al. 2005), gewinnt die Entwicklung neuer, sicherer Impfstoffe an Brisanz. Auch in Brasilien sowie in Indien häufen sich die Berichte über Vakzinia- Varianten, die von Kühen bzw. indischen Büffeln auf den Menschen übertragen werden (GOYAL et al. 2013; PEREIRA OLIVEIRA et al. 2014). Darüber hinaus besteht die Gefahr, dass sich komplett neue zoonotische Pockenvarianten entwickeln (SHCHELKUNOV 2013). Besonders Kuhpockenviren sind hierfür wegen ihres breiten Wirtsbereiches und ihrer genetischen Ausstattung prädestiniert (ESSBAUER et al. 2010).

2.2 Orthopockenviren

Die Familie der Pockenviren ist unterteilt in zwei Subfamilien: die Chordopoxvirinae, die Wirbeltiere infizieren, und die Entomopoxvirinae, die Insekten befallen (BULLER u. PALUMBO 1991). Aktuell werden laut dem International Commitee on Taxonomy of Viruses bei den Chordopoxvirinae 10 Genera beschrieben: Avipoxvirus, Capripoxvirus, Cervidpoxvirus, Crocodylidpoxvirus, Leporipoxvirus, Molluscipoxvirus, Orthopoxvirus, Parapoxvirus, Suipoxvirus und Yatapoxvirus. Zu den Orthopockenviren gehören 10 Spezies (Kamelpockenvirus, Kuhpockenvirus,

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Ektromelievirus, Affenpockenvirus, Waschbärpockenvirus, Stinktierpockenvirus, Taterapoxvirus, Vakziniavirus, Variolavirus, Wühlmauspockenvirus), die serologisch kreuzreaktiv reagieren. Das in der vorliegenden Arbeit verwendete Virus wird aufgrund seiner Entdeckung bei Callithrichiden als Calpoxvirus bezeichnet und weist einen engen Verwandtheitsgrad mit Kuhpockenviren auf, obwohl Sequenzanalysen ergaben, dass es sich von den bisher beschriebenen Kuhpockenvirus-Varianten unterscheidet (MÄTZ-RENSING et al. 2006; CARROLL et al. 2011).

2.2.1 Virusaufbau

Die ziegelsteinähnlichen Pockenviren zählen zu den größten bekannten Viren (300–

100–300 nm). Sie besitzen einen bikonkaven Innenkörper, in dem sich die doppelsträngige DNA befindet. Dem Innenkörper sind außen Lateralkörper angelagert, von denen man früher annahm, dass sie Präparationsartefakte der Elektronenmikroskopie darstellen (DUBOCHET et al. 1994). Neuere Untersuchungen lassen jedoch vermuten, dass diese für den Transport von einem oder mehreren Effektorproteinen zuständig sind (SCHMIDT et al. 2013). Das Virus wird von einer dichten Doppelmembran aus Lipoproteinen umschlossen (Abb. 1).

Abb. 1: Morphologie des Vakzinia Virus. Aus FENNER et al. 1988a.

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6 2.2.2 Virusreplikation und Reifung

Die reifen Viruspartikel gelangen bei einem sauren oder neutralen ph-Wert über Vesikel, die durch Oberflächeneinstülpung abgeschnürt werden, oder durch Fusion mit der Plasmamembran in die Zelle (Abb. 2, SENKEVICH u. MOSS 2005; LIU et al.

2014). Das dadurch freigesetzte Viruscore enthält ein komplettes System für die Transkription früher Gene (HOWARD et al. 2010). Jedes Viruspartikel kann eine eigene „Virusfabrik“ (Typ-B Einschlusskörperchen) hervorrufen, in der die Replikation und der Zusammenbau der Virionen stattfindet (MOSS 2013). Zunächst entstehen offene halbmondförmige Strukturen, die sich aus dem endoplasmatischen Retikulum entwickeln (MARURI-AVIDAL et al. 2013; LIU et al. 2014; MOSS 2015). Diese setzen sich dann zu unreifen Viruspartikeln zusammen, und schließlich zu reifen Viruspartikeln (intracellular mature virus, IMV). Die Mehrzahl der IMVs verweilt bis zur Lyse im Zytoplasma. Die IMVs einiger Orthopockenviren (Kuhpocken, Ektromeliavirus, Waschbärpocken) bilden im Zytoplasma Typ-A Einschlusskörperchen (MARCHAL 1930; HOWARD u. MOSS 2012). Diese sollen im Falle einer Freilassung in die Umgebung die infektiösen Partikel schützen. Einige IMVs werden mit Hilfe von Mikrotubuli zu dem trans-Golgi Netzwerk transportiert, wo sie eine zusätzliche dritte Membran erhalten (intracellular enveloped virus, IEV). Bei dem Verlassen der Zelle durch Fusion mit der Zellmembran verlieren sie die äußerste Hülle und bilden dann doppelt umhüllte extrazelluläre Virionen (extracellular enveloped virus, EEV). Sehr viele EEVs bleiben als cell associated virus (CEV) an der Plasmamembran haften und sind für eine effiziente Zell-Zell-Infektion verantwortlich. Kürzlich wurde herausgefunden, dass bestimmte Oberflächenproteine infizierte Zellen als solche markieren und für die direkte Weiterleitung der neu eintreffenden Viren an uninfizierte Zellen verantwortlich sind (DOCEUL et al. 2010).

Damit wird eine höchst effiziente Verbreitung der Viren gewährleistet.

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Abb. 2: Replikationszyklus der Pockenviren. Aus MODROW 2010, mit freundlicher Genehmigung von Springer Science and Business Media.

In der frühen Infektionsphase wird das angeborene Immunsystem aktiviert. Dabei versuchen Interferone, das Komplementsystem, natürliche Killerzellen und entsprechende Entzündungszellen, die Pockenvirusinfektion unter Kontrolle zu bringen. Neutralisierende Antikörper spielen eine wichtige Rolle bei der Opsonierung und der Antikörper-abhängigen zellvermittelten Zytotoxizität (EDGHILL-SMITH et al.

2005). Bei Patienten, die an einer nicht-hämorrhagischen Pockenerkrankung litten, fand man ab dem 8. Krankheitstag neutralisierende Antikörper (DOWNIE et al.

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1969). Bei Patienten mit einer hämorrhagischen Verlaufsform wurde eine verzögerte, reduzierte oder sogar fehlende Antikörperantwort festgestellt (FENNER et al. 1988c).

Die Antikörper sind für eine Vielzahl von Mechanismen bedeutend: sie binden direkt an das Pockenvirus, verursachen eine Aggregation und verhindern so die Adsorption und Aufnahme in die Zelle. Des Weiteren ermöglichen die Antikörper durch ihre Bindung die durch die Opsonierung herbeigeführte Phagozytose und die Antikörper- abhängige zellvermittelte Zytotoxizität (SMITH u. GIRISH 2002). Sie richten sich sowohl gegen verschiedene Viruspartikel wie IMVs und EVs (DAVIES et al. 2005;

JONES-TROWER et al. 2005; AMANNA et al. 2006) als auch gegen Genprodukte (RODRIGUEZ et al. 1985; DEMKOWICZ et al. 1992).

2.3 Orthopockenviren beim Menschen

Orthopocken können bei Primaten zu verschiedenen Krankheitsbildern führen. Im Vordergrund stehen dabei Infektionen des Menschen mit dem VARV. Im Rahmen von Zoonosen sind aber auch Erkrankungen mit dem Affenpockenvirus und Krankheitsfälle durch Kuhpocken beschrieben.

2.3.1 Humane Pockenerkrankung

Das VARV wird in den meisten Fällen als Aerosol eingeatmet und erreicht so die oropharyngeale oder nasale Mukosa. Aus der Migration in die regionalen Lymphknoten resultiert um den vierten Tag eine Virämie, auf die die Vermehrung des Virus in Milz, Lymphknoten und Knochenmark folgt. Ab dem 8. Tag erfolgt eine zweite virämische Phase, die mit Fieber einhergeht. Läsionen in Mund und Pharynx ulzerieren und entlassen große Mengen an Viren noch vor dem Sichtbarwerden eines Hautausschlags, der sich zwischen Tag 10 und 14 entwickelt (FENNER et al.

1988b). Die am häufigsten auftretende Form ist der „gewöhnliche Typ“, der abhängig von der flächenhaften Verteilung der Hautveränderungen in drei Unterarten aufgeteilt wird: der konfluente Subtyp mit großflächigen Läsionen auf Gesicht und Unterarm, der semi-konfluente Subtyp mit nur auf dem Gesicht großflächigen kutanen Veränderungen und milderen Veränderungen auf anderen Körperteilen sowie der

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diskrete Subtyp, bei dem sich zwischen den Pusteln unveränderte Hautareale finden.

Selten tritt auch eine hämorrhagische, normalerweise immer tödlich verlaufende Variante auf. Das Virus lässt sich zwar in vielen Organen nachweisen, jedoch ohne histopathologische Veränderungen zu verursachen (HENDERSON 1999b). Im Falle einer letal verlaufenden Infektion tritt der Tod in der zweiten Krankheitswoche ein und resultiert wahrscheinlich aus einer Toxämie und einer massiven Zytokinausschüttung (STANFORD et al. 2007). Verschiedene Studien im Primatenmodell weisen dieser Hochregulierung der Zytokine eine Schlüsselrolle in der Pathogenese zu (JAHRLING et al. 2004; RUBINS et al. 2004). Mögliche andere Ursachen für den Todeseintritt sind viral bedingte Pneumonien und virale zytopathische Effekte mit nachfolgendem Schock (MARTIN 2002).

2.3.2 Kuhpocken

Die Übertragung von Kuhpocken auf den Menschen erfolgt über Haut- und Schleimhautläsionen. Dabei handelt es sich häufig um Kratz- oder Bissverletzungen durch infizierte Katzen oder als Haustiere gehaltene Ratten. Im Bereich der Läsionen entwickeln sich dann lokalisierte Exantheme, die über einen Zeitraum von 7-12 Tagen klinische Stadien mit Papel- und Bläschenbildung durchlaufen. Am Ende der zweiten Woche beginnt das Bläschen zu ulzerieren (BAXBY 1994). Die schmerzhaften Hautläsionen sind oft von einer lokalen Lymphadenopathie begleitet.

Viele Patienten leiden unter Pyrexie und Nausea, in einem Drittel der Fälle ist eine Hospitalisierung notwendig (PASTORET et al. 2000). Bei manchen Patienten ist eine wahrscheinlich durch Schmierinfektion bedingte okuläre Infektion zu beobachten (SCHWARZER et al. 2013). Neben den normalerweise selbstlimitierenden Kuhpockeninfektionen können bei Atopikern unter Glukokortikoidtherapie oder HIV- Patienten mit starker Immunsuppression auch schwere generalisierte Infektionen auftreten (KLINGEBIEL et al. 1988; CZERNY et al. 1991; BLACKFORD et al. 1993).

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10 2.3.3 Affenpocken

Menschen können sich mit dem Affenpockenvirus durch direkten Kontakt mit infizierten Wildtieren, sehr wahrscheinlich Eichhörnchen und andere Nagerspezies, oder infizierten Menschen anstecken. Die durchschnittliche Inkubationszeit beträgt 12 Tage. Ab Tag 6 post infectionem tritt Fieber und Unwohlsein auf (RIMOIN et al.

2010; MCCOLLUM u. DAMON 2014). Bei 90 % der Patienten tritt mit Fieberbeginn eine uni- oder bilaterale Lymphadenopathie auf, anhand derer man die Differentialdiagnose Humane Pocken ausschließen kann (DI GIULIO u. ECKBURG 2004). 7 Tage nach Beginn des Fiebers entwickelt sich ein Hautausschlag, welcher sehr dem der Humanen Pocken ähnelt und wie dieser klinische Stadien mit Papel-, Vesikel- und Pustelbildung durchläuft (BREMAN et al. 2000). Die Schwere des Krankheitsverlaufs hängt von der Herkunft des Virusstamms und der Infektionsroute ab (REYNOLDS et al. 2007), so variiert die Sterblichkeitsrate zwischen 0% bei einem Ausbruch in den USA im Jahre 2003 (SALE et al. 2006) und 1-17% bei den Ausbrüchen in Afrika (MUKINDA et al. 1997).

2.4 Immunomodulation durch Orthopockenviren

Das Kuhpockenvirus besitzt innerhalb der Orthopockenviren die meisten immunmodulatorischen Gene (SHCHELKUNOV et al. 1998; ALZHANOVA u. FRUH 2010). Ungefähr die Hälfte der Gene (ca. 100) sind für diese Aufgabe zuständig (ALCAMI u. KOSZINOWSKI 2000). Diese immunomodulatorischen Proteine können in drei Gruppen unterteilt werden: Virokine, Virozeptoren und intrazelluläre Proteine (NITSCHE 2010). Virokine werden von den infizierten Zellen sezerniert und agieren als Antagonisten der wirtseigenen Zytokine. Die Virozeptoren ahmen Zytokin- Rezeptoren nach und legen das Immunsystem lahm, indem sie die wirtseigenen Zytokine von den zellulären Rezeptoren wegleiten (ALCAMI u. KOSZINOWSKI 2000). Die intrazellulären Proteine modifizieren Signaltransduktionswege (SEDGER et al. 2006). Interessanterweise existiert kein gemeinsames immunmodulatorisches Protein, das alle Pockenviren exprimieren. Vielmehr besitzt jede Virusspezies eine individuelle Auswahl an Proteinen, die speziell auf ihren Wirt zugeschnitten ist. Diese

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Wirtsspezifität erklärt die Tatsache, dass Infektionen in einer neuen Wirtsspezies sehr viel milder verlaufen können als im Ursprungswirt (STANFORD et al. 2007).

2.5 Impfstoffe gegen Orthopockenviren

Im Zuge der globalen Impfkampagne wurde Lebendvakzine der ersten Generation verwendet, die auf Kälber- oder Schafhaut gezüchtet wurden. Es kamen weltweit verschiedene Impfstämme zum Einsatz (Tab. 1). Der Impfstoff wurde mit Hilfe einer Lanzette, später mit Hilfe einer Bifurkationsnadel in die Haut des Oberarmes eingebracht. Neben harmlosen Nebenwirkungen wie Fieber, Gliederschmerzen, lokalisierten Lymphadenopathien kam es jedoch auch zu lebensbedrohlichen Komplikationen wie Ekzema vakzinatum, generalisiertem Vakzinia-Ekzem, Myoperikarditis und postvakzinaler Enzephalitis (M. BRAY u. WRIGHT 2003;

MESEDA u. WEIR 2010). Eine erhöhte Prädisposition für diese Nebenwirkungen zeigten Atopiker und Personen mit jeglicher Art von Immundefizienz (FULGINITI et al. 2003, KENNEDY et al. 2009). Durch eine sterile Anzucht in Zellkulturen wurde bei den Impfstoffen der zweiten Generation versucht, die Sicherheit der Vakzine zu erhöhen. Bei den Impfstoffen der dritten Generation wurde durch extensive Passagierung des Impfvirus sowie durch gezielte Einführung von Modifikationen eine Attenuierung erzielt (MESEDA u. WEIR 2010). Ein neuer Ansatz stellen die Impfstoffe der 4. Generation dar, bei denen Untereinheiten-Impfstoffe und DNA Vakzine Antikörper induzieren (HOOPER et al. 2004; HIRAO et al. 2011; GOLDEN et al. 2012).

Das modifizierte Virus Ankara (MVA) entstand in den 60igern durch die kontinuierliche Passagierung eines türkischen Vakzinestammes auf embryonalen Hühnerfibroblasten und besitzt sechs Deletionen, die im Vergleich zu dem Ausgangsstamm einen Verlust von 15% der genetischen Information bedeuten (MEYER et al. 1991; ANTOINE et al. 1998). Die Passagierung führte zu einem sehr hohen Verlust der Replikationsfähigkeit auf Säugerzellen bei gleichzeitiger fehlender Virulenz (EARL et al. 2004). Die daraus abgeleitete gute Verträglichkeit konnte in zahlreichen Studien bestätigt werden. So wurden in Deutschland in den 70igern

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insgesamt 120.000 Menschen mit MVA immunisiert, darunter auch immunsupprimierte Patienten (HOCHSTEIN-MINTZEL et al. 1975; MAYR u.

DANNER 1978). Der tatsächliche Schutz vor dem humanen Pockenvirus ist jedoch auf Grund der zeitgleich ablaufenden Eradikation des Virus unbekannt (GARZA et al.

2009). In den darauffolgenden Jahren erfolgten zahlreiche weitere Studien mit MVA in diversen Tiermodellen, die die gute Verträglichkeit auch unter Immunsuppression bestätigten (MEYER et al. 1991; STITTELAAR et al. 2001; COSMA et al. 2003;

EARL et al. 2004). IMVAMUNE (Bavarian Nordic, Martinsried), eine auf dem gereinigten Klon von Passage MVA-597 basierende Weiterentwicklung von MVA, konnte in zahlreichen Studien eine Immunantwort induzieren. Das hervorragende Sicherheitsprofil konnte auch bei atopischen und immunsupprimierten Patienten in mehreren Phase-II Studien bestätigt werden (VON KREMPELHUBER et al. 2010;

FREY et al. 2013; GREENBERG et al. 2013; WALSH et al. 2013). Laut persönlicher Mitteilung von Dr. Mätz-Rensing konnte IMVAMUNE in vorausgehende Studien im vorliegenden Marmosetmodell keinen Schutz induzieren. In der vorliegenden Arbeit wurde eine im Vergleich zu den früheren Studien weniger passagierte Form von MVA verwendet.

Das in der vorliegenden Arbeit ebenfalls verwendete modifizierte Virus Tiantan (MVTT) wurde in seiner ursprünglichen Form als Vakzinia Virus Tiantan (VTT) im Rahmen der WHO Impfkampagne zwischen 1920 und 1980 erfolgreich in China angewandt. Dieser Virusstamm führte im murinen Tiermodell nach intrakranialer Inokulation zum Tode und verursachte nach intranasaler Inokulation einen Gewichtsverlust von über 25%. Diese Ergebnisse beweisen, dass VTT sich nicht dazu eignet, beim Menschen mukosal appliziert zu werden (FANG et al. 2005). Um VTT weiter zu attenuieren, wurden gezielte Modifizierungen vorgenommen (u.a.

Entfernen des Hämagglutinin-Gens) (ZHU et al. 2007). Die durch VTT verursachte Neurovirulenz im murinen Tiermodell nach intrakranialer Inokulation sowie der massive Gewichtsverlust nach intranasaler Gabe konnte bei MVTT nicht beobachtet werden. Nach einmaliger intranasaler sowie intramuskulärer Vakzinierung mit MVTT im Mausmodell konnte eine neutralisierende Antikörperantwort sowie ein Schutz vor einer anschließenden Belastungsinfektion mit einem pathogenen VACV-Stamm

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(Western Reserve) induziert werden (YU et al. 2010). Da MVTT bisher nur im murinen Tiermodell getestet wurde (HUANG et al. 2009; YU et al. 2010), stellt es einen vielversprechenden Ansatz dar, diesen Impfstoff im Primatenmodell zu testen.

Besonders die nadelfreie mukosale Applikationsmöglichkeit stellt eine attraktive, einfach anwendbare Alternative zur intramuskulären Inokulation dar und erleichtert die Durchführung von Impfungen besonders in Entwicklungsländern (MESEDA et al.

2005).

Tab.1: Impfstoffe gegen Pockenviren*.

Impfstoff Details Vorteil Nachteil Referenz

1. Generation

NYCBOH (Dryvax) Auf Kälberhaut gezüchtet, Verwendung in den

USA bis 2007

Gut charakterisiert,

niedrige Pathogenität

Teils schwere Nebenwirkungen

(Myokarditis, Ekzema vaccinatum, generalisierte

Vakzinia)

PLOTKE u.

LAZOWSKI 1964

NYCBOH (EM-63) Auf Kälberhaut gezüchtet, Verwendung in

Russland

niedrige Pathogenität

FENNER et al. 1988a

Lister Auf Kälberhaut

gezüchtet, Verwendung in UK,

Afrika, Asien, Ozeanien

mittelgradige Pathogenität

FENNER et al. 1988a

Tiantan (Temple of Heaven)

Auf Kälberhaut gezüchtet, Verwendung in

China

Gut charakterisiert

ZHANG et al. 2013

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14

2. Generation NYCBOH (ACAM2000)

Weiterentwicklung von Dryvax, in

Verozellen gezüchtet, Verwendung in den

USA ab 2008

Durch sterile Anzüchtung Kontamina- tionsgefahr

minimiert

FREY et al.

2009

Elstree-BN Weiterentwicklung von Lister, Passagierung in

embryonalen Hühnerfibroblasten

Durch sterile Anzüchtung Kontamina- tionsgefahr

minimiert

STITTELAR et al. 2006

3. Generation

LC16m8 Weiterentwicklung von Lister, Passagierung in

Kaninchen- Nierenzellen, B5R

Deletion, Verwendung in Japan 1974-1975

Gutes Sicherheits-

profil

In PhaseI/II Studie weniger immunogen als

Dryvax

KENNEDY et al. 2011

IMVAMUNE Weiterentwicklung von MVA, Passagierung in Hühnerfibroblasten,

begrenzte Replikation in

Säugerzellen

Gutes Sicherheits-

profil

Evtl. boosting nötig, wenig

Daten über Wirksamkeit vorhanden, keine

sichtbare Impfreaktion

FREY et al.

2007;

GARZA et al. 2009

NYVAC Weiterentwicklung

des Kopenhagen strain, Deletion von

18 Genen

Gutes Sicherheits-

profil, attenuierter Phänotyp im Tiermodell

Evtl. boosting nötig, geringe Antikörper- bildung, keine

sichtbare Impfreaktion

MIDGLEY et al. 2008

MVTT Weiterentwicklung

von Tiantan, Entfernen des Hämagglutinin-Gens

Mukosal applizierbar,

Schutz im murinen Tiermodell

Keine sichtbare Impfreaktion

YU et al.

2010

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15

4. Generation

DNA Vakzine Kombination von IMV, EEV Genen und

core Antigen

Gutes Sicherheits- profil, Schutz

in Tiermodellen

Noch keine klinischen Studien, evtl.

boosting nötig, keine sichtbare Impfreaktion

HIRAO et al. 2011

Protein Vakzine Kombination von IMV und EEV Genen

in Tiermodellen

BUCHMAN et al. 2010

T-Zell Epitop Vakzine

Multi-T-Zell Epitop- Vakzine basierend

auf konservierten Vakzinia- und Variolasequenzen

im Mausmodell

MOISE et al. 2011

*Daten zusammengestellt nach: VERARDI et al. 2012; MCCOLLUM u. DAMON 2013

2.6 Tiermodelle

Seit den 50er Jahren wurden verschiedene Tiermodelle für Orthopockeninfektionen entwickelt, die sowohl hinsichtlich eines detaillierteren Verständnisses der Pathogenese sowie der Evaluierung neuer Therapeutika und Vakzinen unerlässlich sind. Die Food and Drug Administration (FDA) schreibt vor, dass neue Medikamente, bei denen der Einsatz in menschlichen klinischen Studien ethisch nicht vertretbar ist, in mindestens 2 Tiermodellen getestet werden müssen (SNOY 2010). Zum Einsatz kamen in der Vergangenheit sowohl diverse Nager- als auch nichthumane Primatenmodelle (CHAPMAN et al. 2010). Beispiele für Nagermodelle sind das Ektromelie/Mausmodell (ROBERTS 1962; ROBBINS et al. 2005; PARKER et al.

2009), Vakzinia/Mausmodell (SMEE et al. 2001; MELAMED et al. 2007),

Kuhpocken/Mausmodell (MARTINEZ et al. 2000),

Kaninchenpocken/Kaninchenmodell (ADAMS et al. 2007; NALCA et al. 2008;

(22)

16

GARZA et al. 2009), Affenpocken/Präriehundmodell (XIAO et al. 2005; HUTSON et al. 2011), Affenpocken/Zieselmodell (SBRANA et al. 2007) und das Affenpocken/Mausmodell (SCHULTZ et al. 2009; EARL et al. 2015). Nichthumane Primaten stellen auf Grund ihrer engen Verwandtschaft mit dem Menschen die geeignetste Spezies dar, um neue Vakzine sowie Therapeutika zu testen (JORDAN u. HRUBY 2006). Eine Literaturübersicht zu den verschiedenen Modellen unter Verwendung von Primaten ist im Ergebnisteil der vorliegenden Arbeit als Publikation dokumentiert (SCHMITT et al. 2014). In der vorliegenden Arbeit wurde das Calpox/Weißbüschelaffenmodell verwendet. Ausgangspunkt dieses neuen Tiermodells war ein Krankheitsausbruch in einer privaten Affenhaltung. Im Jahre 2002 erlagen 30 von 80 Krallenaffen einer schweren systemischen Infektion mit kutanen und mukokutanen Pockenläsionen. Histologisch ließen sich intrazytoplasmatische, eosinophile Einschlusskörperchen in Epithelzellen nachweisen, in denen elektronenmikroskopisch Viruspartikel mit Orthopockenmorphologie feststellbar waren. Aus verändertem Hautgewebe ließ sich ein neues Virus isolieren, das aufgrund der betroffenen Tiergruppe (Callithrichiden) Calpoxvirus genannt wurde. Sequenzanalysen ergaben, dass es sich bei dem Calpoxvirus um ein neuartiges, mit den bisher bekannten Kuhpockenviren eng verwandtes Virus handelt, das geeignet ist, die Pathogenese, Therapie und Prophylaxe von Orthopockenvirusinfektionen bei Primaten einschließlich Mensch zu studieren (MÄTZ-RENSING et al. 2006). Der Schwerpunkt der vorliegenden Studie sind experimentelle Untersuchungen zur Pathogenese der Calpoxvirusinfektion und zu vorhandenen Impfstoffen und ihre Schutzwirkung.

(23)

17

3 Material und Methoden

3.1 Tiere und Haltungsbedingungen

Die Tierversuche wurden im Deutschen Primatenzentrum Göttingen (DPZ) durchgeführt. Die Genehmigungsnummer des Niedersächsischen Landesamtes für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit lautete 33.9-42502-04-12/0745. Für die vorliegende Arbeit wurden 41 Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus) aus der Zuchtkolonie des Deutschen Primatenzentrums Göttingen (DPZ) verwendet, davon 15 für die Pathogenesestudie und 26 für die Impfstudie (Tab. 2 und 3). Für das Versuchsvorhaben wurden die Tiere einige Wochen vor Versuchsbeginn zwecks Eingewöhnung in die BSL2 Tiereinheit des DPZ gebracht. Dort wurden die Tiere in benachbarten Einzelkäfigen aus rostfreiem Edelstahl (130 x 58 x 80 cm) mit Möglichkeit zur visuellen und akustischen Kontaktaufnahme gehalten. Die Raumtemperatur wurde konstant auf 25 +1 °C gehalten. Um den Tag-Nachtrhythmus zu gewährleisten, wurde tagsüber 12 h lang mit Hilfe von entsprechender Beleuchtung Tageslicht imitiert. Die Tiere erhielten eine ausgewogene Diät aus Primatenpellets, Brei und Früchten. Wasser stand jederzeit ad libitum zur Verfügung.

(24)

18

Tab. 2: Angaben zu den Weißbüschelaffen der Pathogenesestudie.

Tiernummer G-Nummer Alter (Jahre)

Geschlecht Euthanasie (dpi) 14991

14484 14325

9109 9110 9045

6 5 6

m m m

3¹ 3¹ 3¹ 14973

14592 14647

8704 8705 8708

3 4 4

w w m

5 5 5 14966

14483 14917

8706 8707 8711

3 4 3

m w w

7 7 7 14306

15149 15121

8709 8710 8712

4 2 3

w w w

10 10 10 14702

15122 15095

9044 9043 9042

5 5 5

m m m

12 12 12²

1Infektion mit 3,5 x 10⁵PFU Calpoxvirus, alle anderen Tiere erhielten 8,3 x 10³ PFU.

2Tier befand sich im Finalstadium der Krankheit.

Dpi: days post infection, w: weiblich, m: männlich, G-Nummer: fortlaufende Sektionsnummer

(25)

19

Tab. 3: Angaben zu den Weißbüschelaffen der Impfstudie.

Gruppe Tiernr. G-Nr. Alter (Jahre)

Geschlecht Vakzine Wartezeit bis zur Infektion

nach 2.

Immunisierung²

Tod (dpi)

1 ¹⁴⁷⁰⁷

14403 14482 14144

8864 8866 8867 8868

4 5 5 5

w w m w

MVA i. m.

4 Wochen

18†

21*

23*

24*

Kontrolle 14406 14646

8861 8862

5 5

m m

PBS i. m. 13*

14*

2 14233

14248 14372 14309

9039 9041 9040 9049

6 6 6 6

m m m w

MVA i. m.

10 Wochen

17*

21*

99**

3 15077

14327 14575 14414

8865 8869 8870 8871

4 5 5 5

w w m w

MVTT i. n.

4 Wochen

19*

84**

90**

Kontrolle 14415 15006

8860 8863

5 4

w w

PBS i. n. 12†

16†

4 14603

14169 14409 14469

9036 9037 9048 9050

6 6 6 6

w m m w

MVTT i. n.

10 Wochen

16*

17*

99**

101**

Kontrolle 14365 9034 5 w PBS i. n. 12†

5 15100

15098

9038 9046

5 5

m m

MVTT p.

o.

10 Wochen

17*

98**

(26)

20

Gruppe Tiernr. G-Nr. Alter (Jahre)

Geschlecht Vakzine Wartezeit bis zur Infektion

nach 2.

Immunisierung²

Tod (dpi)

14334 14478

9047 9108

6 6

m w

98**

101**

Kontrolle 14974 9035 5 m PBS p. o. 14*

1: Die Vakzinen (bzw. PBS) wurden 2 x im Abstand von 4 Wochen in einer Dosis von 5 x 10⁷ PFU verabreicht. i. m.: intramuskulär, i. n.: intranasal, p. o.: peroral

2: Alle Tiere wurden nach der jeweils angegeben Wartezeit intranasal einer Belastungsinfektion von 8,3 x 10³ PFU des Calpoxvirus ausgesetzt.

*: Euthanasie nach Erreichen der Abbruchkriterien, †: spontaner Tod, **: Euthanasie am Versuchsende.

Dpi: days post infection, w: weiblich, m: männlich, Tiernr.: Tiernummer, G-Nr:

G-Nummer (fortlaufende Sektionsnummer).

3.2 Pathogenesestudie

Das für Weißbüschelaffen hochpathogene Calpoxvirus wurde im Rahmen eines spontanen Krankheitsausbruches in einer Privathaltung in Niedersachsen isoliert.

Das Virus ließ sich aus verschiedenen Organproben anzüchten. Mittels einer permanenten Zelllinie konnte ein Virusstock generiert und das vorliegende Tiermodell etabliert werden (MÄTZ-RENSING et al. 2006; KRAMSKI et al. 2010;

MÄTZ-RENSING et al. 2012). Die Infektion der Tiere erfolgte durch die intranasale Applikation einer Calpoxvirussuspension in zwei verschiedenen Dosierungen. 12 Tiere erhielten 8,3 x 10³ PFU Calpoxvirus. 3 Tiere wurden mit einer höheren Dosis (3,5 x 10⁵ PFU) infiziert und bereits nach 3 Tagen euthanasiert. (Abb. 3). Vor der Infektion wurden die Tiere mittels Göttinger Mischung II (Anhang 8.5) narkotisiert. Mit Hilfe einer Pipette wurden pro Nasenloch 50 µl der Virussuspension inokuliert.

Anschließend fand eine tägliche Adspektion durch erfahrene Tierpfleger statt, um klinische Auffälligkeiten und etwaige kutane Pockenläsionen rasch zu erkennen. Für eine parallel verlaufende Dissertation wurden unter Narkose an Tag 3, 5, 7, 10 und 12 zusätzlich Blutproben zur Bestimmung der Viruslast sowie Rachentupfer

(27)

21

gewonnen. Aus Arbeitsschutzgründen wurden die Probenentnahmen unter Sedation vorgenommen (intramuskuläre Injektion von Ketamin, 20-30 mg/kg KG).

Abb. 3: Versuchsschema Pathogenesestudie.

3.3 Impfstudie

Im Rahmen der Impfstudie wurden zwei verschiedene Vakzinen verwendet: MVA (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Czerny, Mikrobiologie und Tierhygiene, Georg-August Universität Göttingen) und MVTT (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Chen, AIDS Institut, Hong Kong Universität, China). Alle Tiere wurden je nach Impfvirus auf unterschiedlichem Weg (intramuskulär, intranasal oder peroral) 2x im 4-wöchigem Abstand immunisiert und anschließend nach 4- bzw.

10-wöchiger Wartezeit intranasal mittels oben beschriebener Methode inokuliert (8,3 x 10³ PFU Calpoxvirus). Zur Kontrolle wurden Tiere in den jeweils unterschiedlichen Varianten mit PBS mock-immunisiert und anschließend ebenfalls mit 8,3 x 10³ PFU Calpoxvirus infiziert (Abb. 4).

(28)

22 Abb. 4: Versuchsschema Impfstudie.

3.4 Temperaturlogger

Um die Körpertemperatur der Tiere nicht-invasiv kontinuierlich aufzuzeichnen und so einen etwaigen Temperaturanstieg nach der Infektion festzustellen, wurden insgesamt 20 Tieren vor Versuchsbeginn subkutan Temperaturlogger (DST-nano-T, Fa. Star-Oddi, Island) im Rückenbereich implantiert (Abb. 5A). Für die Implantation wurden die Tiere mit der Göttinger Mischung II (Anhang 8.5) in Narkose gelegt. Nach Wirkungseintritt der Injektionsnarkose wurden die Tiere im OP-Bereich rasiert, gesäubert und desinfiziert. Ein oberflächlicher Hautschnitt ermöglichte die Implantation des Loggers (Abb. 5B). Das Messintervall der Logger wurde auf 60 Minuten eingestellt. Die Logger aus Aluminiumoxid (17 mmm x 6 mm, 1,3 g) wurden nach der Sektion entfernt und zu Desinfektionszwecken für mindestens 48 h in Cidex® OPA (Johnson & Johnson Company, United Kingdom) aufbewahrt. Die

(29)

23

aufgezeichneten Daten wurden mittels der Mercury Software (Fa. Star-Oddi, Island) ausgelesen.

Abb. 5: DST-nano-T Logger zur Körpertemperaturaufzeichnung.

A: Detailaufnahme des verwendeten Temperaturloggers.

B: Aufnahme der Haut eines Weißbüschelaffens nach Inzision, subkutaner Implantation des Temperaturloggers und vor Verschluss der Wundnaht.

3.5 Probenentnahme

Die Euthanasie erfolgte entweder im Rahmen der Pathogenesestudie zu vorher festgelegten Zeitpunkten innerhalb der Inkubationszeit (3, 5, 7, 10 und 12 Tage nach Infektion) oder bei Erreichen der Abbruchkriterien im Rahmen der Impfstudie. Dabei wurden im Rahmen der täglichen Adspektion verschiedene klinische Parameter mittels eines Punkteschemas bewertet. Sobald die Summe der Bewertungspunkte den Wert 5 überschritt, erfolgte umgehend der Abbruch des Experiments durch schmerzlose Euthanasie (Tab. 4). Die Euthanasie fand in der Sektionshalle des DPZ unter Narkose (GM II, siehe Anhang 9.5) mittels intraperitonealer Injektion von 100 mg/kg Pentobarbital-Natrium (Narcoren, Fa. Merial GmbH, Hallbergmoos, Deutschland) statt. Während der Sektion, in deren Rahmen eine makroskopische Beurteilung der Organe erfolgte, wurden neben Blutproben und Rachentupfer Gewebeproben zahlreicher Organe (Zunge, Trachea, buccale Schleimhaut, Parotis,

(30)

24

Tonsille, Ösophagus, Lunge, Herz, Leber, Niere, Nebenniere, Harnblase, Milz, submandibulärer Lymphknoten, axillärer Lymphknoten, mesenterialer Lymphknoten, inguinaler Lymphknoten, Dickdarm, Dünndarm, Magen, Haut mit und ohne Pockenläsionen, Muskel, Knochenmark, Nasenschleimhaut, Augen, ZNS, Vagina, Ovar, Uterus bzw. Hoden, Nebenhoden, Prostata) asserviert. Für die histologische Untersuchung wurden dabei die Organe in 4%igem Paraformaldehyd fixiert und für die elektronenmikroskopischen Untersuchungen in einer 2,5%igen gepufferter Glutaraldehydlösung. Im Rahmen der Impfstudie, bei der die Tiere teils fulminante Krankheitsverläufe zeigten, wurden zusätzlich kulturell-bakteriologische Untersuchungen durchgeführt, um etwaige sekundäre bakterielle Erreger identifizieren zu können. Hierzu wurden nach Eröffnung des Tierkörpers mit abgeflammtem Sektionsbesteck Inzisionen in Leber, Niere, Milz, Lunge, Herz, Dünndarm, Dickdarm und Großhirn gesetzt und mittels einer sterilen Einmal-Impföse Abstriche vom Organparenchym auf Blutagarplatten ausgestrichen. Zusätzlich wurden Campylobacter- und Mac-Conkey-Agar-Platten beimpft sowie ein Salmonellen-Anreicherungsmedium angesetzt, um das intestinale Keimspektrum zu erfassen.

(31)

25

Tab. 4: Klinisch-hämatologisches Bewertungsschema zur Definition des Versuchsabbruchs.

(32)

26 3.6 Präparation für die Lichtmikroskopie 3.6.1 Histologie

Die im Rahmen der Sektion gewonnenen Gewebeproben wurden nach der Entnahme in 4%igem, neutral gepufferten Paraformaldehyd für mind. 24 h fixiert, anschließend zugeschnitten und in Einbettkassetten gelegt. Die Einbettung erfolgte im Einbettautomaten Shandon Excelsior ES (Fa. Thermo Fisher Scientific, Dreieich, Deutschland) nach laborüblichem Protokoll (siehe Anhang 8.1.1). Mit Hilfe der Ausgießstation EC 350-1 (Fa. Thermo Fisher, Scientific, Dreieich, Deutschland) wurden die Proben ausgegossen und zum Aushärten in Stahlblechformen gelegt.

Anschließend wurden die Paraffinblöcke aus den Formen herausgenommen und auf Eis gestellt. Nun wurden mit dem Schlittenmikrotom HM 440 E (Fa. Microm, Walldorf, Deutschland) 2-4 µm dicke Schnitte hergestellt, die mit einem in Eiswasser angefeuchteten Streifen Durchschlagpapier aufgenommen wurden. Zur faltenfreien Ausdehnung wurden sie anschließend in ein 40 °C warmes Wasserbad gelegt und auf Standardobjektträger, für die Immunhistochemie zusätzlich auf silanisierte Superfrost Plus® Objektträger (Menzel-Gläser, Fa. Menzel GmbH, Braunschweig, Deutschland) überführt. Zum Trocknen wurden sie über Nacht bei 37 °C im Wärmeschrank gelagert und anschließend bei Raumtemperatur aufbewahrt. Die hergestellten Schnitte wurden mit Hilfe des Färbeautomaten Varistain Gemini (Fa.

Thermo Fisher Scientific, Dreieich, Deutschland) mit der Hämatoxylin-Eosin-Färbung gefärbt (siehe Anhang) und mit Eukitt (O. Kindler GmbH, Freiburg, Deutschland) eingedeckt.

3.6.2 Immunhistochemie

Um die Verbreitung des Calpoxvirusantigens in den einzelnen Organen darzustellen, wurden immunhistochemische Untersuchungen an den Paraffinschnitten unter Verwendung der SABC-Methode (Streptavidin-Biotin-Komplex) mit Fast Red als Chromogen durchgeführt. Dies erfolgte im automatisierten Immunfärbeautomat Discovery XT (Fa. Roche, Mannheim, Deutschland). Die hierzu gehörigen Protokolle befinden sich im Anhang. Als Primärantikörper kam zunächst der Pockenantikörper VIG (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Heinz Ellerbrok, Robert-Koch

(33)

27

Institut, Berlin) in der Verdünnung 1:500 zum Einsatz. Dabei stellte sich heraus, dass sich besonders bei den Kontrolltieren ein sehr hoher Hintergrund darstellte. Aus diesem Grund wurde nach der Auswertung der Pathogenesestudie ein zweiter Antikörper (rabbit anti-Vaccinia virus, Accurate Chemical, Westbury, New York) etabliert, der eine wesentlich geringere Hintergrundfärbung verursachte. Der Universal- Sekundärantikörper (VENTANA, Frankfurt am Main, Deutschland) wurde nach Angabe des Herstellers eingesetzt. Die Auswertung erfolgte am Lichtmikroskop (Olympus BX50). Die angefertigten Schnitte wurden einer semiquantitativen Auswertung unterzogen. Es wurden vier Grade definiert, für die in jedem Präparat in repräsentativen Bereichen der Prozentsatz angefärbter Zellen pro Gesichtsfeld mit dem 40er Objektiv ermittelt wurde (Tab. 5).

Tab. 5: Bewertungsschema für die semiquantitative Beurteilung infizierter Zellen.

Beschreibung Bewertung Positive Zellen pro HPF

Geringstgradig (+) Einzelzellen

Geringgradig + <5%

Mittelgradig ++ <50%

Hochgradig +++ 50-80%

HPF: high power field

Um die Spezifität der Antikörper zu überprüfen, lief als Negativkontrolle in jeder Färbeserie ein sogenanntes Leerpräparat mit, bei dem der Primärantikörper weggelassen wurde. Als zusätzliche Negativkontrolle wurde Gewebe von nichtinfizierten Weißbüschelaffen mit dem Primärantikörper inkubiert. Weiterhin kam eine jeweils mitgeführte Positivkontrolle (ein Hautschnitt mit Pocken typischen Läsionen) aus vorherigen Serien zum Einsatz.

(34)

28 3.7 Transmissionselektronenmikroskopie

Alle untersuchten Organe wurden in frisch angesetzter, gekühlter, 2,5%ig gepufferter Glutaraldehydlösung für mindestens 24 h im Kühlschrank fixiert. Anschließend wurden die Proben in einem Epon-Gemisch nach LUFT (1961, Anhang 8.2.1) im Lynx-Einbettautomaten (Fa. Leica, Bensheim, Deutschland) nach laborüblichem Protokoll eingebettet (Anhang 8.2.2). Es folgte eine 24-stündige Polymerisation des Epoxidharzes bei 60 °C. Mit einer Fräse (Reichert, Ultratrim, Fa. Leica, Bensheim, Deutschland) wurden die Blöcke auf die Größe des Gewebes zugetrimmt. Am Ultramikrotom (Reichert Ultracut S, Fa. Leica, Bensheim, Deutschland) wurde mit Hilfe eines Diamantmessers (Fa. Diatome, Bienne, Schweiz) 0,5 µm dicke Semidünnschnitte hergestellt. Die Schnitte wurden auf Objektträger überführt, bei 60 °C getrocknet und mit Methylenblau nach RICHARDSON et al. (1960) gefärbt (Anhang 8.2.3). Im Anschluss wurden die Schnitte mit Eukitt (O. Kindler GmbH, Freiburg, Deutschland) eingedeckt und lichtmikroskopisch untersucht. Interessante Bereiche wurden zeichnerisch dokumentiert und von Hand zugetrimmt. Daraufhin wurden am Ultramikrotom mit Hilfe des Diamantmessers 60-80 nm dicke Ultradünnschnitte angefertigt. Diese wurden auf Kupferlochblenden (single slot 1x2, Fa. Piano, Wetzlar, Deutschland) aufgezogen und mit Bleizitrat und Uranylacetat kontrastiert. Die transmissionselektronenmikroskopische Untersuchung wurde am ZEISS-Elektronenmikroskop (EM 10 C, Fa. Zeiss, Oberkochen, Deutschland) durchgeführt. Die Dokumentation der Befunde erfolgte mit einer integrierten Digitalkamera (Slow-scan CCD-Camera for TEM, Fa. Zeiss, Oberkochen, Deutschland) und dem Bildverarbeitungsprogramm iTEM 5.0 (Fa. Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Münster, Deutschland).

(35)

29

4 Ergebnisse

Die Ergebnisse werden in einer Publikation und zwei Manuskripten präsentiert.

Mittels einer Literaturstudie (4.1) wurden vor Beginn der experimentellen Arbeiten diverse Tiermodelle zu Untersuchungen von Orthopockenvirusinfektionen deskriptiv und vergleichend dargestellt. Die Arbeit mit dem Titel

„Non-human Primate Models of Orthopoxvirus Infections“

Anne Schmitt, Kerstin Mätz-Rensing und Franz-Josef Kaup wurde in Veterinary Sciences (2014) 1, 40-62 veröffentlicht.

Die experimentellen Arbeiten und ihre Ergebnisse wurden in zwei zur Veröffentlichung vorgesehenen Manuskripten dokumentiert. Das Manuskript (4.2) mit dem Titel

“Dynamics of pathological findings during experimental calpox virus infection of common marmosets (Callithrix jacchus)”

Anne Schmitt, C. Stahl-Hennig, L. Gan, T. Shi, H. Ellerbrok, K. Mätz-Rensing and F.-J. Kaup

stellt die Pathogenese einer experimentellen Calpoxvirusinfektion auf morphologischer Ebene vor. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach experimenteller Infektion wurden Tiere euthanasiert und untersucht, um Verlauf, Ausbreitung und involvierte Organsysteme darzustellen.

Das zweite Manuskript (4.3) mit dem Titel

“Evaluation of vaccination with MVA and MVTT in experimental calpox virus infection in marmosets and associated pathology”

A. Schmitt, L. Gan, C. Stahl-Hennig, K. Mätz-Rensing and F.-J. Kaup

befasst sich mit den Auswirkungen zweier Impfstoffe im Rahmen einer experimentellen Calpoxvirusinfektion. Der Fokus lag dabei auf den morphologischen

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30

Veränderungen, die bei den Impfdurchbrüchen auftraten, während die virologischen Untersuchungen im Rahmen eines parallel durchgeführten Dissertationsvorhabens dokumentiert wurden.

4.1 Publikation: „Non-human Primate Models of Orthopoxvirus Infections“

Um einen Überblick über die bisher angewandten nichthumanen Primatenmodelle für Orthopockenvireninfektionen zu erhalten, wurde eine Literaturstudie angefertigt, in die auch die Ergebnisse vorab erfolgter Untersuchungen am Calpox-Tiermodell einflossen. So konnten die Vorteile des verwendeten Tiermodelles gegenüber anderen nichthumanen Primatenmodellen, die im Rahmen von Orthopockeninfektionen zur Verfügung stehen, dargestellt und verglichen werden.

Das von uns mitentwickelte Calpox-Modell im Krallenaffen zeichnet sich dabei besonders durch folgende Vorteile aus:

1) leichtere Handhabung und einfachere Haltungsbedingungen der Krallenaffen gegenüber Altweltaffenspezies

2) Umgang mit Calpoxviren ermöglicht im Vergleich zu anderen

Orthopockenviren (z.B. Affenpocken) risikoloseres Arbeiten unter BSL2 Bedingungen

3) eine vergleichsweise niedrige Infektionsdosis und im Hinblick auf Variolainfektion des Menschen identische Inokulationsroute (intranasal, aerogen)

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veterinary sciences

ISSN 2306-7381 www.mdpi.com/journal/vetsci Review

Non-Human Primate Models of Orthopoxvirus Infections

Anne Schmitt, Kerstin Mätz-Rensing and Franz-Josef Kaup *

Pathology Unit, German Primate Center, Leibniz Institute for Primate Research, Kellnerweg 4, 37077 Göttingen, Germany; E-Mails: aschmitt@dpz.eu (A.S.); kmaetz@dpz.eu (K.M.-R.)

* Author to whom correspondence should be addressed; E-Mail: fkaup@gwdg.de;

Tel.: +49-551-3851-241; Fax: +49-551-3851-442.

Received: 23 April 2014; in revised form: 4 June 2014 / Accepted: 5 June 2014 / Published: 10 June 2014

Abstract: Smallpox, one of the most destructive diseases, has been successfully eradicated through a worldwide vaccination campaign. Since immunization programs have been stopped, the number of people with vaccinia virus induced immunity is declining. This leads to an increase in orthopoxvirus (OPXV) infections in humans, as well as in animals.

Additionally, potential abuse of Variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, or monkeypox virus, as agents of bioterrorism, has renewed interest in development of antiviral therapeutics and of safer vaccines. Due to its high risk potential, research with VARV is restricted to two laboratories worldwide. Therefore, numerous animal models of other OPXV infections have been developed in the last decades. Non-human primates are especially suitable due to their close relationship to humans. This article provides a review about on non-human primate models of orthopoxvirus infections.

Keywords: non-human primate; smallpox; monkeypox; cowpox; animal models

1. Introduction

The genus Orthopoxvirus (OPXV), as part of the Poxviridae, includes, among others, the species variola virus (VARV), monkeypox virus (MPXV), cowpox virus (CPXV), vaccinia virus (VACV), and mousepox virus. The causative agent of smallpox, VARV, was one of the most dangerous viruses known to mankind, being responsible for the death of 300 to 500 million people. Fortunately, smallpox has been successfully eradicated by a worldwide vaccination campaign under the leadership of the World Health Organization (WHO) [1]. Because of the inferior safety profile of the smallpox vaccine

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in immune compromised persons, pregnant women, or persons with atopic dermatitis, routine smallpox vaccinations were stopped in the 1980s following a recommendation from WHO. Only military personnel, selected healthcare, and laboratory workers still get the vaccine. Consequently, the number of people with lacking immunity, not only against smallpox, but also against other zoonotic OPXV infections is increasing [2], in humans, as well as in animals [3–7]. In the Democratic Republic of Congo there is a massive (20-fold) increase in human monkeypox incidence [8]. Additionally, it is feared that smallpox could be used as a biological weapon [9–11]. There is, thus far, no pharmaceutic treatment available and vaccines are partly unsafe, therefore, more research concerning orthopoxvirus infections is very important. Because of its high risk potential, research with VARV is limited to two BSL4 containments worldwide (Atlanta and Novosibirsk) and is, therefore, highly restricted. Suitable animal models are needed in which an orthopoxvirus causes a disease course, morbidity, and mortality, similar to human disease. Furthermore, the route of infection and transmission should be mimicked, and the infectious dose should be similar to that of humans. Unfortunately, no animal model fulfills all these criteria [12,13]. Nevertheless, these models can help to get an insight into the pathogenesis, and are a good tool to test the efficacy of antiviral compounds and of new vaccines. Furthermore, these animal models are important to fulfill the requirements of the animal efficacy rule. This rule was promulgated by the Food and Drug Administration (FDA) and demands a testing of medical countermeasures in at least two different animal models when clinical trials in humans are unethical or impossible [14].

In the last decades, considerable progress has been made in development of new animal models for OPXV infections [12,15–19]. CPXV, MPXV, VACV, VARV, ectromelia virus, rabbitpox virus, and camelpox virus have been used in animal models. Small animal models, other than non-human primates (NHP) models, have the advantage that large numbers of animals are available. Furthermore, maintenance costs are lower compared to monkeys. However, small animal models have limitations: Disease pathology, a shortened time course of disease, pharmacokinetic behavior of compounds, and tissue distribution can vary from human conditions [20]. Therefore, animals, which are closely related to humans, and whose physiological and pathological reactions are, therefore, more comparable to humans, are more suitable. NHP are the next relatives to humans, recapitulate human condition as closely as possible, and are, therefore, very appropriate to evaluate new vaccines, treatments, or pathogenesis [21]. Thus, NHP are the gold-standard for OPXV models, as their resemblance to humans allows the best predicative value for effects or side effects of new therapeutics or vaccines in humans [13].

In the following, we will review OPXV models in NHP, arranged by virus species and inoculation route (see Table 1).

2. Monkeypox

MPXV is an Orthopoxvirus which causes a zoonotic disease characterized by symptoms similar to smallpox but with a lethality rate of 1%–8% [2,22]. In all probability, some monkeypox infections were misinterpreted as smallpox because of the lack of laboratory testing [23]. One clinical symptom, which allows a differentiation from smallpox, is lymphadenopathy, which could lead to the conclusion that there is a more effective immune response [24,25]. MPXV was first detected in 1957 in captive primates in Denmark [26]. Not only are several species of NHP (rhesus macaques (see Figures 1 and 2),

(39)

cynomolgus macaques, and chimpanzees), but also a broad spectrum of mammals, are susceptible to the disease [15,16]. In 1960, a naturally occurring MPXV outbreak was reported in cynomolgus and rhesus macaques [27]. Human monkeypox emerged in the 1970s in Western and Central Africa and today still leads to outbreaks in the rural villages near the rainforests [8]. The natural host is still unknown, but, with the utmost probability, African squirrels and/or other rodents play an important role [15]. Only once, the virus could be found in a carcass of a Funiscirus squirrel in Democratic Republic of the Congo [28]. Probably, the virus is transmitted via eating infected bushmeat, via saliva/respiratory excretions, or direct contact with crust material. However, the exact transmission route for MPXV is unclear. [12,15,22,24]. In 2003, the disease was accidentally introduced into the U.S. due to infected wild rodents imported from Africa, which transmitted the virus to prairie dogs (Cynomys ludovicianus) and then, via the prairie dogs, to approximately 40 humans [29–31].

Remarkably, the prairie dogs were the only infection source for the humans [15]. Discontinuation of vaccination after eradication of smallpox, inadequate health infrastructure and bushmeat consumption has given rise to increasing susceptibility to MPXV infection in the African population [23,32].

Studies with NHP are useful for understanding monkeypox disease. Additionally, NHP models of MPXV are a good alternative to VARV models, because they are less dangerous for laboratory workers and researchers. Compared to other MPXV susceptible species, such as prairie dogs, NHP are more suitable due to the close relationship to humans. Furthermore, they get better accustomed to the research conditions than other susceptible species, such as prairie dogs [15].

NHP can be infected with MPXV experimentally via different techniques, which are described below.

Figure 1. Monkeypox virus infected Macaca mulatta (M. mulatta) with multifocal severe papular dermatitis.

(40)

Figure 2. Skin of Monkeypox virus infected M. mulatta with multiple vesicular and erosive to ulcerative skin lesions.

2.1. Intramuscular

In the late 1960s, Wenner and colleagues developed a model in which they inoculated 10⁵ plaque-forming unit (PFU) of MPXV intramuscularly in cynomolgus and rhesus macaques [33].

Animals developed a vesicular to pustular rash and became diseased with a systemic viral infection.

Disadvantages of this model are skin and muscle necrosis at the inoculation site [16].

In a study conducted in 1971, six baboons (Papio cynocephalus) were challenged intramuscularly with MPXV and all became infected. Typical lesions like vesicular pustules on the extremities, face, lips, and buccal mucosa, happened after around eight days post infection. One single animal succumbed to the disease. Challenging surviving animals with MPXV after first experiment proved the acquired immunity and the possibility to protect monkey colonies in captivity by immunizing [34].

2.2. Skin Scarification

In a following study, Heberling and Kalter challenged baboons with MPXV via skin scarification and showed an increased resistance to MPXV with ageing [35]. Baboons aged approximately one year developed typical pox lesions, fever, and lymphadenopathy, but did not die. The younger animals (approximately three-months old) showed a similar disease course, but five of ten animals succumbed to the disease.

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2.3. Intravenous

Though the intravenous infection of MPXV causes a fulminant disease with severe lesions, which are very similar to smallpox, this model has several disadvantages: Key events like infection of the upper respiratory tract, primary viremia phase, and prodromal phases are skipped. Additionally, the route of transmission does not resemble the natural route of transmission of smallpox, which happens through close contact or inhalated aerosols. Furthermore, the infectious dose is much higher than the natural infection dose [36]. However, intravenous application of MPXV produces a course of disease that is appropriate to evaluate the efficacy and benefits of anti-OPXV therapeutics and vaccines.

Huggins and colleagues infected eight male cynomolgus macaques with a Zaire strain of MPXV via intravenous inoculation and proved the efficacy of the antiviral drug Tecovirimat (previously known as ST-246) dosed with 300 mg/kg/day. Tecovirimat was able to protect animals from disease and death.

The infection with MPXV in the control group triggered a vesiculopustular rash accompanied by fever, elevated white blood cell count, lymphadenopathy, splenomegaly, and pulmonary edema [20]. Because of the fact that high drug doses at early times post infection were given, a follow-up study was conducted in which lower doses at later times were compared. The researchers conclude that 400 mg, once daily for 14 days after clinical diagnosis, can be an effective treatment for smallpox and monkeypox in humans [37].

To visualize viral infection, researchers inserted a gene encoding green fluorescent protein (GFP) into MPXV Zaire-79 and infected cynomolgus macaques intravenously. This way, initial lesions could be detected under fluorescent light one to two days earlier. Fluorescence was most intense in lesions of the oral cavity and weakest in skin of the palms and soles, which is protected by a thick layer of keratin [38].

Hooper and colleagues challenged rhesus macaques intravenously with MPXV after immunizing with a DNA vaccine consisting of four vaccinia virus genes. Unvaccinated control animals died on days seven, ten, and fourteen, showing hemorrhages in multiple organs, lymphadenopathy, and vesiculopustular rashes on the face and the hands. With a subunit vaccine, immunized animals did not develop severe disease and survived. This is a promising study, because a subunit vaccine does not have the feared side effects of the present smallpox vaccine [39]. In a following study, they tried to boost immune response to the gene-based vaccine using adjuvants like granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) and Escherichia coli heat-labile enterotoxin. Unvaccinated control animals became severely ill, four of the five had to be euthanized, whereas all five animals vaccinated with gene-based vaccine with adjuvants survived without shedding virus, but one developed severe disease. Control animals which were vaccinated with modified Virus Ankara (MVA) shed virus, three of five became heavily ill [40].

To get more information about innate immunity in MPXV infection, Song and colleagues challenged rhesus macaques intravenously with MPXV and analyzed the changes in natural killer (NK) cell numbers, NK cell proliferation, chemokine receptor expression and cellular functions. They found that NK cell frequency and the absolute number in the blood and in the lymphoid tissues increase following MPXV infection. Interestingly, MPXV infection induces a reduced migrating capacity of NK cells and a reduced degranulation capacity. Thus, cytotoxic effects of cytokines were not reached [41].