Aus dem Deutschen Primatenzentrum Göttingen
Untersuchungen zur Normalstruktur des GALT-Systems von Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus)
I N A U G U R A L-D I S S E R T A T I O N zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Murat Caglar aus Marktredwitz
Hannover 2005
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. F.-J. Kaup
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. F.-J. Kaup 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. W. Meyer
Tag der mündlichen Prüfung: 24.11.2005
Meiner Frau
INHALTSVERZEICHNIS
1 Einleitung ... 9
2 Literaturübersicht... 11
2.1 Das Darmschleimhautimmunsystem ...11
2.1.1 Lymphfollikel und Peyer’sche Platten ...14
2.1.2 Lymphozyten der Lamina propria...16
2.1.3 Intraepitheliale Lymphozyten ...17
2.2 Das Follikel-assoziierte Epithel ...18
2.2.1 Morphologie der M-Zellen...18
2.2.2 Funktion und Ontogenese der M-Zellen ...20
3 Eigene Untersuchungen... 24
3.1 Material und Methoden...24
3.1.1 Tiermaterial...24
3.1.1.1 Haltung der Tiere ...24
3.1.1.2 Fütterung der Tiere ...26
3.1.2 Probenentnahme ...27
3.1.2.1 Präparation der Proben für die Lichtmikroskopie ...29
3.1.2.2 Präparation für die Transmissionselektronenmikroskopie ...30
3.1.2.3 Immunhistochemische Untersuchungen...31
3.1.2.4 Auswertung und Dokumentation...32
3.2 Ergebnisse ...33
3.2.1 Messungen der Darmabschnitte ...33
3.2.2 Lichtmikroskopische Untersuchungen ...35
3.2.2.1 Lage der lymphatischen Einrichtungen im Dünn- und Dickdarm ...37
3.2.2.2 Lichtmikroskopisch erkennbare Einheiten des GALT-Systems...39
3.2.2.3 Strukturelle Eigenschaften der lymphatischen Einrichtungen ...40
3.2.2.4 Durchmesser und Größe der Solitärfollikel ...40
3.2.2.5 Solitärfollikel im Dünndarm ...41
3.2.2.6 Peyer’sche Platten...42
3.2.2.7 Lymphatische Einrichtungen im Zäkum, Kolon und Rektum...42
3.2.3 Ergebnisse der Transmissionselektronenmikroskopie...53
3.2.3.1 Follikel-assoziiertes Epithel ...53
3.2.3.2 M-Zelle...55
3.2.3.3 Sonstige Zellen im FAE ...57
3.2.4 Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen ...65
4 Diskussion ... 69
5 Zusammenfassung... 79
6 Summary ... 81
7 Literaturverzeichnis... 83
8 Anhang ... 99
8.1 Puffer und Lösungen...99
8.2 Färbungen ...101
8.3 Laborprotokolle für Einbettungen und Immunhistochemie...102
8.4 Tabellen- und Abbildungsverzeichnis ...106
Verzeichnis relevanter Abkürzungen
Aqua bidest. doppelt destilliertes Wasser Aqua dest. destilliertes Wasser
BALT Bronchus associated lymphoid tissue CMIS Common mucosal immune system DALT Duct associated lymphoid tissue DPZ Deutsches Primatenzentrum et al. et alii (und andere)
Fa. Firma
FAE Follicle associated epithelium GALT Gut associated lymphoid tissue G-Nr. G-Nummer (Sektionsnummer) H.-E. Hämalaun-Eosin-Färbung IEL Intraepitheliale Lymphozyten LGK Lymphoglanduläre Komplexe LPL Lamina propria Lymphozyten
MALT Mucosal associated lymphoid tissue NALT Nasal associated lymphoid tissue
PP Peyer’sche Platten
RT Raumtemperatur
WMS Wasting Marmoset Syndrom
1 EINLEITUNG
Der Weißbüschelaffe (Callithrix jacchus) ist ein Neuweltaffe (Platyrrhini) und gehört zur Gattung der Marmosetten (Callithrix) aus der Familie der Krallenaffen (Callithricidae) (ABBOTT et al. 2003). Es sind kleine, in den Regenwäldern im Osten und Nordosten Brasiliens beheimatete Äffchen mit büschelartigen Haaren an den Ohren. Sie werden bis zu 25 cm groß und haben einen bis zu 35 cm langen Schwanz. Die Geschlechtsreife erreichen sie im Alter von 18 Monaten bis zum zweiten Lebensjahr. Ihr Körpergewicht beträgt im erwachsenen Alter 350–450 g (ABBOTT et al. 2003). Ihre Trächtigkeit dauert 148 Tage und sie gebären häufig Zwillinge oder Drillinge. Sie leben in bis zu 20 köpfigen Sozialgruppen zusammen, in denen starke soziale Beziehungen herrschen. An der Spitze der Gruppe steht ein ranghohes Pärchen. Ab dem Alter von acht Jahren kommen die ersten Alterserscheinungen, wie z. B. graue Haare am Kopf, und ab zehn Jahren werden sie anfälliger gegen verschiedene Krankheitsbilder, wie z. B. entzündliche Darmerkrankungen (TARDIF et al. 2003).
Marmosetten werden häufig in der biomedizinischen Forschung verwendet. Die geringe Körpermasse des erwachsenen Tieres gibt ihnen einen Vorteil gegenüber den größeren (3–15 kg) Altweltaffen (Catarrhini) (ABBOTT et al. 2003). Die Vorteile beziehen sich auf ihre Größe, Anzahl der Nachkommen, Haltungskosten und geringeres Infektionsrisiko im Umgang mit Menschen. Sie werden aufgrund dieser Vorteile und verschiedener biologischer Eigenschaften in zahlreichen Feldern der biomedizinischen Forschung eingesetzt. Dazu gehören u. a. die Infektionsmedizin, Reproduktionsmedizin, Neurologie und Toxikologie (PRYCE et al. 1997, ZÜHLKE u.
WEINBAUER 2003, MANSFIELD 2003).
Sowohl in Versuchstiereinrichtungen als auch in zoologischen Gärten tritt bei dieser Spezies ein Krankheitsbild auf, das als Wasting Marmoset Syndrom (WMS) bezeichnet wird und mit einer chronischen Enteritis einhergeht (KING 1976, CHALIFOUX et al. 1982). Das Krankheitsbild ist in seiner Ätiologie und Pathogenese
weitestgehend unklar. Weiterhin fehlen für Weißbüschelaffen grundlegende Daten zur Morphologie und Physiologie des Intestinaltraktes. Da die Pathogenese entzündlicher Darmerkrankungen häufig mit reaktiven Veränderungen am Darmschleimhautimmunsystem (GALT) einhergeht, war das Ziel dieser Arbeit die grundlegende morphologische Charakterisierung dieses Systems beim Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus). Dazu gehörten das lichtmikroskopische Verteilungsmuster der verschiedenen Strukturen des GALT-Systems, die Austestung von Antikörpern, die für die immunhistochemische Darstellung bestimmter Abwehrzellen dienen sollen, und die transmissionselektronenmikroskopische Analyse des Follikel-assoziierten Epithels (FAE).
2 LITERATURÜBERSICHT
2.1 Das Darmschleimhautimmunsystem
Der Gastrointestinaltrakt ist durch seine außergewöhnlich große Oberfläche ständig mit Antigenen und teilweise pathogenen Erregern in Kontakt. Die intestinale Barriere ist für Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht, wie z. B. Aminosäuren, Fettsäuren und Monosacchariden durchlässig, verhindert jedoch bei gesunden Organismen den Durchgang von Makromolekülen und größeren Partikeln (BJARNASON et al. 1995). Der Organismus wird durch eine Reihe unspezifischer Abwehrmechanismen, wie z. B. die Schleimschicht der Mukosa, die peristaltischen Kontraktionen, Makrophagen und durch ein spezialisiertes Immunsystem im Darmtrakt, das so genannte „gut associated lymphatic tissue“ (GALT) geschützt. Mit ca. 70 – 80 % aller Immunglobulin-produzierenden Plasmazellen in der intestinalen Mukosa stellt sich der Darm als das größte Antikörper-sezernierende Organ des Körpers dar (FIOCCHI 1989).
Das GALT ist ein wichtiger Bestandteil des „common mucosal immune systems”
(CMIS) (BIENENSTOCK 1974, 1984; BIENENSTOCK et al. 1980; MCDERMOTT et al. 1982). Die verschiedenen lymphatischen Einrichtungen des Immunsystems sind durch die als „homing" bezeichnete Rückwanderung von Lymphozyten in die Mukosa funktionell miteinander verbunden (BIENENSTOCK u. BEFUS 1980; MCNABB u.
TOMASI 1981). Die Wanderung der B-Lymphozyten über die intestinalen Lymphbahnen, mesenterialen Lymphknoten, den Ductus thoracicus und über die peripheren Blutbahnen zurück zur Lamina propria mucosae im Darm führte zu der Bezeichnung „mucosal associated lymphoid tissue” (MALT) (BIENENSTOCK et al.
1978; LYDYARD u. GROSSI 1991). Diese Fähigkeit der B-Lymphozyten wurde schon in den frühen sechziger Jahren festgestellt (JACOBSON et al. 1961).
Ebenfalls wurde die Zirkulation der T-Lymphozyten innerhalb des CMIS in
verschiedenen Studien beobachtet (DUNKLEY u. HUSBAND 1987, WESTERMANN u. PABST 1996; KANTELE et al. 1999).
Das MALT ist in einer Form von solitären oder aggregierten Lymphfollikeln im ganzen Körper organisiert. Dazu zählen das „bronchus associated lymphoid tissue"
(BALT) der Lunge, das „nasal associated lymphoid tissue“ (NALT) der Nasenschleimhaut, das „duct associated lymphoid tissue“ (DALT) der Speicheldrüsen und weitere lymphatische Ansammlungen, die in der Milchdrüse, in den Gaumenmandeln, in der Konjunktiva des Auges und im Urogenitaltrakt verbreitet sind (BIENENSTOCK u. BEFUS 1980; GEBERT et al. 1996; OGRA et al. 2001;
AZZALI 2003).
Die lymphatischen Einrichtungen des GALT tauchen je nach Lokalisation in verschiedener Form, Größe und Anzahl auf. Zu ihnen zählen unter anderem die Solitärfollikel im Jejunum, die Peyer’schen Platten (PP) im Ileum, sowie der Appendix vermiformis des Menschen (GEBERT et al. 2000). Die Lymphfollikel im Dickdarm werden als lymphoglanduläre Komplexe (LGK) bezeichnet (MORFITT u. POHLENZ 1989). In den vergangenen Jahren wurde auch von speziellen, mit Lymphozyten gefüllten Zotten im Dünndarm („lymphocyt filled villi“) (MOGHADDAMI et al. 1998) und von Ansammlungen von Vorläufer-T-Zellen in den Krypten der Lamina propria mucosae („cryptopatches“) berichtet (SAITO et al. 1998; SUZUKI et al. 2000). Diese Lamina propria Krypten werden als weitere Bestandteile des GALT und als solche Lokalisationen angesehen, in denen sich Thymus unabhängige intraepitheliale Lymphozyten (IEL) entwickeln. Den lymphatischen Strukturen des GALT, im Besonderen den Peyer’schen Platten, dem Appendix vermiformis und den Solitärfollikeln kommt eine überragende Bedeutung zu. Zum einen wegen ihrer Lokalisation in der Darmwand, des bakterienreichsten Hohlraumsystems des Körpers, und zum anderen für die Erhaltung des Gleichgewichts zwischen Mikroflora und Wirtsorganismus (RUCHTI et al. 1978).
Das GALT besteht aus zahlreichen Schleimhaut-assoziierten Lymphfollikeln, die in der Lamina propria und Tela submucosa eingebettet sind, aus diffus in der Lamina propria verteilten Lymphozyten (LPL) sowie intraepithelialen Lymphozyten (IEL) (FIOCCHI 1989; NICANDER et al. 1993).
Abbildung 1: Schematische Darstellung eines Lymphfollikels der Peyer’schen Platten im Ileum (PP). Das Follikel-assoziierte Epithel mit M-Zellen (M), B- (B) und T- Lymphozyten (T), intraepitheliale Lymphozyten (IEL), dendritische Zellen (DZ), Plasmazellen (P), Makrophagen (Mφ), Mastzellen (MZ) (nach JUNGI 2000).
2.1.1 Lymphfollikel und Peyer’sche Platten
Die im Dünndarm liegenden Lymphfollikel werden als Einzellymphknötchen, Noduli lymphatici solitarii, sowie als aggregierte Lymphknötchen, Noduli lymphatici aggregatii, bezeichnet (LIEBLER et al. 1988; MORFITT u. POHLENZ 1989; UHR et al. 1993; SCHNAPPER 1995). Im Dickdarm stellen Lymphfollikel mit den Darmkrypten eine besondere Einheit dar und werden lymphoglanduläre Komplexe (LGK) genannt (MORFITT u. POHLENZ 1989; UHR 1993). Die aggregierten Lymphfollikel im Dünndarm des Menschen wurden erstmals im Jahre 1677 von dem Schweizer Arzt und Anatom Conrad Peyer (1653 - 1712) beschrieben und nach seinem Namen benannt (GEBBERS u. LAISSUE 1989). Ausführliche und vergleichende Untersuchungen wurden im Jahr 1965 von CORNES (1965) durchgeführt.
Die Lymphfollikel des GALT sind durch ein in das Lumen vorgewölbtes Epithel, mit wenigen Becherzellen, durch Anhäufungen der lymphoiden Zellen und durch die einzigartigen M-Zellen gekennzeichnet (BHALLA u. OWEN, 1982). Ihre Entwicklung fängt im Fötenalter an und reift nach der Geburt weiter aus (CARLENS 1928).
BRAEGGER und Mitarbeiter (1992) untersuchten im menschlichen Fötus das mukosale Immunsystem und fanden in der 19. Schwangerschaftswoche gut entwickelte PP mit T- und B-Zellzonen. Man findet die Lymphfollikel in regelmäßigen Abständen in Ileum, Jejunum und Duodenum (SOBHON 1971). Während die im Ileum verteilten PP überwiegend antimesenterial liegen (CARLENS 1928;
SAHLENDER 1989; UHR 1993; DOUGHRI et al. 1972), findet man die in Duodenum und Jejunum verteilten Lymphfollikel auch in der lateralen Wand des Darmes (CARLENS 1928; LIEBLER 1985; PABST 1987; SAHLENDER 1989; UHR 1993;
SCHNAPPER 1995).
Die Anzahl, Größe und Verteilung der PP ist spezies- und altersabhängig (LIEBLER 1985; POSPISCHIL 1989). Es wurden Unterschiede zwischen den PP der Maus und den PP des Menschen gefunden. Die PP der Maus sind rund und enthalten weniger
als zehn Lymphfollikel. Bei den Menschen dagegen sind sie mehrere Zentimeter lang und bestehen aus mehr als 100 Lymphfollikeln. Die Zahl der Lymphfollikel bei einem über 90 Jahre alten Menschen verringert sich mit dem Alter bis zu etwa 50 PP (CORNES 1965). Bei erwachsenen Menschen liegt die Zahl im Durchschnitt bei 240 PP (SPENCER et al.1986). Die Größe sowie der Aufbau der PP ist vom Alter und von den mikrobiellen Einflüssen abhängig (ROTHKÖTTER u. PABST 1989). Es wurde beobachtet, dass Mäuse, die zunächst keimfrei und anschließend in einer normalen Umwelt gehalten wurden, mehr PP aufwiesen als vorher (SMITH et al.
1987). So wurden auch bei spezifisch pathogenfrei, keimfrei und konventionell gehaltenen Schweinen Unterschiede sowohl in der Größe der PP als auch in der Menge der ausgeschiedenen Immunglobuline festgestellt (BARMAN et al. 1997).
Die PP werden in der Struktur in vier Kompartimente unterteilt. Die Lymphfollikel liegen unter der Lamina muscularis mucosa und bestehen aus einem Keimzentrum und einer Korona, die das Keimzentrum umhüllt. Lumenseitig über dem Lymphfollikel befindet sich das „Dome-Areal“, das mit dem Follikel-assoziierten Epithel (FAE) bedeckt ist. Der Bereich zwischen den Lymphfollikeln wird interfollikuläre Zone oder auch parafollikuläre Zone genannt (ABE u. ITO 1978; POSPISCHIL 1989; GEBERT et al. 1996, 2000).
Das Keimzentrum liegt in der Tela submucosa und enthält neben einigen T- Lymhozyten, Sternhimmelzellen („tingible body" - Makrophagen) und follikulär dendritischen Retikulumzellen überwiegend proliferierende B-Lymphozyten (CHU et al. 1979; POSPISCHIL 1989; UHR 1993; GEBERT et al. 2000). Nach Angaben von ROTHKÖTTER und PABST (1989) fällt die Zahl der T-Lymphozyten in den PP und LGK der Schweine im Gegensatz zu den B-Lymphozyten deutlich geringer aus.
Ähnliche Ergebnisse fanden auch MACDONALD und Mitarbeiter (1987) in den PP des Kindes mit einem Anteil von 26 - 48 % B-Lymphozyten. Diese B-Lymphozyten sind die Vorläufer der in der Mehrheit (bis 80 %) IgA sezernierenden Plasmazellen (BRANDTZAEG et al. 1989).
Das Keimzentrum ist von einer Korona umgeben, die sich hauptsächlich aus kleinen Lymphozyten zusammensetzt (SOBHON 1971; PABST 1987; POSPISCHIL 1989).
Zwischen dem Follikel und dem darüber liegendem Epithel befindet sich das so genannte „Dome-Areal“ (GEBERT et al. 1996). Es zeichnet sich durch eine Vorwölbung in das Darmlumen aus, die nicht die Länge der umgebenden Zotten erreicht (POSPISCHIL 1989). Das Dome-Areal setzt sich neben Makrophagen, neutrophilen Granulozyten, follikulär dendritischen Zellen und Plasmazellen zum größten Teil aus einer Mischung von kleinen und mittelgroßen B- und T- Lymphozyten zusammen, die in einem Netzwerk aus Kollagenfasern angeordnet sind (SOBHON 1971; ABE u. ITO 1978; REYNOLDS u. MORRIS 1983;
POSPISCHIL 1989; UHR 1993; NEUTRA et al. 1996).
Die interfollikuläre Zone ist reich an dicht zusammen liegenden T-Lymphozyten und enthält spezialisierte Gefäße, die so genannten „high endothelial venules“ (HEV) (ABE u. ITO 1978; HOGENESCH u. FELSBURG 1992; NEUTRA et al. 1996). Die lymphatischen Zellen benutzen diesen Weg als Übergang, um über die afferenten Lymphgefäße in den Blutkreislauf, sowie aus dem Blut in das lymphatische Gewebe zu gelangen (BLASCHKE et al. 1995; GEBERT et al. 2000; AZZALI 2003).
2.1.2 Lymphozyten der Lamina propria
Zu dem organisierten GALT zählen auch die diffus in der Lamina propria mucosae verteilten B- und T-Lymphozyten, reife Plasmazellen, Mastzellen, Makrophagen, eosinophile Granulozyten sowie zahlreiche intraepitheliale Lymphozyten (IEL) (HESS 1991). In der Lamina propria der Mäuse befinden sich 38 % T-Lymphozyten und 22
% B-Lymphozyten (BÖRSCH 1984). MACDONALD und Mitarbeiter (1987) fanden weniger B-Lymphozyten in der Lamina propria bei Menschen. Die T-Lymphozyten in der Lamina propria bestehen überwiegend aus CD4 positiven Gedächtniszellen (BRANDTZAEG 1989). Es befinden sich sowohl T-Zellen vom Helfer/Induktor Typ
(CD4) als auch vom Suppressor/zytotoxischen Typ (CD8). Das Verhältnis zwischen den beiden T-Zell Subpopulationen in der Lamina propria ist etwa 2:1 und ähnelt dem im peripheren Blut (JAMES 1993; GEBERT et al. 2000).
Die T-Zellen haben wichtige Funktionen für das Immunsystem des Darmes. Sie fördern die IgA-Bildung, indem sie die Synthese von IgG, IgM und IgE hemmen (ELSON et al. 1979). Als CD4-positive Zellen warten sie in der Darmmukosa auf Antigenkontakt (FARSTAD et al. 2000). Sie sezernieren Lymphokine. Eine Folge davon ist eine Zottenverkürzung und Krypthyperplasie. Eine weitere Eigenschaft der T-Zellen ist die Immuntoleranz gegenüber bestimmten Antigenen. Die beiden genannten Eigenschaften der T-Lymphozyten gehen mit einer Vermehrung der intraepithelialen Lymphozyten einher (MOWAT u. FERGUSON 1981).
2.1.3 Intraepitheliale Lymphozyten
Intraepitheliale Lymphozyten (IEL) unterscheiden sich bezüglich ihrer phänotypischen Zusammensetzung deutlich von den Lymphozyten des peripheren Blutes. Sie vertreten in der Mehrheit die CD8+ T-Zellen des Darmes (JANOSSY et al.
1980; JARRY et al. 1989; GUY-GRAND u. VASSALLI 1993). Mehr als 80 % der intraepithelial gelegenen T-Lymphozyten gehören zum Suppressortyp (HUSBAND et al. 1977). Im Epithel sind sie verstreut oberhalb der Basalmembran zu finden, bilden jedoch keine Desmosomen oder „tight junctions“ mit den Epithelzellen. Sie sind die ersten Zellen des Immunsystems, die zu dem in das Epithel eingedrungenen antigenen Material Kontakt aufnehmen und sind im ganzen MALT anzutreffen (FARSTAD et al. 1994). Der Anteil der γδ positiven IEL ist als annähernd 10 % bei den Menschen, ca. 50 % im Darm der Rinder und mit sehr unterschiedlicher Anzahl (20 - 80 %) bei den Mäusen beschrieben worden. Das Alter, die Antigen-Besiedlung und das Vorhandensein der Thymusdrüse beeinflusst die Zahl der IEL (MOWAT u.
VINEY 1997).
Sie lassen sich in Morphologie, Phänotyp, Rezeptorbesatz, Differenzierung und Funktion von denen der Lamina propria und den Lymphozyten des peripheren Blutes unterscheiden (LEFRANCOIS 1991; GEBERT et al. 2000). IEL bestehen überwiegend aus T-Lymphozyten, enthalten einen Heterochromatin reichen Kern und große intrazytoplasmatische Granula. Sie exprimieren CD8, einen Marker für zytotoxische T-Zellen (BEAGLEY u. HUSBAND 1998; GEBERT et al. 2000). Es gibt Hinweise, dass sich Thymus unabhängige IEL aus unreifen Vorläufer-T-Zellen in den als „Cryptopatches“ bezeichneten Lamina propria Krypten entwickeln (SUZUKI et al.
2000).
2.2 Das Follikel-assoziierte Epithel
Das Darmepithel über den Lymphfollikeln wird als Follikel-assoziiertes Epithel (FAE) bezeichnet (BOCKMAN u. COOPER 1973). In letzter Zeit wird jedoch öfter die Bezeichnung „Dome-Epithel“ verwendet. Jeder Lymphfollikel im Darm besitzt an der Lumenseite ein eigenes FAE. Das FAE setzt sich aus absorptiven Enterozyten, M- Zellen, einer geringen Anzahl Becherzellen und enteroendokrinen Drüsenzellen sowie aus nichtepithelialen Zellen, wie z. B. T- und B-Lymphozyten, wenigen Makrophagen und vereinzelten Plasmazellen zusammen (LIEBLER 1985; GEBERT et al. 2004). Die enteroabsorptiven Zellen des FAE weisen morphologisch keine Unterschiede zu denen der Zotten auf (CHU et al. 1979).
2.2.1 Morphologie der M-Zellen
Ein wichtiger Bestandteil des FAE sind die so genannten „membranous“ (M-) Zellen, auch „microfold bearing" genannt (FOURNIER et al. 1977; OWEN 1977;
MCDERMOTT et al. 1982). M-Zellen wurden erstmals transmissionselektronenmikroskopisch im Appendix vermiformis des Kaninchen
dargestellt (BOCKMAN u. COOPER 1973). Mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie ließen sich M-Zellen auch an den PP des Menschen identifizieren (OWEN u. JONES 1974). BYE und Mitarbeiter (1984) fanden heraus, dass M-Zellen Unterschiede bezüglich der enzymatischen, Zytoskelett- und Oberflächeneigenschaften im Vergleich mit Enterozyten zeigen.
Um die M-Zellen lichtmikroskopisch zu erkennen, werden histochemische Marker, wie z. B. Zytokeratine oder Vimentin (GEBERT et al. 1992, 2004; JEPSON et al.
1993), ein Intermediärfilament-Protein, das in Epithelzellen unter normalen Bedingungen fehlt, sowie Lektine (CLARK et al. 1993; GEBERT et al.1999) verwendet. Elektronenmikroskopisch können M-Zellen aufgrund ihrer Morphologie identifiziert werden (WOLF u. BYE 1984). M-Zellen exprimieren auf ihrer Oberfläche und in ihrem Zytoplasma α-L-Fucose. Die Fucose-spezifische Lektin Ulex europaeus Agglutinin Typ I (UEA I) ist eine Markierung, die eine Unterscheidung der M Zellen in frühem Stadium ermöglicht (GIANNASCA et al. 1994; GEBERT et al. 1999).
M-Zellen unterscheiden sich von den benachbarten Epithelzellen durch ihre apikale Oberfläche mit den charakteristischen Mikrovilli. Die Form und Länge der Mikrovilli variiert je nach Spezies und Lokalisation. Bei Rhesusaffen (Macaca mulatta) sind die Mikrovilli auf der vorgewölbten Oberfläche der M-Zelle kürzer, dicker und zahlenmäßig niedriger als bei den angrenzenden absorptiven Enterozyten (KUHN u.
KAUP 1996). Beim Menschen findet sich eine abgeflachte apikale Oberfläche der M- Zelle (NEUTRA et al. 1999; GEBERT et al. 2000). Während die M-Zellen in den PP von Nagern kurze Mikrovilli besitzen, findet man bei Kaninchen und Schweinen längere und teilweise auch verzweigte Mikrovilli (BYE et al. 1984; MADARA et al.
1984; GEBERT u. BARTELS 1991). In verschiedenen Lokalisationen wurden auch Längenunterschiede festgestellt. Die Mikrovilli der M-Zelle war in den PP des Dickdarms länger als in den PP des Dünndarmes (MORFITT u. POHLENZ 1989;
LIEBLER et al. 1991).
M-Zellen besitzen einen ausgeprägten Golgi-Apparat sowie zahlreiche von rauhem endoplasmatischen Retikulum umgebene Mitochondrien (KUHN u KAUP 1996). Sie besitzen apikal an der Oberfläche kurze, spärliche Mikrovilli, zeigen in ihrem apikalen Zytoplasma zahlreiche kleine Vesikel, wenige Lysosymen und ein unvollständiges terminales Netz („terminal web“) (OWEN u. JONES 1974; OWEN et al. 1981;
LANDSVERK 1981, 1987; MADARA et al. 1984; LIEBLER et al. 1991; KUHN u.
KAUP 1996). Ihre Zellkerne befinden sich basolateral. Das Zytoplasma der M-Zelle stellt sich in der Regel elektronendichter als das der IEL und elektronenheller als das der angrenzenden absorptiven Enterozyten dar (MCCLUGAGE et al. 1986). Mit den benachbarten Epithelzellen sind sie durch die „tight junctions“ und Desmosomen verbunden (TORRES-MEDINA 1981; MADARA et al. 1984; LIEBLER 1985;
GEBERT u. BARTELS 1991; UHR 1993; KUHN u. KAUP 1996). Eine Besonderheit der M-Zelle zeigt sich basolateral durch Invaginationen der Zellmembran, in der sich Lymphozyten und Makrophagen finden (GEBERT et al. 1996; KUHN u. KAUP 1996).
Zumeist besteht zwischen diesen Zellen und dem intestinalen Lumen eine dünne Zytoplasmabrücke der M-Zellen von 1 –2 µm. Dementsprechend sind die Transportwege der Antigene verkürzt (GEBERT et al. 2000; KRAEHENBUHL u.
NEUTRA 2000).
2.2.2 Funktion und Ontogenese der M-Zellen
M-Zellen können durch Endozytose Makromoleküle wie Hefen (BEIER u. GEBERT 1998), Partikel und bakterielle Erreger wie Salmonellen, Yersinien und Vibrio cholera (OWEN et al. 1986; CLARK et al. 1994; SCHULTE et al. 2000) sowie virale Erreger wie HIV, Reoviren und Polioviren (AMERONGEN et al. 1991, 1994; SICINSKI et al.
1990) an ihrer apikalen Membran aufnehmen, diese in Vesikeln zur basolateralen Membran transportieren und durch Exozytose in den Interzellularraum abgeben.
Diese Aufnahme von Makromolekülen, bakteriellen und viralen Erregern durch M- Zellen wurde bei verschiedenen Spezies und in zahlreichen Untersuchungen beschrieben (OWEN 1977, 1998, 1999; WOLF u. BYE 1984; FUJIMURA 1986;
MARCIAL u. MADARA 1986; NEUTRA et al. 1987; LANDSVERK 1988; PAPPO u.
ERMAK 1989; GEBERT et al. 1996, 2000, 2004; BEIER u. GEBERT 1998;
BORGHESI et al. 1999; KRAEHENBRUHL u. NEUTRA 2000; NICOLETTI 2000).
Zudem wurde an in vitro Modellen die Aufnahme von HIV-1 (AMERONGEN et al.
1991) und von Prion-Proteinen (HEPPNER et al. 2001) durch M-Zellen nachgewiesen.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Antigenaufnahme durch eine M-Zelle (M) zwischen zwei absorptiven Enterozyten (E). Die durch die Basallamina eingewanderten intraepithelialen Zellen (L) befinden sich in der Seitentasche der M- Zelle (modifiziert nach OWEN 1977).
Im Gegensatz zu den Enterozyten haben M-Zellen auf der apikalen Oberfläche eine reduzierte alkalische Phosphataseaktivität (OWEN et al. 1986; HOGENESCH u.
FELSBURG 1990, GEBERT et al. 1996) und die Glykokalyx zeigt sich weniger ausgeprägt (OWEN 1977; GEBERT u. BARTELS 1995; KUHN u. KAUP 1996).
Diese Faktoren begünstigen den Mikroorganismen und anderen Antigenen die
Anhaftung an die M-Zelle (OWEN 1994; GEBERT u. BARTELS 1995). Weiterhin weisen sie wenige lysosomale Strukturen auf. Dies ermöglicht ihnen, die Antigene unverdaut zu transportieren (OWEN et al. 1986). Es ist jedoch nicht bekannt, in welchem Maße diese Antigene während des Transportes unverändert bleiben (GEBERT et al. 2000).
Der Anteil der M-Zellen im FAE fällt je nach Lokalisation und Spezies unterschiedlich aus. Sie sind in den Flanken der Dome-Areale häufiger, dagegen an der Spitze seltener zu finden (GEBERT u. BARTELS 1991; GEBERT u. HACH 1993; JEPSON et al. 1993; GEBERT et al. 1999). Im Verhältnis zu Enterozyten liegt die Zahl der M- Zellen im FAE bei Kaninchen und Schweinen etwa bei 50 % (PAPPO et al. 1988;
GEBERT et al. 1996; BEIER u. GEBERT 1998; GEBERT et al. 2004) und bei Mäusen und Ratten etwa bei etwa 10 % (SMITH u. PEACOCK 1980; CLARK et al.
1994; GEBERT et al. 1999). Nach elektronenmikroskopischen Untersuchungen von GEBERT und Mitarbeitern (2000) an endoskopischen Biopsien von Solitärfollikeln und Peyer’schen Platten aus dem terminalen Ileum des Menschen bleibt die Zahl der M-Zellen unter den Epithelzellen im FAE unter 10 % (OWEN u. ERMAK 1990;
CLARK et al. 1993; GEBERT et al. 2000).
In einer Arbeit von KUCHARZIK und Mitarbeitern (2000) konnte gezeigt werden, dass M-Zellen unter chronisch entzündlichen Bedingungen vermehrt angetroffen werden und die Vermehrung dieser M-Zellen mit den morphologischen Zeichen der M-Zell Apoptose einhergeht. Nach Indomethazingabe bei Ratten konnte auch bei Menschen mit Spondylathropathie im Rahmen einer Darmentzündung eine starke Vermehrung von M-Zellen festgestellt werden (CUVELIER et al. 1994). Andere Arbeitsgruppen beschrieben jedoch einen Verlust von M-Zellen im FAE von Lymphfollikeln im Dickdarm des Menschen bei Morbus Crohn (FUJIMURA et al.1992).
Über die Ontogenese der M-Zelle wurde in den letzten Jahren kontrovers diskutiert.
In den Versuchen an keimfreien Mäusen, die mit Salmonellen oral infiziert wurden,
zeigten die M-Zellen im FAE eine zweifache bis dreifache Vermehrung (SAVIDGE et al. 1992). In einem in vitro Modell mit B-Zellen und Enterozyten der Caco-2 Linie in Co-Kulturen, verwandelten sich Enterozyten in Zellen, die morphologisch und funktionell ähnliche Eigenschaften wie M-Zellen aufwiesen (KERNEIS et al. 1997).
So wurde auch beobachtet, dass die Zahl der M-Zellen in kurzer Zeit bedeutend zunimmt, nachdem in das Ileum des Kaninchens Streptococcus pneumoniae ausgesetzt wurde (BORGHESI et al. 1999; MEYNELL et al. 1999). Daraufhin wurde die Hypothese geäußert, dass sich einige Enterozyten in besonderen Fällen im FAE zu M-Zellen differenzieren können. Weitere Untersuchungen bei Kaninchen, die ebenfalls mit Streptococcus pneumoniae behandelt wurden, zeigen im FAE eine erhöhte Transportkapazität und vermehrte Lymphozyten. In diesen Untersuchungen blieb aber die Anzahl der M-Zellen (etwa 46 %) im FAE unverändert (GEBERT et al.
2004). GEBERT und Mitarbeiter (1999) postulierten aufgrund ihrer Untersuchungen an Mäusen, dass Epithelzellen sich nicht zu M-Zellen umwandeln.
Im Allgemeinen wird angenommen, dass sich die M-Zellen ebenfalls wie die übrigen Epithelzelltypen aus proliferierenden Stammzellen in den Bereichen der Krypten entwickeln (FUJIMURA u. OWEN 1996). Diese Stammzellen liegen im mittleren Drittel der Dome-assoziierten Krypten und wandern innerhalb weniger Tage zur Spitze der Dome-Areale, wo sie durch Apoptose untergehen und zum Lumen hin abgegeben werden (BHALLA u. OWEN 1982; BYE et al. 1984; NICOLETTI 2000;
SIERRO 2000; GEBERT et al. 1999, 2004). Sie enthalten Zytokeratine (GEBERT et al. 1992; RAUTENBERG et al. 1996; GEBERT et al. 2000) und ein für Epithelien typisches Aktin-assoziiertes Protein, das Villin (KERNEIS et al. 1996). Die Lebensdauer einer einzelnen M-Zelle beträgt ungefähr vier Tage. Davon vergehen ungefähr zwei Tage während der Wanderung und Weiterentwicklung von den Darm- assoziierten Krypten bis zur Dome-Spitze (GEBERT et al. 2004).
Bei nichtmenschlichen Primaten liegen nur wenige Befunde zum GALT-System vor.
Diese beziehen sich aber auf Altweltaffen (Catarrhini) (SAMUEL et al. 1992, KUHN u. KAUP 1996), so dass keine Befunde bei Krallenaffen vorliegen.
3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN
3.1 Material und Methoden
3.1.1 Tiermaterial
Für diese Arbeit standen 14 Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus) aus unterschiedlichen Altersgruppen zur Verfügung. Die Tiere stammen aus der Ethologischen Station der Anthropologischen Einrichtungen des Instituts für Zoologie, Anthropologie und Entwicklungsbiologie der Georg-August-Universität Göttingen. Nähere Angaben zu den einzelnen Tieren sind in Tabelle 1 ausgeführt.
Da auch die Umwelt-/Ernährungsfaktoren die Entwicklung des GALT-Systems beeinflussen können, werden im Folgenden Einzelheiten über die Haltungsbedingungen und die Ernährung der Tiere dargestellt.
3.1.1.1 Haltung der Tiere
Die Weißbüschelaffenkolonie der Ethologischen Station Sennickerode ist in mehrere Gruppen eingeteilt und wird in Außeneinrichtungen sowie in einem Gewächshaus gehalten. Im Gewächshaus sind die Tiere in mehreren Käfigen untergebracht. Die Tiere verbringen jede Jahreszeit in derselben Einheit. Es findet kein Wechsel zwischen Außen- und Inneneinrichtungen statt. Die Außeneinrichtungen bestehen aus ca. 8 m² großen Blockhütten mit überdachter Veranda und einem angeschlossenen Außenkäfig. Diese Hütten-/Käfigkomplexe sind mit heimischen Bäumen (z. B. Ahorn, Linde, Birke, Weide; Pappel) umgeben. Einige der Komplexe stehen durch Baum- und Strauchalleen in Verbindung. Somit stehen den Gruppen mehrere Käfige zur Verfügung. Zwischen den Bäumen bestehen zusätzlich verschiedene Kletter- und Laufmöglichkeiten. In und außerhalb der Hütte befinden
sich Futterplätze, Sitzbretter und Schlafkästen. Die Tiere auf dem Gelände leben nur im Winter/Frühjahr (November bis Mai) in den Käfig – Hüttenkomplexen, im Sommer/Herbst haben sie Zugang zum Freigelände. Jeder Gruppe stehen bzw.
standen ca. zwei Hektar Streifgebiet zur Verfügung.
Tabelle 1: Angaben zu den Tieren.
Lfd.
Nr. G-Nr. Bestands-
Nr. Geschlecht Geburtsdatum Körpergewicht (g) 1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
6696 6697 6698 6699 6700 6701 6702 6703 6704 6705 6706 6707 6708
1211*
1212*
1243*
1244*
1206 1231*
1236 1174 1237 1196 1176 1222 1160
♂
♀
♂
♂
♂
♂
♂
♂
♂
♂
♂
♀
♂
29.08.2001 29.08.2001 29.09.2002 29.09.2002 05.08.2001 18.04.2002 17.08.2002 01.05.2000 17.08.2002 20.04.2001 23.05.2000 07.01.2002 03.08.1999
365 428 282 320 306 313 293 363 312 359 371 333 374
14 6709 1188 ♀ 22.12.2000 346
(*) Tiere mit Haltung im Gewächshaus ohne Zugang zu natürlichen Nahrungsressourcen.
Jede Blockhütte ist durch eine Bodenheizung beheizbar, so dass die Innentemperatur bei kälteren Außentemperaturen reguliert werden kann. Die Temperatur im Gewächshaus und in den Blockhütten wird so reguliert, dass 18° C
nicht unterschritten und 30° C nicht überschritten werden. Die Beleuchtungszeiten in den Hütten werden durch einen Schwellwertschalter an den natürlichen Hell-Dunkel- Rhythmus des Tages angepasst. Auch im Gewächshaus ist die Beleuchtung dem natürlichen Hell-Dunkel-Rhythmus angepasst. Die Hüttenböden sind mit relativ staubarmer Hobelspaneinstreu bedeckt. Täglich werden aus allen Käfigen und Hütten Exkremente und Futterreste entfernt, die Futternäpfe werden gesäubert und gewaschen. Einmal die Woche werden die Böden desinfiziert und einmal in vier Wochen wird eine Grundreinigung durchgeführt. Sämtliche Gegenstände werden bei dieser Grundreinigung mit der Bürste gescheuert und anschließend desinfiziert.
Die Haltung der Weißbüschelaffenkolonie in der Ethologischen Station Sennickerode dient nicht den invasiven Tierexperimenten. Es werden nur verschiedene ethologische und semifreiland-ökologische wissenschaftliche Projekte durchgeführt.
Die Bestandgröße beträgt je nach Gruppenzahl 40-50 Tiere. Um die Tierzahl konstant zu halten, werden alle zwei Jahre Tiere in Überzahl an andere Institutionen abgegeben. Im vorliegenden Fall wurden die Tiere für Organentnahmen zu verschiedenen wissenschaftlichen Zwecken ohne vorherige Behandlungen oder Eingriffe schmerzlos euthanasiert.
3.1.1.2 Fütterung der Tiere
Die Tiere werden täglich zweimal, morgens und mittags, an verschiedenen Stellen des Hüttenkomplexes und der Klettergerüste bzw. Baumalleen gefüttert. Für jedes Tier werden 50 g Futter am Tag gerechnet und in zwei Mahlzeiten angeboten. Das Futter wird täglich frisch aus wechselnden Nahrungsmitteln (morgens: Futterbrei mit Haferflocken, Reis, Quark, Yoghurt, Hefe, Zitronensaft, Speiseöl, Vitamine und Mineralien; mittags: Obst-/Gemüsesalat mit Früchten und Gemüse je nach Jahreszeit, hartgekochtes Ei, Mehlwürmer, Fisch und pelletiertes Trockenfutter für Katzen) frisch zusammengestellt. Zudem können die Tiere verschiedene Insektenarten, Spinnen und Schnecken (Nacktschnecken) selbst fangen und
verzehren. Die Tiere auf dem Freigelände fressen bzw. lecken auch Baumharze von z. B. Ahorn, Linde und Hainbuche. Weiterhin verzehren sie Früchte und Blätter von Robinien in größeren Mengen und fangen zusätzlich Eidechsen, Singvögel und Mäuse, die sie ebenfalls fressen. Weiterhin bekommen sie zweimal in der Woche ein spezielles Futter, gemischt aus Kräutern (z. B. Oregano, Petersilie, Kümmel), Erdnüssen, Knäckebrot, Sonnenblumenkerne und Feigen. Frisches Wasser steht den Tieren jederzeit zur Verfügung. Die Verpflegung und Versorgung der Tiere werden von Tierpflegerinnen und Tierpflegern durchgeführt.
3.1.2 Probenentnahme
Die Tiere wurden je 0,1 ml/kg Körpergewicht mit GM2 (Göttinger Narkosemischung 2) intramuskulär narkotisiert und anschließend mit Narcoren euthanasiert. Die Göttinger Mischung setzt sich zusammen aus: 5 ml Ketamin (100 mg/ml), 1 ml Xylazin (10 %ig), 0,1 ml Atropin (1 %ig), 3,9 ml Aqua ad inject.. Die Probenentnahme erfolgte unmittelbar nach Euthanasie des jeweiligen Tieres.
Nach Eröffnung der Bauchhöhle wurde das Darmkonvulat exenteriert. Anschließend wurden der Magen vom Dünndarm und das Mesenterium vorsichtig vom Darm getrennt. Die einzelnen Darmabschnitte (Duodenum, Jejunum, Ileum, Zäkum, Kolon, Rektum) wurden im entspannt geradeliegenden Zustand in cm ausgemessen und abgesetzt. Nach Absetzen der Darmabschnitte wurde der Darminhalt vorsichtig mit Aqua bidest. ausgespült. Wie in Abb. 3 dargestellt, wurden die Darmabschnitte je nach Lokalisation nummeriert und dementsprechend asserviert (flüssiger Stickstoff, Formalin 4%ig, Glutaraldehyd 2,5 %ig, Formalin 10 %ig). Um bei den lichtmikroskopischen Untersuchungen die Lage der lymphatischen Einrichtungen beurteilen zu können, wurden die Darmabschnitte gezielt in zirkulärer Form gelassen und nicht dem Mesenterialansatz entlang aufgeschnitten.
Die Proben für die histologischen und immunhistochemischen Untersuchungen wurden in 10 %igem und in 4 %igem neutral gepufferten Formaldehyd fixiert und in Paraffin eingebettet.
Die für die ultrastrukturellen Auswertungen bestimmten Proben wurden für eine gerichtete Einbettung zugeschnitten, für 24 Stunden in 2,5 %igem phosphatgepufferten gekühlten Glutaraldehyd fixiert und anschließend in Epon eingebettet.
Abbildung 3: Entnahmelokalisationen der Darmproben
3.1.2.1 Präparation der Proben für die Lichtmikroskopie
Für die Lichtmikroskopie wurden die Proben direkt nach der Entnahme für 24 Stunden in 10 %igem, neutral gepufferten Formalin fixiert. Die Darmabschnitte wurden in Querscheiben zugeschnitten und in Einbettkassetten gelegt. Für jedes Tier wurden zwei Einbettkassetten angelegt, von denen die eine Duodenum, Jejunum und Ileum und die andere Zäkum, Kolon und Rektum enthielt. Die Paraplast- Einbettung erfolgte nach laborüblichem Protokoll automatisch in Hypercenter XP (Fa.
Thermo Shandon, Frankfurt am Main). Im Einbettautomaten wurden die Proben zunächst für 2 Stunden mit entmineralisiertem Wasser bei RT gewässert.
Anschließend durchliefen sie eine aufsteigende Alkoholreihe (50 %iges, 70 %iges, 80 %iges, 96 %iges, 96 %iges, 100 %iges, 100 %iges Ethanol für jeweils 45 min bei 35° C unter Vakuum) zur Entwässerung. Die Proben kamen dann zweimal für 1,5 bzw. 1 Stunde bei RT und unter Vakuum in das Intermedium Chloroform. Zum Schluss wurden sie zweimal für jeweils 1,5 Stunden bei 60° C unter Vakuum in flüssiges Paraffin überführt. Nach Ausgießen der Proben und Aushärtung der Paraplastblöckchen wurden mit einem Schlittenmikrotom (Mikrotom HM 400R, Fa.
Microm, Walldorf, Deutschland) Serienschnitte angefertigt. Die 3-4 µm dicken Schnitte wurden mit Hilfe eines in einem Eisbad angefeuchteten Durchschlagpapierstreifens vom Paraffinblock abgenommen und in ein 40° C warmes Wasserbad zum Strecken überführt. Die Schnitte wurden dann auf beschichtete Histobond-Objektträger aufgezogen und bei 37° C im Wärmeschrank über Nacht zum Trocknen gelassen. Danach wurden sie bei Raumtemperatur aufbewahrt. Somit wurden aus einem Paraplastblock 300 - 500 Schnitte fertig gestellt. Im Weiteren wurde von jeder Serie zunächst jeder zehnte Paraffinschnitt und nach einer Vororientierung weitere Schnitte im Färbeautomat (Varistain Gemini, Fa.
Thermo Shandon, Frankfurt am Main) mit Hämalaun-Eosin gefärbt (siehe Anhang).
Anschließend wurden die lichtmikroskopischen Untersuchungen durchgeführt.
3.1.2.2 Präparation für die Transmissionselektronenmikroskopie
Für die elektronenmikroskopische Charakterisierung des Follikel-assoziierten Epithels, insbesondere der M-Zellen im Ileum, wurden die in 2,5%iger Glutaraldehydlösung fixierten Proben in Epon eingebettet. Die Einbettung in einem Epongemisch nach LUFT (1961, siehe Anhang) erfolgte im Lynx-Einbettautomaten (Fa. Leica, Bensheim, Deutschland) nach dem im Anhang angegebenen Protokoll.
Die anschließende Einbettung der Sektionsproben in bereits mit vorpolymerisiertem Epon zu einem Drittel gefüllten Einbettungsformen aus Silikongummi erfolgte seitlich positioniert gerichtet, so dass beim späteren Anschneiden der Gewebeblöcke ein Darmwandquerschnitt getroffen werden konnte. Nach Auffüllung der einzelnen Blockformen mit Epon schloss sich eine 24-stündige Polymerisation des Epoxidharzes bei 60° C im Wärmeschrank an.
Die auspolymerisierten Epon-Blöckchen wurden mit einer Fräse (Reichert, Ultracut S, Fa. Leica, Bensheim, Deutschland) zugetrimmt. Dann wurden am Ultramikrotom (Reichert, Ultracut S, Fa. Leica, Bensheim, Deutschland) unter Verwendung von Glasmessern 0,5 µm dicke Semidünnschnitte angefertigt. Die dazu benötigten Glasmesser wurden mit Hilfe eines Knifemakers (Reichert Knifemaker, Fa. Leica, Bensheim, Deutschland) hergestellt. Danach wurde auf jedes Glasmesser mit Klebeband ein Flüssigkeitstrog montiert. Dieser wurde soweit mit Wasser gefüllt, dass die Flüssigkeit die Messerschneide benetzen konnte. Die auf dem Flüssigkeitstrog schwimmenden Schnitte wurden auf einen Objektträger mit 4-5 Tropfen Wasser mittels Glassstäbchen übertragen und anschließend auf einer Wärmebank bei 60° C für eine Stunde und im Wärmeschrank bei 37° C über Nacht getrocknet. Danach wurden sie nach RICHARDSON und Mitarbeiter (1960, siehe Anhang) gefärbt und mit Entellan eingedeckt. Die Semidünnschnitte wurden sowohl zur morphologischen Beurteilung als auch zur Vororientierung für das Anfertigen von Ultradünnschnitten lichtmikroskopisch ausgewertet. Im Weiteren wurden die Blöcke mittels einer zeichnerisch festgehaltenen Vororientierung per Hand zugetrimmt.
Daraufhin wurden am oben genannten Ultramikrotom unter Verwendung eines
Diamantmessers (Fa. Diatome, Bienne, Schweiz) 50-80 nm dicke Ultradünnschnitte hergestellt und auf Lochblenden (single slot 1 x 2, Fa. Plano, Marburg, Deutschland) aufgezogen. Diese wurden dann per Hand mit Uranylacetat und Bleicitrat (REYNOLDS 1963, STEMPAK u. WARD 1964) nachkontrastiert. Für die Anfertigung der Ultradünnschnitte wurden ausschließlich Bereiche eines Lymphfollikels mit im Semidünnschnitt sichtbaren FAE ausgewählt.
3.1.2.3 Immunhistochemische Untersuchungen
Um die Verteilung der CD3-, CD20-positiven Zellen und Makrophagen im GALT- System des Weißbüschelaffen zu identifizieren und die Verteilung der genannten Zellen beurteilen zu können, wurden an ausgewählten Paraffinschnitten immunhistochemische Untersuchungen durchgeführt. In den vorliegenden Untersuchungen kam die Streptavidin-Biotin-Komplex-Methode (SABC-Methode) zur Anwendung. Das Material wurde vor der Paraffineinbettung in 10 %igem Formalin fixiert.
Bei der Anwendung der Streptavidin-Biotin-Methode wurden kommerziell erhältliche, gegen verschiedene Oberflächenmoleküle gerichtete Antikörper-Marker, für T- Lymphozyten CD 3, für B-Lymphozyten CD 20 und für Makrophagen MAC 38 verwendet. Vor der CD3-, CD20- und MAC-387 Markierung wurden die Schnitte, wie vom Hersteller angegeben, entparaffiniert und rehydriert. Zur Antigen-Demaskierung wurden die Schnitte in Citratpuffer im Schnellkochtopf einer Hitzevorbehandlung unterzogen. Anschließend wurden die Schnitte in das NexES-IHC-Färbemodul (Fa.
VENTANA, Illkirch, Frankreich) eingespannt, wo alle weiteren Reaktionen stattfanden (siehe Anhang). Die Gebrauchsverdünnungen der Antikörper wurden unmittelbar vor Gebrauch angesetzt. Bei dieser Immunperoxidase-Methode wird die Bindungsaffinität von Streptavidin und Biotin genutzt. Als Chromogen dient Diaminobenzidin (DAB). Für die Negativ- und Positivkontrollen wurde ein Lymphknoten von einem Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus) verwendet.
Folgende Antikörper wurden erfolgreich ausgetestet und für die Untersuchungen eingesetzt. Der CD3-Antikörper Rabbit Anti-Human T Cell (Fa. DakoCytomation, Hamburg, Code Nr. A0452) wurde für die Identifizierung von T-Lymphozyten verwendet. B-Lymphozyten wurden mit dem CD20-Antikörper Monoclonal Mouse Anti-Human B Cell (Fa. DakoCytomation, Hamburg, Code Nr. M0755) markiert. Für die Identifizierung der Makrophagen wurde der Antikörper Monoclonal Mouse Anti- Human Myeoloid/Histiocyte Antigen, Clone MAC 387 (Fa. DakoCytomation, Hamburg, Code Nr. M 0747) verwendet.
3.1.2.4 Auswertung und Dokumentation
Für die lichtmikroskopische und immunhistochemische Auswertung sowie photographische Dokumentation der lymphatischen Einrichtungen wurde das Mikroskop Axioplan 2-Imaging (Fa. Zeiss, Göttingen), die Digitalkamera AxioCam (Fa. Carl Zeiss, Göttingen) sowie das Computerprogramm AxioVision (Fa. Carl Zeiss, Göttingen) verwendet. Für die elektronenmikroskopische Auswertung und Analyse der Gewebepräparate wurde das ZEISS-Elektronenmikroskop (EM 10 C, Fa. Zeiss, Oberkochen) sowie das Bildanalyseprogramm Analysis (Soft Imaging System, Münster) genutzt.
3.2 Ergebnisse
Das Probenmaterial für diese Arbeit wurde von 14 klinisch gesunden adulten Weißbüschelaffen entnommen. Bei den lichtmikroskopischen Untersuchungen der Darmproben konnten, außer bei Tier G-6697 und G-6702, keine Veränderungen festgestellt werden. Bei Tier G-6697 und G-6702 wurden im Dünndarmepithel, besonders im apikalen Zottenbereich, geringgradige Epitheldesquamationen festgestellt. Die Lymphfollikel der Tiere zeigen jedoch keine strukturellen Veränderungen. In den weiterführenden elektronenmikroskopischen Untersuchungen wurden die Veränderungen genauer untersucht. Präparationsbedingte Schäden sind aber bei diesen Proben nicht auszuschließen.
Die lichtmikroskopischen Untersuchungen der Serienschnitte ermöglichten eine nahezu drei dimensionale Beurteilung der Follikelstrukturen. Dabei wurden ihre morphologischen Eigenschaften, insbesondere ihre Lage zum Mesenterialansatz, untersucht. Im Weiteren erfolgte die Untersuchung des Follikel-assoziierten Epithels mittels Elektronenmikroskopie. Dabei wurden besonders der Aufbau des FAE und die Morphologie der M-Zelle charakterisiert. Anschließend wurden zum Nachweis der lymphozytären Zellen im GALT-System immunhistochemische Untersuchungen durchgeführt.
3.2.1 Messungen der Darmabschnitte
Während der Probenentnahme wurden zunächst bei allen Tieren die abgesetzten Darmabschnitte gemessen. Die Länge des gesamten Darmtraktes betrug bei dieser Tiergruppe im Durchschnitt 58,8 cm. Anschließend wurden die Längen der einzelnen Darmabschnitte gemessen (Tabelle 2), wobei die des Ileums mit 8 cm vorgegeben wurde. Die größte Variabilität in der Länge zeigten die Jejunumabschnitte (minimal 12 cm bis maximal 41 cm). Zwischen den Kolonabschnitten dagegen gab es eine niedrigere Bandbreite, die zwischen minimal 12 cm und maximal 20 cm lag. Da der
überwiegende Teil der zu Verfügung stehenden Tiere männlich war, und bei Weißbüschelaffen nur ein minimaler Geschlechtsdimorphismus vorliegt, konnten keine signifikanten geschlechtsspezifischen Unterschiede festgestellt werden.
Tabelle 2 : Längen der einzelnen Darmabschnitte in den jeweiligen Lokalisationen.
Maximal- und Minimalwerte sind unterstrichen. Mittelwert und Standardabweichung der Gesamtlängen: 58,8 ± 11,4 cm.
Längen der Darmabschnitte (cm) Lfd.
Nr. G-Nr.
Duodenum Jejunum Ileum Zäkum Kolon Rektum
Gesamt- länge
1 6696 2,6 12 8 2,5 12 2,5 39,6
2 6697 3 16 8 4,5 15 3 49,5
3 6698 3 13 8 3,5 13 2,5 43
4 6699 3 21 8 4 13 2,5 51,5
5 6700 3 40,5 8 4,5 12,5 3 71,5
6 6701 3 22 8 3,5 16 3 56,5
7 6702 2,5 24 8 4 16 3 57,5
8 6703 2,5 13 8 4,5 15,5 3 46,5
9 6704 3 19,5 8 4 20 3 57,5
10 6705 3,5 41 8 4,5 15,5 2,5 75
11 6706 2,5 30,5 8 4,5 17,5 3 66
12 6707 3,5 37 8 4,5 20 3 76
13 6708 3 35 8 5 16 2,5 69,5
14 6709 3 27 8 6 16,5 3 63,5
3.2.2 Lichtmikroskopische Untersuchungen
Da die Lymphfollikel in der Darmwand der Weißbüschelaffen zunächst mittels Durchlichtmethode nicht feststellbar waren, wurden die Darmproben immer aus der gleichen Darmlokalisation nach demselben Schema gewonnen (Abb. 3). Bei der Analyse der verschiedenen Lokalisationen konnten mithilfe von annähernd 400 Serienschnitten pro Lokalisation 531 Lymphfollikel bei den vierzehn Tieren festgestellt und ausgewertet werden (Tabelle 3). Solitäre Follikel konnten in allen Darmlokalisationen festgestellt werden. Bei zwei Tieren (G-6698 und G-6706) standen einige Lokalisationen nur eingeschränkt zur Verfügung, so dass diese in die nachfolgenden Ergebnisse nicht mit einbezogen wurden (Abb. 4).
Bei den verbleibenden zwölf Weißbüschelaffen wurden Lymphfollikel im Bereich des Duodenums (8 x), Jejunums (5 x), Ileums (8 x), Zäkums (12 x), Colons (11 x) und Rektums (11 x) festgestellt. Nur bei einem Tier (G-6707) wurden in allen sechs untersuchten Darmabschnitten Follikel festgestellt, bei den übrigen Tieren zeigten fünf Darmabschnitte (n = 6) oder vier Darmlokalisationen (n = 4) Lymphfollikel. Bei Tier G-6701 konnten Lymphfollikel nur im Bereich des Dickdarms gefunden werden.
Die höchsten Follikelzahlen lagen bei neun Tieren im Bereich des Zäkums, bei je einem Tier im Bereich des Ileums und Rektums und bei einem Tier mit jeweils 10 Follikeln im Rektum und Ileum.
Zusammenhängende Lymphfollikel wurden bei vier Tieren festgestellt. Diese Follikelaggregationen lagen dabei ausschließlich im Ileum, so dass von echten Peyer´schen Platten gesprochen werden konnte. Je Tier wurde dabei nur eine dieser Peyer’schen Platten (PP) festgestellt. Sie setzten sich bei den betroffenen Tieren aus einer unterschiedlichen Anzahl von Follikeln zusammen. Sie lagen in allen vier Fällen antimesenterial. Die größte PP wurde mit 26 Follikeln beim Tier G-6697 gefunden.
Weitere PP fanden sich bei Tier G-6700 (18 Follikel), G-6709 (10 Follikel) und G- 6708 (9 Follikel).
Fasst man diese Ergebnisse zusammen, so ist festzuhalten, dass lymphatische Einrichtungen ihren Schwerpunkt im Ileum, Zäkum und Rektum haben. Im Ileum zeigen sich nur bei vier von zwölf vollständig ausgewerteten Tieren echte Peyersche Platten, so dass diese nicht zur klassischen Definition des Ileums herangezogen werden können. Lymphatische Einrichtungen sind bei Weißbüschelaffen im Wesentlichen durch Solitärfollikel repräsentiert.
Tabelle 3: Anzahl der angetroffenen Lymphfollikel bei den einzelnen Tieren. In den Proben von 14 Weißbüschelaffen wurden insgesamt 531 Lymphfollikel untersucht.
Die Follikelzahlen der Peyer’schen Platten sind unterstrichen.
Darmabschnitte Tiernummer
Duodenum Jejunum Ileum Zäkum Kolon Rektum
6696 - - 2 24 8 12
6697 - 3 26 18 3 21
6698 - - 2 (fehlt)
6699 - 3 4 38 5 13
6700 4 - 18 20 4 15
6701 - - - 19 3 9
6702 1 - - 15 3 1
6703 2 - - 22 9 6
6704 1 - - 18 6 6
6705 1 2 5 10 - 21
6706 2 5 4 (fehlt) - 9
6707 2 1 6 27 4 5
6708 3 2 9 12 3 -
6709 2 - 10 6 6 10
0 5 10 15 20 25 30 35 40
6696 6697
6698 6699
6700 6701
6702 6703
6704 6705
6706 6707
6708 6709
Tiernummer Follikelzahl
Duodenum Jejunum
Ileum Zäkum
Kolon Rektum
Abbildung 4: Anzahl der angetroffenen Lymphfollikel (einschl. Peyer’sche Platten) bei den einzelnen Tieren. Bei Tier G-6698 und G-6706 standen präparationsbedingt nur Ileum (G-6698) oder Duodenum, Jejunum, Ileum und Rektum (G-6706) zur Verfügung.
3.2.2.1 Lage der lymphatischen Einrichtungen im Dünn- und Dickdarm
Alle lymphatischen Einrichtungen im Dünn- und Dickdarm wurden zunächst nach ihrer Lage im Bezug zum Mesenterialansatz bewertet. In den Querschnitten lassen sich die Lymphfollikel des Darmes bei mesenterialer Aufsicht in vier unterschiedliche Lokalisationen einteilen: links-lateral, mesenterial, rechts-lateral und antimesenterial.
Die Solitärfollikel im Duodenum und Jejunum waren in allen Lagen aufzufinden.
Ebenso waren die LGK im Zäkum, Kolon und Rektum regellos in der Darmwand verteilt, so dass keine dominante Lage festgestellt werden konnte. Die PP im Ileum lagen dagegen antimesenterial (Abb. 9) und breiteten sich von dort nach links und rechts aus. Seltener kamen im Ileum auch Solitärfollikel vor, die in jeder Lage zu finden waren. Die Beziehungen zum Mesenterialansatz und die Follikelzahlen der
untersuchten lymphatischen Einrichtungen sind in Abbildung 5 und in Tabelle 4 dargestellt.
Tabelle 4 : Die Lage der Lymphfollikel im Verhältnis zum Mesenterialansatz.
Verteilung der Lymphfollikel im Uhrzeigersinn Darm-
abschnitte I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII
Duodenum 2 3 4 5 1 2 1
Jejunum 1 2 10 2 1
Ileum 2 1 5 17 28 18 10 2 1 2
Zäkum 14 15 21 20 15 25 18 21 18 21 18 23
Kolon 2 5 8 7 5 11 6 1 2 3 3 1
0 5 10 15 20 25 30 35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Lagebezeichnung im Uhrzeigersinn Follikelzahl
Duodenum Jejunum Ileum Zäkum Kolon
Abbildung 5: Lage der Lymphfollikel im Verhältnis zum Mesenterium. „0“ bezeichnet die Lage als mesenterial und „6“ als antimesenterial.
3.2.2.2 Lichtmikroskopisch erkennbare Einheiten des GALT-Systems
Die Lymphfollikel im Dünn- und Dickdarm des Weißbüschelaffen wurden in diesen Untersuchungen in fünf Einheiten geteilt. Zu den festen Bestandteilen eines Lymphfollikels gehören das Keimzentrum, das durch die Korona umrandet wird; das Dome-Areal, das zum Lumen hin eine Übergangsregion darstellt; das FAE, das das Dome-Areal bedeckt und die interfollikulären bzw. parafollikulären Zonen im Randbereich der Follikel.
In der Korona lagen die lymphatischen Zellen mit heterochromatinreichen, runden Kernen zwischen den aufgelockerten Bindegewebsfasern dicht beieinander. Die lamellenartig angeordneten Bindegewebsfasern in der Korona und den parafollikulären Zonen waren besonders in den immunhistochemischen Präparaten gut zu erkennen (Abb. 22, 23). Im Keimzentrum hingegen zeigten sich lockerer angeordnete größere und polymorphkernige Zellen. Das Keimzentrum enthielt überwiegend kleine lymphozytäre Zellen. Das Dome-Areal, das zum Lumen hin eine Übergangszone bildete, wurde vom Follikel-assoziierten Epithel (FAE) bedeckt. Das FAE zeigte in den Darmabschnitten verschiedene Formen und war unterschiedlich ausgebildet. Je nach Lokalisation war es kuppelartig vorgewölbt, abgeflacht (Dünndarm) oder trichterförmig (Dickdarm) eingesenkt. Dabei spielte die Form des Lymphfollikels eine entscheidende Rolle.
Die Lamina propria, die die Lymphfollikel umgab, enthielt neben einer geringen Anzahl mononukleärer Zellen parallel zur Längsachse ausgerichtete glatte Muskelzellen und Bindegewebsfasern. Lichtmikroskopisch gut zu erkennen befanden sich in den interfollikulären bzw. parafollikulären Zonen longitudinal angeschnittene postkapilläre Venulen mit epitheloidem Endothel. Im Lumen der postkapillären Venulen waren angesammelte lymphoide Zellen zu erkennen. Ihre tubuläre Form erschien auf der Schnittebene rund, oval oder längs-oval und zeigte einen Verlauf in Richtung Keimzentrum.
3.2.2.3 Strukturelle Eigenschaften der lymphatischen Einrichtungen
Im Querschnitt des Darmrohres bildeten die Lymphfollikel in den Dünndarmabschnitten eine deutliche Vorwölbung der Mukosa. Sie lagen in Dünn- und Dickdarm überwiegend in der Tela submucosa. Dabei basaß jeder Follikel ein eigenes FAE und stand dadurch in direktem Kontakt mit dem Lumen. Die Lamina muscularis zog sowohl bei den Solitärfollikeln und PP im Dünndarm als auch bei den LGK im Zäkum und Dickdarm wie eine Decke über das Follikel. In den Bereichen, in denen das FAE den Follikel lumenwärts bedeckte, wurden die sonst durchgängigen glatten Muskelzellen der Lamina muscularis mucosae durchbrochen, indem lymphoide Zellen diese Bereiche durchsetzten. Zwischen dem Dome-Areal und der Lamina propria bestand meistens ein dünner Strang retikuläres Gewebe. Während im Dünndarm, besonders im Jejunum und Ileum, und Zäkum gelegentlich über dem Follikel eine Vorwölbung der Mukosa erzeugt wurde, bildete die Kryptenmukosa im Kolon und Rektum hauptsächlich tiefe, trichterförmige Einsenkungen (Abb. 11). In welcher Höhe bzw. Tiefe sich das FAE in der Darmwand befand, war je nach Lokalisation verschieden. Dabei hatte die Form und Größe des Lymphfollikels und die Höhe des umgebenden Epithels eine hohe Einwirkung auf die Form des FAE. Im Grunde genommen verstärkte sich die Muskulatur der Darmwand vom Duodenum in Richtung Rektum. Je stärker die Muskelschicht in der Darmwand war, umso tiefer lagen die Lymphfollikel im Bereich der eigentlichen Mukosa.
3.2.2.4 Durchmesser und Größe der Solitärfollikel
In den Querschnitten variierte die Ausdehnung der lymphatischen Einrichtungen in den Darmsegmenten sehr stark. In den vorderen Darmabschnitten fielen sie eher kleiner aus, wobei im Jejunum auch größere Solitärfollikel anzutreffen waren als im Ileum. Im Dünndarm wurde hauptsächlich die Höhe der umgebenen Darmzotten nicht überschritten. Hier hatten die Lymphfollikel einen kleineren Umfang. Im Duodenum lagen ihre Durchmesser zwischen 200 - 600 µm. Im Jejunum waren sie
zwischen 300 - 1200 µm im Durchmesser. In den PP im Ileum war die Abgrenzung von einem Follikel zum anderen auch an Serienschnitten meistens nicht klar erkennbar. Die einzelnen Follikel in den PP hatten einen Durchmesser von 600-1300 µm und variierten damit nicht so stark wie im Jejunum. Die größten lymphatischen Strukturen wurden im Zäkum beobachtet. Sie wiesen in den Querschnitten einen Durchmesser bis zu 1500 µm auf. Im Kolon war die Größe wieder geringer. Hier hatten sie einen Durchmesser von 400 – 700 µm. Im Rektum variierten sie stark zwischen 400 – 1200 µm.
3.2.2.5 Solitärfollikel im Dünndarm
Die Form der einzelnen Follikel fiel in den Darmabschnitten unterschiedlich aus. Je nachdem in welchem Darmabschnitt sie auftraten, erschienen sie in runder, ovaler oder länglicher Form.
Im Duodenum und Jejunum lagen die Lymphfollikel überwiegend tief zwischen den Zotten. Im Duodenum traten neben einigen kleinen lymphozytären Ansammlungen mit unauffälligem und schwach ausgebildetem FAE hauptsächlich Solitärfollikel in kleiner Form auf (Abb. 6). Das FAE war kurz und meistens lumenwärts kuppelartig vorgewölbt. Die Mitte des Epithels war meistens leicht vorgespitzt. Im Duodenum wurde auch eine lymphatische Einrichtung angetroffen, die aus zwei Lymphfollikeln ausgebildet war (Abb. 7). Beide Follikel lagen dicht beieinander, so dass der Übergang von einem Follikel zum anderen ohne interfollikuläre Zone verlief. Dabei besaßen sie eigene Keimzentren und ein eigenes Dome-Areal. Im Jejunum nahmen die Solitärfollikel an Umfang zu. Einige der Solitärfollikel im Jejunum breiteten sich unter der Lamina muscularis mucosae teilweise bis in die Quermuskulatur der Tunica muscularis aus. In den Querschnitten, wo diese Lymphfollikel im vollen Ausmaß zu sehen waren, war zu erkennen, dass die Tunica muscularis nach außen ausgedehnt war und deutlich dünner ausfiel als die in den übrigen Bereichen. Regelmäßig fanden sich deutliche Vorwölbungen mit Dome-Arealen (Abb. 8).
3.2.2.6 Peyer’sche Platten
Während in den untersuchten Lokalisationen im Duodenum und Jejenum ausschließlich einzelne Follikel anzutreffen waren, befanden sich im Ileum nur bei vier Tieren neben Solitärfollikeln Lymphfollikelaggregationen, die Peyer’schen Platten (PP). Die PP im Ileum setzten sich aus mehreren Solitärfollikeln zusammen, die bis auf die Dome-Areale alle unter der Lamina muscularis mucosae lagen. Die Lamina propria zog wie ein Netzteil über die gesamte PP. Die relativ kurzen Zotten im Ileum überlappten den Follikelbereich von allen Seiten. An der Basis der Zotten lagen kryptenartige Öffnungen, die eine Verbindung zum Lumen ermöglichten. Meist an der Basis der Zotten und im Kryptenbereich fanden die Follikel über das FAE Zugang zum intestinalen Lumen. Dies galt aber nicht für alle Follikel, die die PP bildeten.
Einzelne Follikel zeigten dabei auch leicht kuppelartige Vorwölbungen, die nur vereinzelt echte kirchturmähnliche Strukturen aufwiesen und die Grenzzone der Zottenspitzen erreichten. Meistens zeigten sich eher abgeflachte diskoidale Oberflächen mit zentralen Anhebungen (Abb. 9, 10). Zwischen den vier Tieren bestanden dabei nicht nur hinsichtlich der beteiligten Lymphfollikelzahlen, sondern auch in Bezug auf das Arrangement der Lymphfollikel erhebliche Unterschiede.
Während die Lymphfollikel bei Tier G-6697 kompakt und dicht lagen, präsentierte G- 6708 aufgelockerte Lymphfollikel, die zwar zusammenhingen, aber breitere interfollikuläre Zonen aufwiesen.
3.2.2.7 Lymphatische Einrichtungen im Zäkum, Kolon und Rektum
Entsprechend der Literatur werden die Lymphfollikel des Dickdarms im Folgenden als lymphoglanduläre Komplexe (LGK) bezeichnet. Im Zäkum wurden sie zum größten Teil ohne bestimmte Anordnung in Bezug zum Mesenterialansatz angetroffen. Sie variierten sehr stark in Größe und Form. Häufig erschienen sie in ovaler und längsovaler Form. Sie waren dicht von Submukosa-Falten umgeben, die im Gegensatz zur Dünndarmwand von stärkeren Muskelfasern begleitet wurden
(Abb. 11). Auch das FAE zeigte unterschiedliche Morphologie hinsichtlich Form und Größe. Meistens lag das FAE unter den eingewölbten Krypten eingesenkt und breitete sich in abgeflachter Form aus. Im lateralen Bereich des FAE befanden sich die Follikel-assozierten Krypten. Im Zäkum sanken die Krypten im Bereich der Follikel nicht so tief ein wie im Kolon und Rektum, wo sie trichterförmige Einsenkungen bildeten.
Die in die Follikel eingesenkten Kryptenepithelstrukturen und die Lymphfollikel bildeten zusammen im Zäkum, Kolon und Rektum die so genannten lymphoglandulären Komplexe (LGK). Neben LGK wurden im Zäkum auch zahlreiche Follikel gefunden, die eher den Solitärfollikeln des Dünndarms entsprechen, da im Randbereich keine engen Infiltrationen mit Kryptenepithel zu beobachten waren. Sie zeigten eine eher rundovale Form und besaßen ein in der Mitte leicht in das Lumen vorgewölbtes FAE, das mit den Krypten in gleicher Höhe lag und offen zum Lumen ausgerichtet war.
Im Kolon waren Solitärfollikel bzw. die LGK allein die dominierende Einheit. Sie waren einzeln verteilt in unterschiedlichen Anteilen der Darmwand vorzufinden. Die Mukosa im Kolon zeigte im quergeschnittenen Zustand zahlreiche Invaginationen.
Meistens waren auch Anteile der Submukosa in diesen Falten enthalten. Diese Falten bildeten mit lockerem Bindegewebe und darin vorhandenen Blut- und Lymphgefäßen dreieckige Strukturen. Die LGK waren überwiegend in der Nähe dieser Falten lokalisiert. Die Lamina muscularis mucosae, die stärker als im Dünndarm ausgebildet war, umgab die LGK, so dass das lymphatische Gewebe im Muskelgewebe eingepackt lag.
Im Rektum wurden hauptsächlich zwei Typen lymphatischer Strukturen gefunden.
Die eine Gruppe bildeten die LGK mit typischer tief in die Darmwand eingesenkter Struktur (Abb. 12), die neben reinen Solitärfollikeln vorkamen. Die Form des FAE wurde durch die in die Mukosa eingesenkten Krypten und durch die Lamina muscularis mucosae stark beeinflusst. Es lag tief in der trichterförmigen
Kryptenöffnung und bedeckte das schalenförmige Dome-Areal. Dabei erkannte man in der Mitte des FAE eine leichte Erhebung des Epithels. Weiterhin fanden sich hier kleine so genannte Propriaknötchen, die in der Lamina propria lagen und nicht oder sehr schwach von einer Lamina muscularis umgeben waren. Diese Propriaknötchen baseßen in der Regel kein Keimzentrum (Abb. 13). Sie waren im Vergleich zu den Solitärfollikeln weniger ausgebildet und erschienen eher als lymphozelluläre Ansammlungen.
Abbildung 6: Ein Solitärfollikel im Duodenum ohne erkennbares Keimzentrum. Das Dome-Areal (D) ist durch das FAE (Pfeilspitzen) bedeckt und besitzt eine kuppelartige Form. Die Lamina muscularis ist sehr schwach ausgebildet. Die Pfeile zeigen eine hochendotheliale Venule. G-6707, Paraffinschnitt, H. E.-Färbung.
Abbildung 7: Zwei dicht nebeneinander liegende Lymphfollikel im Duodenum. Das gemeinsame Dome-Areal (D) wölbt sich spitz in das Lumen. FAE (Pfeilspitzen), KZ = Keimzentren, KO = Korona. G-6708, Paraffinschnitt, H. E.-Färbung.
Abbildung 8: Normalstruktur von einem Solitärfollikel im Jejunum. Die Tunica muscularis ist nach außen ausgedehnt (Pfeile). Follikel-assoziiertes Epithel (Pfeilspitzen), D = Dome-Areal, K = Keimzentrum, KO = Korona. G-6696;
Paraffinschnitt, H. E.-Färbung.
Abbildung 9: Querschnitt einer Peyer’schen Platte aus dem Ileum. Sie liegt antimesenterial. In diesem Schnitt sind fünf Follikel (Sterne) und drei Dome-Areale zu erkennen. Ein Dome-Areal zeigt eine spitze Vorwölbung (Pfeil), zweimal sind die Bereiche eher kuppelförmig (Pfeilspitzen). G–6697, Paraffinschnitt, H. E.-Färbung.
Abbildung 10: Ileum mit Ausschnitt einer Peyer’schen Platte mit Dome-Areal (D).
Das Follikel-assoziierte Epithel (Pfeilspitzen) erhebt sich in der Mitte leicht (Pfeil).
Becherzellen sind vorhanden, aber deutlich weniger als auf den benachbarten Zotten. Zwischen den einzelnen Follikeln liegen die interfollikulären Zonen (IF). Die Korona umgibt das Keimzentrum (KZ). G–6697, Paraffinschnitt, H. E.-Färbung.
Abbildung 11: Ein lymphoglandulärer Komplex (LGK) in der Tela submucosa. Der LGK ist tief eingesenkt in die Schleimhaut. Das FAE des Dome-Areals (D) bildet in der Mitte eine Erhebung (Pfeile). KO = Korona, KZ = Keimzentrum, Lm = Lamina muscularis. G-6697, Zäkum, Paraffinschnitt, H. E.-Färbung.
Abbildung 12: Lymphoglandulärer Komplex (LGK) im Bereich des Rektums. Die lymphatischen Strukturen liegen in enger Assoziation zu Kryptenepithelbereichen.
Der Komplex liegt in der Tiefe der Rektumwand und wird begrenzt von glatter Muskulatur und Bindegewebssträngen. Das Follikel-assoziierte Epithel bildet leichte Vorwölbungen (Pfeile). G-6699, Paraffinschnitt, H. E.-Färbung. Inset: In der Tiefe der Rektumwand liegender LGK mit ausgeprägten Kryptenepithelstrukturen und lymphatischen Zellansammlungen. G-6699, Paraffinschnitt, H. E.-Färbung.
Abbildung 13: Propriaknötchen im Rektum ohne Keimzentrum und ohne Dome- Areal. Das Follikel-assoziierte Epithel (Pfeile) ist weit in das Lumen vorgewölbt. Die Lamina muscularis ist deutlich zu erkennen (Pfeilspitzen). G-6698, Paraffinschnitt, H.
E.-Färbung.
3.2.3 Ergebnisse der Transmissionselektronenmikroskopie
Für die Transmissionelektronenmikroskopie wurde in den Epon-Blöckchen durch vorsichtiges Anschneiden in seriellen Semidünnschnitten (Abb. 14) nach Lymphfollikeln gesucht. Daraufhin erfolgte nach Vororientierung an Semidünnschnitten die elektronenmikroskopische Charakterisierung des Follikel- assoziierten Epithels (FAE), insbesondere der M-Zellen, an Ultradünnschnitten.
3.2.3.1 Follikel-assoziiertes Epithel
Das Follikel-assoziierte Epithel (FAE) ist elektronenmikroskopisch einfach von dem üblichen Zottenepithel zu unterscheiden. Es setzt sich aus enteroabsorptiven Zellen, Becherzellen und M-Zellen zusammen. Darüber hinaus wurde im FAE eine nicht eindeutig identifizierbare Zelle beobachtet. Die enteroabsorptiven Zellen liegen dicht und regelmäßig beieinander und reichen von der Basalmembran bis zum Lumen hin.
Dazwischen sind einzelne M-Zellen verteilt, die ebenfalls bis zur Basalmembran reichen. Dabei stellen sie sich in den Ultradünnschnitten nur selten in voller Länge dar. Dies liegt an eingewanderten intraepithelialen Lymphozyten (IEL), durch die die Form der M-Zelle stark beeinflusst wird. IEL stehen im direkten Kontakt zu den M- Zellen und verdrängen Teile der M-Zellen. IEL zeigen ein helleres Zytoplasma als die Enterozyten und M-Zellen. Mit ihren Zytoplasmaausläufern durchtrennen sie die Basalmembran und wandern in das Epithel. Zu den M-Zellen besitzen sie eine besondere Affinität, aber liegen ohne deutlich erkennbare Verbindungen streng interzellulär. Die meisten der IEL verfügen über einen schmalen Zytoplasmasaum, der unter anderem Mitochondrien und freie Ribosomen enthält. Becherzellen sind ebenfalls im FAE vorhanden, allerdings ist ihre Zahl gegenüber den umliegenden Epithelstrukturen deutlich reduziert.
Abbildung 14: Semidünnschnitt aus dem Ileum, der den Aufbau eines Solitärfollikels demonstriert. Links erhebt sich eine muskelzellfaserhaltige Submukosa-Falte (F). Die Ellipse zeigt den Bereich für die elektronenmikroskopische Präparation. Die postkapillären Venulen (Pfeile) liegen in der parafollikulären Zone. Das Dome-Areal (D) bildet eine Übergangszone zum Lumen. K = Keimzentrum. G-6702, Semidünnschnitt, Methylenblaufärbung.
