Nationalbibliografie;
Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.
1. Auflage 2012
© 2012 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen
Printed in Germany
ISBN 978-3-86345-0
Verlag: DVG Service GmbH Friedrichstraße 17
35392 Gießen 0641/24466 geschaeftsstelle@dvg.net
www.dvg.net 91-5
Morphologische Untersuchungen an den Atemwegen von Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus) unter besonderer
Berücksichtigung von Clara-Zellen
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae-
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Victoria Seidel Iwanowo (Russland)
Hannover 2012
Wissenschaftliche Betreuung: Univ. Prof. Dr. F.-J. Kaup
Deutsches Primatenzentrum, Göttingen Abteilung Infektionspathologie
1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. F.-J. Kaup
Tierärztliche Hochschule Hannover, Deutsches Primatenzentrum, Göttingen
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H. Gasse
Tierärztliche Hochschule Hannover
Tag der mündlichen Prüfung: 25.05.2012
Meinem Vater, meiner Mutter
und meinem Mann Andreas
1 EINLEITUNG ... 7
2 LITERATURÜBERSICHT ... 8
2.1 Der Weißbüschelaffe (Callithrix jacchus) ... 8
2.2 Einsatz von Weißbüschelaffen in der biomedizinischen Forschung ... 10
2.3 Anatomie der Lunge ... 12
2.3.1 Makroskopie ... 12
2.3.1.1 Lappung ... 13
2.3.1.2 Bronchialbaum ... 15
2.3.2 Lunge bei Weißbüschelaffen ... 17
2.4 Nicht-zilierte Zellen des pulmonalen Respirationsepithels ... 19
2.4.1 Flimmerepithel ... 19
2.4.2 Nicht-zilierte Zellen des Flimmerepithels ... 20
2.4.2.1 Clara-Zellen ... 20
2.4.2.2 Becherzellen... 22
2.4.2.3 Pulmonale neuroendokrine Zellen ... 22
2.4.2.4 Basalzellen ... 24
2.4.3 Alveolarepithel ... 25
2.4.3.1 Pneumozyten Typ I ... 26
2.4.3.2 Pneumozyten Typ II ... 27
2.4.4 Pulmonale Surfactant-Proteine ... 28
3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN ... 30
3.1 Material und Methoden ... 30
3.1.1 Tiere und Probenmaterial ... 30
3.1.2 Haltungsbedingungen ... 30
3.1.3 Probenentnahme ... 31
3.1.4 Korrosionstechnik ... 33
3.1.5 Computertomographie und Datenauswertung mit MeVisLab ... 33
3.1.6 Zuordnung und Nomenklatur der Bronchialbäume ... 34
3.1.7 Lichtmikroskopie ... 35
3.1.7.1 Histologie und Immunhistochemie ... 35
3.1.8 Elektronenmikroskopie ... 38
3.1.8.1 Transmissionselektronenmikroskopie ... 38
3.1.8.2 Rasterelektronenmikroskopie... 39
3.1.9 Datenauswertung und statistische Berechnungen ... 39
3.2 Ergebnisse ... 42
3.2.1 Makroskopie ... 42
3.2.1.1 Bronchialbaum ... 44
3.2.2 Histologie und Immunhistochemie ... 59
3.2.2.1 Trachea ... 59
3.2.2.2 Hauptbronchus ... 59
3.2.2.3 Lobar- und Segmentbronchus ... 60
3.2.2.4 Bronchiolus ... 61
3.2.2.5 Nicht-zilierte Zellen der intrapulmonalen Atemwege ... 62
3.2.2.6 Alveolarepithel ... 69
3.2.2.7 Alveolarmakrophagen ... 71
3.2.3 Verteilung der nicht-zilierten Zellen in den intrapulmonalen luftführenden Wegen ... 74
3.2.3.1 Statistische Auswertung der nicht-zilierten Zellen ... 74
3.2.3.2 Prozentuale Verteilung der nicht-zilierten Zellen im Vergleich zu zilierten und undifferenzierten Zellen ... 79
3.2.4 Elektronenmikroskopische Untersuchungen an den Clara-Zellen ... 83
4 DISKUSSION ... 90
5 ZUSAMMENFASSUNG ... 105
6 SUMMARY ... 108
7 LITERATURVERZEICHNIS ... 111
8 ANHANG ... 127
1 EINLEITUNG
Der Weißbüschelaffe (Callithrix jacchus) als nicht-menschlicher Primat ist ein weit verbreitetes Tiermodell für verschiedene humane Erkrankungen. Im Vergleich zu anderen Primaten haben diese Neuweltaffen dank ihrer kleinen Größe, ihrer Anpassungsfähigkeit an Gefangenschaftshaltung, ihrer reproduktiven Besonderheiten und ihrer Kosteneffizienz viele Vorteile als Versuchstiermodell.
Hintergrund der vorliegenden Arbeit ist die Etablierung eines Tiermodells in nicht- menschlichen Primaten für chronische Atemwegserkrankungen des Menschen, insbesondere Asthma und Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD).
Bei Asthma und COPD des Menschen spielen die nicht-zilierten Zellen des respiratorischen Epithels bekanntermaßen eine wichtige Rolle. Um Veränderungen dieser Zellpopulation im Tiermodell beurteilen zu können, sind umfassende Kenntnisse zur normalen Verteilung und Morphologie dieser Epithelzellen sowie allgemeiner Lungenbesonderheiten bei Weißbüschelaffen unerlässlich. Da es aber in der Literatur kaum Informationen zu den morphologischen Verhältnissen im Respirationstrakt bei Weißbüschelaffen gibt, ist es das Ziel dieser Arbeit, umfangreiche Informationen und Daten zur Lungenmorphologie, Bronchialbaumstruktur, Verteilung und Morphologie von Clara-Zellen, Becherzellen und neuroendokrinen Zellen im Atmungstrakt von Weißbüschelaffen unterschiedlichen Alters zu gewinnen bzw. generieren, um Referenzdaten im Vorfeld tierexperimenteller Arbeiten zur Verfügung zu haben und um Aussagen über die anatomischen Ähnlichkeiten und Unterschiede zu anderen Tiermodellen und dem Menschen machen zu können.
2 LITERATURÜBERSICHT
2.1 Der Weißbüschelaffe (Callithrix jacchus)
Callithrix (C.) jacchus, auch als Pinselohraffe, Marmoset oder Weißbüschelaffe bezeichnet, ist ein tagaktiver, baumbewohnender Primat aus der Gruppe der Neuweltaffen. Nach aktueller Klassifikation von RYLANDS und MITTERMEIER (2009) sind die Krallenaffen eine eigenständige Familie (Callitrichidae) innerhalb der Gruppe der Breitnasenaffen (Platyrrhini), die aus 7 Gattungen besteht: Atlantische Marmosetten (Callithrix), Zwergseidenäffchen (Cebuella), Zwergmarmosetten (Callibella), Amazonas-Marmosetten (Mico), Tamarine (Saguinus), Löwenaffen (Leontopithecus) und Springtamarine (Callimico) (RYLANDS u. MITTERMEIER 2009). Bei der Gattung Callithrix gibt es keine weiteren Untergattungen. Der Name „Marmosetten“ wurde zum ersten Mal von WOLTERS und IMMELMANN (1988) eingeführt, die darunter die Gattungen Callithrix und Cebuella zusammenfassten (WOLTERS u. IMMELMANN 1988). Inzwischen werden die Gattungen Callithrix, Mico und Callibella als Marmosetten bezeichnet und die Gattungen Saguinus und Callimico als Tamarine (GEISSMANN 2003; RYLANDS u. MITTERMEIER 2009).
Gemeinsames anatomisches Merkmal der Gattungen Callithrix, Cebuella und Mico ist, dass alle Zähne im Vordergebiss etwa gleich hoch sind, wobei die Incisivi vergrößert und die Canini verkürzt sind (GEISSMANN 2003).
Laut der taxonomischen Revision von GROVES (2005) und RYLANDS u. MITTERMEIER (2009) besteht die Gattung Callithrix aus 6 Arten (GROVES 2005; RYLANDS u.
MITTERMEIER 2009):
C. jacchus - Weißbüschelaffe C. penicillata - Schwarzpinselaffe C. kuhli - Bahia-Seidenaffe
C. geoffroyi - Weißgesichtsseidenaffe C. aurita - Weißohrseidenaffe C. flaviceps - Gelbkopfbüschelaffe
Weißbüschelaffen weisen eine vorwiegend graubraune Fellfärbung auf. Das Rücken- und Schwanzfell ist in hellgrauen Tönen transversal gestreift (SCHRÖPEL 2010). Im Alter von etwa drei Monaten beginnen sich die typischen Gesichtszeichnungen dieser Tierart, weiße Ohrbüschel, auszubilden (SCHRÖPEL 2010). STEVENSON und RYLANDS (1988) geben für den adulten Weißbüschelaffen Kopf-Rumpf-Längen von ca. 25 cm und Schwanzlängen von 28 cm an. Das Gewicht wildlebender Tiere beträgt 317,9 +/- 34,1 g für Männchen und 322,0 +/- 40,4 g für Weibchen. In Laborhaltung wurden mit 347,6 +/- 30,5 g (Männchen) und 359,7 +/- 50,4 g (Weibchen) etwas höhere Werte ermittelt (ARAUJO et al. 2000).
Im Alter von 9 bis 13 Monaten werden die männlichen Weißbüschelaffen geschlechtsreif, weibliche Tiere allerdings erst nach ca. 20 Monaten (EISENBERG 1977). Laut HEARN (1983) beträgt die Ovarialzyklusdauer 28,6 +/- 1,0 Tage (HEARN 1994). Nach einer Tragzeit von 141-146 Tagen gebären Weißbüschelaffen in bis zu 65 % der Fälle Zwillinge, die Blut- und Stammzellchimären sind (HEARN 1983, 1994; A. KÖNIG 1995;
GEISSMANN 2003; SCHRÖPEL 2010).
Die Weißbüschelaffen sind vor allem im Nordosten Brasiliens und bis zum Rio Sao Francisco bzw. südwestlich bis zum Rio Grande verbreitet. In diesem Gebiet herrscht ein gemischtes Klima, und es sind verschiedene Vegetationsformen vorhanden, die eine hohe Anpassungsfähigkeit der Tiere verlangen. Die Luftfeuchtigkeit im atlantischen Küstenwald ist mit 77 - 99 % (auch in der Trockenzeit) sehr hoch. Niederschläge kommen außerhalb der Regenzeit (Juni bis Juli) eher selten vor. Die Temperaturschwankung in diesem Gebiet beträgt zwischen 21 und 31° C. Die Tiere sind häufig im Sekundärwald anzutreffen, der zusammen mit Zuckerrohr- und Cashewnuss-Plantagen reichlich vorhanden ist (SCHRÖPEL 2010). Je nach Literaturquelle liegt die Lebenserwartung der Weißbüschelaffen in freier Wildbahn zwischen 10 und 16 Jahren. In Laborhaltung reicht sie bis zu 18 Jahren (NOWAK 1999). Im Deutschen Primatenzentrum (DPZ), das seit 30 Jahren über eine große Weißbüschelaffenkolonie verfügt, leben einzelne Tiere, die schon mehr als 20 Jahre alt sind.
2.2 Einsatz von Weißbüschelaffen in der biomedizinischen Forschung
Weißbüschelaffen werden in den letzten Jahren zunehmend als Tiermodell in der biomedizinischen Forschung eingesetzt (SASAKI et al. 2009). Während sie zunächst hautsächlich im Bereich der Infektionsforschung, der Reproduktionsbiologie, der Neurowissenschaften sowie der Verhaltensforschung eingesetzt wurden, finden sie heute zunehmend Verwendung in der Arzneientwicklung sowie für die Sicherheitsbewertung von Substanzen in toxikologischen Studien (MANSFIELD 2003).
In der Infektionsforschung zeigen die Weißbüschelaffen eine hohe Empfänglichkeit für einige wichtige humane Infektionserreger, u.a. Yersinia pseudotuberculosis, Herpesviren und Toxoplasma gondii. Außerdem werden sie auch zur Erforschung von Alterserkrankungen wie der Alzheimer Krankheit und altersbedingter Gehörabnahme (TARDIF et al. 2010) sowie für Atemwegserkrankungen wie dem Schweren Akuten Respiratorischen Syndrom (SARS) eingesetzt (GREENOUGH et al. 2005). Weitere biomedizinische Einsatzgebiete sind Onkologie, Virologie (ADAMS et al. 2008), Pharmakologie (CHELLMAN et al. 2009), Teratologie, Endokrinologie, Osteologie, Autoimmunerkrankungen und Transplantationsimmunologie. Zusammenfassend sind in der Tabelle 1 Krankheitsmodelle und Forschungsbereiche aufgeführt, in denen Weißbüschelaffen als Tiermodell eingesetzt werden.
Aufgrund ihrer geringen Größe können diese nicht-menschlichen Primaten auch in kleineren Käfigen artgerecht in Gruppen gehalten werden. Die Größe erleichtert zudem das Handling der Tiere. Dazu kommen ökonomische Vorteile: da in der Arzneimittelentwicklung das Verbrauchsmaterial nach Gewicht des Tieres berechnet wird, sind Weißbüschelaffen im Vergleich zu Rhesusaffen (etwa 5 - 10 kg) 10 - 15 mal kostengünstiger (ORSI et al. 2010).
Durch die frühe Geschlechtsreife und die gute und konstante Reproduktion in Laborhaltung ergeben sich darüber hinaus Vorteile bezüglich zeitlicher Aspekte, da im Vergleich zu anderen Affenspezies in kürzerer Zeit reproduzierbare Datensätze erhoben werden können.
Tabelle 1: Einsatz der Weißbüschelaffen für Krankheitsmodelle und Forschungsbereiche.
(MANSFIELD 2003; ORSI et al. 2010).
Neurowissenschaften Multiple Sklerose Parkinson-Krankheit
Chorea Huntington (Huntington- Krankheit)
Schlaganfall Alzheimer-Krankheit Absence-Epilepsie Alterung
Rückenmarksverletzung Immunologie Thymusepithelium
Interleukin 2und 4
Amyloid A (AA) Amyloidose
Induzierte thrombozytopenische Purpura Infektionskrankheiten Hepatitis
Östliche Pferdeenzephalomyelitis Schweres Akutes Respiratorisches Syndrom (SARS)
Viruspersistenz HIV
Masern Milzbrand Pocken
Hämorrhagisches Fieber Filariose
Malaria
Urogenitale Infektionen Legionellose Prionkrankheiten Andere Reproduktive Biologie und
Immunokontrazeption Knochenerkrankungen Humane Physiologie Verhaltenswissenschaften
2.3 Anatomie der Lunge
2.3.1 Makroskopie
Bei Menschen und Haus- und Labortieren unterscheidet man zwei im Brustraum liegende Lungen, eine rechte (Pulmo dexter) und eine linke (Pulmo sinister). Sie gliedern sich in Lappen, Segmente, Läppchen und Azini (LARSEN u. ZIEGENFUSS 2009).
Man differenziert drei äußere Lungenflächen, die von einem einschichtigen flachen Epithel (Serosa bzw. Pleura) überzogen sind: Facies diaphragmatica, Facies mediastinalis und Facies costalis (jeweils angrenzend an das Zwerchfell, das Mediastinum und die Rippen) (MOLL u. MOLL 2005; H. KÖNIG u. LIEBICH 2008). Auf diesen Flächen sind zwei Kanten zu finden: bei menschlichen Lungen zwischen Facies mediastinalis und Facies costalis der Margo anterior und beim Übergang zwischen Facies costalis und Facies diaphragmatica der Margo inferior (MOLL u. MOLL 2005). Bei Haustierlungen nennt man den stumpfen dorsalen Rand der Lunge Margo dorsalis oder obtusus und den gegenüber stehenden scharfen Rand Margo acutus (H. KÖNIG u. LIEBICH 2008).
Die rechte und linke Lunge befindet sich jeweils in einer Cavitas pleuralis (in dieser Arbeit wird aufgrund der starken Ähnlichkeit von Weißbüschelaffen und Menschen sowie der Motivation dieser Arbeit an einigen Stellen die Human-Nomenklatur benutzt, die Cavitas pleuralis hieße in der Veterinärnomenklatur Cavum pleurae). Sie werden von einer Pleura pulmonalis (Pleura visceralis) überzogen, die durch einen schmalen Spalt von der Pleura parietalis getrennt wird. Im Pleuralspalt befindet sich ein Flüssigkeitsfilm, der die Verschiebung der Lungen gegenüber der Brustwand ermöglicht (LARSEN u.
ZIEGENFUSS 2009). Die Pleura parietalis ist äußerst schmerzempfindlich, da sie viele Nerven enthält. Im Gegensatz dazu hat die Pleura visceralis keine sehr ausgeprägte Innervation (WALDEYER 2003).
2.3.1.1 Lappung
Die Lungenlappung bei Säugetieren ist artspezifisch unterschiedlich ausgebildet. Als Basis für die Bezeichnung der einzelnen Lungenlappen dient die Aufzweigung des Bronchialbaums (H. KÖNIG u. LIEBICH 2008). Bei Menschen besteht die rechte Lunge aus drei Lappen (LARSEN u. ZIEGENFUSS 2009):
- Oberlappen (Lobus superior);
- Mittellappen (Lobus medius);
- Unterlappen (Lobus inferior).
Die linke Lunge hingegen besteht nur aus zwei Lappen:
- Oberlappen (Lobus superior);
- Unterlappen (Lobus inferior).
In der Tabelle 2 wird zusammenfassend die Lappung der Lunge bei Menschen, Labor- und Haustieren dargestellt.
Die Lungenlappen sind bei Menschen (und größeren Säugetieren wie Rindern und Pferden) mit interlobäre bindegewebige Septen verbunden. Bei Rhesusaffen sind die Septen nur schwach entwickelt, und bei Mäusen und Ratten fast gar nicht vorhanden (PLOPPER 1996).
Tabelle 2: Lungenlappung bei Menschen, Labor- und Haustieren (ELLENBERGER u.
BAUM 1943; MERCER et al. 1987; TYLER et al. 1988; WEIBEL 1989; HARKEMA et al.
1991; MCBRIDE 1992).
Linke Lunge Rechte Lunge
Mensch Lobus superior Lobus inferior
Lobus superior Lobus medius Lobus inferior
Rhesusaffe Lobus cranialis Lobus caudalis
Lobus cranialis Lobus medius Lobus caudalis Lobus accessorius
Ratte Lobus cranialis Lobus caudalis
Lobus cranialis Lobus medius Lobus caudalis Lobus accessorius
Maus Lobus cranialis Lobus caudalis
Lobus cranialis Lobus medius Lobus caudalis Lobus accessorius
Schwein Lobus cranialis (zweigeteilt) Lobus caudalis
Lobus cranialis Lobus medius Lobus caudalis Lobus accessorius
Pferd Lobus cranialis Lobus caudalis
Lobus cranialis Lobus caudalis Lobus accessorius
2.3.1.2 Bronchialbaum
Erste Erkenntnisse über den Bronchialbaum der Säugetiere, inklusive des Menschen, wurden im Jahr 1880 von AEBY (1880) veröffentlicht.
Die Luftröhre (Trachea) ist eine flexible Röhre, die den Kehlkopf mit den Hauptbronchien verbindet. Bei menschlichen Erwachsenen ist sie 10 bis 12 cm lang und hat einen Durchmesser zwischen 1,2 und 1,5 cm (MOLL u. MOLL 2005). Die Trachea wird von hyalinen Knorpelspangen stabilisiert, die je nach Tierart unterschiedliche Form und Anzahl haben können (H. KÖNIG u. LIEBICH 2008). Die Trachea des Menschen, des Hundes, und des Pferds besitzt C-förmige Knorpelspangen (MOLL u. MOLL 2005; H. KÖNIG u.
LIEBICH 2008). Beim Schwein hat sie die Form eines fast verschlossenen Ringes mit überlappenden Enden, und beim Rind sind die Enden der Spangen nach dorsal aufgebogen (H. KÖNIG u. LIEBICH 2008). Die dorsalen Enden der Knorpelspangen werden von transversal verlaufender glatter Muskulatur (Musculus trachealis) verschlossen (DRAKE et al. 2007). Bei den meisten Säugetieren teilt sich die Trachea an dem keilförmigen Knorpelstück Carina tracheae über die Bifurcatio tracheae in zwei Hauptbronchien (Bronchi principales), die weiter zur linken und rechten Lunge führen. Bei Wiederkäuer und Schwein entlässt die Trachea auf der rechten Seite vor ihrer Bifurcatio tracheae einen Bronchus trachealis. Er ist für die Belüftung des Lobus cranialis verantwortlich (H.
KÖNIG u. LIEBICH 2008). Im weiteren Verlauf verzweigt sich jeder Hauptbronchus in Lappenbronchien (Bronchi lobares). Je nach Säugetierart können die Abzweigungen innerhalb der Lappenbronchien jedoch unterschiedlich sein (H. KÖNIG u. LIEBICH 2008).
Die Verzweigung der Bronchien beim Mensch erfolgt dichotomisch (LARSEN u.
ZIEGENFUSS 2009). Das Aufzweigungsprinzip bei nicht-menschlichen Primaten ist relativ einzigartig: es kann dichotomisch und trichotomisch sein. Die Bronchialsegmente verzweigen sich dabei unter einem Winkel von etwa 45° (PLOPPER 2005). Beim Menschen teilt sich der rechte Hauptbronchus in drei Lappenbronchien (Bronchi lobares superior, medius und inferior) auf. Der linke Hauptbronchus teilt sich in zwei Lappenbronchien (Bronchi lobares superior und inferior) auf (MOLL u. MOLL 2005). Danach verzweigen
sich die Lappenbronchien in Segmentbronchien (Bronchi segmentales), die zu einzelnen bronchopulmonalen Lungensegmenten innerhalb eines Lappens führen. Unter einem bronchopulmonalen Segment versteht man eine selbstständige funktionstüchtige Atmungseinheit, die einen Segmentbronchus und eine zugehörige pulmonale Arterie besitzt (DRAKE et al. 2007). Auf der rechten Seite befinden sich beim Menschen 10 Segmentbronchien:
Bronchus lobaris superior mit 3 Segmentbronchien (1.-3. Lungensegment);
Bronchus lobaris medius mit 3 Segmentbronchien (4.-5. Lungensegment);
Bronchus lobaris inferior mit 5 Segmentbronchien (6.-10. Lungensegment);
Auf der linken Seite sind nur 9 Segmentbronchien vorhanden:
Bronchus lobaris superior mit 5 Segmentbronchien (1.-5. Lungensegment);
Bronchus lobaris inferior mit 4 Segmentbronchien (6.-10. Lungensegment, der 7.
Bronchus fehlt);
Den Segmentbronchien schließen sich mehrere Generationen von Bronchi intrasegmentales an: mittlere, kleine und kleinste. Die Bronchi lobares, Bronchi segmentales und die anderen kleineren Bronchien besitzen Knorpelspangen, die unregelmäßig ringförmig in der Wand angeordnet sind (WALDEYER 2003). Weiterhin gehen die Bronchi subsegmentales in Bronchioli veri über. In der Humanliteratur spricht man von Bronchiolen, wenn sie weniger als 1 mm im Durchmesser sind und keine Knorpelplatten haben. Nach mehreren Verzweigungen gehen die Bronchioli veri in Bronchioli terminales über (DRAKE et al.
2007) und teilen sich schließlich in die Bronchioli respiratorii auf. Bronchioli respiratorii sind Bronchiolen, in deren alveolären Aussackungen der Gasaustausch stattfindet. Die Letzteren teilen sich noch 3 mal und zweigen sich in Ductuli alveolares auf. Von den Ductuli alveolares gehen die Alveolen ab, die sich traubenartig um einen Ductulus alveolaris herum gruppieren. Gruppen von Alveolen werden als Sacculi alveolares bezeichnet (MOLL u. MOLL 2005) (Abbildung 1).
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Bronchialbaums (H. KÖNIG u. LIEBICH 2008).
Für die großen Menschenaffen (Schimpansen (NAKAKUKI 1992), Orang-Utans (NAKAKUKI u. EHARA 1991) und Gorillas (NAKAKUKI 1991)) liegen ausführliche Daten über den Bronchialbaum vor. Es konnte gezeigt werden, dass die Verzweigung des Bronchialbaums des Menschen und der Menschenaffen weitgehend übereinstimmt (NAKAKUKI 1992).
2.3.2 Lunge bei Weißbüschelaffen
Erste Beschreibungen der anatomischen Charakteristika der Lunge von Weißbüschelaffen finden sich in den wissenschaftlichen Arbeiten von FORBES (1880), WELDON (1884) und BEDDARD (1901). Eine makroskopische und histologische Beschreibung der
Lungenmorphologie bei Callithrix jacchus erfolgte erstmalig von SURRIBAS u.
LAWZEWITSCH (1987) und von FOERSTER (1988).
Die etwa 3 cm lange Trachea teilt sich in zwei Hauptbronchien (SURRIBAS u.
LAWZEWITSCH 1987). Die Lunge von einem adulten Weißbüschelaffen hat, gemessen von der oberen Kante des oberen Lappens bis zur unteren Kante des unteren Lappens, eine Ausdehnung von etwa 3,5 cm und ist, wie bei allen luftatmenden Lebewesen, von Pleura überzogen (SURRIBAS u. LAWZEWITSCH 1987). Die Lunge ist unterteilt in sechs Lappen: zwei auf der linken Seite und vier auf der rechten Seite. Die beiden oberen Lappen (Lobus cranialis sinister und Lobus cranialis dexter) haben eher eine ovale Form. An seiner Spitze hat der obere linke Lappen (Lobus cranialis sinister) sehr häufig eine Einkerbung.
Die beiden unteren Lappen (Lobus caudalis sinister und Lobus caudalis dexter) sind die größten. Kranial des Herzens und kaudal des Zwerchfells liegt der mittlere Lappen (Lobus medius), der eine langgezogene, spitz auslaufende Gestalt aufweist. Der infrakardiale Lappen (Lobus accessorius) befindet sich auf der rechten Seite und ist im Vergleich zu den anderen Lappen beweglicher (FOERSTER 1988).
Eine Übersicht über die pränatale Entwicklung sowie die Morphologie der Lunge in der neonatalen Periode bei Weißbüschelaffen gibt die Arbeit von FOERSTER (1988). In dieser Arbeit wurden mit Hilfe von Lupen-, Licht- und Elektronenmikroskopie die einzelnen Phasen der Lungenentwicklung identifiziert und mit denen anderer nicht-menschlicher Primaten bzw. des Menschen verglichen. Die Lungenentwicklung bei Weißbüschelaffen stimmt weitgehend mit der anderer Primaten überein.
2.4 Nicht-zilierte Zellen des pulmonalen Respirationsepithels
2.4.1 Flimmerepithel
Die Trachea, Hauptbronchien und intrapulmonalen Atemwege sind von einem respiratorischen Flimmerepithel (Abbildung 2) ausgekleidet. Die Höhe des Flimmerepithels nimmt entlang des Bronchialbaums in distale Richtung der Alveolen kontinuierlich ab. In der Trachea, den Hauptbronchien und den Bronchien befindet sich ein mehrreihiges hochprismatisches Epithel, wohingegen die Bronchiolen von einem einschichtigen isoprismatischen Flimmerepithel ausgekleidet sind (LIEBICH 2009). Die größte Zellpopulation des respiratorischen Epithels stellen zilierte Zellen dar (SHAH et al. 2009).
Diese besitzen am apikalen Zellpol Zilien, die koordiniert Bewegungen in Richtung des Pharynx ausführen und damit eine wichtige Rolle bei der mukoziliären Clearance spielen (WELSCH 2006). Die Oberfläche des respiratorischen Flimmerepithels wird von einem seromukösen Sekretfilm überzogen, der von Becherzellen und Bronchialdrüsen produziert wird und zur Reinigung der Atemwege von Pathogenen und Fremdpartikeln (z. B. Staub) dient. Der Schleimfilm wird in zwei Phasen unterteilt: eine Sol- und Gelphase (LARSEN u.
ZIEGENFUSS 2009). Für die mukoziliäre Clearance ist die Anzahl, Struktur, Aktivität und koordinierte Bewegung der Zilien sowie eine ausreichende Sekretproduktion der nicht- zilierten Zellen relevant. Beim Menschen setzt eine optimale Funktion der mukoziliären Clearance eine Körpertemperatur von 37 °C und eine intrapulmonale absolute Feuchtigkeit von 44 mg/l entsprechend einer relativen Feuchtigkeit von 100 % voraus (OCZENSKI et al.
2008).
Eine erste Beschreibung zur Histologie des Flimmerepithels im Respirationstrakt von Weißbüschelaffen lieferten SURRIBAS und LAWZEWITSCH (1987). Das einschichtige iso- bis hochprismatische Epithel kleidet die Nasen-, Trachea- und stellenweise die Bronchialbereiche aus. Das bronchioläre Epithel zeichnet sich durch einreihiges kubisches Epithel aus (SURRIBAS u. LAWZEWITSCH 1987).
2.4.2 Nicht-zilierte Zellen des Flimmerepithels
2.4.2.1 Clara-Zellen
Clara-Zellen (Abbildung 2) sind nicht-zilierte, sekretorisch aktive Zellen, die erstmals von KÖLLIKER (1881) und später von CLARA (1937) in den terminalen Bronchiolen bei Kaninchen und Mensch beschrieben wurden. Clara-Zellen erfüllen verschiedene wichtige Funktionen im respiratorischen Epithel der Lunge. Sie sind involviert in die Regulation von Entzündungsprozessen und in die Regeneration des Bronchialepithels. Weiterhin können sie bei Schädigungen des respiratorischen Epithels als Vorläuferzellen für andere zilierte und nicht-zilierte Zellen dienen (REYNOLDS u. MALKINSON 2009). Ihre Hauptfunktion liegt in der Synthese und Sekretion verschiedener Substanzen. Sie sezernieren hauptsächlich das Clara-Zell-Protein, das auch als Clara Cell Secretory Protein (CCSP) bekannt ist. Spezies- und organabhängig kann man dieses Protein auch unter anderen Namen finden: CC10, CC16, Uteroglobulin oder Blastokinin (COPPENS et al. 2007).
Durch die Bildung der Surfactant-Proteine A, B und D, die für die unspezifische Immunabwehr erforderlich sind, tragen die Clara-Zellen zum pulmonalen Surfactant-System bei (PLOPPER 1996; REYNOLDS u. MALKINSON 2009). Surfactant-Proteine setzen die Oberflächenspannung herab und ermöglichen die Zilienbewegung unter dem Schleim. Eine wesentliche detoxifizierende Wirkung für die gesamte Lunge wird den Clara-Zellen aufgrund verschiedener intrazytoplasmatischer Enzymsysteme, insbesondere einer Zytochrom-P-450 (CYP) und einer Flavin-enthaltenden Monooxygenase (FMO), zugeschrieben (DROMMER et al. 1987; DEVEREUX et al. 1989). Bei Rhesusaffen sind diese jedoch nur in geringem Maße nachweisbar (PLOPPER 1996). Bei den meisten anderen Labortieren ist eine Zytochrom-P-450-Expression, insbesondere von CYP2B und CYP4B, nachweisbar. Weiterhin spielen die Clara-Zellen eine wichtige immunmodulierende Rolle, weil sie Glykosaminoglykane, Lysozym und sekretorisches Immunglobulin A (IgA) sezernieren können (SINGH u. KATYAL 2000).
Hinsichtlich ihrer Morphologie weisen Clara-Zellen große, spezies-abhängige Unterschiede auf. Insbesondere ihre Granula, die Menge von Glykogen, das raue endoplasmatische Retikulum (RER) und das glatte endoplasmatische Retikulum (GER) unterliegen tierartspezifischen Variationen (PLOPPER et al. 1980a; PLOPPER et al. 1980c; PLOPPER 1983, 1996; REYNOLDS u. MALKINSON 2009).
Man glaubte viele Jahre, dass sich Clara-Zellen nur in den terminalen Bronchiolen befinden.
PLOPPER et al. (1983) konnten jedoch nachweisen, dass die Clara-Zellen bei einigen Tierarten nicht nur in den Bronchiolen, sondern auch in der Trachea und den Hauptbronchien vorkommen, wie z. B. bei Rhesusaffe, Maus, Hamster und Kaninchen (PLOPPER et al. 1983; MARIASSY 1992; COPPENS et al. 2007). Im Gegensatz zu diesen Tieren sind die Clara-Zellen in der menschlichen Lunge erst ab Höhe der terminalen Bronchiolen zu finden (BOERS et al. 1999). Immunhistochemisch können Clara-Zellen mit Antikörpern gegen CCSP dargestellt werden (SINGH u. KATYAL 1997; COPPENS et al.
2007).
Ultrastrukturell weisen Clara-Zellen die für sie typischen elektronendichten Granula auf. Bei der Katze fehlen diese vollständig (PLOPPER et al. 1980c). Die Mitochondrien können in der Größe sehr variabel sein. Die größten von ihnen sind zugleich in großen Mengen z.B.
bei Maus und Meerschweinchen zu finden. Die Glykogenspeicherung im Zytoplasma ist besonders ausgeprägt bei Ratten, Rindern und Kaninchen (PLOPPER u. HYDE 1992; EL- GAWAD u. WESTFALL 2000). Von einem besonders großen Nukleus wird häufig bei menschlichen Clara-Zellen berichtet (SMITH et al. 1979). Mit Hilfe der Elektronenmikroskopie ist der Sekretionsmodus der Clara-Zellen darstellbar: ein apokriner Typ der Sekretion liegt vor, wenn die Zellen ihre Sekretionsgranula unter Verlust ihres Zytoplasmas in sogenannten „apical caps“ abschnüren; bei dem merokrinen Typ trennen sich die Granula ohne Verlust des Zytoplasmas von der Zelle. Beide Sekretionsmodi wurden bei den Clara-Zellen des Pferdes beobachtet (DROMMER et al. 1987). In der vorhandenen wissenschaftlichen Literatur liegen bis jetzt keine morphologischen Daten zu Clara-Zellen bei Weißbüschelaffen vor.
2.4.2.2 Becherzellen
Becherzellen sind nicht-zilientragende, becherförmige, schleimproduzierende Zellen, die im respiratorischen und intestinalen Epithel sowie in den Konjunktiven des Auges vorkommen.
Sie produzieren hauptsächlich Muzine, die sich unter Wasseraufnahme zu Mukus (Schleim) umbilden. Becherzellen geben ihre Sekrete auf der Zelloberfläche auf apokrinem und merokrinem Sekretionsweg ab. Chronische Atemwegserkrankungen, wie z. B. Asthma, COPD und zystische Fibrose, führen zu einer Hyperplasie und Hypertrophie der Becherzellen. In der Folge verändert sich aufgrund einer Hypersekretion von Muzinen das Volumen und die Zusammensetzung des Mukus (ROGERS 2003). Histologisch können Becherzellen mit der PAS-Reaktion oder immunhistochemisch mit muzinbindenden Antikörpern wie z. B. MUC5AC nachgewiesen werden.
Ultrastrukturell zeigen Becherzellen eine becherförmige Morphologie und liegen zwischen den zilientragenden Zellen. In den apikalen Bereichen des Zytoplasmas sind die charakteristischen elektronendurchlässigen, muzin-enthaltenden Granula zu finden. Im basalen Bereich befinden sich das raue endoplasmatische Retikulum, Mitochondrien, der Nukleus und weitere Organellen (TOMASHEFSKI u. FARVER 2008).
Bis jetzt ist sehr wenig bekannt über die Becherzellen von Weißbüschelaffen. SURRIBAS und LAWZEWITSCH (1987) erwähnt in seiner Arbeit nur kurz, dass sie in der Trachea in geringer Anzahl vorhanden sind.
2.4.2.3 Pulmonale neuroendokrine Zellen
Seit der ersten Erwähnung von FEYRTER (1938) haben die pulmonalen neuroendokrinen Zellen (PNEZ) (Abbildung 2) großes wissenschaftliches Interesse hervorgerufen (FEYRTER 1938; PAN et al. 2004). Sie kommen in geringer Anzahl bei den meisten Säugetieren, Reptilien, Amphibien, Vögeln und sogar in den Kiemen von Fischen vor (SORHAUG 2007). Disseminiert im respiratorischen Epithel treten sie einzeln oder in Form korpuskulärer Zellaggregate, sogenannter „neuroepithelial bodies“, auf (CUTZ 1982). Es ist
bekannt, dass beim Menschen pulmonale neuroendokrine Zellen von dem respiratorischen Epithel der Nasenhöhle bis zu den bronchioalveolären Regionen vorkommen (SORHAUG 2007). Sie sind meistens nahe an der Basalmembran lokalisiert (HARKEMA et al. 1991).
Neuroepithelial bodies (NEBs) befinden sich eher im Bifurkationsbereich und an den Übergangsstellen zwischen den Bronchiolen und Alveolen (SORHAUG 2007).
Viele funktionelle und morphologische Eigenschaften teilen die pulmonalen neuroendokrinen Zellen mit anderen neuroendokrinen Zellen, die z.B. im Gastrointestinaltrakt vorkommen. Sie synthetisieren und geben bioaktive Peptide und Amine ab, die über das Blut (endokrin) auf Zielzellen wirken können. NEBs können als Sauerstoffsensoren dienen. Sie haben engen Kontakt mit Nervenfasern, und die Sekretprodukte der NEBs können daher als Neurotransmitter agieren (SORHAUG 2007).
Laut SOROKIN et al. (1993) und HOYT et al. (1993) spielen PNEZ eine regulatorische Rolle in der Lungenentwicklung. Während der pulmonalen Organogenese reifen die PNEZ als erster Zelltyp aus. Es wird vermutet, dass die von PNEZ produzierten Peptide einen parakrinen stimulierenden Effekt auf ihre Nachbarzellen haben und damit für die Ausreifung der Lungen verantwortlich sind (SORHAUG 2007).
Die von den PNEZ bzw. NEBs produzierten Peptide sollen weiterhin die Entzündungsreaktion bei Erkrankungen wie Asthma und COPD modulieren (SORHAUG 2007). Außerdem werden den PNEZ bzw. NEBs weitere Funktionen wie die Regulation der pulmonalen Blutbahn und des bronchialen Tonus zugeschrieben (SORHAUG 2007).
Ausgereifte PNEZ haben eine konische oder spindelförmige Struktur, die mit ihrer basalen Oberfläche an die Basallamina grenzt. Die dünnen apikalen Teile der Zellen dehnen sich in Richtung des Lumens aus (JOHNSON 1991).
Mit verschiedenen histologischen Techniken, wie z. B. Versilberungen, kann eine prägnante Argyrophilie der Granula nachgewiesen werden (GRIMELIUS 2004). Dann zeigen die neuroendokrine Zellen ihre charakteristischen argyrophilen, endokrinen Granula (DIAUGUSTINE u. SONSTEGARD 1984). Immunhistochemisch kann diese Zellpopulation mit den üblichen neuroendokrinen Markern, wie z.B. Neuronspezifische
Enolase (NSE) oder Chromogranin A, gut dargestellt werden (WHARTON et al. 1981).
Weitere immunhistochemische Marker für pulmonale neuroendokrine Zellen bzw.
neuroepithelial bodies sind Calcitonin gene-related peptide (CGRP) und gastrin releasing peptide (GRP, bombesin) (SCHEUERMANN 1997).
Ultrastrukturell sind für die neuroendokrinen Zellen zahlreiche runde und ovoide intrazytoplasmatische neurosekretorische Granula charakteristisch, deren Durchmesser zwischen 70 und 150 nm beträgt. Sie enthalten Peptide und Serotonin (CUTZ et al. 1993).
Die Granula besitzen ein elektronendichtes Zentrum, das von der äußeren Grenzmembran durch einen klaren, elektronentransparenten Halo getrennt ist.
Neuroendokrine Zellen in der Lunge wurden bei nicht-menschlichen Primaten unter anderem bei Geoffroy-Klammeraffen (Ateles geoffroyi) beschrieben (LAUWERYNS et al.
1972), aber bis heute liegen keine Veröffentlichungen über die Morphologie oder Verteilung der pulmonalen neuroendokrinen Zellen bei Weißbüschelaffen vor.
2.4.2.4 Basalzellen
Basalzellen sind kleine, abgeflachte Zellen, die auf der Basallamina ruhen, aber mit ihren apikalen Zellgrenzen nicht an das Lumen heranreichen (HARKEMA et al. 1991). Mit dieser zentralen Position haben sie direkten Kontakt mit den Epithelzellen, den Nervenfasern, der Basalmembran sowie den mesenchymalen Zellen. Auf diese Weise spielen sie eine wichtige Rolle in der sogenannten „epithelial-mesenchymal trophic unit“ im Bronchialepithel (EVANS et al. 2001). Sie kommen im gesamten respiratorischen Epithel vor und erfüllen in der ersten Linie eine regenerative Funktion durch Ersatz von abgestorbenen oder beschädigten Epithelzellen. Man vermutet, dass sie sich als Reservezellen in eine Clara- Zelle, Becherzelle oder sogar eine zilierte Epithelzelle differenzieren können (ROCK et al.
2009). Es wird auch berichtet, dass sie zusätzlich eine Funktion in neurogenen Entzündungen, anderen Entzündungsreaktionen, bei der mukoziliären Clearance und bei Antioxidationsprozessen im Gewebe haben können (EVANS et al. 2001).
Morphologisch weisen die Basalzellen keine charakteristischen Organellen wie die anderen nicht-zilierten Zellen auf. Sie besitzen wenig Zytoplasma und einen kleinen Nukleus. Das Zytoplasma ist gefüllt mit Intermediärfilamenten. Zahlreiche Desmosomen verbinden die Basalzellen mit umliegenden Epithelzellen (HARKEMA et al. 1991). Immunhistochemische Untersuchungen der Basalzellen von BOERS et al. (1998) zeigten eine positive Reaktion mit Hilfe des Antikeratin-Antikörpers 34βE12 als Marker für Basalzellen (BOERS et al. 1998).
Während die Verteilung der Basalzellen innerhalb des Bronchialbaumes bei Rhesusaffen bereits von HARKEMA et. al. (1991) untersucht wurde, gibt es bis heute bei den als Versuchstiermodell interessanteren Weißbüschelaffen noch keine Untersuchungen zu den Basalzellen im Respirationsepithel.
Abbildung 2: Schematische Darstellung verschiedener Zelltypen im Bronchialepithel (WALDEYER 2003).
2.4.3 Alveolarepithel
Als Alveolarepithel bezeichnet man das einschichtige flache Epithel, mit dem die Innenseite der Alveolen ausgekleidet ist. In den Alveolen als strukturelle Einheiten des
Respirationstraktes findet der Gasaustausch zwischen Blut und alveolären Luftraum statt.
Das Alveolarepithel setzt sich aus zwei Zelltypen zusammen: Pneumozyten Typ I und Pneumozyten Typ II. Die Alveolen haben die Form kleiner Bläschen, die weintraubenförmig einen Alveolargang (Ductulus alveolaris) bilden, der seinerseits das Ende der Bronchiolen ist. Die einzelne Alveole weist eine runde bis polygonale Form auf, wobei ihr Durchmesser stark davon abhängt, in welcher Phase der Ein- oder Ausatmung sie sich befindet (WELSCH 2006). Angrenzende Alveolen sind voneinander durch dünne Alveolarsepten getrennt, in denen sich feinste Poren, die sogenannten Kohn‘schen Poren, befinden. Sie ermöglichen eine kollaterale, alveoläre Ventilation, Umtausch des Surfactants und auch Durchtritt für pulmonale Makrophagen (BLÜMCKE 1983). Außerdem enthalten Alveolarsepten viele Kapillaren und sind reich an Elastin (HEINZELLER 2001).
Untersuchungen von BARBIER und BACHOFEN (2000) zeigen, dass die Alveolarsepten bei Weißbüschelaffen von auffällig vielen Kohn‘schen Poren unterbrochen werden. Sie stellen sich in rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen besonders gut dar. Des Weiteren sind die Alveolen bei Weibüschelaffen ungewöhnlich stark kapillarisiert (BARBIER u. BACHOFEN 2000).
2.4.3.1 Pneumozyten Typ I
Etwa 95 % der inneren Alveolaroberfläche wird von Pneumozyten vom Typ I ausgekleidet (LIEBICH 2009). Ihre Hauptfunktion ist der Gasaustausch. Pneumozyten Typ I bilden die Blut-Luft-Schranke, deren Hauptkomponenten, außer den Pneumozyten Typ I, die noch darunter liegende Basalmembran und das Kapillarendothel sind. Durch die Blut-Luft- Schranke findet die Aufnahme von Sauerstoff in das Blut und die Abgabe von Kohlenstoffdioxid in die Atemwege statt (WELSCH 2006).
Pneumozyten vom Typ I sind etwa 50 µm breite und ca. 0,1 – 0,2 µm hohe, stark abgeflachte Zellen, die über tight junctions mit den Pneumozyten vom Typ II verbunden sind (TOMASHEFSKI u. FARVER 2008). Immunhistochemisch lassen sich die Typ I Pneumozyten mit dem Epithelzellmarker Caveolin-1 darstellen (NEWMAN et al. 1999).
Auf ultrastrukturellem Niveau besitzen Typ I Pneumozyten einen zentral liegenden Nukleus, Mitochondrien, eine minimale Menge von rauem endoplasmatischen Retikulum und eine moderate Menge von endozytotischen Vesikeln, Mikrotubuli, Mikrofilamenten und andere Organellen (PLOPPER 1996; WELSCH 2006).
SURRIBAS und LAWZEWITSCH (1987) beschreiben die Typ I Pneumozyten bei Weißbüschelaffen als Zellen mit wenig Zytoplasma und einem prominenten Nukleus, die nur minimal in das Alveolarlumen hineinragen (SURRIBAS u. LAWZEWITSCH 1987).
2.4.3.2 Pneumozyten Typ II
Etwa 5% der inneren Alveolaroberfläche bedecken Pneumozyten Typ II, die ebenso viele wichtige Funktionen erfüllen: Produktion von pulmonalen Surfactant-Proteinen und Synthese von Fibronektin, Kollagen Typ IV und Proteoglykanen. Ebenso können sie Arachnidonsäure metabolisieren, um Eikosanoide (z. B. Prostaglandin) zu bilden.
Untersuchungen der letzten Jahre weisen darauf hin, dass die Pneumozyten Typ II sich in Pneumozyten Typ I differenzieren können und somit als Reservezellen anzusehen sind (BISHOP 2004). Darüber hinaus exprimieren Pneumozyten Typ II den Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) I-Rezeptor und fungieren als Antigen- präsentierende Zellen (OSBORN u. LOWENSTINE 1998).
Pneumozyten Typ II haben eine kubische bis polygonale Form, sind bis zu 10 – 15 µm im Durchmesser groß und liegen meist in den Nischen der Alveolen. Das erklärt die Tatsache, dass ihre Gesamtzahl innerhalb einer Alveole größer ist als die der Pneumozyten Typ I (40
% Pneumozyten Typ I und 60 % vom Typ II), denn die Pneumozyten vom Typ II sind wesentlich flächenmäßig kleiner als die vom Typ I (TOMASHEFSKI u. FARVER 2008).
Ultrastrukturell besitzen Pneumozyten vom Typ II einen großen, basal liegenden, runden Kern mit einem prominenten Nukleolus. Außerdem haben sie viele Mitochondrien, Ribosomen, wenige Lysosomen, raues endoplasmatisches Retikulum, Mikrovesikel und einen Golgi-Apparat und Mikrovilli (PLOPPER 1996). Eine Besonderheit der Typ II Pneumozyten sind zahlreiche osmophile ‚lamellar inclusion bodies‘ (TOMASHEFSKI u.
FARVER 2008), die die wesentlichen Surfactant-Proteine A, B, C und D (SP-A, SP-B, SP- C, SP-D) enthalten. Dank dieser Surfactant-Proteine lassen sich Typ II Pneumozyten mit Antikörpern gegen Surfactant-Proteine immuhistochemisch detektieren (SCHMIEDL et al.
2005).
Pneumozyten vom Typ II sind bei Weißbüschelaffen laut SURRIBAS und LAWZEWITSCH (1987) kubisch bis oval, ihre Zellgrenzen sind „schaumig“ und die Zellen wölben sich deutlich in Richtung des Alveolarlumens vor.
2.4.4 Pulmonale Surfactant-Proteine
Als „grenzflächenaktive Substanz“ spielt der Surfactant mehrere wichtige Rollen in der Stabilität und normalen Funktion einer Alveole (TOMASHEFSKI u. FARVER 2008).
Surfactant setzt sich aus verschiedenen Phospholipiden, insbesondere Dipalmitoyl-Lecithin, und Glykoproteinen, Plasmaproteinen und speziellen Surfactant-Proteinen (SP-A, SP-B, SP- C, SP-D) zusammen (TOMASHEFSKI u. FARVER 2008). Während SP-A und SP-D eine immunologische Funktion zugeordnet wird, spielen SP-B und SP-C eine eher biophysikalische Rolle. Für die Erkennung von Kohlenhydraten haben hydrophile Surfactant-Proteine A und D spezielle Domänen, mit deren Hilfe sie mit den Oberflächenantigenen von Bakterien und Viren interagieren können und sie damit für Makrophagen phagozytierbar machen. SP-B und SP-C gehören zu den hydrophoben Membranproteinen, die für die Beschleunigung der Ausbreitung des Surfactantfilms auf der Alveolaroberfläche verantwortlich sind (GRIESE 1992, 1999).
Bei der Entfaltung einer Alveole werden die Phospholipide zusammengedrückt. Dabei arrangieren sich die hydrophoben und die hydrophilen Enden jeweils auf einer Seite der Luft-Flüssigkeits-Grenzschicht. Dadurch reduziert sich die Oberflächenspannung, und der Kollaps der Alveole wird verhindert. Bei der Inflation einer Alveole wird diese Anordnung zerstört. Durch den sich damit ergebenden Anstieg der Oberflächenspannung wird die elastische Rückstellkraft der Alveole beim Ausatmen unterstützt. Die alveoläre Clearance
wird durch die ständige Sekretion des Surfactants in den Alveolen und seinem Fluss zu den Bronchiolen unterstützt.
Die Surfactant-Proteine werden hauptsächlich von den Pneumozyten Typ II und den Clara- Zellen produziert. Ein Teil des Surfactants wird von den Makrophagen phagozytiert (WELSCH 2006).
Eine mengenmäßig nicht ausreichende Surfactantproduktion kann bei Menschen, insbesondere bei Neugeborenen zu schweren Erkrankungen wie dem „Neonatal Respiratory Distress Syndrome“ (NRDS) führen (WELSCH 2006).
3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN 3.1 Material und Methoden
3.1.1 Tiere und Probenmaterial
In der vorliegenden Arbeit wurden Gewebeproben des Respirationstrakts von 37 klinisch gesunden Weißbüschelaffen verwendet (s. Anhang, Tabelle 15). Das Probenmaterial stammt aus dem Sektionsgut des Deutschen Primatenzentrums (DPZ) aus dem Zeitraum von 2009 bis 2011. Die Tiere wurden aufgrund ungünstiger Prognose bei einer nicht den Respirationstrakt betreffenden Erkrankung, aus tierschutzrelevanten Gründen oder im Rahmen anderer genehmigter tierexperimenteller Arbeiten euthanasiert. Die verwendeten Tiere wurden anhand klinischer Angaben, nachfolgender Sektionsergebnisse und pathohistologischer Untersuchungen als lungengesund eingestuft.
Aufgrund ihrer Altersstruktur wurden die Tiere in 3 Gruppen eingeteilt:
erste Gruppe - Neugeborene (1 bis 2 Tage)
zweite Gruppe - juvenile Tiere (ab 5 bis 18 Monaten) dritte Gruppe - adulte Tiere (ab 18 Monaten und älter)
3.1.2 Haltungsbedingungen
Die Weißbüschelaffenkolonie des DPZ wird in einem modernen Haltungssystem unter Berücksichtigung der Mindestanforderungen zur Haltung von Versuchstieren gehalten. Die Tiere wohnen paarweise, als Familiengruppe mit oder ohne Nachwuchs. Im Alter von etwa 3 bis 5 Monaten werden die Jungtiere von ihren Elterntieren getrennt.
Jede Tiereinheit besitzt eine eigene Futterküche und einen Raum für die tierärztliche Versorgung. Die Tiere werden in Zuchtvolieren mit einer Größe von 1 m2 Grundfläche und 250 cm Höhe gehalten, wobei mehrere derartige Volieren verbunden werden können. Die Ausstattung jedes Käfigs schließt verschiedene Kletteräste, Baumzweige sowie wechselndes
Spielzeug wie z. B. Pappkartons, Seile, Ketten, Kunststoffkontainer etc. ein. Pro Käfig stehen den Tieren je nach Gruppengröße 1 bis 2 Holzschlafhäuschen zur Verfügung. Die Raumtemperatur beträgt 24 bis 26 °C. Die relative Luftfeuchtigkeit liegt zwischen 60 und 70
%. Die Raumluft wird etwa 8 Mal pro Stunde ausgetauscht. Der Hell/Dunkelzyklus beträgt 12 Stunden.
Im Alter von ca. 3 Monaten werden alle Jungtiere gegen Bordetella bronchiseptica (Bestandsspezifischer Impfstoff gegen Bordetella-Infektionen bei Affen, IDT, Roßlau, Deutschland), Yersinia pseudotuberculosis (Pseudovac, Fa. IBSS Biomed, Krakow, Polen) und Rotlauf (Porcilis ery, Fa. Intervet, Unterschleißheim, Deutschland) geimpft und mit einem individuellen Mikrochip markiert.
Im Futtermenü der Kolonie von Weißbüschelaffen sind enthalten:
Morgens: Quarkbrei mit Obstanteil, frisches Obst und Gummi arabicum Mittags: Obst, Gemüse, Reis, Nudeln, Hühnerfleisch
Einmal pro Woche: Mehlwürmer, Heuschrecken
Die Fütterung erfolgt 2 mal am Tag (außer am Sonntag, dann nur einmal). Täglich bekommen die Tiere Krallenaffenpellets (Fa. Ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest, Deutschland) sowie Wasser ad libitum.
3.1.3 Probenentnahme
Die Tiere wurden unmittelbar vor der Sektion euthanasiert. Hierzu wurden sie zunächst mit Göttinger Mischung II (GM II, 0,1 ml/kg Körpergewicht i.m.), in tiefe Narkose gelegt.
Göttinger Mischung (10 ml) setzt sich zusammen aus 5 ml Ketamin (100 mg/ml), 1 ml Xylazin (10 % ig), 0,1 ml Atropin (1 % ig) und 3,9 ml Aqua ad injectionem. Die Euthanasie erfolgte mittels intrakardialer Injektion von 150 mg/kg Körpergewicht Pentobarbital- Natrium (Narcoren, Fa. Merial GmbH, Hallbergmoos, Deutschland). Nach der Eröffnung des Thorax wurde die Lage des Respirationstraktes untersucht. Anschließend wurde der gesamte Respirationstrakt in toto entnommen und makroskopisch hinsichtlich Größe, Gewicht und Lappung beurteilt. Die weitere Probenentnahme erfolgte entsprechend dem Entnahmeschema in Abbildung 3. Für histologische und immunhistochemische Untersuchungen wurden die vier rechtsseitigen Lungenlappen in 4% igem Formalin fixiert.
Für die elektronenmikroskopische Aufarbeitung wurden die zwei linksseitigen Lappen in 2,5
% igem, frisch angesetztem Glutaraldehyd (GA) verbracht (Protokolle s. Anhang). Hierzu wurden Gewebeproben aus Bronchien, Bronchiolen und alveolären Bereichen in 2,5 mm3 große Stücke geschnitten und im Kühlschrank bei 4 °C mindestens 24 Stunden und maximal eine Woche gelagert. Bei einer Reihe von Tieren (G 8233, G 8307, G 8111, G 8001, G 8003, G 8375, G 8217, G 8218, G 8247) wurden zusätzlich Trachea und Hauptbronchus für histologische und elektronenmikroskopischen Untersuchungen asserviert. Bei diesen Tieren handelte es sich ausschließlich um adulte Tiere.
Abbildung 3: Schematische Darstellung der Lungen von Weißbüschelaffen und Probeentnahme. Beschriftung der Lappen: I – Lobus cranialis dexter; II – Lobus medius dexter; III – Lobus caudalis dexter; IV – Lobus accessorius dexter; V – Lobus cranialis sinister; VI – Lobus caudalis sinister.
3.1.4 Korrosionstechnik
Mithilfe der sogenannten Ausgusstechnik wurde die Bronchialbaumstruktur der Lunge von Weißbüschelaffen dargestellt. Es wurden drei Ausgusspräparate der Lungen hergestellt, jeweils von einem Neonaten (K 2163), von einem Jungtier (K 2097/2) und von einem adulten Tier (K 2157) (s. Anhang, Tabelle 15). Dabei wurde der Kunststoff (Methylmetacrylat) Technovit 7143 (Fa. Kulzer&Co GmbH, Bad Homburg, Deutschland) verwendet.
Zunächst wurden die Lungen inklusive der Trachea von bindegewebigen Anteilen und Mediastinum abpräpariert und in eine Warmwasserwanne gelegt. Die Luft wurde zusammen mit der bronchoalveolären Flüssigkeit mittels einer 2 ml-Spritze vorsichtig aus der Lunge herausgezogen. Daraufhin wurde das Technovit 7143 mit einer 2 ml-Einmalspritze und einer Kanüle mit Mandrin, die über die Trachea fast bis zur Bifurkation vorgeschoben wurde, unter mäßigem Druck von Hand in die Lunge injiziert. Für die Lunge eines adulten Tieres wurden ca. 1,5 ml verwendet. Bei juvenilen Tieren betrug die Menge lediglich ca. 1,1 ml und bei neugeborenen Tieren ca. 0,8 ml. Die Injektionsdauer betrug 5 bis 10 Sekunden.
Nach der Füllung der Lungen wurde die Kanüle vorsichtig herausgezogen und die Trachea mit einem Faden zugebunden. Die gefüllte Lunge wurde für den Polymerisationseffekt in der Warmwasserwanne für 3 Stunden gelagert. Nach der Polymerisation des Kunststoffs wurden die Lungen mit 40 %igem Kaliumhydroxid (KOH) korrodiert. Um eine bessere, schnellere und effektivere Korrosion zu erreichen, wurden die Lungen für 24 Stunden in KOH in den Wärmeschrank bei 50 °C verbracht. Anschließend wurde das Ausgusspräparat mit Wasser gespült, lackiert und auf einer Halterung fixiert.
3.1.5 Computertomographie und Datenauswertung mit MeVisLab
Die bildgebende Analyse und Ausmessung des Bronchialsystems erfolgte mit Hilfe von Mikro Computer Tomograph (CT) Scans der Ausgusspräparate mit anschließender Datenauswertung, die mit speziellen MeVisLab-basierten Bildanalyseverfahren vom Fraunhofer Institut MEVIS in Bremen durchgeführt wurde.
Mit Hilfe des MeVisLab wurden die Durchmesser der Ausgüsse der Trachea und des Bronchialbaums ermittelt. Dabei wurden folgende digitale Bildverarbeitungsmethoden verwendet: Erstellung von 2D-Histogrammen, Skelettierung und Rendering. Ausgehend von den 2D-Histogrammen der Grauwerte relativ zur Kantenstärke (3D Gradient aus Sobel- Filter) konnten die optimalen Schwellenwerte per Scan gefunden werden, um die Daten zu binarisieren. Lücken und kleine Defekte wurden durch Constraint Connection Cost Operationen gefüllt bzw. bereinigt. Danach wurde die Halterung von dem Ausgusspräparat entfernt. Eine euklidische Distanztransformation wurde auf die binäre Baummaske angewendet, um einen Schätzwert für den lokalen Lumenradius zu erhalten. Mit Skelettierung erhält man die Mittellinien und die Voronoi-Markierung, so dass anschließend die Radiusinformation vom Skelett auf den vollen Durchmesser der Zweige des Bronchialbaums übertragen werden konnte. Ebenso wurde der Abstand von der Carina zu den Voxeln des Skeletts verwendet, um Abbildungen zu erstellen, in denen alle Baumvoxel dargestellt sind. Eine 3D-Visualisierung der Abbildungen wurde sowohl für Entfernung als auch für den Durchmesser erstellt. Der Farbkodex pro Parameter blieb für beide Scans gleich. Anschließend wurde eine virtuelle Unterteilung in Subtrees durchgeführt, indem Grenzwerte festgelegt wurden, um den zentralen Teil des Bronchialbaums entweder innerhalb einer von Hand eingestellten Entfernung zur Bifurkation oder über einen günstig eingestellten Grenzdurchmesser zu entfernen. Bildlich gesehen ergibt der Durchmesseransatz eine Teilung des Bronchialbaums in anatomisch ähnlichere Teile als der Entfernungsansatz. Der resultierende Satz nicht zusammenhängender Subtrees wurde mittels Connected Component Analysis markiert, um die Subtrees in kontrastierende zufällig ausgewählten Farben zu kolorieren. Um die Übersichtlichkeit zu erhöhen, wurden einige Teile der Bäume nur als erweitertes Skelett und nicht als komplette Bronchialbaummaske dargestellt.
3.1.6 Zuordnung und Nomenklatur der Bronchialbäume
Die Bronchialbäume der Weißbüschelaffen wurden mit den bekannten Bronchialbäumen von Haussäugetieren, Labornagern und dem Menschen verglichen. Aufgrund der großen
Ähnlichkeiten wurde die beim Menschen etablierte Nomenklatur angewandt (MOLL u.
MOLL 2005).
3.1.7 Lichtmikroskopie
3.1.7.1 Histologie und Immunhistochemie
Nach der Entnahme wurden die Gewebeproben aus dem Respirationstrakt für 24 Stunden in 4 %igem, neutral gepuffertem Formalin fixiert. Anschließend wurden durch die Lungenlappen Nummer I und III (Abbildung 3) 2 Querschnitte angelegt, so dass 3 Lokalisationen (bronchusnah: A, mittig: B, bronchusfern: C) entstanden, die zusammen in eine Einbettkassette gelegt wurden. Bei einer Reihe von adulten Tieren (G 8233, G 8307, G 8111, G 8001, G 8003, G 8375, G 8217, G 8218, G 8247) wurden zusätzlich Trachea und Hauptbronchus entnommen. Der mittlere Teil der Trachea und der gesamte Hauptbronchus wurden transversal geschnitten und in die Einbettkassette gelegt. Die automatische Paraffineinbettung erfolgte im Excelsior ES (Fa. ThermoFisher Scientific, Dreieich, Deutschland) nach laborüblichem Protokoll (s. Anhang). Das Ausgießen der Paraffinblöcke erfolgte mit Hilfe der Ausgießstation EC 350-1 (Fa. ThermoFisher Scientific, Dreieich, Deutschland). Beim Ausgießen wurden die Lokalisationen A, B und C in eine standardisierte Reihenfolge gebracht und in Stahlblechformen gelegt. Nach dem Aushärten wurden die Paraffinblöcke aus den Stahlblechformen herausgenommen und zur Aushärtung auf Eis gestellt.
Danach wurden Paraffinschnitte für histologische und immunhistochemische Färbungen hergestellt. Dafür wurden ca. 3 μm dicke Schnitte am Schlittenmikrotom HM 400 (Fa.
ThermoFisher Scientific, Dreieich, Deutschland) angefertigt. Danach wurden die Schnitte mit einem in Eiswasser angefeuchteten Streifen Durchschlagpapier vom Paraffinblock gelöst. Zum Strecken und Beseitigen von Falten wurden sie in ein Warmwasserbad (40 °C) überführt. Anschließend wurden die Schnitte für die histologischen Färbungen auf Standardobjektträger (Menzel-Gläser, Fa. Gerhard Menzel GmbH, Braunschweig, Deutschland) und für die Immunhistochemie auf Superfrost Plus Objektträger (Menzel- Gläser, Fa. Gerhard Menzel GmbH, Braunschweig, Deutschland) aufgezogen. Zum
Trocknen wurden sie 24 Stunden im Wärmeschrank bei 37 °C gelagert und anschließend bei Raumtemperatur aufbewahrt.
Nach dem im Anhang aufgeführten Protokoll wurden die angefertigten Schnitte für die histologischen Untersuchungen mit Hilfe des Färbeautomaten Varistain Gemini (Fa. Thermo Fisher Scientific, Dreieich, Deutschland) mit der Hämatoxylin-Eosin (H&E)-Färbung gefärbt.
Für die Darstellung der muzinbildenden Becherzellen wurde die Periodic-Acid-Schiff (PAS)-Reaktion, die ebenfalls mit dem Färbeautomat Varistain Gemini (Fa. Thermo Fisher Scientific, Dreieich, Deutschland) erfolgte, als Nachweis für neutrale Mukopolysaccharide und die Alcian Blau-Färbung (per Hand, s. Anhang) für saure Mukopolysaccharide durchgeführt.
Die immunhistochemischen Färbungen erfolgten im automatisierten Immunfärbeautomat Discovery XT (Fa. Roche, Mannheim, Deutschland, Protokolle s. Anhang). Die verwendeten Primär-Antikörper sind in Tabelle 3 aufgelistet. Mit der indirekten SABC (Streptavidin-Biotin-Komplex)-Methode und DAB (3,3'-Diaminobenzidin) als Chromogen wurden in 4 %igem, neutral gepuffertem Formalin fixierte Paraffinschnitte gefärbt. Als Sekundärantikörper wurde der Universal Secondary Antibody (Fa. Roche, Mannheim, Deutschland) verwendet. Für die negative Kontrolle diente Antibody Diluent Roche (Fa.
Roche, Mannheim, Deutschland).
Die Auswertung der histologischen und immunhistochemischen Schnittpräparate erfolgte an dem Lichtmikroskop Axioplan 2 Imaging mit der Kamera AxioCam HRc (Fa. Zeiss, Oberkochen, Deutschland). Dabei wurde die Verteilung und Morphologie der nicht-zilierten Zellen evaluiert und das Lungengewebe grundsätzlich morphologisch beurteilt.
Tabelle 3: Verwendete Antikörper für die immunhistochemischen Färbungen.
Zielzelle/- Protein
Antikörper Firma/Bestell- nummer
Verdünnung Positiv- Kontrolle*
Clara-Zellen Clara Cell Protein Human Rabbit
Polyclonal Antibody
BioVender RD 181022220
1:2000 Lunge C.j.
Neuroendokrine Zellen
Monoclonal Mouse Anti- Human Neuron-Specific Enolase (NSE)
Dako M 0873 1:400 Nebenniere C.j.
Becherzellen Mucin 5AC Antibody (45M1) (MUC5AC)
Novus Biologicals NB120-3649
1:50 Trachea M.m.
Surfactant B Mouse Monoclonal Surfactant Protein B (Precursor) Ab-1
Lab Vision MS-704-B0
1:10 Lunge C.j.
Surfactant C Rabbit Polyclonal Prosurfactant Protein C
Abcam ab 28744 1:400 Lunge C.j.
Makrophagen MAC387
Monoclonal Mouse Anti- Human
Myeloid/Histiocyte
Dako M 0747 1:100 Lunge C.j.
*C.j. – Callithrix jacchus;
M.m. – Macaca mulatta.
3.1.8 Elektronenmikroskopie
3.1.8.1 Transmissionselektronenmikroskopie
Um die Zellen des respiratorischen Epithels auf ultrastrukturellem Niveau zu untersuchen, wurden zusätzlich transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen durchgeführt.
Das in 2,5 %igem Glutaraldehyd fixierte Gewebe wurde bis zur weiteren Verarbeitung bei 4
°C im Kühlschrank aufbewahrt und anschließend in einem Epongemisch nach LUFT (1961, s. Anhang) im Lynx Einbettautomaten (Fa. Leica, Bensheim, Deutschland) nach laborüblichlichem Protokoll (s. Anhang) für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) eingebettet.
Die Gewebeproben wurden gerichtet eingebettet, so dass beim Schneiden der eingebetteten Blöcke die untersuchten Lokalisationen, nämlich Bronchus, Bronchiolus und alveoläre Bereiche erreicht werden konnten. Anschließend erfolgte die Polymerisation des Epoxidharzes über 24 Stunden bei 60 °C im Wärmeschrank. Die ausgehärteten Kunststoffblöcke wurden mit Hilfe einer Fräse (Reichert Ultratrim, Fa. Leica, Bensheim, Deutschland) auf die Größe des eingebetteten Gewebes zugetrimmt. Am Ultramikrotom Reichert, Ultracut S (Fa. Leica, Bensheim, Deutschland) wurden unter Verwendung eines Diamantenmessers (Fa. Diatome, Bienne, Schweiz) 0,5 µm dicke Semidünnschnitte angefertigt. Die Schnitte wurden auf Objektträger aufgezogen, bei 60 °C getrocknet und anschließend mit Methylenblau nach RICHARDSON et al. (1960) gefärbt. Die lichtmikroskopische Untersuchung von Semidünnschnitten half, die relevanten Bereiche der Bronchen und Bronchiolen mit nicht-zilierten Zellen zu identifizieren. Die ausgewählten Bereiche wurden für die Anfertigung von Ultradünnschnitten zeichnerisch dargestellt, und der Block wurde per Hand auf den gewünschten Bereich zugetrimmt. Nachfolgend wurden am Ultramikrotom (Reichert, Ultracut S der Fa. Leica, Bensheim, Deutschland) 60 nm dünne Ultradünnschnitte mit Hilfe eines Diamantenmessers (Fa. Diatome, Bienne, Schweiz) angefertigt. Diese wurden auf Kupfer-Lochblenden (single slot 1 x 2, Fa. Plano, Wetzlar, Deutschland) aufgefangen und mit Uranylazetat und Bleizitrat per Hand kontrastiert.
Die transmissionselektronenmikroskopische Darstellung der nicht-zilierten Zellen erfolgte am Elektronenmikroskop EM 10 C (Fa. Zeiss, Oberkochen, Deutschland). Die morphologische Befunde wurden fotographisch mit Hilfe einer integrierten Digitalkamera Slow-scan CCD-Camera for TEM (Fa. Zeiss, Oberkochen, Deutschland) zusammen mit dem Bildverarbeitungsprogramm iTEM 5.0 (Fa. Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Münster, Deutschland) dokumentiert.
3.1.8.2 Rasterelektronenmikroskopie
Von einzelnen Tieren (G 8109 (adult), K 2114 (juvenil) und K 2091 (neonatal)) wurden darüber hinaus rastelektronenmikroskopische Untersuchungen von dem Lungenlappen V (Abbildung 3) durchgeführt. Bei der Probenentnahme wurde der Lungenlappen gründlich mit physiologischer Kochsalzlösung gespült und in 2,5 %igem Glutaraldehyd sagittal geschnitten. Die so gewonnenen Gewebeproben wurden bis zur weiteren Verarbeitung in 2,5
%igem Glutaraldehyd bei 4 °C im Kühlschrank aufbewahrt. Die weitere Probenverarbeitung erfolgte nach laborüblichem Protokoll (s. Anhang). Die Trocknung erfolgte im Critical Point Dryer (Modell CPA E 3100, Fa. Polaron, Watford, England). Anschließend wurden die Gewebestücke mit einem Spezialklebstoff (Leit C, Fa. Plano, Marburg, Deutschland) auf Aluminiumpräparatehaltern aufgeklebt und im Sputter Coater SCD 040 (Fa. Balzers, Wiesbaden, Deutschland) mit einer dünnen Goldschicht überzogen. Die Auswertung der Oberflächenstruktur des Bronchial- und Bronchiolarepithels erfolgte mit Hilfe des Rasterelektronenmikroskops FEI Quanta 400 F (Hillsboro, Oregon, USA) bei einer Beschleunigungsspannung von 5-10 kV. Die bildgebende Fotodokumentation wurde mit dem Bildbearbeitungsprogramm Adobe Photoshop CS (Version 8.0.1., Fa. Adobe Systems Incorporated, USA) durchgeführt.
3.1.9 Datenauswertung und statistische Berechnungen
Grundsätzlich wurden alle untersuchten Tiere (n = 37) in drei Altersgruppen eingeteilt:
adulte Tiere, juvenile und neugeborene Tiere. Bei allen Tieren der Studie wurden 8 Schnitte aus den Lungenlappen I und III (Abbildung 3) angefertigt. Für die statistischen
Untersuchungen wurden insgesamt 20 Tiere verwendet (für genauere Angaben zu den Tieren s. Anhang, Tabelle 15). Die 8 Schnitte pro Lungenlappen wurden hintereinander nach folgendem Schema geschnitten und histologisch bzw. immunhistochemisch gefärbt:
Schnitt Nr. 1 Haematoxylin und Eosin-Färbung (HE) Schnitt Nr. 2 PAS-Reaktion
Schnitt Nr. 3 MUC5AC Schnitt Nr. 4 CCSP Schnitt Nr. 5 NSE Schnitt Nr. 6 Surfactant B Schnitt Nr. 7 Surfactant C Schnitt Nr. 8 MAC 387
Schnitt Nr. 1 diente der allgemeinen histologischen Beurteilung des Lungengewebes mittels HE-Färbung. Dabei wurde vor allem geprüft, ob die Lungen gesund waren, und welche anatomischen Besonderheiten in den Lungen von Weißbüschelaffen gegenüber anderen Tieren vorhanden sind. Mit dem Schnitt Nr. 2, an dem die PAS-Reaktion durchgeführt wurde, wurden hauptsachlich die Muzine enthaltenden Becherzellen hinsichtlich Existenz, Färbeverhalten und Verbreitung evaluiert. Schnitte Nr. 6 (Surfactant B) und 7 (Surfactant C) wurden hergestellt, um Surfactant-Proteine in Clara-Zellen nachzuweisen. Außerdem wurden Pneumozyten Typ II mit Hilfe von Surfactant-Protein B deskriptiv beschrieben.
Mittels Schnitt Nr. 8 (MAC 387) konnten Alveolarmakrophagen im Alveolarlumen und auf der Oberfläche des Alveolarseptum nachgewiesen und allgemein beschrieben werden.
Außerdem wurde die Verteilung bei unterschiedlichen Altersgruppen deskriptiv ermittelt.
Für statistische Untersuchungen wurden bei 20 Tieren (s. Anhang, Tabelle 15) nur die Schnitte 3, 4 und 5 ausgewählt und miteinander verglichen, um die Verteilung der nicht- zilierten Zellen (Clara-Zellen, Becherzellen und pulmonale neuroendokrine Zellen) je nach Lokalisation (Bronchus oder Bronchiolus) und Altersgruppe zu bestimmen. Dabei wurde die Verteilung der Zellen auf signifikante Unterschiede zwischen den Altersgruppen und Lokalisationen geprüft. Hierfür wurden in jedem Schnitt Nr. 3, 4 und 5 fünf Strecken pro immunhistochemischer Färbung (CCSP Human für Clara-Zellen, MUC5AC für
Becherzellen, NSE für pulmonale neuroendokrine Zellen und neuroepithelial bodies), pro Tier und pro Lokalisation (Bronchi und Bronchioli veri) von Hand ausgezählt. Um die Vergleichbarkeit zwischen den Strecken bzw. Zählungen herzustellen, wurden die Strecken auf eine Länge von exakt 100 Zellen standardisiert.
Für die Datenerfassung und Berechnung von Mittelwerten wurde die Software Microsoft Excel 2010 (Microsoft Corporation, Redmond, USA) verwendet. Die statistische Auswertung und die Erstellung der Grafiken erfolgten mit Hilfe des Statistikprogramms Statistica (Statsoft, Tulsa, USA). Für die primären Endpunkte (Anzahl der CCSP-positiven Clara-Zellen, MUC5AC-positiven Becherzellen und NSE-positiven pulmonalen neuroendokrinen Zellen) wurde ein Repeated-Measure Analysis of Variance (ANOVA) Test modelliert. Bei diesem Test handelt es sich um eine Varianzanalyse, bei der überprüft wird, ob die Varianzen innerhalb einer Gruppe von Werten größer oder kleiner sind als die Varianzen zwischen den einzelnen Gruppen. Es wurden die Haupteffekte Altersgruppierung und Lokalisation und eine Wechselwirkung zwischen den beiden Faktoren modelliert. Das Signifikanzniveau wurde in allen globalen Tests mit α = 5 % festgelegt, das heißt, dass ein Unterschied statistisch signifikant war, sobald für die Irrtumswahrscheinlichkeit p < 0,05 galt. Für die Paarvergleiche wurden als weiterführende Auswertung T-Tests und eine Adjustierung mit der Bonferroni-Methode durchgeführt. Bei diesen Tests handelt es sich um Verfahren, die die Hypothese des signifikanten Unterschieds in der Gruppe weiter untersuchen. Eine Adjustierung mit der Bonferroni-Methode ist ab einer gewissen Größe der Gruppe notwendig, um konservativ zu bleiben, d. h. um die Signifikanzen richtig zu erkennen. Die Grafiken zu den Analysen zeigen Mittelwerte und Konfidenzintervalle (Standardabweichungen).
