Zur Validierung von hämatologischen Referenzintervallen bei Rhesus- und Weißbüschelaffen
INAUGURAL–DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
- Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)
vorgelegt von Sabine Taubert
Göttingen
Hannover 2015
Abteilung Infektionspathologie
Univ.-Prof. Dr. A. Moritz,
Justus Liebig Universität Gießen,
Klin. Pathophysiologie & Klin. Labordiagnostik
1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. F.-J. Kaup,
Deutsches Primatenzentrum Göttingen, Abteilung Infektionspathologie
2. Gutachter: Univ. Prof.. Dr. R. Mischke,
Tierärztliche Hochschule Hannover, Klinik für Kleintiere
Tag der mündlichen Prüfung: 26.06.2015
Gewidmet Dieter Brandt
&
in memoriam Robert Fahlbusch
Im Text verwendete Abkürzungen V
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 1
2 Literaturübersicht ... 3
2.1 Primaten in der biomedizinischen Forschung ... 3
2.1.1 Taxonomie ... 4
2.1.2 Rhesusaffen: Physiologie und Einsatzmöglichkeiten ... 5
2.1.3 Weißbüschelaffen: Physiologie und Einsatzmöglichkeiten ... 7
2.1.4 Hämatologische Untersuchungen bei nicht-menschlichen Primaten ... 9
2.2 Hämatologische Analyseverfahren ... 14
2.2.1 Entwicklung der hämatologischen Untersuchungsmethoden ... 14
2.2.2 Messmethoden moderner Hämatologiesysteme ... 16
2.3 Evaluation von Hämatologiesystemen ... 19
2.4 Manuelle hämatologische Methoden ... 22
2.4.1 Manuelle Erythrozyten-/Leukozytenzählung ... 22
2.4.2 Manuelle Hämatokritbestimmung ... 23
2.4.3 Manuelle Leukozytendifferenzierung ... 23
2.4.3.1 Panoptische Färbung ... 24
2.4.3.2 Peroxidase Reaktion (POX) ... 24
2.4.4 Manuelle Retikulozytenzählung ... 25
3 Material und Methoden ... 27
3.1 Tiere ... 27
3.1.1 Haltung und Fütterung ... 27
3.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien ... 28
3.2.1 Geräte ... 28
3.2.2 Verbrauchsmaterialien ... 28
3.2.3 Reagenzien und Lösungen ... 29
3.3 Gewinnung und Verarbeitung der Proben ... 29
3.4 Messprinzipien Hämatologiesystem ADVIA 2120 ... 30
3.4.1 Erythrozyten- und Thrombozytenkanal ... 33
3.4.2 Retikulozytenanalyse ... 35
3.4.4 Leukogramm (Peroxidase-Kanal) ... 38
3.4.5 Nukleogramm der Leukozyten (Baso-Kanal) ... 40
3.4.6 Störungen der automatischen Blutzellanalyse und –differenzierung ... 41
3.5 Durchführung der Tests und deren Auswertung ... 43
3.5.1 Präzision ... 43
3.5.2 Linearität und Carry-over beim ADVIA 2120 ... 44
3.5.2.1 Statistik, Linearität und Carry-over beim ADVIA 2120 ... 45
3.5.3 ADVIA 2120 Einstellung und Kalibrierung ... 45
3.5.4 Manuelle Leukozytendifferenzierung ... 46
3.5.5 Manuelle Hämatokritbestimmung ... 46
3.5.6 Retikulozytenbestimmung (Supravitalfärbung) ... 46
3.6 Statistik ... 47
3.6.1 Varianzanalyse ... 47
3.6.2 Prüfung auf Normalverteilung/Abweichungen ... 47
3.6.3 Korrelationsanalyse ... 47
3.6.4 Referenzintervalle ... 48
3.6.5 Signifikanzen ... 48
3.6.6 Ein- und Ausschlusskriterien von Ausreißern ... 49
4 Ergebnisse ... 50
4.1 ADVIA 2120 ... 50
4.1.1 Präzision ADVIA 2120 ... 50
4.1.1.1 Präzision ADVIA 2120, Parameter der Zellzählung für Rhesus- und Weißbüschelaffen ... 52
4.1.1.2 Präzision ADVIA 2120, Parameter der Leukozytendifferenzierung für den Rhesusaffen ... 56
4.1.1.3 Präzision ADVIA 2120, Parameter der Retikulozytenzählung für den Rhesusaffen ... 58
4.1.1.4 Präzision ADVIA 2120, Parameter der Leukozytendifferenzierung für den Weißbüschelaffen ... 58
4.1.1.5 Präzision ADVIA 2120, Parameter der Retikulozytenzählung für den Weißbüschelaffen ... 60
4.1.2 Linearität ... 60
4.1.3 Carry-over (Verschleppung) ... 60
4.2 Methodenvergleich, Rhesusaffen ... 61
4.2.1.1 Hämatokritbestimmung Rhesusaffe, Zentrifuge Compur 1100 /
Haematokrit 210... 63
4.2.2 Leukozytendifferenzierung, Rhesusaffe ... 66
4.2.2.1 Neutrophile Granulozyten, Rhesusaffe ... 66
4.2.2.2 Lymphozyten, Rhesusaffe... 68
4.2.2.3 Monozyten, Rhesusaffe ... 69
4.2.2.4 Eosinophile Granulozyten, Rhesusaffe ... 71
4.2.3 Retikulozytenzählung, Rhesusaffe ... 72
4.3 Methodenvergleich, Weißbüschelaffe ... 74
4.3.1 Hämatokritbestimmung, Weißbüschelaffe ... 74
4.3.1.1 Hämatokritbestimmung, Weißbüschelaffe, Zentrifuge Compur 1100 / Haematokrit 210... 76
4.3.2 Leukozytendifferenzierung, Weißbüschelaffe ... 79
4.3.2.1 Besonderheiten manuelle Leukozytendifferenzierung, Weißbüschelaffe ... 80
4.3.3 Retikulozytenzählung, Weißbüschelaffe ... 84
4.4 Referenzintervalle, Rhesusaffe ... 86
4.4.1 Referenzintervalle Blutbild, Rhesusaffen ... 86
4.4.2 Referenzintervalle Differentialblutbild, Rhesusaffen ... 88
4.5 Referenzintervalle, Weißbüschelaffe ... 90
4.5.1 Referenzintervalle Blutbild, Weißbüschelaffen ... 90
4.5.2 Referenzintervalle Differentialblutbild, Weißbüschelaffen ... 93
5 Diskussion ... 95
5.1 ADVIA 2120 ... 95
5.1.1 Präzision ... 95
5.1.2 Linearität ... 97
5.1.3 Carry-over ... 98
5.2 Methodenvergleich, Rhesusaffe ... 98
5.2.1 Hämatokritbestimmung, Rhesusaffe ... 99
5.2.2 Leukozytendifferenzierung, Rhesusaffe ... 100
5.2.3 Retikulozytenzählung, Rhesusaffe ... 101
5.3 Methodenvergleich, Weißbüschelaffe ... 103
5.3.1 Hämatokritbestimmung, Weißbüschelaffe ... 104
5.3.2 Leukozytendifferenzierung, Weißbüschelaffe ... 105
5.4 Referenzintervalle, Rhesusaffen ... 108
5.5 Referenzintervalle, Weißbüschelaffen ... 109
6 Zusammenfassung ... 111
7 Summary ... 114
8 Literaturverzeichnis ... 117
9 Danksagung ... 134
Abb. = Abbildung
Aqua bidest = zweifach destilliertes Wasser (Aqua bidestillata) Baso = Basophile Granulozyten (basophilic leukocytes)
bzw. = Beziehungsweise
CBC = Blutbild (Complete Blood Count)
CHCM = mittlere Zellhämoglobinkonzentration (Cell Hemoglobin Con- centration Mean)
CI = Konfidenzintervall (Intervall of Confidence) Cj = Weißbüschelaffe (Callithrix jacchus)
cm = Zentimeter
CV = Variationskoeffizient (Coefficient of Variation) Diff. = Differentialblutbild der Leukozyten
DNA = Deoxyribonucleic acid (engl. für DNS) DNS = Desoxyribonukleinsäure
DPZ = Deutsches Primatenzentrum EDTA = Ethylendiamintetraacetat EG = Europäische Gemeinschaft
engl. = englisch
Eos = Eosinophile Granulozyten (eosinophilic leukocytes) ETS = Veröffentlichungsreihe für Konventionen des
Europarates (European Treaty Series)
EU = Europäische Union
fl = Femtoliter
fmol = Femtomol
g = Beschleunigung
HCT = Hämatokrit gemessen am ADVIA 2120 HDW = Hämoglobinverteilungsbreite (Haemoglobin
Distribution Width)
HGB = Hämoglobin
inkl. = inklusive
ISLH = International Society for Laboratory Hematology
k.a. = keine Angaben
Kap. = Kapitel
kg = Kilogramm
K3-EDTA = Trikalium-Ethylendiamintetraessigsäure LI = Lobularitätsindex
Lymph = Lymphozyten (Lymphocytes) LUC = Große Peroxidase-negative Zellen
(Large Unstained Cells)
MCH = Mittlerer zellulärer Hämoglobingehalt (Mean Corpuscular Hae- moglobin)
MCHC = Mittlere Hämoglobinkonzentration der Erythrozyten (Mean Cor- puscular Haemoglobin Concentration)
MCV = Mittleres Erythrozytenvolumen (Mean Corpuscular Volumen) MGG = May-Grünwald-Giemsa Färbung
Mono = Monozyten (Monocytes)
ml = Milliliter
Mm = Rhesusaffe (Macaca mulatta)
mmol = Millimol
MN = Mononukleäre Zellen (Mononucleated Cells)
MPV = Mittleres Trombozytenvolumen (Mean Platelet Volume)
n = Anzahl
NDS = Natriumlaurylsulfat (auch Natriumdodecylsulfat oder Sodiumdodecylsulfat, SDS)
Neut = neutrophile Granulozyten (Neutrophilic Granulocytes) NRBC = Normoblasten (Nucleated Red Blood Cells)
nm = Nanometer
n.s. = nicht signifikant
µl = Mikroliter
PC = Personal Computer PCT = Thrombokrit (Plateletcrit)
PCV = Hämatokrit mittels Zentrifuge bestimmt (Packed Cell Volume) PDW = Thrombozytenverteilungsbreite (Platelet Volume
Distribution Width)
pg = Pikogramm
PIN = Primate Info Net
PLT = Thrombozytenzahl (Platelet Count)
PMN = Polymorphnukleäre Zellen (Polymorph-nucleated Cells) PTLC = Panther Tracks Learning Center
QBCA = Quantitative Buffy Coat-Analyse
rS = Korrelationskoeffizient nach Spearman RBC = Erythrozyten (Red Blood Cells)
RDW = Erythrozyten(volumen)verteilungsbreite (Red Cell Volume Dis- tribution Width)
Retic = Retikulozyt (Reticulocytes) RI = Referenzintervall
RNA = Ribonucleic acid (engl. Abkürzung für RNS) RPM = Revolutions per minute (Umdrehung pro Minute) rs = Rangkorrelationskoeffizient nach Spearman SD = Standardabweichung (standard deviation)
sog. = Sogenannt
Tab. = Tabelle
TierSchVersV = Tierschutz-Versuchstierverordnung
u.a. = unter anderem
UFC = Unified Fluids Circuit U/min = Umdrehung pro Minute
vgl. = Vergleiche
= Mittelwert z. B. = zum Beispiel
% = Prozent
°C = Grad Celsius
1 Einleitung
Nicht-menschliche Primaten werden wegen ihrer evolutionären Nähe zum Men- schen, trotz erheblicher rechtlicher Einschränkungen, in verschiedenen Bereichen der biomedizinischen Forschung verwendet. In diesem Zusammenhang, aber auch für veterinärmedizinische Belange, ist die Erhebung hämatologischer Befunde für die Auswertung von Versuchsergebnissen und zur Ermittlung des Gesundheitszustan- des der Tiere von grundlegender Bedeutung.
Die dabei verwendeten Referenzwerte umschreiben den Messwertebereich, der für den entsprechenden Parameter als klinisch unauffällig zu interpretieren ist. Dieses umschriebene Referenzintervall (RI) stellt eine gesunde Vergleichspopulation dar, die als Bezugspunkt zur Interpretation von individuellen Analysewerten dient. Das RI des jeweiligen Analyseverfahrens ist aber nur für die entsprechende Methode und Population anwendbar. Veränderungen in diesen beiden Faktoren können zu hohen Schwankungen der Ergebnisse führen. Dies erklärt, warum in der Literatur dokumen- tierte Referenzwerte, besonders für exotische Tierspezies, teilweise erheblich vonei- nander abweichen.
Vor dem Hintergrund der guten wissenschaftlichen und veterinärmedizinischen Pra- xis ist es daher notwendig, Referenzwerte unter Einsatz neuer moderner Analyse- techniken zu validieren und im Sinne des Qualitätsmanagements regelmäßig zu kon- trollieren. Die Erhebung von Referenzwerten bei der Etablierung neuer Techniken ist, neben einem großen Arbeits- und Zeitaufwand, mit hohen, genau definierten Anfor- derungen an die präanalytischen und analytischen Prozesse verbunden. Eine exakte Definition der Referenzpopulation sowie der statistischen Auswertung der erhobenen Daten ist notwendig (SCHWENDENWEIN 2014).
Aus diesen Gründen können auch in der Tiermedizin meist nur Einrichtungen mit größeren Tierzahlen entsprechende Methoden mit Erhebung eigener Referenzwerte validieren, da hier die notwendigen Voraussetzungen vorliegen (CLSI 2008). Kleine Populationen unter gleichen Haltungs- und Ernährungsbedingungen oder große Po- pulationen mit unterschiedlichen Haltungsformen erschweren dieses Vorhaben er- heblich (FORTMAN et al. 2002).
Das Deutsche Primatenzentrum Göttingen (DPZ) hat als europäisches Referenz- und Kompetenzzentrum für die Forschung mit Primaten die Möglichkeit, diese Vo- raussetzungen für exotische Spezies wie den Rhesusaffen (Macaca mulatta) und den Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus) zu gewährleisten, da das DPZ über ent- sprechende Zuchtkolonien für diese Tierarten verfügt.
Bei den beiden Arten handelt es sich um die am häufigsten in der biomedizinischen Forschung eingesetzten nicht–menschlichen Primaten. Der Rhesusaffe gehört zu den Altweltaffen und wird wegen seiner genetischen Nähe zum Menschen unter an- derem im Rahmen der Arzneimittelforschung und –zulassung häufig verwendet (FORTMAN et al. 2002). Der Weißbüschelaffe, als Vertreter der Neuweltaffen, wird aufgrund seiner geringen Körpergröße, seiner hohen Reproduktionsrate und dem von ihm ausgehenden geringeren zoonotischen Risikopotenzial als alternatives Tiermodell eingesetzt (KUNZE 2012).
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, mit Hilfe eines neuen hämatologischen Analyse- gerätes (ADVIA 2120 der Firma Siemens) für Rhesusaffen und Weißbüschelaffen populationsspezifische RI nach den Vorgaben des INTERNATIONAL COUNCIL FOR STANDARDIZATION IN HAEMATOLOGY (2014) zu erheben. Das Analysegerät ADVIA 2120 wurde bereits mehrfach für umfangreiche Validierungen bei anderen Spezies herangezogen (BAUER et al. 2011, 2012). Im vorliegenden Fall sollen die in der Multispezies-Software vorgelegten Werte für den Rhesusaffen durch eigene Un- tersuchungen überprüft sowie für den Weißbüschelaffen neu entwickelt werden.
2 Literaturübersicht
2.1 Primaten in der biomedizinischen Forschung
Die nicht-menschlichen Primaten faszinieren bereits seit Tausenden von Jahren den Menschen und haben über die Jahrhunderte hinweg immer wieder neue Fragen auf- geworfen. Den ersten Primatologen, wie Edward Tyson (1650–1708), ging es dabei darum, diese Spezies in Hinblick auf ihre Anatomie, sozialen Strukturen und ihr Ver- halten zu begreifen. Das Erstellen einer systematischen Ordnung der einzelnen Ar- ten in der Tierwelt, und im Besonderen der Vergleich zum Menschen, war zu diesem Zeitpunkt aufgrund der vorliegenden Weltanschauung die treibende Kraft hinter den Bemühungen (FRIDMAN 2002c).
Bereits im folgenden Jahrhundert zeichnete sich eine Verlagerung des Forschungs- schwerpunktes ab. Pasteur (1822–1895) gelang es, durch seine Studien an Tieren die erste Vakzine herzustellen und somit einen wichtigen Schritt in Richtung Aufklä- rung, Bekämpfung und möglichen Prävention von den auf den Menschen übertrag- baren Krankheiten zu machen (FRIDMAN 2002c).
Zu Beginn des 20. Jahrhunderts wurde der Rhesusaffe als Versuchstierart in der Forschung etabliert. Seine anatomische und physiologische Ähnlichkeit mit dem Menschen und seine damit verbundenen neurologischen Eigenschaften gaben ihm gegenüber Hunden, Ratten und anderen Versuchstieren den Vorzug (MORTON et al. 2005). Durch den breitgefächerten Einsatz des Rhesusaffen, z.B. in der Erfor- schung von Gelbfieber sowie Alterungsprozessen des Skeletts und des Blutgruppen- systems kam es in den USA und der damaligen Sowjetunion zur Etablierung von Forschungszentren, die sich ausschließlich mit Primaten beschäftigten.
Im Wandel der Zeit passten sich die Forschungsgebiete, in denen nicht-menschliche Primaten Verwendung fanden, den aktuellen Problemen an. Zu diesen Gebieten ge- hören u. v. a. Themen wie Tuberkulose, AIDS oder Morbus Alzheimer (MORTON et al. 2005; ´T HART et al. 2012).
Gleichzeitig führten Aspekte des Tier- und Artenschutzes zu einem Umdenken in Be- zug auf die Herkunft der Tiere, deren Haltungsbedingungen und die Art des Einsat- zes in der Forschung. Wurden zu Beginn der Forschung unter Verwendung von Pri- maten die entsprechenden Affen in der freien Wildbahn gefangen, werden heute in der Biomedizin Tiere aus eigens dafür etablierten Zuchtstationen eingesetzt. Dieses dient zum einen dem Artenschutz und garantiert die Unabhängigkeit von der wirt- schaftlichen und politischen Situation der Herkunftsländer (CROCKETT et al. 1996;
KYES et al. 1998) zum anderen kann gewährleistet werden, dass die verwendeten Tiere einen definierten Gesundheitsstatus und ggf. entsprechende genetische Vo- raussetzungen besitzen, die für die biomedizinische Forschung und die gute wissen-
schaftliche Praxis unabdingbar sind (HAUS et al. 2014). Dementsprechend sind die Tiere mit der Haltung in der Obhut des Menschen vertraut und im Vergleich zu ihren wildlebenden Artgenossen weniger Stressanfälligkeit beim Umgang mit den Men- schen (MORTON et al. 2005).
Hinsichtlich des Tierschutzes ist die Verwendung von nicht-menschlichen Primaten in der biomedizinischen Forschung durch verschiedene rechtliche Rahmenbedingun- gen geregelt. Dazu gehören u. a.
die EU Richtlinie 2010/63/EU zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere
das deutsche Tierschutzgesetz zuletzt geändert am 07.08.2013 die Tierschutzversuchstierverordnung
die Leitlinien für die Unterbringung und Pflege von Tieren, die für Versuche und andere wissenschaftliche Zwecke verwendet werden (2007/526/EG bzw.
ETS 123).
In Deutschland dürfen nicht-menschliche Primaten ausschließlich in Versuchen ver- wendet werden, die
der Grundlagenforschung,
dem Zweck des Vorbeugens, Erkennens oder Behandelns von Krankheiten, Leiden, Körperschäden oder körperlichen Beschwerden bei Menschen, die le- bensbedrohlich sein können oder zu einer Verminderung der körperlichen o- der geistigen Funktionsfähigkeit führen, oder der Entwicklung und Herstellung sowie Prüfung der Qualität, Wirksamkeit oder Unbedenklichkeit von Stoffen oder Produkten hinsichtlich der genannten Beeinträchtigungen der menschli- chen Gesundheit oder
der Forschung im Hinblick auf die Erhaltung der Arten dienen (§ 23 Tierschutz-Versuchstierverordnung–TierSchVersV).
2.1.1 Taxonomie
In der biomedizinischen Forschung werden verschiedene Primatenspezies einge- setzt, wobei der Rhesusaffe (Macaca mulatta) als wichtigster Vertreter der Altweltaf- fen und der Weißbüschelaffe (Callithrix jacchus) als wichtigster Vertreter der Neu- weltaffen gelten (ABBOTT et. al. 1984; CARLSSON et. al. 2004).
Die Gruppe der Primaten umfasst je nach biologischer Sichtweise zwischen 250 und 350 verschiedene Spezies und bilden damit eine der größten Tiergruppen innerhalb der Klasse der Säugetiere (Mammalia). Die Ordnung der Primaten (Primates) teilt sich in die Unterordnungen der Strepsirrhini (Feuchtnasenaffen) und Haplorrhini
(Trockennasenaffen) ein. Die überwiegende Zahl der Primatenspezies, die in der bi- omedizinischen Forschung Verwendung finden, gehören zu den Haplorrhini (CARLSSON 2004).
Die Haplorrhini zeichnen sich im Gegensatz zu den Strepsirrhini dadurch aus, dass ihre Schnauzen einfache, gemeinsam abgeleitete Nüstern haben, denen das feuch- te, drüsenreiche Rhinarium fehlt. Das Philtrum, welches den medialen Spalt im Rhi- narium darstellt, ist deutlich reduziert bis hin zum vollständigen Verschwinden. Diese anatomische Gegebenheit ermöglicht eine ausgeprägte Beweglichkeit der Oberlippe.
Allen Trockennasenprimaten ist gemein, dass sie beidseits eine Reduktion der sonst üblichen Anzahl von fünf Nasenmuscheln (Ethmoturbinalia) auf zwei haben, was ei- nen verminderten Geruchssinn bedingt (GEISSMANN 2003a). Sie werden in die bei- den Infraordnungen der Koboldmakis (Tarsiiformes) und der eigentlichen Affen (Anthropoidea) aufgeteilt. Die eigentlichen Affen können noch einmal in die Gruppe der Neuweltaffen (Plathyrrhini), zu denen der Weißbüschelaffe gehört, und die der Altweltaffen (Catarrhini), zu denen der Rhesusaffe gehört, getrennt werden (GEISSMAN 2003b).
Der Rhesusaffe (Macaca mulatta) gehört zu der Gattung der Makaken (Macaca), welche den Zweig der Pavianartigen (Papionini) in der Unterfamilie der Backenta- schenaffen (Cercopithecinae) bilden. Diese wiederum sind der der Familie der Meer- katzenverwandten (Cercopithecidae) zuzuordnen, die die einzige Familie der ge- schwänzten Altweltaffen bildet (ZINNER et al. 2013).
Der Weißbüschelaffe (Callithrix jacchus) gehört zu der Gattung der Büschelaffen, welche zusammen mit den Zwergseidenäffchen, Seidenäffchen und Callibella die Gruppe der Marmosetten bilden. Die Marmosette gehören, ebenso wie die Tamarin, Springtamarin und Löwenäffche, zu der Familie der Krallenaffen (Callithrichidae) in- nerhalb der Ordnung der Neuweltaffen (RYLANDS u. MITTERMEIER 2013).
2.1.2 Rhesusaffen: Physiologie und Einsatzmöglichkeiten
Unter den Primaten haben die Makaken, mit Ausnahme des Menschen, das am aus- gedehnteste Verbreitungsgebiet. Es zieht sich von Nordwest-Afrika über Indien, Burma, Indochina, einen Großteil von China bis auf die Philippinen, Bali und Japan (GROVES 2005).
Die adulten Rhesusaffen haben ein Gewicht von bis zu 11 kg und besitzen ausge- prägte Backentaschen. Die Weibchen sind deutlich kleiner und schlanker als die Männchen. Die Fellfärbung geht von hell bis mittelbraun mit teilweise rötlichbrauner oder schwach olivgrüner Tönung. Das haarlose Gesicht ist grau-bräunlich bis rosa.
Der mittellange Schwanz misst in etwa um die 20 cm. Sie besitzen neben den oppo-
nierbaren, großen Zehen auch ebensolche Daumen, welche ihnen in Kombination mit den relativ kurzen Fingern zu einer großen Geschicklichkeit verhelfen. Wie alle Altweltaffen sind sie tagaktiv (GEISSMANN 2003g).
Hauptsächlich bewegen sich Rhesusaffen durch vierbeiniges Gehen und Rennen fort, Springen ist eher selten zu beobachten und suspensorische Fortbewegung fehlt, bis auf gelegentliches Hängen an den Hinterbeinen, gänzlich (GEISSMANN 2003g).
Sie sind anpassungs- und widerstandsfähig. Im Süden von Asien, besonders Indien, sind sie mit steigender Tendenz als Kommensale zum Menschen in ländlichen und städtischen Gebieten anzutreffen (ZINNER et al. 2013). Rhesusaffen sind vornehm- lich frugivor. Ihre Nahrungsgrundlage besteht hauptsächlich aus Getreidearten, Sä- mereien, Früchten, Knollen, Wurzeln, Knospen, Beeren, Blüten aber auch vielerlei Kleingetier (ZINNER et. al. 2013).
Die Männchen leben, je nach Lebensraum, in kleinen bis größeren Mehrmänner- gruppen mit oft komplexen sozialen Beziehungen, auf die die Weibchen-Hierarchien und Matrilinien großen Einfluss nehmen. Männchen verlassen ihre Geburtsgruppe mit dem Erreichen der Geschlechtsreife im Alter von 4 bis 4,5 Jahren und wechseln dann oft in ihrem Leben von kleineren reinen Männergruppen zu anderen Gruppen mit Weibchen oder leben auch als Single (GEISSMANN 2003g).
Die Weibchen verbleiben für den Rest ihres Lebens in ihrer Geburtsgruppe mit einer dauerhaften Rangordnung. Sie werden im Alter von 3 Jahren geschlechtsreif und haben einen Menstruationszyklus von durchschnittlich 28 Tagen (FRIDMAN 2002a).
Während es in der Natur teilweise saisonale Paarungszeiten gibt, so dass die Jung- tiere im Frühling auf die Welt kommen, sind in Gefangenschaft Geburten über das ganze Jahr hinweg möglich. Meist erfolgen die Geburten im jährlichen Intervall als Einlingsgeburten, die typisch für alle Catarrhini sind (GEISSMANN 2003g). Die Trag- zeit beträgt 165 Tage (FRIDMAN 2002a). Die Jungtiere werden mit 6 bis 12 Monaten entwöhnt (BERCOVICH 1999). In Gefangenschaft können sie bis zu 40 Jahre alt werden.
Rhesusaffen machten zwischen 1965 und 1985 über 42 % der Primaten in der bio- medizinischen Forschung aus (siehe Tierschutzberichte des Bundesministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz (BMELV) unter www.bmel.de) und sind bis heute aufgrund ihrer evolutionären Nähe zum Menschen die am häufigsten verwendete Versuchstierspezies unter den Primaten (CARLSSON 2004). Sie zeigen eine gute Adaptation an die Haltungsbedingungen in der Gefangenschaft und sind sehr widerstandsfähig. Im Gegensatz zu anderen Versuchstieren weist ihre DNA ei- ne bis 93 % Übereinstimmung mit der des Menschen auf (GIBBS et al. 2007). Ihre hämatologischen und biochemischen Charakteristika sind denen des Menschen sehr ähnlich. Sie haben eine gleich ablaufende Ovogenese, Spermatogenese, Physiologie
der fetalen Plazentaentwicklung, Embryologie und Gestation im Allgemeinen (FRIDMAN 2002a).
Rhesusaffen ermöglichen einen weitgefächerten Einsatz in der Forschung, welcher unter anderem Endokrinologie, Immunologie, Pharmakologie, Kardiologie, Ophthal- mologie, Zahnmedizin sowie Biochemie umfasst (FRIDMAN 2002a). Ein Schwer- punkt liegt in der Infektionsforschung, wo Rhesusaffen in verschiedenen Tiermodel- len Verwendung finden (KAUP u. SCHWIBBE 2002). Das SIV/SHIV Makakenmodell gilt immer noch als der Goldstandard in der HIV Forschung.
Sie weisen eine leichte Trainierbarkeit auf und erbringen teilweise erstaunlich intelli- gente Leistungen, die man ansonsten nur beim Orang-Utan oder Schimpansen kennt (BERGER 1984a). Neben den Javaneraffen (Macaca fascicularis) werden sie daher häufig in der neurobiologischen bzw. neuromedizinischen Grundlagenforschung ein- gesetzt.
2.1.3 Weißbüschelaffen: Physiologie und Einsatzmöglichkeiten
Das Verbreitungsgebiet der Weißbüschelaffen erstreckt sich auf den Nord-Osten von Brasilien, wo sie meist in den Trockenwäldern der Küstenregion vorkommen (RYLANDS u. MITTERMEIER 2013). Sie werden zwischen 15 und 25 cm lang und sind mit einem Schwanz ausgestattet, der fast die doppelte Körperlänge erreichen kann. Ihr Körpergewicht kann von 250 g bis 500 g variieren (FRIDMAN 2002b).
Das Fell ist seidig weich, dicht und langhaarig mit unterschiedlichen braunen, gelb- lich weißen und orangefarbenen Farbtönen, was beim engen Anliegen an den Körper zu Längsstreifen am Rücken und Ringel am Schwanz führt. Ihren Namen erlangten sie durch die weißen Haarbüschel, welche um ihre Ohrmuscheln herum angebracht sind. Meist tragen sie auf der Stirn einen weißen Fleck (BERGER 1984b). Sie kön- nen in Gefangenschaft bis zu 14 Jahre und älter werden.
Alle ihre Finger liegen in einer Ebene, was ihren Griff ungeschickt erscheinen lässt, sie jedoch nicht am flinken Klettern in ihrem Lebensraum hindert (BERGER 1984b).
Ihre typische Fortbewegung umfasst das vierbeinige Gehen, Rennen und Springen.
Die Krallen, welche sie mit der Ausnahme der großen Zehen, an ihren Fingern tra- gen, ermöglicht sogar das Kopfüber-Klettern an dicken vertikalen Stämmen (RYLANDS u. MITTERMEIER 2013).
Eine weitere Besonderheit stellen ihre Incisivi und Canini da. Alle Incisivi und Canini sind im Vordergebiss etwa gleich hoch. Sie nutzen das spezialisierte Gebiss dazu, kleine Löcher in die Baumrinde zu nagen, um den Saft- und Harzabfluss anzuregen,
der neben Früchten und Arthropoden einen wichtigen Nahrungsbestandteil darstellt (GEISSMANN 2003d).
Weißbüschelaffen sind ebenso wie die Rhesusaffen tagaktiv. Ihr Zusammenleben erfolgt im Familienverband, an dessen Spitze ein ranghohes Männchen und Weib- chen stehen. Die eigenen Kinder werden auch mit dem Erreichen der Geschlechts- reife geduldet, da sie aufgrund sozioendokrinologischer Einflüsse sexuell inaktiv sind.
Innerhalb der Gruppe lebt daher nur ein paarungsbereites Paar. Fremde adulte Tiere werden von dem entsprechenden gleichgeschlechtlichen Paarpartner vertrieben (GEISSMANN 2003d).
Weißbüschelaffen bzw. Marmosetten im Generellen sind das ganze Jahr über fort- pflanzungsfähig mit einem durchschnittlichen Regelzyklus von 28 Tagen. Nach einer Tragezeit von circa 145 Tagen erfolgt die Geburt meist nachts. Häufig kommen Zwil- linge oder Drillinge zu Welt, welche von der Mutter gesäugt, aber größtenteils durch den Vater betreut werden, der die Jungtiere auf dem Rücken trägt (FRIDMAN 2002b). Das Muttertier hat bereits 8–18 Tage nach der Geburt einen erneuten Ei- sprung und ist bereits wieder zur Aufnahme fähig (RENSING u. OERKE 2005).
Ihre geringe Größe in Kombination mit leichter Gruppenhaltung ermöglichen, im Ge- gensatz zu mehr traditionellen nicht-menschlichen Primatenmodellen, eine kosten- günstigere Haltung mit einem deutlich reduzierten Infektionsrisiko für die betreuen- den Pfleger, Wissenschaftler und Ärzte. Ihre Empfänglichkeit gegenüber Virusfami- lien, wie den Herpesviren und dem GB-Virus aus der Familie der Flaviviren, macht sie zu einem idealen Modell zur Erforschung der entsprechenden Krankheitsbilder beim Menschen (MANSFIELD 2003). Die frühe geschlechtliche Entwicklung und die anschließende hohe Reproduktionsrate machen den Weißbüschelaffen nicht nur in der Reproduktionsforschung zu einem attraktiven Tiermodell (FRIDMAN 2002b). Ne- ben der Verwendung in der Verhaltensforschung und den Neurowissenschaften wer- den Weißbüschelaffen traditionell aufgrund ihrer besonderen Plazentation und den daraus resultierenden Chimären des Knochenmarkes bei Zwillingsgeburten bei der Klärung von immunologischen Zusammenhängen eingesetzt (´T HART et al. 2012).
Seit kurzem führt man toxikologischen Studien und Studien zur Bemessung von Ge- fahrenstoffen mit Krallenaffen durch, da sie eine engere stammesgeschichtliche Verwandtschaft mit dem Menschen haben als die klassischen Versuchstiere wie Na- ger und Hund (Smith 2001). Da der Weißbüschelaffe im Gegensatz zum Rhesusaf- fen andere, insbesondere klimatische Haltungsbedingungen, sowie in Hinblick auf seine Größe andere Instrumente und Techniken benötigt, ist sein Einsatz nicht in allen Forschungsgebieten sinnvoll.
Aufgrund der oben aufgeführten Aspekte bedarf es im Vorfeld des Versuches einer genauen Prüfung der Fragestellung innerhalb des Forschungsbereiches und einer damit verbundenen optimalen Auswahl des passenden Tiermodells unter Berück- sichtigung ethischer und tierschutzrechtlicher Gesichtspunkte (EU Direktive 2010/63/EU, Deutsches Tierschutzgesetz–TierSchG, Tierschutz-Versuchstier- Verordnung–TierschVersV).
2.1.4 Hämatologische Untersuchungen bei nicht-menschlichen Primaten
Blutuntersuchungen ermöglichen bei Versuchstieren die Beurteilung des allgemeinen Befindens im Rahmen einer Routineuntersuchung, als Verlaufskontrolle innerhalb einer Studie oder im Falle von Krankheit und lassen Rückschlüsse auf das Krank- heitsgeschehen ziehen. Ohne die entsprechenden Referenzwerte ist eine Interpreta- tion des Blutbildes nicht möglich und somit die Beurteilung stark eingeschränkt (SCHWENDENWEIN 2014).
Da Rhesus- und Weißbüschelaffen schon viele Jahre in der biomedizinischen For- schung eingesetzt werden, wurden dementsprechend schon mehrfach Referenzwer- te erhoben und veröffentlicht (DILLINGHAM et al. 1971; ROSENBLUM u.
COULSTON 1981; MCNEES et al. 1982; BUCHL u. HOWARD 1997; SMUCNY et al.
2001; OMATSU et al. 2012).
Bei der Verwendung von Daten aus der Literatur muss berücksichtigt werden, ob die Erhebung unter ähnlichen Bedingungen wie die der eigenen Daten stattgefunden hat. Als die wichtigsten Kriterien sind dabei anzusehen (WOOD et al. 2013; ICSH 2014):
Tieranzahl, mindestens 80 Tiere, Optimum 100 bis 120 Tiere Alter und Geschlecht der Tiere, hormoneller Status
Haltungsbedingungen, Außen- und Innenbereiche Klimabedingungen
Fütterung (Art und Zusammensetzung) Art der Blutentnahme
Erst wenn sich diese Bedingungen entsprechen, lassen sich die Referenzwerte aus der Literatur auf die eigene Bestandssituation valide übertragen (SCHWENDEN- WEIN 2013). In Standardwerken für nicht menschliche Primaten, wie zum Beispiel
„The Laboratory Primate“ (WOLFE-COOTE 2005) oder “The Laboratory Nonhuman Primate” (FORTMAN et al. 2001), finden sich sowohl zum Rhesusaffen als auch zum Weißbüschelaffen hämatologische RI (Tab. 1, Tab. 2). Dabei ist nicht immer eindeu- tig dokumentiert, aufgrund welcher Originalarbeiten die angeführten Werte entnom-
men wurden. So wird in den beiden oben aufgeführten Standardwerken als Referenz für den Weißbüschelaffen neben den gesammelten Daten von ABOU-MADI bei- spielsweise auch eine persönliche Mitteilung angeführt (ABOU-MADI 1999). Als Re- ferenz für den Rhesusaffen wurden Studien mit einer geringen Tieranzahl (n = 54) oder Angaben ohne weitere Hintergrundinformationen angeben. Bei HOM und Mitar- beitern (1999) ist weiterhin zu berücksichtigen, dass die Blutabnahme über einen Port und mit gänzlich anderen Analysegeräten, dem Hämatologiesystem H1E von Bayer (Bayer Diagnostics, Tarrytown, New York) und dem Hämatologiesystem Baker 9000 (BiochemImmuno Systems, Allentown, Pennsylvania) erfolgte.
In dem tierartenübergreifenden Standardwerk der Hämatologie „Schalm´s Veterinary Hematology“ (WEISS u. WARDROP 2010) werden ebenfalls Referenzwerte für den Weißbüschel- und Rhesusaffen angeben. Die den Referenzwerten zugrunde liegen- den Arbeiten sind alle in der Zeit von 1983 bis 2001 entstanden, nur zwei davon mit einer für die heutigen Standards akzeptablen Anzahl an Tieren (BUCHL u. HOWARD 1997; SMUCNY et al. 2001). In die Studie von SMUNCY et al. (2001) wurden Tiere aus drei unterschiedlichen Primatenzentren und somit aus unterschiedlichen Hal- tungsbedingungen einbezogen. Die Studie von BUCHL u. HOWARD (1997) verwen- dete Analysegeräte, die heute als veraltet anzusehen sind (Tab. 1, Tab. 2). Die bei- den anderen Untersuchungen geben Referenzwerte an, die auf Daten mit einer nied- rigen Tieranzahl und enger Spannbreite im Alter basieren (FERNIE et al. 1994) oder Tiere aus nicht vergleichbaren Lebensräumen berücksichtigen (KESSLER u.
RAWLINS 1983).
Tab. 1: Referenzintervalle für Blutparameter beim Rhesusaffen aus der Standardlite- ratur
1) 54 männliche Tiere im Alter von 3–5 Jahren, Sedation mittels Ketaminhydrochlorid
2) 44 männliche Tiere im Alter von 4–5 Jahren, Sedation mittels Ketaminhydrochlorid
3) 345 männliche und weibliche Tiere zusammen, 7–36 Jahre alt, Blutprobenentnahme sowohl im Wachzustand als auch unter Sedation
4) 161 männliche Tiere im Alter von 5–6 Jahren, keine Angaben bzgl. Sedation
5) segmentkernige Granulozyten
6) stabkernige Granulozyten
k.a (keine Angaben), MCV = mittleres Erythrozytenvolumen, MCH = mittlerer zellulärer Hämoglobin- gehalt, MCHC = mittlere Hämoglobinkonzentration der Erythrozyten
Zusätzlich zu den Studien aus den in Tabelle 2 genannten Standardwerken über den Weißbüschelaffen seien zwei Veröffentlichungen aus den Jahren 1982 und 1984 aufgrund der hohen Tieranzahl von 96 Tieren (HAWKEY et al. 1982) und 115 Tieren (YARBROUGH et al. 1984) erwähnt. Beide Untersuchungen weisen neben unter- schiedlichen Messmethoden keine einheitlichen Herkunftsorte sowie unterschiedliche Haltungs- und Fütterungsbedingungen der Primaten auf.
Parameter SI-Einheiten HOM et al.
(1999) 1)
BUCHL u. HOWARD (1997) 2)
SMUCNY et al.
(2001) 3)
TERAO (2001) 4)
Leukozyten x109/l 4.2 - 8.1 x106/l 7.8 - 13.0 x103/µl 4.34 - 11.34x103/mm3 61 - 111 x102/l
Erythrozyten x1012/l 5.1 - 5.6 x106/l 5.54 - 6.24 x106/µl 4.93 - 6.31x106/mm3 495 - 629 x104/l
Hämoglobin mmol/l 12.0 - 13.1 g/dl 12.4 - 14.0 g/dl 11.78 - 14.94 g/dl 11.2 - 13.2 g/dl
Hämatokrit l/l 37.3 - 40.4 % 38.3 - 43.9 % 36.83 - 46.29 % 33 - 41.2 %
Thrombozyten x109/l 260 - 361 x103/l k.a k.a 25.1 - 42.5 x104/l
MCV fl 71 - 75 fl 66.9 - 72.5 fl 69.75 - 79.47 fl 62.3 - 70.1 fl
MCH fmol 22.8 - 24.5 pg 21.5 - 23.3 pg 22.16 - 25.98 pg 20 - 23.6 pg
MCHC mmol/l 31 - 33.4 g/dl 31.6 - 32.8 g/dl 27.6 - 37.14 % 20.8 - 35.2 g/dl
Neutrophile
Granulozyten % 26.6 - 52.5 % 4.05 - 8.70 /µl 5)
0 - 165 /µl 6) 35.66 - 67.42 % k.a
Lymphozyten % 39.3 - 71.6 % 2.00 - 5.18 /µl 24.37 - 53.47 % k.a
Eosinophile
Granulozyten % 0.4 - 3.9 % 0 - 331 /µl 0.23 - 7.51 % k.a
Basophile
Granulozyten % 0 - 0.4 % 0 - 35 /µl k.a k.a
Monozyten % 1.5 - 4.3 % 41 - 475 /µl 1.27 - 5.77 % k.a
Retikulozyten x109/l oder % k.a k.a k.a k.a
Tab. 2: Referenzintervalle für Blutparameter beim Weißbüschelaffen aus der Stan- dardliteratur
*) segmentkernige Granulozyten
**) stabkernige Granulozyten
1) keine Angaben bzgl. Tieranzahl oder Sedation
2) 30–35 männliche und weibliche, erwachsene Tiere zusammen je nach Parameter, Blutentnahme im Wachzustand als auch unter Sedation mittels Ketaminhydrochlorid
3) 55–61 männliche, erwachsene Tiere, , Blutprobenentnahme im Wachzustand
4) 6–45 männliche und weibliche Tiere, keine Angaben bzgl. Sedation
k.a (keine Angaben), MCV = mittleres Erythrozytenvolumen, MCH = mittlerer zellulärer Hämoglobin- gehalt, MCHC = mittlere Hämoglobinkonzentration der Erythrozyten
Bereits zu diesem Zeitpunkt sind sich die Verfasser einig, dass es zur Erhebung von validen Ergebnissen erforderlich ist, Referenzwerte für die unterschiedlichen Prima- tenarten, unter deren spezifischen Haltungsbedingungen, zu etablieren (KESSLER u.
RAWLINS 1983; YARBROUGH et al. 1984; BUCHL u. HOWARD 1997).
Parameter SI-Einheiten FORTMAN et al.
(2001) 1)
HAWKEY et al.
(1982) 2)
YARBROUGH et al.
(1984) 3)
WOLFE-COOTE (2005) 4)
Leukozyten x109/l 4.9 - 11.3 x106/ml 5.7 - 8.9 x109/l 4.9 - 11.3 x103/mm3 3.9- 8.3 x103/Ul
Erythrozyten x1012/l 4.6 - 6.6 x106/ml 6.5 - 7.3 x1012/l 4.7 - 6.7 x106/mm3 4.8 - 6.4 x106/Ul
Hämoglobin mmol/l 12.6 - 19.6 g/dl 14.5 - 16.5 g/dl 12.6 - 19.6 g/dl 13.6 - 16.4 mg/dl
Hämatokrit l/l 32 - 54 % 0.45 - 0.51 l/l 31.5 - 53.9 % 37.5 - 51.7 %
Thrombozyten x109/l 180 - 382 x103 364 - 586 x109/l 180 - 382 x103/mm3 409 - 809 x103/Ul
MCV fl 66 - 78 fl 66 - 72.6 fl 66 - 78 µ3 63.4 - 85.2 fl
MCH fmol 14 - 32 pg 21.1 - 23.7 pg 23.8 - 32.2 pg 23.1 - 28.5 mg/dl
MCHC mmol/l 34 - 45 g/dl 31.3 - 33.3 % 33.5 - 44.5 % 29.7 - 38.7 g/dl
Neutrophile
Granulozyten % 27 - 59 % 40.3 - 69.7 % 27 - 59 %*)
0 - 1.1 %**)
1.7 - 4.7 x103/UI *)
0.09 - 0.25 x103/UI **)
Lymphozyten % 35 - 67 % 29.5 - 56.5 % 35 - 67 % 1.4 - 4.6 x103/UI
Eosinophile
Granulozyten % 0 - 1.4 % 0.50 % 0 - 1.4 % 0.09 - 0.37 x103/UI
Basophile
Granulozyten % 0 - 2.1 % 1.30 % 0 - 2.1 % 0.01 - 0.31 x103/UI
Monozyten % 0.4 - 6.2 % 0.40% 0.4 - 6.2 % 0.07 - 0.43 x103/UI
Retikulozyten % k.a 1.8 - 5.2 % 0.1 - 4.7 % 1.0 - 5.0 /100 WBC
Im Zeitalter des Internets werden auch über dieses Medium Referenzwerte veröffent- licht. Zwei häufig genutzte Seiten sind die des „Panther Tracks Learning Center“ der Firma „Primate Products, Inc.“ und das „Primate Info Net“, welches zum Library and Information Service des National Primate Research Center der Universität von Wis- consin, USA in Madison gehört (www.primateproducts.com). Primate Products, Inc.
ist eine Firma in Florida, USA, welche Produkte und Zubehör für die Primatenhaltung vertreibt und sich dem Schutz und der Pflege von nicht-humanen Primaten verbun- den fühlt. Weder auf der Internetseite noch auf den verkäuflichen Postern werden Quellennachweise zu den erhobenen Daten angegeben. Lediglich ein Hinweis auf die Varianz der Werte, abhängig von Alter, Geschlecht, Haltung, sozialem Verband und Hormonstatus, erfolgt (www.primateproducts.com).
Die Internetseite des Primate Info Net (PIN), welche über die Homepage der Univer- sity of Wisconsin-Madison verlinkt ist, wurde seit einigen Jahren nicht mehr aktuali- siert und verweist bei den Referenzen für die hämatologischen Parameter auf unter- schiedliche Studien (www.primate.wisc.edu). Die Verweise für den Rhesusaffen lie- gen zeitlich zwischen 1955 und 1983 und decken sich teilweise mit den bereits in der Fachliteratur zitierten Studien (KESSLER u. RAWLINS 1983). Ihnen liegen niedrige Tierzahlen zugrunde oder sie entsprechen in der Auswertung bzw. Zählung der Zel- len nicht mehr den heutigen Standards (DILLINGHAM et al. 1971; VOGIN u. OSER 1971). Ähnliches gilt beim Weißbüschelaffen in Bezug auf bereits in der Fachliteratur zitierte Werke (HAWKEY et al. 1982; YARBROUGH et al. 1984). Des Weiteren wer- den Veröffentlichungen, die sich in keinerlei Hinsicht mit hämatologischen Parame- tern beschäftigt haben, angeführt (FREMMING et al. 1955; WADSWORTH et al.
1981). Der im Internet gelistete Ansprechpartner ist unter der gegebenen E-mail Ad- resse nicht erreichbar. Der Library and Information Service der Universität von Wis- consin wurde mit der Schließung der Bibliothek bis auf weiteres eingestellt. Obwohl die Internetseite des PIN weiterhin online bleibt, wird sie nicht mehr aktualisiert.
Die Anzahl der Veröffentlichungen der letzten dreißig Jahre, die sich mit hämatologi- schen Referenzwerten beim Rhesus- und Weißbüschelaffen beschäftigt haben, ist im Gegensatz zu den Jahren 1955 bis 1985 relativ gering. Dieses kann daran liegen, dass die dokumentierten Werte als valide angesehen wurden. Zum anderen änder- ten sich die Fragestellungen im Zusammenhang mit der Erhebung hämatologischer Werte. So wurden für den Rhesusaffen, neben dem Einfluss von unterschiedlichen Narkosearten, die Veränderungen der Blutparameter im Laufe der Schwangerschaft beleuchtet (HOM et al. 1999; ROGERS et al. 2005; IBANEZ-CONTRERAS et al.
2013). Bei allen Studien wurden aber nur niedrige Tierzahlen, bis maximal 28 Tiere, mit unterschiedlichen Narkoseregimen und Haltungsbedingungen untersucht. Dies gilt auch für den Weißbüschelaffen, der in den letzten Jahren verstärkt in den Fokus der biomedizinischen Forschung geraten ist. Auch hier handelt es sich meist um sehr
spezifische Fragestellungen, wie zum Beispiel Auswirkungen von Stresssituationen oder Virusinfektionen auf das hämatologische Bild. Versuchsbedingt wurden in die- sen Studien nur kleine Tierzahlen verwendet (KUEHNEL et al. 2012; OMATSU et al.
2012).
Abschließend lässt sich das Fazit ziehen, dass Rhesus- und Weißbüschelaffen unter den Versuchstieren in der biomedizinischen Forschung einen hohen Stellenwert in- nehaben und es heute mehr denn je wichtig ist, auf geeignete Referenzwerte zu- rückgreifen zu können. Die in der Literatur dokumentierten Werte sind häufig veraltet und entsprechen nicht mehr den Kriterien, die an moderne Analyseverfahren zu stel- len sind. Vor dem Hintergrund neuer Technologien sind daher regelmäßige Anpas- sungen der hämatologischen RI an die aktuellen Standards, sowohl im technischen als auch statistischen Bereich, unumgänglich (ICSH 2014; SCHWENDENWEIN 2014).
2.2 Hämatologische Analyseverfahren
2.2.1 Entwicklung der hämatologischen Untersuchungsmethoden
Die für uns selbstverständlichen Methoden der Zellzählung und Differenzierung der einzelnen Blutparameter rückten erst mit der Erfindung des Mikroskops um 1590 durch Hans und Zacharias JANSSEN in den Bereich des Möglichen. Sie legten den Grundstein für weitere technische Entwicklungen der Pioniere auf dem Sektor der Mikroskopie, wie Robert HOOKE und Antoni van LEEUWNHOEK. Ernst Karl ABBE, Carl ZEISS und Otto SCHOTT brachten mit ihrer jeweiligen Expertise die mikrosko- pische Technik soweit voran, dass es ab 1860 möglich war, Objekte mit einer Min- destgröße von 200 nm scharf darzustellen (ASCHOFF 1960).
Mitte des 17. Jahrhundert erkannten Giovanni Alfonso BORRELLI weiße Blutkörper- chen (1656) und Jan SWAMMERDAN rote Blutkörperchen im Mikroskop (ASCHOFF 1960). Da letzterer seine Entdeckung nicht veröffentlichte, wurde sie dem Anatom Marcello MALPHIGI im Jahre 1666 zugeschrieben. Einige Jahre später beschrieb Antoni van LEEUWNHOEK Gestalt und Form der roten Blutkörperchen genauer (ASCHOFF 1960; ROTHSCHUH 1974).
Die Entwicklung der Zählkammern durch den Holländer CRAMER im Jahr 1855, ba- sierend auf der von Alfred DONNÉ etablierten quantitativen Bestimmung der rote Blutkörperchen mittels Ausstrich (BOSCHUNG 1980), und deren Verbesserung durch BÜRKER 50 Jahre später, waren nicht nur ein Meilenstein der Wissenschaft, sondern spiegeln auch das große wissenschaftliche Interesse der damaligen Epoche wider (THOMA u. LYON 1881; ROERDANSZ 1913). Die um 1881 durch THOMA
vorgeschlagene veränderte Behandlung der Blutprobe mit verdünnter Essigsäure ermöglichte dann auch erstmals die direkte Zählung der Leukozyten. Zuvor wurden sie in Relation zu den ausgezählten Erythrozyten angegeben (KRAFT et al. 1999, MORITZ et al. 2013).
Die Modifikation der Netzeinteilung der Bürker-Zählkammer durch NEUBAUER im Jahre 1924 ist immer noch aktuell und findet ihren Einsatz bei der manuellen Aus- zählung der Erythrozyten und Leukozyten (KRAFT et al. 1999; MORITZ et al. 2013).
Schwieriger gestaltete sich die Auszählug der Thrombozyten aufgrund ihrer hohen Adhäsions- und Aggregationstendenz (ROLEFF 2004). Erst die Entwicklung einer indirekten Zählmethode im Blutausstrich nach Fonio etablierte ein bis heute anwend- bares Verfahren (FONIO 1912).
Die mikroskopische Untersuchung von Blutvolumina zur Zellzählung von Erythrozy- ten und Leukozyten mittels einer entsprechenden Zählkammer sowie die Differenzie- rung der Leukozyten im Blutausstrich unter dem Mikroskop wurde Jahrzehnte lang als Mittel der Wahl praktiziert (BEGEMANN u. BEGEMANN 1997). Über die Jahre hinweg wurde festgestellt, dass die manuelle Probenbearbeitung, zu der unter ande- rem die Herstellung von Verdünnungen, Ausstrichen, Auszählungen und Färbungen gehört, an mehreren Stellen Fehler aufweisen kann (WEISS u. TVEDTEN 2004a), zum einen in der Handhabung des Systems an sich und zum anderen bei der Zäh- lung und Beurteilung der Zellen durch den Menschen (RUEMKE 1959). Selbst geüb- ten technischen Assistenten mit jahrelanger Praxis unterlaufen oft systemische Feh- ler. Hinzu kommt der hohe zeitliche Aufwand bei größer werdender Probenanzahl (MORITZ et al. 2013).
Die Erfindung eines photoelektrischen Apparates für die mikroskopische Zählung von Zellsuspensionen durch den Schweden Carl LANGERCRANTZ legte 1948 den Grundstein für die automatischen Zählgeräte (LANGERCRANTZ 1948; ROLEFF 2004). Waren die Geräte zunächst nur in der Lage, Erythrozyten und Leukozyten zu zählen und mussten die Verdünnungen noch von Hand vorgenommen werden, so ermöglichten die Arbeiten von MOLDAVON im Jahre 1934 und COULTER 1953 ne- ben der Etablierung unterschiedlicher Messprinzipien, auf die unten näher eingegan- gen wird, auch die voranschreitende Automatisierung der selbigen (MOLDOVAN 1934, COULTER 1953).
Heute erfolgt die Verarbeitung der Blutprobe auf den großen Blutzellzählgeräten, vom Ansaugen bis hin zum Ausdruck, vollautomatisch. Wurden diese Geräte zu- nächst für die Humanmedizin entwickelt, hielten sie über die Jahre mit der Speziali- sierung der einzelnen veterinärmedizinischen Fachbereiche auch hier Einzug in die Labore. Eine große Herausforderung stellt dabei die Anpassung an die speziesspezi- fischen hämatologischen Unterschiede dar (MORITZ et.al. 2013).
Die manuellen Methoden sind als Routinebestimmungen mehr und mehr in den Hin- tergrund getreten und finden Ihren Einsatz noch in kleineren Praxen oder dort, wo die Gegebenheiten zur automatischen Analyse nicht gegeben sind. Sie sind allerdings unersetzlich bei der Überprüfung von kritisch zu betrachtenden maschinellen Ergeb- nissen und dienen bis heute als Mittel der Wahl, um die automatisierten Messungen zu etablieren und zu validieren (ICSH 1994; ICSH 2014).
Ein besonders Problemfeld bei automatisierten Hämatologieuntersuchungen stellen exotische Spezies dar, die in der Obhut des Menschen meist in nur kleinen Populati- onen vorkommen. Hier können selbst die hoch entwickelten Multispezies- Multiparameter-Analysegeräte an ihre Grenzen stoßen, wenn die relevanten Messparameter und Grenzen noch nicht etabliert sind. Dennoch konnte durch die beständige Weiterentwicklung der einzelnen Messtechniken und –verfahren eine immer präzisere Definition der speziesbedingten, teilweise stark unterschiedlich aus- geprägten Blutbestandteile vorgenommen werden. Dieses ermöglicht heute nicht nur einen besseren Einblick in die Zusammensetzung der verschiedenen Blutkomponen- ten, sondern auch eine genauere Einschätzung der möglichen Konsequenzen sowie eine Aussage zur Pathogenese bei einem Krankheitsgeschehen.
2.2.2 Messmethoden moderner Hämatologiesysteme
Heute ist in der veterinärmedizinischen Diagnostik eine Vielzahl von Systemen im Einsatz, die von der einfachen Zellzählmaschine bis hin zu hochspezialisierten Mul- tispezies-Multiparameter-Analysegeräten reichen. Die Auswahlkriterien für die Gerä- te richten sich, ausgehend von der Größe und Anforderung, neben Faktoren wie Exaktheit, Anschaffungskosten und Unterhaltungskosten, nach der Vielfalt der zu bestimmenden Parameter, der Einfachheit der Handhabung und dem Probendurch- satz pro Zeiteinheit (MORITZ u. BECKER 2010). Ihnen allen gemein ist, dass sie je Probe mehrere tausend Zellen analysieren können und somit eine höhere Präzision aufweisen als vergleichbare manuelle Methoden (KNOLL 2000; MISCHKE 2003;
ROLEFF 2004).
Die Besonderheit der „Multiparameter-Hämatologiegeräte“ besteht in ihrer Fähigkeit, automatisiert und standardisiert die Informationen zu liefern, welche bisher nur mit- tels der manuellen Differenzierung möglich war. Im Rahmen der automatisierten Me- thoden werden hauptsächlich die Widerstands- bzw. Impedanzmessung, die Quanti- tative Buffy Coat-Analyse (QBCA), die Streulicht/Lichtabsorptions-Messung und die Zellfärbung oder aber eine Kombination der jeweiligen Methoden herangezogen (ROLEFF 2004; MORITZ u. BECKER 2010). Im Folgenden soll ein kurzer Einblick in drei grundlegende Messprinzipien gegeben werden.
Widerstands- oder Impedanzmessung
Dieses Verfahren wurde von COULTER in den 1950er Jahren etabliert und paten- tiert. Hierbei fließt in einer Elektrolytlösung elektrischer Strom zwischen der Anode und Kathode und sorgt somit für ein Spannungsfeld. Bei der Passage von Partikeln bzw. Blutzellen durch dieses Feld kommt es zu einer Änderung der Spannung bzw.
des Widerstandes, was als elektrischer Impuls gemessen werden kann (BEGEMANN u. BEGEMANN 1997). Die Widerstandsänderung ist proportional zum Partikelvolu- men. Sie wird registriert, wenn der Impuls den für die Tierart und jeweiligen Zelltyp spezifischen Schwellenwert (Diskriminator) überschritten hat. Anschließend kommt es zu einer Verstärkung und Zählung. Mit diesem Verfahren werden die Anzahl der Zellen und ihre Größe bestimmt sowie rechnerisch weitere Parameter, wie Hämato- krit und Erythrozytenindizes, ermittelt. Probleme bei der Zuordnung der Signale zu einer Blutzellfraktion treten auf, wenn unterschiedliche Zellen mit annähernd gleicher Größe gemessen werden. Durch eine Kombination der Messtechnik mit Reagenzien, welche die Zelllyse bedingen, kann die Messgenauigkeit bzw. die Zelldifferenzierung verbessert werden (MORITZ 2000).
Quantitative Buffy Coat (QBC) Systeme
Dieses System basiert auf dem Prinzip der Zelltrennung aufgrund der unterschiedli- chen Dichte der einzelnen Zellpopulationen mittels Zentrifugation. Um die einzelnen Zellschichten deutlicher darstellen zu können, befindet sich in der Kapillare ein soge- nannter Schwimmkörper, der es ermöglicht, die einzelnen Fraktionen zu strecken.
Gleichzeitig ist die Innenwand der Kapillare mit dem Fluoreszenzfarbstoff Acridin- orange beschichtet, welcher sich an Nukleinsäuren, Glykosaminoglykane bzw.
Lioproteine von Thrombozyten und Leukozyten bindet. Erythrozyten lassen sich mit Acridinorange nicht anfärben, Granulozyten werden orange-gelb eingefärbt, Lymphozyten und Monozyten in brillantem grün und Thrombozyten stellen sich blass gelb dar (MORITZ u. BECKER 2010). Somit wird die Differenzierung der Zellschich- ten durch die Auswertung des Fluoreszenzfarbstoffes präzisiert. Eine Schrumpfung der Erythrozyten, aufgrund einer Veränderung der Osmolarität im Plasma durch Zu- gabe von Kaliumoxalt, erhöht deren Dichte und ermöglicht eine bessere Abgrenzung zu den Granulozyten (ROLEFF 2004). Abschließend wird eine charakteristische Buffy-Coat-Profilkurve erstellt. Zur Verbesserung der Genauigkeit werden Schwel- lenwerte bestimmt. Hierbei handelt es sich um Begrenzungsspannungen, die von den Impulsen überschritten werden müssen bzw. nicht überschritten werden dürfen (SOLOMON u. RAU 1985). Als Vertreter für diese Messtechnik in der Veterinär-
medizin ist das IDEXX VetAutoRead ™ der Firma IDEXX Laboratories zu nennen.
Streulicht/Lichtabsorptions-Messung
Beim optischen Verfahren bedient man sich der Messung der Lichtstreuung, die auf- tritt, wenn Blutzellen in einer feinen Kapillare einen scharf gebündelten Lichtstrahl passieren. Der Grad der Streuung ist proportional zur Teilchengröße und wird mit einem geeigneten optischen Gerät in ein Signal umgewandelt und registriert (BEGEMANN u. BEGEMANN 1997; DURA 2006). Gleichzeitig können mittels zyto- chemischer Verfahren Zellinhalte angefärbt und deren Konzentration über eine Ab- sorptionsmessung bestimmt werden (WEBER 1992). Auf diese Weise lassen sich die fünf Leukozyten-Populationen ermitteln. Eine Unterscheidung von stabkernigen und segmentkernigen Granulozyten ist nicht möglich. Sie werden als neutrophile Gra- nulozyten zusammengefasst.
Die Mehrheit der Anwender bevorzugt Geräte, die mit der Impedanzmessung arbei- ten, um Erythrozyten, Leukozyten und Thrombozyten voneinander zu trennen. Einige verwenden lasergestützte Systeme, um zusätzlich eine genaue Differenzierung der Leukozyten zu erhalten. Der Einsatz von Geräten, die nach dem QBC-System arbei- ten, macht den geringsten Anteil aus. Zu den großen Multiparameter-Analysegeräten in der veterinärmedizinischen Hämatologie gehören zur Zeit, neben dem ADVIA 2120 von Siemens Healthcare GmbH, der Cell-Dyn®3500® von Abbot Laboratories und der Sysmex XT-2000IV ® von Sysmex Europe (MORITZ u. BECKER 2010).
In dieser Arbeit wurde der ADVIA 2120 verwendet, welcher sich der Streulichtme- thode bedient. Die genauen Messvorgänge für die jeweiligen Parameter werden in Kapitel 3.4 detailliert dargestellt.
Der Cell-Dyn®3500® von Abbot Laboratories bedient sich, neben dem optischen Verfahren zur Zählung und Differenzierung der Leukozyten, der Impedanzmessung in zwei unterschiedlichen Kanälen für Leukozyten und für Erythrozy- ten/Thrombozyten. Das Hämoglobin wird nicht berechnet, sondern mit einem Spekt- ralphotometer gemessen. Die Erhebung der absoluten Retikulozytenzahl, von ver- größerten Thrombozyten und Thrombozytenaggregaten gestaltet sich in der graphi- sche Darstellung schwierig. Im Vergleich zum ADVIA 2120 weist der Cell- Dyn®3500® geringere Verwendungsmöglichkeit auf, da weniger Parameter durch direkte Messung als durch Berechnungen aus einzelnen Messkanälen erhoben wer- den (MORITZ u. BECKER 2010). FERNANDES und Mitarbeiter konnten 2002 zei- gen, dass durch die mit dem Algorithmus des Cell-Dyn®3500® erhobenen Daten eine Vorhersage der Abstammung der Leukozyten im Zusammenhang mit Neopla- sien möglich ist (FERNANDES et al. 2002).
Auch beim Sysmex XT-2000IV ® wird die Impedanzmessung mit dem optischen Messverfahren kombiniert. Die Erythrozyten und Thrombozyten werden mittels Im- pedanz in Kombination mit hydrodynamischer Fokussierungstechnologie ermittelt.
Der Hämatokrit wird aus der jeweiligen Pulshöhe der Erythozytenmessung berech- net. Die Hämoglobinbestimmung erfolgt durch photometrische Messung nach Kom- plexbildung mit Natriumdodecylsulfat (im Englischen Sodiumdodecylsulfate, SDS).
Die Bestimmung der absolute Retikulozytenanzahl sowie deren Reifestufe erfolgt mittels Fluoreszenzfärbung und Lasertechnologie (MORITZ u. BECKER 2010).
BAUER et al. konnten 2011 und 2012 zeigen, dass der Sysmex XT-2000IV ® im Vergleich zum ADVIA 2120 sowohl in Präzision, Linearität und Genauigkeit als auch bei der Leukozytendifferenzierung, der Retikulozytenzählung sowie unter dem Ein- fluss von unterschiedlichen Antikoagulanzien und Alterung der Proben für die Tierar- ten Hund, Katze und Pferd exzellente Ergebnisse erbrachte und eine sehr gute Ver- gleichbarkeit aufwies (BAUER et al. 2011, 2012). Besonders hervorzuheben ist das geringe benötigte Blutvolumen und die sehr gute Nachweisbarkeit von felinen eo- sinophilen Granulozyten im Differentialblutbild.
2.3 Evaluation von Hämatologiesystemen
Bereits 1963 wurde durch die Gründung des „International Council for Standardizati- on in Haematology“ (ICSH), welche mit der deutschen Gesellschaft für Hämatologie in Verbindung stand, dem Wunsch nach einheitlichen Messtechniken und Arbeitsab- läufen in den Laboren Rechnung getragen. Das Ziel dieser Kommission war die Er- arbeitung von verlässlichen und reproduzierbaren Ergebnissen in der Laboranalyse, mit dem Hauptaugenmerk auf der Hämatologie (MCFADDEN et al. 2008). Seitdem wurden, neben Stellungnahmen, Richtlinien und Empfehlungen ausgesprochen. Eine der Ersten war „Empfehlung und Anforderungen an die Hämoglobinuntersuchung in humanen Blut“ (ICSH 1965).
In den 90er Jahren des letzten Jahrhunderts entstand die „International Society for Laboratory Hematology“ (ISLH), die in Zusammenarbeit mit der ICSH eine Arbeits- gruppe zur Etablierung von Referenzmethoden zur Zellzählung mittels Durchflußzy- tometrie und Zellanalyse unreifer Retikulozyten einrichtete (ICSH 1994; DAVIES et al. 1997). Die dabei entstandenen Empfehlungen wurden durch ständige Überarbei- tungen den weiterentwickelten Methoden angepasst.
In der aktuellen Version der „ICSH guidelines for the evaluation of blood cell analy- sers including those used for differential leucocyte and reticulocyte counting” (ICSH 2014) werden unter anderem folgende Empfehlungen ausgesprochen.
Eine internationale und nationale, vom Hersteller unabhängige Evalua- tion, die am besten von einem akkreditierten hämatologischen Labor vorgenommen wird, welches die Ergebnisse mit denen des Herstellers vergleicht und in einem peer-reviewed Journal veröffentlicht.
Laborinterne Evaluation der erhobene Ergebnisse.
Laborinterne Festlegung der Referenzmethoden, des geeigneten Fachpersonals, einschließlich Morphologen, und der zu verwendenden statistischen Auswertung. Aus– und Weiterbildung der Nutzer des Ana- lysegerätes durch den Hersteller, um einen sicheren Umgang und ein vollständiges Verständnis der Funktionsweise des Gerätes zu gewähr- leisten.
Verwendung von frischem Vollblut mit dem Antikoagulanz K2- oder K3 EDTA (Ethylendiamintetraacetat). Die Blutprobe sollte innerhalb von 4 bis 8 Stunden nach der Entnahme verarbeitet werden. Makroskopisch sichtbar koagulierte Proben sollten verworfen werden, wohingegen sol- che mit Erythrozyten- oder Thrombozytenagglutination einbezogen werden können, da sie eine Aussage über die Messgenauigkeit des Gerätes liefern.
Je Probe sollten mindestens zwei Blutausstriche nach dem jeweiligen Laborstandardprotokoll angefertigt werden.
Dokumentation und Aufbewahrung der Proben– und Kontrollergebnis- se.
Gewährleistung, dass das Analysegerät in elektronischer, mechani- scher, chemischer und mikrobiologischer Hinsicht den nationalen Si- cherheitsbestimmungen entspricht.
Die Präzision sollte mittels einer 10-fachen Messung einer Einzelprobe (within-run) und mittels der Messung einer Probe über 20–30 Tage (between batch) dargestellt werden. In der statistischen Auswertung sollten die Standardabweichung und der Variationskoeffizient angege- ben werden.
Die mögliche Verschleppung von Verunreinigungen soll durch das Car- ry-over ermittelt werden. Hierbei werden nacheinander, jeweils mittels dreifacher Bestimmung, eine Probe mit hohen Konzentrationen und ei- ne Probe mit niedrigen Konzentrationen gemessen. Diese Bestimmung sollte für Erythrozyten, Hämoglobin, Thrombozyten, Retikulozyten und Vorläuferzellen vorgenommen werden.
Die Bestimmung der Linearität, d.h. die Überprüfung, ob die Messer- gebnisse proportional zu der Zellkonzentration sind. Dies erfolgt durch die Messung einer Verdünnungsreihe mit bekannter Zellkonzentration, welche im Idealfall den gesamten analytischen Bereich umfasst. Die Li- nearität wird für Erythrozyten, Leukozyten und Thrombozyten durchge- führt.
Für die Ermittlung der Probenstabilität sollen nach der Blutentnahme Messungen in einem definierten Zeitrahmen und definierten Zeitab- ständen vorgenommen werden. Die Proben werden bei Raumtempera- tur und bei 4 °C gelagert.
Jedes Labor sollte für sich spezifische Referenzwerte erheben, die alle Komponenten des vollständigen Blutbildes umfassen. Dafür werden idealer Weise 120 Proben verwendet, die sich zu gleichen Teilen aus Proben von Männern und Frauen zusammensetzen, die augenschein- lich gesund sind. Die Bestimmung sollte innerhalb von 4 h nach Blut- entnahme erfolgen. Durch Angabe des Mittelwertes, der Standardab- weichung und des 95 % Konfidenzbereiches kann die Verteilung der Ergebnisse deutlich gemacht werden. Bei einer Normalverteilung der Daten werden die RI durch den Mittelwert plus/minus 2x die Stan- dardabweichung bestimmt. Sollte keine Normalverteilung vorliegen soll- te stattdessen der Mann-Whitney-U-Test angewendet werden. Es ist ratsam für Kleinkinder und Babys eigene Referenzwerte zu etablieren.
Um eine Aussage über die Richtigkeit einer Messung treffen zu kön- nen, bedarf es entsprechender Referenzmethoden zu dem erhobenen Wert. Diese Option besteht nur für die Bestimmung von folgenden Pa- rametern:
1. Hämoglobin 2. Hämatokrit
3. Zählung roter Blutkörperchen 4. Zählung weißer Blutkörperchen 5. Zählung der Thrombozyten 6. Zählung der Retikulozyten
Zur Bestimmung der Vergleichbarkeit des Analysegerätes mit den bis- herigen Standarduntersuchungen, sollten 250–300 Proben gemessen werden, wobei zwei Drittel bis die Hälfte der Proben von gesunden Probanden sein sollten. Die graphische Darstellung sollte durch eine Regressions- und Korrelationsanalyse, sowie eines Bland-Altman plot erfolgen. Weitere aussagekräftige Parameter sind Slope, Intercept und Bias. Gepaarte Proben sollten auch hier mittels t-Test bei Normalvertei- lung und mittels Mann-Whitney-U-Test, wenn keine Normalverteilung vorliegt, dargestellt werden. Ein p-Wert < 0,05 wird als statistisch signi- fikant angesehen.
Um die so etablierte Qualität auch kontinuierlich zu gewährleisten, bedarf es deren Sicherung durch Vereinheitlichung der Arbeitsabläufe innerhalb des Labors, den so- genannten Standard Operating Procedures (SOP). Zusätzlich kann das Labor, sollte es den allgemeinen Bedingungen an die Kompetenz von Prüf- und Kalibrierlaborato- rien (DEUTSCHE NORM 2005) und dem damit verbundenen Qualitätsstandard ent- sprechen (DEUTSCHE NORM 2008), eine Akkreditierung durch die deutsche Akkre- ditierungsstellle GMBH (DAkkS) anstreben und sich somit seine Leistung verifizieren lassen.
2.4 Manuelle hämatologische Methoden
Eine manuelle Messmethode sollte immer als vergleichender Standard bei der Etab- lierung von neuen Grenz- und Referenzwerten sowie bei der Verifizierung einer pa- thologischen Routineuntersuchung herangezogen werden, um die Korrektheit der Messung zu belegen (ICSH 2014). Da nicht alle Parameter manuell präzise genau bestimmt werden können, kommen als Referenzmethoden nur ausgewählte Bestim- mungen in Frage, auf die im Folgenden genauer eingegangen wird (ICSH 1994).
2.4.1 Manuelle Erythrozyten-/Leukozytenzählung
Die Bestimmung der Anzahl von Erythrozyten und Leukozyten mittels Zählkammer ist nicht nur zeitaufwändig, sondern auch sehr fehleranfällig (RUEMKE 1985b;
MORITZ et al. 2013). Sie findet Ihren Einsatz als Referenzmethode somit nur bei be- stimmten Fragestellungen bzgl. der Bewertung von automatischen Blutzellanalysege- räten (MISCHKE et al. 1995; DURA 2006).
