Die Probenbearbeitung, Messung am ADVIA 2120, Bestimmung des Hämatokrit mit-tels Zentrifuge (PCV), Färbungen jeglicher Art sowie die manuelle Differenzierung der WBC und Zählung der Retikulozyten erfolgt durch mich, die Autorin. Aufgrund meiner beruflichen Qualifikation als Medizinisch–Technische Laboratoriumsassisten-tin mit mehrjähriger Berufserfahrung und als TierärzLaboratoriumsassisten-tin habe ich die
Messun-gen/Zählungen selber durchgeführt und hatte zu dem jeweiligen Zeitpunkt der Tätig-keit keinen Einblick in die Ergebnisse der maschinell vorgenommenen Auswertun-gen.
3.5.1 Präzision
Zur Ermittlung der Messgenauigkeit des ADVIA 2120 innerhalb einer Serie wurde beim Rhesusaffen eine Wiederholungsmessung von mindestens 6x bis zu 11x je Blutprobe vorgenommen. Beim Weißbüschelaffen erfolgte die Wiederholungsmes-sung aufgrund des teilweise geringen Volumens der Blutprobe teilweise nur 3x bis hin zu 11x. Die Ermittlung der Präzision erfolgte jeweils an mit EDTA antikoagulierten Blutproben und wurde für die Blutzellzählung, Retikulozytenzählung und Blutzelldiffe-renzierung vorgenommen.
3.5.2 Linearität und Carry-over beim ADVIA 2120
Für die Evaluierung der Linearität und der Verschleppung (Carry-over) bei der Mul-tispeziessoftware des ADVIA 2120 ist eine besondere Aufarbeitung der Vollblutpro-ben je Spezies nötig. Für den Weißbüschelaffen wurde aufgrund des Vollblutpro-benötigten sehr hohen Blutvolumens von einmal circa 40 ml und einmal circa 80 ml Vollblut und der maximale Volumenentnahme pro Tier von maximal 2,5 ml auf diese Bestimmung verzichtet.
Zur Überprüfung der Linearität des roten Blutbildes (RBC/HGB) wurde beim Rhesus-affen eine Anreicherung der RBC vorgenommen und daraus die RBC und das HGB bestimmt. Sechs 9 ml K3-EDTA antikoagulierte Blutprobenröhrchen wurden zweimal bei Raumtemperatur und einer Geschwindigkeit von 750 g für 25 min zentrifugiert.
Der plättchenfreie Überstand (Plasma) wurde abpipettiert und verworfen. Das Sedi-ment wies eine Konzentration von 11,66 x1012 Zellen/l auf und wird im Folgenden als 100 % Pool bezeichnet. Als 0 % Pool dient physiologische Kochsalzlösung, mit der aus dem 100 % Pool Verdünnungsstufen von 75 %, 50 %, 25 % und 12,5 % herge-stellt wurden.
Linearität und Verschleppung wurden direkt nacheinander gemessen. Die Bestim-mung der Linearität erfolgte als erstes durch DoppelbestimBestim-mung der Verdünnungs-stufen in aufsteigender Reihenfolge. Danach folgte die 5-malige abwechselnde Mes-sung des 0 % und 100 % Pools, wobei der 0 % Pool immer einer Doppelbestimmung unterlag, um den Grad der Verschleppung darzustellen.
Im nächsten Schritt wurde die Linearität des weißen Blutbildes anhand der Bestim-mung der WBC und PLT mittels sieben 9 ml K3-EDTA antikoagulierten Blutproben-röhrchen vorgenommen. Im ersten Zentrifugationsschritt erfolgte bei einer Ge-schwindigkeit von 300 g über 15 Minuten bei Raumtemperatur die Trennung des leu-kozyten- und thrombozytenreichen Überstandes vom erythrozytenreichen Sediment.
Der Überstände wurden abpipettiert und erneut bei Raumtemperatur, 300 g und über 15 min zentrifugiert, das Sediment wurde hingegen verworfen. Der zellarme Über-stand wurde nach dem zweiten Zentrifugationsschritt abgenommen und ebenfalls verworfen. Das entstandene Sediment wurde mit physiologischer Kochsalzlösung (0
% Pool) vermischt und eine Konzentration von 25,4 x109 Zellen/l eingestellt.
Die Überprüfung der Linearität und Verschleppung erfolgte direkt im Anschluss, nach den gleichen Kriterien wie oben für das rote Blutbild beschrieben. Die Protokolle zur Anreicherung der RBC, HGB, WBC und PLT stammen aus eigenen umfangreichen Vorversuchen, die der optimalen Separation und daraus folgenden Anreicherung der Zellen dienten.
3.5.2.1 Statistik, Linearität und Carry-over beim ADVIA 2120
Der F-Test (Varianzquotiententest) zur Überprüfung der Linearität konnte aufgrund der geringen Varianz der Wiederholungsmessungen bei einzelnen Verdünnungsstu-fen nicht angewendet werden. Alternativ fand daher eine Korrelationsanalyse unter Angabe des Korrelationskoeffizienten r und der Hauptkomponentengerade (Haupt-komponentengleichung y = mx + b) statt.
Die Berechnung der Verschleppung % (carry-over) erfolgte nach folgender Formel (WATSON u. DAVIS 1987):
( n1 - n 2 / H ) 100
n1 = arithmetischer Mittelwert 0 % Pool 1; n2 = arithmetischer Mittelwert 0 % Pool 2;
H = arithmetischer Mittelwert 100 % Pool
Werte von 0,25 % sollten bei modernen Hämatologiesystemen nicht überschritten werden (BOLLINGER et al. 1987).
3.5.3 ADVIA 2120 Einstellung und Kalibrierung
Die mit EDTA antikoagulierten Blutproben der Rhesusaffen wurden unter der Einstel-lung „Rhesus“ der Multi-Spezies-Software und den Testanforderungen
„CBC/Diff/Reti“ (kleines Blutbild/Differentialblutbild/Retikulozyten) gemessen. Es er-folgte eine einmalige Analyse, die gespeichert und gleichzeitig ausgedruckt wurde.
Die gleichen Einstellungen und Parameter wurden für den Weißbüschelaffen ge-wählt.
Die Qualitätskontrolle vor den eigentlichen Messungen erfolgte mittels drei unter-schiedlich konzentrierter Kontrollblutproben humanen Ursprungs der Firma Siemens Healthcare. Die Kalibrierung des Hämatologiesystems ADVIA 2120 mittels entspre-chendem optischen Testmaterial (ADVIA TESTpoint), Kalibrator (ADVIA OPTIpoint) und frischen humanen Vollblutproben wurde durch das technische Personal der Fir-ma Siemens Healthcare durchgeführt.
3.5.4 Manuelle Leukozytendifferenzierung
Die Differenzierung der WBC erfolgte anhand luftgetrockneter Blutausstriche, die mit-tels der panoptischen Färbung nach Pappenheim gefärbt wurden. Diese beinhaltete zunächst 5 min in einer gebrauchsfertigen May-Grünwald-Lösung, der eine 1-minütige Spülung in Aqua bidest folgte. Als dritter Schritt erfolgte eine Gegenfärbung mit 1:20 verdünnter Giemsa-Lösung und eine abschließende Spülung mit Aqua bi-dest. Nach erneuter Lufttrocknung wurden die Ausstriche mit Entellan® eingedeckt.
Zur Differenzierung wurden 200 WBC ausgezählt und in % umgerechnet.
3.5.5 Manuelle Hämatokritbestimmung
Mittels einer Doppelbestimmung erfolgte die Hämatokrit-Bestimmung unter zur Hilfe-nahme einer Zentrifuge, Kapillarröhrchen und einer Ableseschablone. Die Bestim-mung der Proben von August 2012 bis zum Anfang März 2014 erfolgte mittels der Mikrohämatokritzentrifuge Compur 1100. Die Laufzeit konnte nicht variabel einge-stellt werden und betrug circa 10 min bei einer maximalen Geschwindigkeit von 5000 U/min. Proben, welche danach genommen worden sind, wurde mit der Mikrohämato-kritzentrifuge Haematokrit 210 der Firma Hettich gemessen. Die Zentrifugation wurde bei 130 RPM über 7 min durchgeführt. Die Angabe erfolgte in %. Der Wechsel der Zentrifugen beruht auf einem Motorschaden des ersten Modells.
3.5.6 Retikulozytenbestimmung (Supravitalfärbung)
Zur Darstellung der Retic wurden 100 µl Blut mit der gleichen Menge einer ge-brauchsfertigen 1%-igen Brillantkresylblaulösung der Firma Sarstedt vermengt, nach einer 20-minütiger Reaktionszeit erneut gemischt und ein Ausstrich angefertigt. Die-ser wurde nach Lufttrocknung mit Entellan® eingedeckt.
Zur Ermittlung der Retikulozytenanzahl wurden je Ausstrich 1000 RBC ausgezählt und differenziert. Die Angabe der Anzahl der Retic erfolgt sowohl in % als auch als absolute Zahl bezogen auf die gesamte Erythrozytenzahl.