Dissertation
( D r . m e d . )
T e c h n i s c h e U n i v e r s i t ä t M ü n c h e n , K l i n i k u m r e c h t s d e r I s a r
Fakultät für Medizin
Lehrstuhl für diagnostische und interventionelle Radiologie
Monozyten- Subpopulationen als Biomarker der Peripheren Arteriellen Verschlusskrankheit
Teresa Maria Aschenbrenner
Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Medizin der Technischen
Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Medizin genehmigten Dissertation.
Vorsitzender: Prof. Dr. Jürgen Schlegel
Prüfer der Dissertation:
1. Prof. Dr. Ernst J. Rummeny 2. Priv.-Doz. Dr. M. Wildgruber
Die Dissertation wurde bei der Technischen Universität München eingereicht und durch die Fakultät für Medizin am 28.03.2018 angenommen.
Inhaltsverzeichnis
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ... 7
1. EINFÜHRUNG ... 9
1.1. EPIDEMIOLOGIE DER PERIPHEREN ARTERIELLEN VERSCHLUSSKRANKHEIT ...9
1.2. DEFINITION UND KLINIK ... 11
1.3. DIAGNOSTIK... 13
1.3.1 Anamnese, Inspektion, Palpation und Auskultation ... 13
1.3.2 Knöchel- Arm – Index (ABI) ... 14
1.3.3 Zehendruckmessung (TBI) ... 15
1.3.4 Bildgebende Verfahren ... 15
1.3.5 Zusatzuntersuchungen ... 16
1.4. KLASSIFIKATION ... 17
1.5. THERAPIE ... 18
1.6. AUSBLICK ... 21
2. GRUNDLAGEN ... 23
2.1MONOZYTEN IN DER ATHEROSKLEROSE ... 23
2.2MONOZYTEN/MAKROPHAGEN ... 27
2.3MONOZYTENSUBPOPULATIONEN ... 28
2.3.1 Monozytensubpopulationen bei der Maus... 29
2.3.2 Monozytensubpopulationen beim Menschen ... 31
2.4MONOZYTENSUBPOPULATIONEN ALS BIOMARKER ... 32
3. FRAGESTELLUNG DER ARBEIT ... 33
4. MATERIAL UND METHODEN ... 34
4.1STUDIENDESIGN UND STUDIENABLAUF ... 34
4.2.REKRUTIERUNG DER PATIENTEN... 35
4.3.PATIENTENANAMNESE UND DIAGNOSTIK ... 36
4.4.BLUTENTNAHME FÜR DIE STUDIE ... 37
4.5.PROBENAUFBEREITUNG UND DURCHFLUSSZYTOMETRIEANALYSE ... 38
4.6.AUSWERTUNG ... 40
4.7.STATISTIK ... 41
5. ERGEBNISSE ... 42
5.1DEMOGRAPHISCHE DATEN ... 42
5.2LEUKOZYTEN– UND MONOZYTENZAHL ... 44
5.3.VERTEILUNG DER MONOZYTENSUBPOPULATIONEN ... 48
5.4.PHÄNOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG DER MONOZYTENSUBPOPULATIONEN ... 52
5.4.1.Marker 𝐶𝑋3𝐶𝑅1 ... 52
5.4.2. Marker CCR2... 54
5.4.3. Marker CD11b ... 56
5.4.4. Marker CD106 ... 58
5.4.5. Marker CD 162 ... 60
5.4.6. Marker MPO ... 62
6. DISKUSSION... 64
6.1.DEMOGRAFISCHE DATEN ...64
6.2.MONOZYTEN UND MONOZYTENSUBPOPULATIONEN ...66
6.3.PHÄNOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG DER MONOZYTENSUBPOPULATIONEN ...71
6.4.METHODENKRITIK ...75
6.6AUSBLICK ...78
7. ZUSAMMENFASSUNG ... 81
8. DANKSAGUNG ... 83 9. ABBILDUNGSVERZEICHNIS ... 84 10. LITERATURVERZEICHNIS ... 85
Abkürzungsverzeichnis
AAA Abdominales Aortenaneurysma
ACE Angiotensin Converting Enzym
ABI Ankle brachial index, Knöchel-Arm Index
CCR chemokine C-C motif receptor
CD cluster of differation
𝐶𝑋3𝐶𝑅1 chemokine C-X3-C motif receptor 1
𝐶𝑋3𝐶𝐿1 chemokine C-X3-C motif ligand 1
CFA Communis femoral Arterie
CIA Communis iliacal Arterie
CLI critical limb ischemia
CRP C-reaktives Protein
CRT Computerresonanztomographie
Cy Cyanin
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DMSO Dimethylsulfoxid
DPBS Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline
DAS Digitale Subtrakitonangiographie
EIA External iliacal Arterie
Em-Max Emissionmaximum
Ex-Max Exzitationmaximum
FACS fluorescence-activated cell sorting;
Durchflusszytometrie
FCS fetal culf serum
FcγIII FcγIII Rezeptor
FITC Fluoresceinisothiocyanat
FKDSs Farbkodierte Dopplersonsographie
FWS forward scatter; Vorwärtsstreulicht
GM-CSF granulocyte macrophage colony-stimulating
factor
GR1 granulocyte differentiation antigen 1
HbA1c Hämoglobin A1c
HDL high density lipoprotein
i.a. intraarteriell
IL Interleukin
ILDL intermediate density lipoprotein
iNOS inducible Stickstoffmonoxid-Synthase
IQR Inter- Quartilen Range
LPS Lipopolysaccharid
Ly6C lymphocyte antigen 6C
KHK Koronare Herzkrankheit
LSM Lymphozyten Seperationsmedium
MAC-1 Makrophagen 1-Antigen
MCP-1 monocyte chemoattractant protein 1
M-CSF macrophage colony stimulating factor
MFI Mean Flow Intensity
MIP-1α macrophage inflammatory protein-1α
MMP Matrix Metalloproteinasen
MRT Magnetresonanztomographie
MPO Myeloperoxidase
NK Natürliche Killerzellen
NSTEMI Nicht ST Hebungsinfarkt
pAVK periphere arterielle Verschlusskrankheit
PD-1 Programmed Cell Death 1 Protein
PE Phycoerythrin
PerCP Peridinin Chlorophyll
PI Propidium Iodid
PSGL-1 P-selectin glycoprotein ligand-1
PTA perkutane transluminale Angioplastie
rpm rotation per minute
SCC side scatter; Seitwärtsstreulicht
STEMI ST Hebungsinfarkt
TAE Thrombaterienektomie
TAH Thrombozytenaggregationshemmer
TASC trans-atlantic inter-society consensus
document on management of arterial disease
TcPO2 Transkutane Sauerstoffpartialdruckmessung
TBI Toe brachial index, Zehen-Arm Index
TNF-α Tumornekrosefaktor α
VCAM-1 vascular cell adhesion molecule-1
VEGF vascular endothelial growth factor
VLDL very low density lipoprotein
V450 Violet 450
1. Einführung
1.1. Epidemiologie der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit
In Industrienationen nimmt die Bedeutung der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit (pAVK) nicht nur wegen des demografischen Wandels, sondern auch durch eine gewisse Lebensstiländerung, immer weiter zu. Der Lebensstil in einer Industrienation ist durch einen Mangel an Bewegung, durch Fehlernährung, durch Stress und hohem Konsum an Alkohol und Nikotin charakterisiert. Dies führt zu einer Zunahme der kardiovaskulären Risikofaktoren.
Zahlreiche epidemiologische Studien zeigen eine Gesamtprävalenz der pAVK von 3-10%. (Criqui, M.H., Fronek, A., et al. 1985) Ab einem Alter von 70 Jahren steigt die Prävalenz auf 15-20% an. (Criqui, M.H., Fronek, A., et al. 1985) Dabei sind Männer unter 75 Jahren häufiger betroffen als Frauen. Ab etwa 75 Jahren ist die Prävalenz bei Frauen höher als die der Männer. (Diehm, C., Schuster, A., et al., 2004) In der getABI Studie in Deutschland zeigt sich eine pAVK Prävalenz von 20% bei den über 60jährigen und sogar 30% bei den über 80jährigen. Die Inzidenz der über 65jährigen nach sieben Jahren Beobachtung ist 12,9%. (Krause, D., Burghaus, I., et al., 2016) Die signifikanten kardiovaskulären Risikofaktoren in dieser Studie sind Rauchen, Diabetes mellitus, hohe LDL Lipoproteine, hohes CRP Level, Abnahme der glomerulären Filtrationsrate und ein hohes Homocystein.
Krause, D., Burghaus, I., et al., 2016) Die PARTNERS Studie der USA zeigt eine Gesamtprävalenz bei Risikopatienten (≥70 Jahre oder 50-69 Jahre mit Rauchen oder Diabetes) von 29%. (Hirsch, A.T., Criqui, M.H., et al. 2001) Eine genaue Anzahl der asymptomatischen Patienten in der Bevölkerung ist aber ungewiss, sodass die Erkrankungshäufigkeit eher unterschätzt wird.
Das pAVK Risiko steigt um mehr als das Doppelte bei afroamerikanischen Patienten (nicht hispanischer Herkunft). (Criqui, M.H., Vargas, V., et al., 2005) Der
Unterschied kann nicht alleine durch das stärkere Vorhandensein von Risikofaktoren erklärt werden.
Patienten mit einer pAVK haben ein erhöhtes kardiovaskuläres Co- Morbiditätsrisiko und damit eine höhere kardiovaskuläre Gefährdung. (Diehm, C., Schuster, A., et al., 2004) Die Atherosklerose mit ihren Folgeerkrankungen führt die Mortalitätsstatistik der 30- bis 65jährigen mit 30% der Todesfälle an. Im höheren Alter steigen die Todesfälle durch Atherosklerose und ihren Folgeerkrankungen sogar noch auf 50% an. (Baretton, G.B., Kirkpatrick, C.J., et al.
2008)
1.2. Definition und Klinik
Die periphere arterielle Verschlusskrankheit ist gekennzeichnet durch eine progrediente Stenosierung bzw. Okklusion arterieller Gefäße der oberen und unteren Extremitäten, wobei letztere deutlich häufiger betroffen sind. Man unterscheidet einen langsamen, chronischen Krankheitsverlauf von einer akuten peripheren Durchblutungsstörung, die meist durch einen thromboembolischen Gefäßverschluss verursacht wird.
Am häufigsten entsteht die pAVK auf der Grundlage atherosklerotischer Gefäßveränderungen, welche sich im gesamten peripheren arteriellen Versorgungssystem manifestieren können (ca. 95%). Traumatische Verschlüsse, Vaskulitiden und muskuläre Kompressionsyndrome (Entrapment) sind seltener für eine pAVK verantwortlich (ca. 5%).(Duvall, V.L, Vorchheimer, D.A., 2004) Mit zunehmendem Lebensalter werden entzündliche, genetische und traumatische Ursachen seltener, wohingegen thromboembolische Ereignisse häufiger auftreten. (Hirsch, A.T., Haskal, Z.J., et al. 2006) Die Atherosklerose ist eine chronische inflammatorische Erkrankung der Arterienwand und der zugrundeliegende Mechanismus bei der Entstehung von kardiovaskulären Komplikationen, wie Herzinfarkt, Schlaganfall und periphere Verschlusskrankheit.
Bei einem Großteil der Patienten sind die unteren Extremitäten mit den Becken- Beinarterien betroffen. Die Läsionen sind dabei zu ca. 50% in der A. femoralis, zu ca. 30% in den Beckenarterien und zu ca. 20% in den Arterien des Unterschenkels lokalisiert. (Norgren, L., Hiatt, W.R., et al., 2007) Bei einem längeren Fortbestehen der Erkrankung sind häufig auch mehrere Segmente betroffen. Die Kombination von femorpopliteal und cruralen Läsionen sind bei einer Mehretagen- pAVK am häufigsten. (Ozkan, U., Oguzkurt, L., et al., 2009)
Das Kardinalsymptom der Erkrankung ist die Claudicatio intermittens, ein reproduzierbarer, belastungsabhängiger ischämischer Muskelschmerz, der in Ruhe häufig rasch rückläufig ist. Die klinische Erhebung dieses Symptoms ist
allerdings nicht spezifisch für eine tatsächliche pAVK Manifestation.
Kompressionssyndrome des Spinalkanals können ähnliche Symptome erzeugen und sind klinisch teils nur schwer von der Claudicatio intermittens abzugrenzen.
Zu Ruheschmerzen kommt es häufig erst im fortgeschrittenen Stadium. Nur etwa ein Viertel der Patienten mit Claudicatio intermittens werden sich im klinischen Verlauf drastisch verschlechtern und können eine kritische Beinischämie entwickeln. (Norgren, L., Hiatt, W.R., et al., 2007)
Einflüsse auf die Erkrankung haben die klassischen kardiovaskulären Risikofaktoren Nikotinabusus, Diabetes mellitus, arterieller Hypertonus und Fettstoffwechselstörung. In der Edinburgh Artery Studie wurde gemessen, dass das relative Risiko bei Rauchern vierfach erhöht ist, eine Claudicatio intermittens zu entwickeln. (Norgren, L., Hiatt, W.R., et al., 2007) Das Risiko für eine pAVK erhöht sich bei Diabetespatienten um ca. 30% für jede Erhöhung des HbA1c Wertes um 1%. (Muntner, P., Wildman, R.P., et al. 2005) In der Framingham Studie wurde ein erhöhter Cholesterinspiegel mit der Verdopplung der Inzidenz einer Claudicatio intermittens assoziiert. Ein direkter Zusammenhang besteht zwischen dem erniedrigten gesamten HDL und dem Auftreten der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit. (Kannel, W.B., Castelli, W.P., et al., 1979) In einer anderen Studie haben Patienten mit einer pAVK signifikant erhöhte Werte für Triglyceride, VLDL, IDL und erniedrigte Werte für HDL gezeigt. (Senti, M., Nogues, X., et al., 1992) Die Hypertonie wird mit allen kardiovaskulären Erkrankungen assoziiert, obwohl das relative Risiko für eine pAVK geringer angesehen wird als Rauchen oder Diabetes. (Norgren, L., Hiatt, W.R., et al., 2007)
1.3. Diagnostik
Im klinischen Alltag ist es vor allem schwierig die asymptomatischen Patienten zu identifizieren. Ungefähr jeder vierte asymptomatische Patient wird durch rein nicht- invasive Untersuchungsmethoden falsch diagnostiziert. (Fowkes, F.G., Housley, E., et al., 1991) Eine Früherkennung ist somit häufig nicht möglich.
Zusätzlich ist zu beachten, dass die Gesamtmortalität und die kardio- und zerebrovaskuläre Mortalität bei asymptomatischen und symptomatischen Patienten mit pAVK gleich hoch ist. (Diehm, C., Allenberg, J.R., et al 2009) Damit ist eine Früherkennung der pAVK sinnvoll.
1.3.1 Anamnese, Inspektion, Palpation und Auskultation
Zu Beginn der Diagnostik stehen die Anamnese und die klinische Untersuchung.
Dabei ist zu beachten, dass über zwei Drittel der Patienten klinisch asymptomatisch sind oder atypische Symptome bieten. (Hirsch, A.T., Criqui, M.H., et al. 2001) Eine sehr genaue Befunderhebung ist unerlässlich.
Bei der Inspektion spielen das Hautcolorit, die Hauttemperatur, trophische Störungen, Nekrosen und Gangrän eine wichtige Rolle. Die Ratschow Lagerungsprobe kann eine Claudicatio Symptomatik hervorrufen und liefert eine erste Einschätzung des funktionellen Ausmaßes der pAVK.
Der periphere Pulsstatus wird erhoben, wobei auf eine Pulsabschwächung oder auf einen Pulsverlust geachtet wird. Ein Pulsverlust wird jedoch erst bei einer Lumeneinengung von mehr als ca. 90% festgestellt. Bei der Auskultation achtet der Untersucher auf ein Strömungsgeräusch, welches bei ca. 60-70%
Lumeneinengung entstehen kann. (Baretton, G.B., Kirkpatrick, C.J., et al., 2008) Der Pulsstatus alleine hat eine geringe Sensitivität für das Erkennen einer pAVK, deshalb ist eine Auskultation unverzichtbar. Die Basler Studie zeigt, dass eine Claudicatio Anamnese zusammen mit seitenvergleichendem Pulsstatus der Beine und Auskultation 84% der Stenosen bei einer pAVK erfassen können. (Hartmann, G., Stahelin, H.B., 1980)
1.3.2 Knöchel- Arm – Index (ABI)
Eine der wichtigsten Untersuchungen ist die ABI (Ankle-Brachialis-Index) Messung. Der Index ist der Quotient von Dopplerdruckmessung am distalen Unterschenkel (A. tibialis, A. dorsalis pedis, ggf. A. fibularis) zur systolischen Blutdruckmessung am Oberarm. Er soll sowohl in Ruhe, als auch nach standardisierter Belastung bestimmt werden.
Normwerte liegen zwischen 0,9-1,3. Eine leichte PAVK findet man bei 0,75-0,9, eine mittelschwere PAVK bei 0,5-0,75 und eine schwere PAVK bei ˂0,5. Bei Werten von ˃1,3 besteht der Verdacht auf eine Mediasklerose, sodass die Messung hier nicht valide ist. (Lawall, H., Diehm, C., et al., 2009) Die Diagnose der pAVK wird bei einem Grenzwert von ˂ 0,9 gestellt. ABI Werte von ˂ 0,9, gemessen in Ruhe, zeigen eine mindestens 50%ige Gefäßstenose (Sensitivität 95%, Spezifität 100%).
(Xu, D., Zou, L., et al., 2013)
Eine Abnahme des ABI Wertes um 15-20% nach standardisierter Belastung, im Vergleich zum Ruheausgangswert, ist beweisend für die pAVK. (Hoogeveen, E.K., Mackaay, A.J., et al., 2008)
Asymptomatische Patienten mit ABI Werten von ˂ 0,9 zeigen in der getABI Studie eine höhere Gesamtmortalität mit schweren kardiovaskulären Ereignissen (Herzinfarkt, Schlaganfall, Tod) auf. (Krause, D., Burghaus, I., et al., 2016)
ABI-Wert Schweregrad der pAVK
˃1,3 Falsch hohe Werte mit Verdacht auf Mediasklerose
˃0,9 Normalbefund
0,75-0,9 Leichte pAVK
0,5-0,75 Mittelschwere pAVK
˂0,5 Schwere pAVK (kritische Ischämie)
Abbildung 1 ABI Werte zur Abschätzung des Schweregrads der pAVK (Lawall, H., Diehm, C., et al., 2009)
1.3.3 Zehendruckmessung (TBI)
Bei falsch hohen ABI Werten mit Verdacht auf eine Mediasklerose der Unterschenkelarterien bietet sich an den TBI (Toe-Brachial-Index) zu bestimmen, da die Mediasklerose die Zehenarterien weniger betreffen. Der Index beschreibt das Verhältnis von systolischer Blutdruckmessung an der Großzehe zum Oberarm. Der Zehendruck beträgt ca. 30mmHg weniger als der systolische Knöcheldruck und der TBI Normwert liegt bei ˃0,7. (Lawall, H., Diehm, C., et al., 2009)
1.3.4 Bildgebende Verfahren
Die einfachste Bildgebung erfolgt mit der farbkodierten Duplex Sonographie und Messung der Strompulskurve. Eine gute duplexsonographische Beurteilbarkeit der Gefäße vor einer Angiographie mit Interventionsbereitschaft ist als alleinige bildgebende Diagnostik ausreichend. Eine retrospektive Auswertung von intraoperativen DSA Bildern zeigte eine Sensitivität von 97% und eine Spezifität von 98% der FKDS als alleinige diagnostische bildgebende Methode zur Therapieplanung und -entscheidung, bezüglich einer Bypass OP oder einer endovaskulären Therapie. (Bostrom, A., Karacagil, S., et al., 2001)
Weiterführende bildgebende Verfahren, wie die Magnetresonanzangiographie, die Computertomographische Angiographie und die intraarterielle digitale Subtraktionsangiographie sind bei nicht eindeutigen duplexsonographischen Befunden notwendig. Aufgrund zunehmender Sensitivität und Spezifität wird die i.a. DSA als rein diagnostische Maßnahme immer mehr von MR und CT Angiographie abgelöst. Die i.a. DSA hat Vorteile bei der Erkennung von In- Stent- Thrombosen durch ihre Kombination mit Dopplerfrequenzspektralanalysen und man kann, neben der Diagnostik, interventionelle Maßnahmen in der gleichen Sitzung durchführen. (Lawall, H., Diehm, C., et al., 2009)
1.3.5 Zusatzuntersuchungen
Zusätzliche Parameter werden bei nicht eindeutigen Untersuchungsbefunden herangezogen.
Die Mitbeurteilung des Dopplerfrequenzspektrums konnte bei einem Drittel der Patienten mit normalen Ruhe- und Belastungs-ABI Werten eine pAVK erkennen.
(Hoogeveen, E.K., Mackaay, A.J., et al., 2008) Patienten mit signifikanten aortoiliacalen Läsionen zeigen häufig monophasische Dopplerfrequenzkurven an der Arteria femoralis communis. Der prädiktive Wert lag bei 92%. (Spronk, S., den Hoed, P.T., et al., 2005)
Die Pulskurvenform bei der Oszillographie kann Durchblutungsstörungen, vor allem bei der Mediasklerose, zeigen.
Bei einer kritischen Extremitätenischämie kann zusätzlich eine transkutane Sauerstoffpartialdruckmessung erfolgen, um das Amputationsrisiko abzuschätzen. TcPO2 Werte von ˂30mmHg sind kennzeichnend für eine kritische Extremitätenischämie. Bei tcPO2 Werten von ˂10mmHg besteht ein Amputationsrisiko von 70%. (Spronk, S., den Hoed, P.T., et al., 2005)
1.4. Klassifikation
Die klinische Einteilung der Stadien der Erkrankung erfolgt in Europa meist nach der Fontaine Klassifikation, im angloamerikanischen Raum sowie in der englischsprachigen Fachliteratur werden die unterschiedlichen Schweregrade nach Rutherford klassifiziert.
Die klinischen Stadien werden auch mit den Begriffen asymptomatisch, Claudicatio intermittens, Ruheschmerz und im Spätstadium mit kritischer Extremitätenischämie (critical limb ischemia, CLI) bezeichnet.
Klassifikation nach Fontaine Klassifikation nach Rutherford
Stadium Klinisches Bild Grad/
Kategorie
Klinisches Bild
I asymptomatisch 0/0 asymptomatisch
II Claudicatio intermittens
>200m Stadium IIa
<200m Stadium IIb
I/1 Geringe Claudicatio intermittens I/2 Mäßige Claudicatio intermittens I/3 Schwere Claudicatio
intermittens
III Ruheschmerzen II/4 Ruheschmerzen
IV Ulkus, Gangrän III/5 Kleinflächige Nekrose
III/6 Großflächige Nekrose Abbildung 2 Klassifikationen der arteriellen Verschlusskrankheit
Eine morphologische Einteilung der Läsionen wurde erstmals durch die Trans- Atlantic Inter-Society Consensus Working Group (TASC) im Jahr 2000 durchgeführt und 2007 und 2015 aktualisiert.(Norgren, L., Hiatt, W.R., et al., 2007;
TASC 2000; Committee, T.S., Jaff, M.R., et al., 2015) Aus der Morphologie und Ausdehnung der Läsionen ergeben sich entsprechende Therapieempfehlungen.
Dabei wird grundsätzlich in Läsionen der aorto-iliacalen, femoro-poplitealen und infrapoplitealen Region unterschieden.
1.5. Therapie
Die Therapie der pAVK erfolgt stadiengerecht und symptomorientiert und umfasst konservative, medikamentöse, sowie invasive Therapiemöglichkeiten.
Ziel der Behandlung ist es, die Symptomatik zu lindern, eine erhöhte Belastbarkeit und Lebensqualität zu erreichen und das Fortschreiten der Erkrankung zu verhindern. Im Stadium I nach Fontaine sollte auf die Risikoreduktion von kardiovaskulärer Erkrankungen geachtet werden, wohingegen im Stadium II nach Fontaine die symptomatische Besserung der schmerzfreien und maximalen Gehstrecke und der Erhalt der Mobilität im Vordergrund stehen. Im Stadium III und IV (kritische Extremitätenischämie) nach Fontaine ist vor allem der Extremitätenerhalt bei kritischer Extremitätenischämie an oberster Stelle.
Wichtig ist die Beseitigung möglichst vieler Risikofaktoren, wie eine Gewichtsreduktion bei Übergewicht, die Nikotinkarenz bei Rauchern und die Behandlung der arteriellen Hypertonie, Hypercholesterinämie und Diabetes mellitus. Ausschließlich konservative Therapiemaßnahmen, ohne operative Versorgung, bieten sich für die Anfangsstadien der Erkrankung ohne Ischämiezeichen an, wohingegen endovaskuläre und operative Verfahren bei fortgeschrittenen Stadien mit hämodynamisch relevanter, peripherer Durchblutungseinschränkung eingesetzt werden. Eine konservative Maßnahme bietet das standardisierte Gehtraining zur Förderung der Kollateralenbildung und Verbesserung der Mikrozirkulation. Lokale Maßnahmen umfassen eine sorgfältige Fußpflege, die Prophylaxe und konsequente Therapie von Verletzungen, um trophische Läsionen zu minimieren.
Die medikamentöse Therapie ist eine wichtige Begleitmaßnahme in allen Stadien, vor allem zur Behandlung der Risikofaktoren. Es gilt eine optimale medikamentöse Einstellung von Fettstoffwechsel, der Hypertonie und des Diabetes mellitus zu erreichen. In der Langzeitanwendung können Thrombozytenaggregationshemmer (ASS, Clopidogrel) das Risiko kardiovaskulärer Ereignisse und Mortalität um ca. 20% reduzieren. (Collaborative overview, Antiplatelet Trialists‘ Collabaration, 1994) Andere Antikoagulanzien sind nicht standardmäßig für die Langzeittherapie indiziert. Ebenso führt eine
Blutdrucksenkung (ACE Hemmer, Calciumantagonisten, Betablocker) (Zielwert
<140/90 (Mancia, G., Fagard, R., et al. 2013)), eine Diabetes Therapie (HbA1c Zielwert 6,5-7,5% (Authors/Task Force, M., Ryden L., et al., 2013)) und eine Senkung des Cholesterinwertes (Statine) (LDL <70-100mg/dl (Authors/Task Force, M., Catapano, A.L., et al., 2016)) zu einer Reduktion der kardiovaskulären Mortalität. (Bendermacher, B.L., Willigendael, E.M. et al. 2015) Studien konnten bei Patienten mit Claudicatio zeigen, dass Blutdruckmedikamente (ACE Hemmer) und Cholesterinsenker (Statine) die maximale schmerzfreie Gehstrecke und die ABI Werte verbessern. (Shahin, Y., Cockcroft, J.R., et al., 2013; Momsen, A.H., Jensen, M.B., et al. 2009) Die STENO 2 Studie zeigte bei Patienten mit Diabetes Typ II unter intensivierter Behandlung (Diabeteseinstellung, Statintherapie und Thrombozytenfunktionshemmer) eine Reduktion der Amputationsrate um 25%
und eine Verminderung der Anzahl von vaskulärer Eingriffe um 10% innerhalb von 7 Jahren. (Gaede, P., Vedel, P., et al., 2003)
Zur Symptomverbesserung der Claudicatio intermittens eignet sich auch Cilostazol, alternativ zu Naftidrofuryl. Cilostazol ist ein Phoshpodiesterase III- Hemmer und führt zu einer Vasodilatation mit metabolischer und plättchenhemmender Aktivität. (Norgren, L., Hiatt, W.R., et al. 2007) Die kardiovaskuläre Mortalität wird durch Cilostazol aber nicht verbessert. (Pratt, C.M., 2001) Naftidrofuryl verbessert bei Patienten mit Claudicatio intermittens die schmerzfreie Gehstrecke um ca. 37%. (de Backer, T.L., Vander Stichele, R., et al., 2012)
Zu den invasiven Maßnahmen zählen minimalinvasive Katheterverfahren und die operativen Maßnahmen zur Revaskularisation, sowie Hybrideingriffe. Die perkutane transluminale Angioplastie (PTA) mit Ballondilatation und die Stentimplantation sind minimal-invasive Methoden. Eine operative Revaskularisation wird durch die Thrombendarterienektomie und die Bypass Operation erreicht. Die oben genannten TASC Klassifikation gibt Anhaltspunkte, welche Therapiemaßnahme indiziert ist. Sowohl aortoiliacal, als auch femoropopliteal werden TASC A und B Läsionen vorzugsweise mittels endovaskulären Verfahren therapiert. TASC C und D machen häufig eine operative Versorgung notwendig. (Norgren, L., Hiatt, W.R., et al. 2007) Gleichzeitig ist im
klinischen Alltag ein zunehmender Trend zu endovaskulären Therapieansätzen auch für die TASC C und D Läsionen zu verzeichnen.
Maßnahmen
Fontaine Stadium I II III IV
Konservative Therapie
z.B. strukturiertes Gehtraining, Fußpflege
+ + + +
Risikofaktorenreduktion
Nikotinkarenz, Diabetestherapie, Statine, Bluthochdruckbehandlung
+ + + +
Thrombozytenaggregationshemmer ASS oder Clopidogrel
(+) + + +
Medikamentöse Therapie Cilostazol oder Naftidrofuryl
+
Strukturierte Wundbehandlung
+
Interventionelle Therapie
(+) + +
Operative Therapie
(+) + +
Abbildung 3 Stadiengerechte Behandlung der pAVK in Abhängigkeit der Fontaine Klassifikation; + klinische Nutzen nachgewiesen, (+) Einzelfallentscheidung (Lawall, H., Diehm, C., et al., 2009)
1.6. Ausblick
Trotz stetiger Verbesserung der interventionellen und pharmakologischen Therapien bleibt die Atherosklerose mit ihren Komplikationen Haupttodesursache in den Industrienationen. Um eine bedarfsgerechte Therapie der Atherosklerose zu etablieren, braucht es ein grundlegenderes Verständnis der zellulären und molekularen Pathogenese. Die Akkumulation und die stetige Rekrutierung von Leukozyten führen zu einem Voranschreiten der atherosklerotischen Plaqueentwicklung in Gefäßen. In den letzten Jahren wird angenommen, dass Monozyten sowohl bei der initialen Plaquebildung, als auch für den Progress atherosklerotischer Läsionen, eine Schlüsselrolle einnehmen.
(Hilgendorf, I., Swirski, F.K., 2012) Dieser Prozess unterliegt ständigen zellulären Interaktionen, welche sich auf das Plaquewachstum und -abbau, bis hin zur Destabilisierung auswirken können. Kritische Ischämien entstehen bei einer zu starken Gefäßeinengung oder bei Plaqueruptur mit Verlegung des nachfolgenden arteriellen Stromgebiets. Der Einfluss der Monozyten bei der Bildung von instabilen, atherosklerotischen Gefäßläsionen bedeutet eine große klinische Relevanz für die Plaquedestabilisierung und -ruptur. (Ghattas, A., Griffiths, H.R., et al., 2013) Monozyten bilden eine heterogene Gruppe, bei der einzelne Subpopulationen dedizierte molekulare und zellbiologische Eigenschaften aufweisen. Die Subpopulationen spielen eine entscheidende Rolle bei der Bildung und dem Voranschreiten von atherosklerotischen Gefäßläsionen. (Hilgendorf, I., Swirski, F.K., 2012; Libby, P., Nahrendorf, M., et al., 2013)
Neben dem Herzinfarkt und dem Schlaganfall, ist die pAVK die klinische Hauptmanifestationsart der Atherosklerose. Die pAVK führt zu einer intermittierenden Claudicatio und Extremitätenischämie, welche sich bis zu einer Nekrose oder Gangrän weiterentwickeln kann. Eine Amputation stellt dann häufig, vor allem bei Diabetikern, die letzte Therapieoption dar. Laut Studien ist das klinische Ergebnis bei kritischer Extremitätenischämie, welche sich in einem höheren Rutherfordstadium widerspiegelt, eher frustran und führt zu einer höheren Amputationsrate. Zusätzlich bedeutet ein höheres Rutherfordstadium eine erhöhte Anzahl an Herzinfarkten, Schlaganfällen und Todesfolgen. Damit
kann die pAVK, trotz der peripheren Manifestation, als Vorhersagewert für andere kardiovaskuläre Ereignisse gesehen werden. (Reinecke, H., Unrath, M., et al., 2015)
Trotz des Beweises, dass Monozyten die Bildung und das Voranschreiten von atherosklerotischen Läsionen im peripheren Gefäßsystem beeinflussen, ist die Rolle der Monozyten und ihrer Subpopulationen bei der pAVK nicht ausreichend untersucht. In der vorliegenden Studie werden sowohl die Monozytenanzahl, als auch die Verteilung der Subpopulationen, bei Patienten mit unterschiedlicher Ausprägung der peripheren Atherosklerose der unteren Extremitäten bestimmt.
Dabei wird die Ausprägung der pAVK mit der Rutherfordklassifikation eingeteilt.
Diese Studie untersucht die Frage, ob Monozytensubpopulationen als Biomarker geeignet sind den klinischen Krankheitsverlauf der pAVK vorherzusagen. Wir wollen nachweisen, dass ein signifikanter Unterschied der Monozytensubpopulationen in den verschiedenen Stadien der pAVK besteht.
Zudem wollen wir zeigen, dass sich der Phänotyp der Monozyten ändert und dass bestimmte Schlüsselproteine an der Zelloberfläche exprimiert werden. Anhand dieser Merkmalseinteilung und der Verteilung der Monozytensubpopulationen in den verschiedenen Stadien der pAVK im peripheren Blut könnten Monozyten Biomarker für die pAVK und deren Progress darstellen.
2. Grundlagen
2.1 Monozyten in der Atherosklerose
Die Atherosklerose spielt bei der Pathogenese der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit eine Hauptrolle. Sie ist eine Erkrankung der arteriellen Gefäße und kann das gesamte Gefäßsystem betreffen. Gemäß der Weltgesundheitsorganisation WHO ist die Atherosklerose eine variable Kombination von Veränderungen der Intima und Media, bestehend aus herdförmigen Ansammlungen von Fettsubstanzen, Blut und Blutbestandteilen, Bindegewebe und Kalziumablagerungen.
Unter physiologischen Bedingungen im Gefäßsystem kommt es zu keiner Adhäsion von Zellen an das Gefäßwandendothel. Schädigende Mediatoren die mit Risikofaktoren, wie der Hypertonie, Rauchen, erhöhter Lipidspiegel, Diabetes mellitus und Entzündung assoziiert sind führen zu einer erhöhten Endothelpermeabilität durch das Auftreten von Endothelläsionen. Diese endotheliale Dysfunktion kann zu einer reversiblen Veränderung der Endothelzellen führen, die mit einer veränderten Genexpression und Proteinsynthese reagieren. Eine Endothelaktivierung kann durch Zytokine, bakterielle Faktoren oder Lipide (Bierhaus, A., Chen, J., et al., 2000), durch hämodynamischen Stress (Garcia-Polite, F., Martorell, J., et al., 2016; Valent, E.T., van Nieuw Amerongen, G.P., et al., 2016) oder durch glykosilierte Produkte (AGE) bei Diabetes mellitus (Baretton, G.B., Kirkpatrick, C.J., et al., 2008) ausgelöst werden. Aktivierte Endothelzellen können normalerweise nicht vorhandene Adhäsionsmoleküle, verschiedene Zyto- und Chemokine, Wachstumsfaktoren, vasoaktive Moleküle, MHC Moleküle, pro- und antikoagulatorische Substanzen exprimieren. Fokale Endothelzelldefekte können durch Migration und Proliferation von benachbarten Endothelzellen beseitigt werden.
Prädilektionsstellen für die Entstehung atherosklerotischer Läsionen sind Gefäßabschnitte mit Änderung der Fließeigenschaften des Blutes. An
Gefäßaufzweigungen, aber auch an Engstellen von Gefäßen entstehen turbulente Strömungen, welche eine Verlangsamung des Blutstroms bewirken. Durch eine turbulente Strömung entstehen Scherkräfte an der Gefäßwand, welche einen Endothelschaden verursachen können.
In der initialen Phase führt die endotheliale Dysfunktion zu einem Einstrom von Lipoproteine durch einen passiven Übertritt zwischen den interzellulären Verbindungen in die Intima. Teilweise werden LDL Lipoproteine oxidiert und abgelagert. HDL Lipoproteine wirken diesem Prozess durch eine lypooxygenasehemmende Untereinheit entgegen und können wieder mit Cholesterin zurück in den Blutkreislauf gelangen. Endothelaktivierung und erhöhte endotheliale Permeabilität, sowie Lipidakkumulationen führen zu einer zunehmenden Rekrutierung von proinflammatorischen Immunzellen. Sowohl das angeborene, als auch das erworbene Immunsystem sind in dieser Immunantwort involviert. (Libby, P., Ridker, P.M., et al., 2009) Das angeborene Immunsystem besteht aus Mediatoren (Granulozyten, Monozyten, Makrophagen, NK Zellen, Komplementfaktoren, Lysozyme, Interferone), die eine sofortige ungezielte Abwehrreaktion gegen inflammatorische Reize und Schädigung auslösen. Das erworbene Immunsystem (B-Zellen, T-Zellen, Antikörper, Plasmazellen) reagiert gezielt auf ein körperschädigendes Agens.
Die Entzündung fördert sowohl die Bildung, das Voranschreiten, als auch die Ruptur von atherosklerotischen Plaques. (Libby, P., Okamoto, Y., et al., 2010) Die Infiltration von Leukozyten bedingt das Voranschreiten der atherosklerotischen Läsion in der Gefäßwand. Die Aktivierung der Endothelzellen führt zu einer gesteigerten Expression von verschiedenen Leukozytenadhäsionsmolekülen und Chemokinen, die eine Adhäsion und die Diapedese von Monozyten zwischen den Endothelzellen ermöglichen. Die wichtigsten Chemokinrezeptoren/ Chemokine sind CCR2/MCP-1, 𝐶𝑋3𝐶𝑅1/Fraktalkin und CCR5/MIP-1α. (Gautier, E.L., Jakubzick, C., et al., 2009) Eine Blockade der Chemokinsignaltransduktion von CCR2/MCP-1 und 𝐶𝑋3𝐶𝑅1/Fraktalkin im Mausmodell hat zu einer signifikant reduzierten Atherosklerosebildung geführt und bei zusätzlicher Blockade von CCR5 ist eine Plaquebildung im Mausmodel kaum noch zu beobachten. (Saederup, N., Chan, L.,
et al., 2008; Caombadiere, C., Potteaux, S., et al. 2003; Lesnik P., Haskell, C.A., et al., 2003) Monozyten werden durch das Adhäsionsmolekül VCAM-1(CD106) (vascular cell adhesion molecule-1) an das Endothel gebunden. (Cybulsky, M.I., Gimbrone, M.A., Jr, 1991; Li, H., Cybulsky, M.I. et al., 1993)
MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1) ist ein chemotaktisches Zytokin, welches über den CCR2 Rezeptor am Monozyten bindet und die Diapedese in die Intima ermöglicht. (Gu, L., Okada, Y., et al., 1998; Boring, L, Gosling, J., et al., 1998) n der Intima werden die Blutmonozyten zu Makrophagen umgewandelt. Auf der Zelloberfläche der Makrophagen bilden sich Scavenger Rezeptoren aus. M-CSF (macrophage colony stimulating factor) ist einer der Faktoren, der die Umwandlung der Monozyten zu Makrophagen stimuliert und die Expression von Scavenger Rezeptoren induziert. (Rosenfeld, M.E., Yla-Herttuala, S., et al., 1992;
Clinton, S.K., Underwood, R., et al.) Oxidiertes LDL wird über den Scavenger Rezeptor von Makrophagen aufgenommen. Diese lipidbeladenen Makrophagen werden als Schaumzellen bezeichnet. Ebenso bewirken TNF α, Interferon γ aus Lymphozyten und Peroxisome Proliferator activated Rezeptor γ die Expression von Scavenger Rezeptoren auf den Makrophagen. (Zani, I.A., Stephen, S.L., et al.
2015) Die Makrophagen proliferieren in der Intima und unterhalten den Entzündungsprozess, indem sie verschiedene Wachstumsfaktoren und inflammatorische Zytokine sezernieren. Immer mehr Schaumzellen akkumulieren in der Intima. Chemokine und Interleukine rekrutieren Lymphozyten, deren Interaktion mit Makrophagen (CD40/CD40L) die Sekretion von INF γ stimuliert und damit die entzündliche Reaktion im Lipidplaque fördert.
Die entzündliche Reaktion mit Ausschüttung von Zytokinen und Wachstumsfaktoren wie Interleukin-6 und Basic-Fibroblast-Growth-Factor (bFGF) fördert die Migration von glatten Muskelzellen von der Media Richtung Intima und deren Proliferation. Angiotensin II und Homocystein können ebenfalls die Proliferation von glatten Muskelzellen stimulieren. Durch die Umhüllung der Schaumzellen mit glatten Muskelzellen entsteht eine fibröse Schicht. Der atherosklortische Plaque ist damit ziemlich stabil. Durch die Volumenzunahme wird das Gefäßlumen immer mehr eingeengt.
Im weiteren Verlauf können zahlreiche Schaumzellen zugrunde gehen und hinterlassen damit eine große Menge an freien oxidierten Lipiden. Es entsteht ein nekrotischer Kern innerhalb des atherosklerotischen Plaques.
Aus einem stabilen atherosklerotischen Plaque kann somit ein vulnerabler Plaque mit der Gefahr einer Plaqueruptur entstehen. INF γ hemmt die glatten Muskelzellen bei der Produktion von extrazellulärer Matrix. Durch die Degeneration von extrazellulärer Matrix kann es zu einer Ruptur der fibrösen Kappe des atherosklerotischen Plaques kommen. Dieser Prozess der Matrixdestabilisierung wird noch von den Makrophagen mit ihren sezenierten Proteinasen verstärkt. Makrophagen produzieren MMPs (Matrix Metalloproteinasen). MMPs degradieren stabilisierende Proteine aus dem atherosklerotischen Plaque und fördern eine Plaqueruptur. Durch die Plaqueruptur kommt der Blutstrom mit dem pro-koagulativen Tissue Factor, ebenfalls ein Produkt der Makrophagen, in Kontakt und kann eine Thrombose bilden.
2.2 Monozyten/ Makrophagen
Monozyten sind Teil des Monozyten-Makrophagen Systems mit Abstammung aus dem Knochenmark. Ihre Hauptaufgabe als Vertreter des angeborenen Abwehrsystems beinhaltet die Phagozytose und Chemokinproduktion. Die Fähigkeit der Antigenpräsentation durch Toll- like Rezeptoren auf der Zelloberfläche bildet eine Verbindung zum erworbenen Immunsystem. Das Blut eines gesunden Erwachsenen beinhaltet durchschnittlich 450 Monozyten pro Mikroliter, das sind ca. 3-7% der Gesamtleukozytenzahl. Monozyten sind die größten zirkulierenden Leukozyten im Blut und können morphologisch durch ihren nierenförmigen Kern abgegrenzt werden, obwohl eine eindeutige Zuordnung durch das variable Verhältnis von Kern zu Zytoplasma häufig schwierig ist.
Die hämatopoetische Stammzelle im Knochenmark wird durch Wachstumsfaktoren, wie den GM-CSF (Granulozyten-Makrophagen Kolonie- stimulierender Faktor) und den M-CSF (Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor), zur Bildung von Vorläuferzellen angeregt. Aus ihnen differenziert sich der Monozyt, der aus dem Knochenmark ins Blut ausgeschwemmt wird. Dort zirkulieren die Monozyten im Durchschnitt 1-3 Tage und werden entweder in der Milzpurpura gespeichert oder durch einen entzündlichen Stimulus aktiviert und in bestimmte Zielregionen, respektive -gewebe rekrutiert. Bei der Einwanderung in ein Gewebe differenzieren die Monozyten zu Makrophagen, oder Dendritischen Zellen. (Geissmann, F., Jung, S., et al., 2003)
2.3 Monozytensubpopulationen
Bereits 1979 entdeckte Gerrity et al. Monozyten als zelluläre Hauptkomponente der Atherosklerose bei Schweinen. (Gerrity, R. G., Naito, H.K., et al., 1979) Eine Reduktion der Monozyteninteraktion an der Gefäßwand durch Bisphosphonate bei Kaninchen konnte eine verminderte Bildung von atherosklerotischen Läsionen hervorrufen. (Ylitalo, R., Oksala, O., et al., 1994) Diese Entdeckungen ließen annehmen, dass Monozyten eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der Atherosklerose spielen müssen.
Monozyten wurden zunächst nur als Übergangszellen im Blut angesehen, welche sich im Gewebe zu Makrophagen und Dendritischen Zellen entwickeln, um dann ihre eigentliche Funktion ausüben zu können. Studien konnten jedoch belegen, dass Monozyten eine relativ heterogene Population sind, wobei auch die einzelnen Subpopulationen verschiedene Funktionen ausüben können.
Monozytensubpopulationen existieren sowohl bei der Maus als auch beim Menschen und spielen bei der Bildung und dem Progress von atherosklerotischen Plaques unterschiedliche Rollen. (Libby, P., Nahrendorf, M., et al., 2013)
2.3.1 Monozytensubpopulationen bei der Maus
Das Blut einer Maus beinhaltet durchschnittlich 100 Monozyten pro Mikroliter, das sind ca. 1,5% der Gesamtleukozytenzahl und damit eine deutlich geringere Proportion als beim Menschen. Mit Hilfe von Durchflusszytometrie und Mikroskopie wurden anhand der unterschiedlichen Oberflächenmarker CCR2 und CX3CR1 verschiedene Subpopulationen bei der Maus beschrieben.
Ly6Chi/Gr1+ Monozyten exprimieren vermehrt CCR2 und kaum CX3CR1 . Umgekehrt exprimieren die Ly6Clo/Gr1− Monozyten in erhöhtem Ausmaß CX3CR1, dafür CCR2 nur gering. Im Knochenmark differenzieren die Monozyten Subpopulationen aus einer hämopoetischen Stammzelle und bilden Vorläuferzellen. Es bilden sich 𝐿𝑦6𝐶ℎ𝑖 und 𝐿𝑦6𝐶𝑙𝑜 Zellen, die aus dem Knochenmark in das Blut ausgeschwemmt werden. CCR2 ist wichtig für den Übertritt der Monozyten aus dem Knochenmark in das zirkulierende Blut.
(Serbina, N.V., Pamer, E.G., 2006; Tsou, C.L., Peters, W., et al., 2007) Die Rekrutierung der Monozyten aus der Milz und die Migration aus dem Blutstrom ins Gewebe ist CCR2 unabhängig. (Serbina, N.V., Pamer, E.G., 2006) CX3CR1 reguliert die Differenzierung von glatten Muskelzellen in der Gefäßwand nach Verletzungen und trägt so zu einer Defektheilung bei. Eine Herunterregulierung des CX3CR1 Rezeptoren auf der Monozytenoberfläche der Maus führt zu einer gestörten Defektheilung der Gefäßwand und damit zu einem Gefäßleck. (Kumar, A.H., Martin, K., et al., 2013) Landsman et al. zeigte, dass die CX3CR1-CX3CL1 Interaktion weniger Apoptose von Monozyten induziert. (Landsman, L., Bar-On, L.
et al., 2009)
Im Kontext der Atherosklerose erfolgt eine Diapedese der 𝐿𝑦6𝐶ℎ𝑖/𝐺𝑟1+ Monozyten in die Intima, welche zu Makrophagen differenzieren, die durch Lipidaufnahme den atherosklerotischen Plaque bilden und den Prozess weiter vorantreiben. Ly6Chi/Gr1+ Monozyten der Maus akkumulieren bevorzugt im Blut bei akuter oder chronischer Entzündung, auch im Rahmen einer akuten Verletzung. (Drevets, D.A., Dillon, M.J., et al., 2004; Nahrendorf, M., Swirski, F.K., et al. 2007) Bei einer chronischen Entzündungsreaktion, wie es bei der
Atherosklerose der Fall ist, steigt die Anzahl der zirkulierenden Ly6Chi/Gr1+ Mausmonozyten deutlich an. (Swirski, F.K., Pittet, M.J., et al. 2006)
Die Funktion der 𝐿𝑦6𝐶𝑙𝑜/𝐺𝑟1−Monozyten bei der Bildung und dem Progress von atherosklerotischen Läsionen ist nicht eindeutig belegt, aber ihre Eigenschaften könnten die Wundheilung der Gefäßwand nach Verletzung begünstigen. Bei akuter Verletzung und bei einem Myokardinfarkt bleibt die Anzahl der 𝐿𝑦6𝐶𝑙𝑜/𝐺𝑟1− Monozyten relativ konstant. (Wu, H., Gower, R.M., et al. 2009) Bei chronischer Entzündung, zum Beispiel im Rahmen der Atherosklerose, konnte kein signifikanter Anstieg oder Abfall der 𝐿𝑦6𝐶𝑙𝑜/𝐺𝑟1− Monozyten gezeigt werden. (Combadiere, C., Potteaux, S., et al., 2008; Tacke, F., Alvarez, D., et al. 2007)
Bei einem Myokardinfarkt sind in der akuten Phase vor allem 𝐿𝑦6𝐶ℎ𝑖/𝐺𝑟1+ Monozyten zu finden, die durch eine erhöhte Sezernierung an TNF-α und proteolytischen Enzymen eine Entzündungsreaktion unterhalten. (Nahrendorf, M., Swirski, F.K., et al. 2007) Ähnlich verläuft die entzündliche Reaktion bei Bakterien, Viren oder Parasiten, mit einer erhöhten Produktion von TNF-α, iNOS, IL-12 und Interferon-1. (Serbina, N. V., Jia, T., et al. 2008; Strauss-Ayali, D., Conrad, S.M., et al. 2007; Serbina, N.V., Salazar-Mather, T.P., et al., 2003; Barbalat, R., Lau, L., et al., 2009; Robben, P.M., LaRegina, M., et al., 2005) bei der Wundheilung nach einem Myokardinfarkt teil, indem sie einen proangiogenetischen Phänotyp entwickeln und durch verstärkte Stimulation von Fibroblasten zur Ausbildung einer stabilen Infarktnarbe beitragen. (Serbina, N.V., Pamer, E. G., 2006)
2.3.2 Monozytensubpopulationen beim Menschen
Auch Menschen haben verschiedene Monozytensubpopulationen, die sich durch die Expression entweder vom LPS Rezeptor CD14 oder den FcγIII Rezeptor CD16 unterscheiden lassen. CD14++CD16− Monozyten werden häufig als klassische Monozyten, CD14++CD16++ als intermediäre Monozyten und CD14+CD16++ als nicht klassische Monozyten bezeichnet.
Studien zeigen, dass die CD16+ Monozyten möglicherweise eine Weiterentwicklung der CD16− Monozyten sind. (Ziegler-Heitbrock, H.W., Fingerle, G., et al., 1993) CD14++CD16−Monozyten machen mit ca. 85% den Hauptteil der gesamten Monozyten im peripheren Blut aus. Phänotypisch ähneln die klassischen Monozyten im Menschen den proinflammatorischen Ly6Chi/ Gr1+Monozyten der Maus, welche vermehrt CCR2, CD62L, CD64, MPO und vermindert CX3CR1 exprimieren. (Wildgruber, M., Lee, H., et al., 2009) Ihre eher inflammatorische Wirkung wird auch dadurch begründet, dass sie kurz nach einem Myokardinfarkt signifikant ansteigen und sie das antiinflammatorische Molekül PD-1 herunterregulieren (Serbina, N.V., Pamer, E.G., 2006; Said, E.A., Dupuy, F.P., et al., 2010).
Die nicht klassischen CD14+CD16++ Monozyten sind eher anti-inflammatorisch und ähneln der Ly6Clo/Gr1− Monozyten der Maus, denen eine Schutzfunktion an der luminalen Endothelseite unter homeostatischen und entzündlichen Bedingungen zugeschrieben wird. Dieses Phänomen konnte bis jetzt nur in kleinen Venen und Arterien von Haut, Mesenterium und Gehirn der Maus nachgewiesen werden. (Auffray, C., Fogg D., et al., 2007) Die Monozyten bewegen sich langsam an der Endothelinnenseite entlang und binden durch ihren Chemokinrezeptor CX3CR1 an Fraktalkin. CCR2 wird vermindert exprimiert.
Die intermediäre CD14++CD16++ Monozytenpopulation ist anteilsmäßig am geringsten vertreten, kann jedoch verstärkt TNFα sezernieren. (Schlitt, A., Heine, G.H., et al., 2004) Clusteranalysen haben ergeben, dass die intermediären Monozyten eher der Gruppe der Ly6Chi/Gr1+ Monozyten ähnlich sind, als denen der Ly6Clo/Gr1− Monozyten. (Libby, P., Nahrendorf, M., et al., 2013; Cros, J., Cagnard, N., et al., 2010; Ingersoll, M.A., Spanbroek, R., et al., 2010)
2.4 Monozytensubpopulationen als Biomarker
CD14 und CD16 charakterisieren die Subpopulationen der Monozyten beim Menschen und erlauben die Evaluierung der Monozytensubpopulationen als Biomarker bei verschiedenen Erkrankungen.
Ein möglicher Einfluss der Subpopulationen wurde bis jetzt in verschiedenen klinischen Studien für die koronare Herzerkrankung und für den Herzinfarkt untersucht. Hiroto et al. untersuchte 2009 den Einfluss der Heterogenität von Monozytensubpopulationen für das Outcome von Patienten mit einem akuten Myokardinfarkt. Sowohl CD16- und CD16+ Zellen steigen bei Patienten mit akutem Herzinfarkt an, wobei hohe Werte von CD16- Monozyten negativ mit dem Überleben von Myokardzellen assoziiert ist. Nach dem Akutereignis korrelieren CD16- Monozyten negativ mit der Erholung der linksventrikulären Ejektionsfraktion. (Tsujioka, H., Imanishi, T., et al., 2009)
Schlitt et al. zeigten 2004, dass Patienten mit einer Koronaren Herzerkrankung einen erhöhten Wert an CD16+ Monozyten gegenüber einer Kontrollgruppe haben. Es zeigte sich eine signifikante Assoziation zwischen dem CD16+
Monozyten und der Prävalenz einer KHK. (Schlitt, A., Heine, G.H., et al., 2004) Eine Kohortenstudie von 951 Patienten im Jahr 2012 ging noch weiter und wollte herausfinden, ob 𝐶𝐷14++𝐶𝐷16++ Zellen unmittelbar ein kardiovaskuläres Ereignis, wie Tod, einen akuten Myokardinfarkt oder einen nicht- hämorraghischen Schlaganfall, vorhersagen können. Die intermediären Monozyten korrelierten dabei direkt mit dem kardiovaskulären Ereignis.
(Rogacev, K.S., Cremers, B., et al., 2012)
Die pAVK stellt neben dem Herzinfarkt und dem Schlaganfall eine klinische Hauptmanifestation der Atherosklerose dar. Obwohl der Einfluss von Monozytensubpopulationen auf atherosklerotische Gefäßveränderungen und den Progress der KHK bereits untersucht wurde, fehlen Studien bei der pAVK, welche die Monozytensubpopulationen hier näher untersuchen. Diese Studie evaluiert die Monozytenanzahl und die Monozytensubpopulationen bei der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit der unteren Extremität in den verschiedenen Rutherfordstadien. Ziel ist einen verlässlichen Biomarker für den klinischen Progress der pAVK zu etablieren.
3. Fragestellung der Arbeit
Bezieht man die grundlegenden Ergebnisse durchgeführter Studien zur Heterogenität von Monozyten mit ein, so konnte gezeigt werden, dass sie eine erhebliche Dynamik im Rahmen der koronaren Herzerkrankung aufweist.
Aufgrund der gemeinsamen Pathogenese atherosklerotischer Erkrankungen sowie den dargelegten Beobachtungen im Mausmodell ist zu erwarten, dass auch bei der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit die Monozytensubpopulationen eine wichtige Rolle in der Pathogenese spielen. Die Heterogenität der Monozyten und ihrer Subpopulationen sind aber für die pAVK bis dato noch nicht untersucht.
Mit der vorliegenden Studie soll untersucht werden, ob die Monozytensubpopulationen bei Patienten mit peripherer arteriellen Verschlusskrankheit eine mögliche Rolle bei der Pathogenese und dem Progress der Erkrankung spielen und entsprechend als Biomarker fungieren können.
Folgende Hypothesen sollen dabei geprüft werden:
1. Es soll gezeigt werden, dass es einen signifikanten Unterschied der Proportion von Monozytensubpopulationen in den verschiedenen Stadien der Erkrankung gibt. Untersucht wird dabei, ob fortgeschrittene Stadien der Erkrankung, gemessen anhand der Rutherfordstadien, mit einer veränderten Verteilung der einzelnen Subpopulationen assoziiert werden können. Im diesem Fall könnte die Verteilung der Monozytensubpopulationen im peripheren Blut einen Biomarker für die pAVK und deren Progress darstellen.
2. Zudem soll gezeigt werden, dass Monozytensubpopulationen mit zunehmendem Schweregrad ihren Phänotyp ändern. Hierzu werden die Expression von Schlüsselproteinen an der Zelloberfläche (CCR2, CD11b, CD106, CD162), sowie das intrazelluläre, proinflammatorische Enzym Myeloperoxidase (MPO) analysiert.
4. Material und Methoden
4.1 Studiendesign und Studienablauf
Es handelte sich um eine kontrollierte, klinische Studie mit Follow- Up Untersuchungen. Bei Erstkontakt der Patienten wurden die Einschluss-/ und Ausschlusskriterien überprüft. Den Patienten wurde vor Einleitung einer therapeutischen Maßnahme venös Blut abgenommen, um die Monozytensubpopulationen und deren Phänotyp zu bestimmen.
In dieser Studie wurde auf die Auswertung von Follow- Up Daten verzichtet. Ein Großteil der Patienten wurde invasiv behandelt und damit als Verlaufsgruppe unbrauchbar, weil zu viele Störgrößen die Laborergebnisse verfälschen würden.
Die konservative Verlaufsgruppe gestaltete sich als zu klein um valide Ergebnisse zu erhalten. Die Blutentnahme und Laboranalysen wurden damit nur zu einem Zeitpunkt durchgeführt.
4.2. Rekrutierung der Patienten
Im Zeitraum von 2012 bis 2014 wurden 143 Patienten mit pAVK prospektiv über das interdisziplinäre Gefäßzentrum der Klinik für vaskuläre und endvaskuläre Chirurgie, sowie der Abteilung für interventionelle Radiologie des Klinikums Rechts der Isar in München, zur Teilnahme für die Studie rekrutiert.
In die Studie wurden alle Patienten eingeschlossen, die eine nachweisbare periphere arterielle Verschlusskrankheit in den verschiedenen Rutherfordstadien 1-6 hatten. Ausschlusskriterien waren eine stattgehabte Intervention oder Operation an den Becken- und Beingefäßen in den letzten drei Monaten.
Die Studie wurde durch die Ethikkommission genehmigt und alle Teilnehmer gaben nach ausführlicher Aufklärung eine schriftliche Einverständniserklärung ab (Protokollnummer der Ethikkommission 5147/11).
Abbildung 4 Studiendesign
4.3. Patientenanamnese und Diagnostik
Eine gründliche Patientenanamnese wurde bei der Aufnahme erhoben. Die Patientenanamnese erfasste das Alter, das Geschlecht, den BMI, die Risikofaktoren Hypertonus, Nikotinabusus, Diabetes mellitus, Niereninsuffizienz, Adipositas, weitere kardiovaskuläre Komorbiditäten und die aktuelle Medikamenteneinnahme.
Alle Patienten erhielten eine klinische Untersuchung mit Pulsstatuserhebung, Laufbandtest und Messung des ABI Wertes vor und nach Laufbandbelastung. Der Laufbandtest wurde als eine standardisierte Untersuchung mit der Grundeinstellung von 10% Steigung und 3,5km/h durchgeführt. Sobald die Schmerzen einen Abbruch forderten, wurde der Laufbandtest beendet und die maximale Gehstrecke notiert.
Bildgebende Verfahren beinhalteten standardmäßig die Duplexsonographie der Becken- und Beingefäße und weiterführende bildgebende Verfahren, wie eine Magnetresonanztomographie oder eine Computertomographie, um die Ausdehnung der Erkrankung zu beurteilen (Einteilung gemäß der TASC Klassifikation) und eine mögliche Therapie planen zu können.
4.4. Blutentnahme für die Studie
Eine Blutentnahme erfolgte bei jedem rekrutierten Patienten. Die Probe wurde sofort im Labor weiterverarbeitet, um Blutkoagulation und Apoptose zu vermeiden. Die venösen Blutproben wurden in NH4-Monovetten gesammelt.
Die Zeit der venösen Stauung wurde versucht möglichst kurz zu halten und es wurde auf eine möglichst sterile Blutabnahme geachtet. Die aufbereiteten Blutröhrchen wurden mit Nummern codiert und nach Durchflusszytometrieanalyse in einer Blutdatenbank gesammelt.
4.5. Probenaufbereitung und Durchflusszytometrieanalyse
Das heparinisierte venöse Vollblut wurde 1:1 mit DPBS gemischt und vorsichtig auf 15ml eines Dichtegradienten pipettiert (Ficoll-Paque Plus, Dichte 1,077 g/ml, GE Healthcare, NJ). Dabei soll keine Durchmischung erfolgen. Das Dichtemedium wurde genutzt, um einen Dichtegradienten zwischen den zu separierenden Zellen und den subzellulären Bestandteilen des Blutes aufzubauen. Durch Nutzung der Kräfte bei Zentrifugation kam es zu einer Trennung in die verschiedenen Phasen.
Der Trennungsprozess wurde durch eine Zentrifugation bei 1600rpm für 20 Minuten bei 18°C durchgeführt. Dabei ergab sich die gewünschte Phasentrennung.
Die oberste gelbliche Schicht beinhaltet das Plasma. In der Interphase, der weißen Schicht darunter, befinden sich die mononukleären Zellen, welche über dem Dichtegradienten abpipettiert wurden. Am Boden des Probenröhrchens sammeln sich die Erythrozyten. Die abpipettierten Zellen wurden noch dreimal in DPBS gewaschen, um Verunreinigungen zu beseitigen.
Durch Zugaben von einem Nährmedium (80% fetal calf serum (FCS), 20% DMSO) wurden die Zellen bei -80°C bis zu weiteren Analysen tiefgefroren.
Die weiteren Analysen erfolgten mit der Durchflusszytometrie. Die Grundeigenschaften der Durchflusszytometrie sind charakterisiert durch Messung von Streulicht und Fluoreszenzsignale der Zellen. Jede Zelle wurde in einem Flüssigkeitsstrom durch den Messbereich des Laserstrahls geführt. Das entstandene Streulicht oder Fluoreszenzsignal wurde durch verschiedene Detektoren gemessen. Das Vorwärtsstreulicht (FSC=forward scatter) ist ein Maß für die Ablenkung des Laserstrahls, abhängig von der Größe der Zelle. Das Seitwärtsstreulicht (SSC=side scatter) misst die Änderung der Ausbreitungsrichtung des Laserstrahls und damit die intrazelluläre Beschaffenheit. Monozyten sind große Zellen und besitzen kaum Granula und können somit von Granulozyten und Lymphozyten unterschieden werden. Neben dem gestreuten Licht können auch multiple Fluoreszenzen verschiedener Wellenlängen gemessen werden, die durch markierte Antikörper mit Fluorochromen erzeugt werden.
Vor der Durchflusszytometrieanalyse stand die Aufbereitung der konservierten Zellen. Die Proben mussten langsam mit 1ml Medium (90% DMEM, 10% FCS) aufgetaut werden. Der Zellinhalt mit 10ml von diesem Auftaumedium wurde bei 4°C gehalten. Anschließend folgten zwei Waschvorgänge und eine Resuspendierung mit 1,5ml DPBS/2%FCS. Eine Kompensationsreihe diente zur Überprüfung der Färbungen und zur Kalibrierung des FACS Gerätes. Die Zellsuspensionen wurde mit Hilfe von Antikörpern, gekoppelt an Fluoreszenzen, im Verhältnis 1:100 gefärbt (alle von BD Bioscience): CD14-PerCP-Cy5.5/M5E2, CD16-PE-Cy7/3G8, CD106-PE/51-10C9, CX3CR1-FITC/2A9-1, CCR2- AlexaFluor647/48607, CD11b-V450/ICRF44, CD162-PE/KPL-1. Die Zellen wurden im Dunklen mit den Antikörpern bei 4°C für 30 Minuten inkubiert. Nach einem letzten Waschschritt mit DPBS/2%FCS waren die Proben, bis auf die intrazelluläre Färbereihe, für die Durchflusszytometrieanalyse fertig.
Die intrazelluläre Färbung für die Myeloperoxidase (MPO) erfolgte mit einem Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit (BD Bioscience). Erst die Inkubation mit Fixier/Permeabilisations Lösung ermöglichte eine intrazelluläre Färbung durch Perforation der Zellmembran. Danach erfolgte ein Waschvorgang mit der PermWash Pufferlösung. Der Antikörper wurde ebenfalls in der verdünnten PermWash Pufferlösung angesetzt und anschließend wurden die Zellen für 20 Minuten im Dunkeln inkubiert. Nach Komplettierung der Färbung erfolgte die FACS Analyse.
4.6. Auswertung
Die Analysen erfolgten mit einem CyAn™ ADP Durchflusszytometer (Beckman Coulter, Fichtenhain, Deutschland). Die Daten wurden mittels FlowJo v.8.5.2 (Tree Star, Inc., Ashland, Oregon, USA) analysiert.
4.7. Statistik
Die statistischen Auswertungen wurden mittels Prism 6.0 (Graph Pad, La Jolla, USA) durchgeführt. Die demografischen Patientendaten wurden als Median, oder als Häufigkeiten in Prozent angegeben. Vergleichende Statistik für die demografischen Daten erfolgten, je nach Merkmalscharakteristik, mit dem Chi- Quadrat Test oder Fisher- Exact Test.
Alter, Body-Mass-Index (BMI), schmerzfreie Gehstrecke und ABI wurden mit dem Spearman’s Korrelationskoeffizient verglichen. Die Vergleiche zwischen den sechs Rutherfordstadien wurden durch Korrelationsberechnungen nach Pearson vorgenommen.
Um mögliche Störgrößen zu eliminieren erfolgte eine Adjustierung mit Kovariablen für Alter, Geschlecht und Risikofaktoren (Diabetes, Nikotinabusus, Hypertonie und Hyperlipidämie).
Die Daten wurden durch Boxplots dargestellt, die jeweils Median, Minimum, Maximum und 25%/75% Percentile angeben. Das Signifikanzniveau wurde bei 5% festgesetzt.
5. Ergebnisse
5.1 Demographische Daten
143 Patienten (94 männlich, 49 weiblich; Medianes Alter 72 Jahre) in den verschiedenen Rutherfordstadien 1-6 wurden prospektiv in dem Zeitraum von Oktober 2012 bis Januar 2014 in die Studie eingeschlossen. Die Patientencharakteristika und die Einteilung in die TASC Klassifikation anhand der verschiedenen Rutherfordstadien wird in der Abbildung 5 zusammengefasst.
Einige Risikofaktoren wie Diabetes mellitus, Nikotinabusus, Dialysetherapie, eine begleitende Malignomerkrankung und die Statintherapie zeigen einen signifikanten Unterschied zwischen den Rutherfordstadien. Die Häufigkeit von Diabetes ist in den fortgeschrittenen Stadien 5 und 6 erhöht. Um potenzielle Störgrößen auszuschließen, wurden die nachfolgenden Auswertung für diese Kovariablen adjustiert.
Die Gehstrecke nimmt mit Schweregrad der Erkrankung ab. Für die Patienten in Stadium 5 und 6 ist eine objektive Bestimmung der Gehstrecke nicht aussagekräftig, daher sind hier keine numerischen Werte aufgeführt.
