M ONOZYTEN UND M ONOZYTENSUBPOPULATIONEN

Monozyten können durch Ausbildung einer chronischen Entzündungsreaktion den Progress der atherosklerotischen Läsionen vorantreiben. (Reinecke, H., Unrath, M., et al., 2015; Libby, P., Ridker, P.M., et al., 2009) Eine gezielte Reduktion der Monozyten beim Hasen kann die Bildung atherosklerotischer Läsionen vermindern. (Ylitalo, R., Oksala, O., et al., 1994) Umgekehrt kann man schlussfolgern, dass Monozyten den chronischen Entzündungsprozess der Atherosklerose vorantreiben und damit die pAVK verschlimmert.

In der vorliegenden Studie zeigten Patienten mit einem fortgeschrittenen Rutherfordstadium eine erhöhte Anzahl von zirkulierenden Monozyten. Im Speziellen stieg die Monozytenzahl, prozentual und absolut, bei Patienten im Rutherfordstadium 5 und 6. Bei einem Gewebedefekt wird eine Entzündungsreaktion mit Leukozytose erwartet. Alleine durch den Leukozytenwert konnte aber kein eindeutiger Zusammenhang mit dem Schweregrad der Erkrankung in der vorliegenden Studie nachgewiesen werden.

Selbst in den höchsten Stadien (Rutherford 5 und 6) der Erkrankung befand sich der mediane Wert der Leukozyten noch im Referenzbereich Die Monozytenspiegel korrelierten im peripheren Blut der Patienten eindeutig mit dem Stadium der Erkrankung.

Interessanterweise zeigen sich in der vorliegenden Studie bereits Veränderungen der Monozytensubpopulationen in früheren Erkrankungsstadien (Rutherford 4) der pAVK und nicht erst wenn Gewebedefekte (Rutherford 5 und 6) auftreten. In der Studie zeigten sich unterschiedliche Ergebnisse bei den prozentualen und bei den absoluten Werten der Monozytensubpopulationen. Bei beiden Auswertungen steigt der Anteil der „intermediären“ Monozyten 𝐶𝐷14⁺⁺𝐶𝐷16⁺⁺ mit höherem Rutherfordstadium bereits bei Patienten mit Ruheschmerzen, im Gegensatz zu Patienten mit intermittierender Claudicatio, an.

Die „klassischen“ 𝐶𝐷14⁺⁺𝐶𝐷16⁻ Monozyten steigen nur bei den absoluten Werten der Monozytensubpopulationen im Rutherfordstadium 5 und 6 an. Bei der prozentualen Angabe der Monozytensubpopulationen ergibt sich kein signifikanter Unterschied innerhalb der Rutherfordstadien.

Die „nicht klassischen“ 𝐶𝐷14⁺𝐶𝐷16⁺⁺ Monozyten nahmen bei den prozentualen Angaben der Monozytensubpopulationen im Rutherfordstadium 5 und 6 ab, zeigten aber bei den absoluten Werten keinen signifikanten Unterschied.

Bei den unterschiedlichen Angaben der Monozytensubpopulationen ist zu beachten, dass die absoluten Werte eine Berechnung aus zwei verschiedenen Analyseverfahren waren. Bei der Berechnung gingen sowohl die Leukozytenanzahl, gemessen im Standardlabor, als auch die Prozentangaben der Monozyten und der prozentuale Anteil der Monozytensubpopulationen, gemessen bei der Durchflusszytometrie, mit ein. Somit ist anzunehmen, dass bei der Berechnung eine gewisse Ungenauigkeit, durch die verschiedenen Analyseverfahren entstanden ist, welche die reine prozentuale Angabe der Subpopulationen aussagekräftiger macht. Die prozentuale Angabe der Subpopulationen wird nur aus den FACS Daten generiert.

Die unterschiedliche Verteilung der Monozytensubpopulationen in unserer Studie zeigte einen Unterschied bei der Produktion oder dem Verbrauch der Monozytensubpopulationen in den verschiedenen Stadien der pAVK. Das kann ein Hinweis für eine unterschiedliche biologische Funktion der Monozytensubpopulationen sein. Studien bei KHK Patienten zeigten bereits eine veränderte Zusammensetzung der Monozytensubpopulationen. Die Prävalenz der Koronaren Gefäßerkrankung korreliert mit einem erhöhten Wert von zirkulierenden 𝐶𝐷16⁺⁺ Monozyten im Blut. (Schlitt, A., Heine, G.H., et al., 2004) Rogacev et al. zeigten, dass die „intermediären“ 𝐶𝐷14⁺⁺𝐶𝐷16⁺⁺ Monozyten ein kardiovaskuläres Ereignis vorhersagen können. (Rogacev, K.S., Cremers, B., et al., 2012) Zusätzlich zeigen die „intermediären“ Monozyten eine erhöhte Expression von TNFα bei Patienten mit KHK. Daher wird ihnen eine proinflammatorische Funktion zugeschrieben. (Schlitt, A., Heine, G.H., et al., 2004) 𝐶𝐷14⁺⁺𝐶𝐷16⁺⁺

Monozyten sind auch bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz mit kardiovaskulären Komplikationen assoziiert. Dabei werden die 𝐶𝐷16⁺⁺

Monozyten eher als Einflussfaktor für die Atherosklerose gesehen. (Rogacev, K.S., Cremers, B., et al., 20012)

Weitere Studien zeigen aber auch, dass die „klassischen“ 𝐶𝐷14⁺⁺𝐶𝐷16⁻ Monozyten kardiovaskuläre Ereignisse vorhersagen können (Berg, K.E., Ljungcrantz, I., et al., 2012) und die Intima-Media Dicke steigern. (Jaipersad, A.S., Shantsila, A., et al., 2014) Darüber hinaus können auch verschiedene Risikofaktoren die Zusammensetzung der Monozytensubpopulationen beeinflussen. Die „nicht klassischen“ 𝐶𝐷14⁺𝐶𝐷16⁺⁺ Monozyten und die

„intermediären“ 𝐶𝐷14⁺⁺𝐶𝐷16⁺⁺ Monozyten steigen bei adipösen Patienten an, wobei sich die „nicht klassischen“ Monozyten nur bei adipösen Diabetikern vermehrt im peripheren Blut finden. (Poitou, C., Dalmas, E., et al., 2011) Diese Studien machen deutlich, dass gewisse Risikofaktoren die Zusammensetzung der Monozytensubpopulationen verändern können. Falls man die Monozytensubpopulationen als Biomarker verwenden möchte, muss auf den Erkrankungsprozess und die individuellen Risikofaktoren Rücksicht genommen werden.

Zahlreiche Studien im Mausmodell haben gezeigt, dass im Rahmen der Pathogenese der Atherosklerose die Heterogenität der Monozyten und die unterschiedlichen Funktionen der einzelnen Subpopulationen eine wichtige Rolle spielen. Proinflammatorische 𝐿𝑦6𝐶^ℎ𝑖/𝐺𝑟 − 1⁺ Zellen dominieren in der Monozytenrekrutierung bei apoE/- Mäusen mit Hypercholesterinämie und erhöhen die Makrophagenanzahl im Atherom. (Serbina, N.V., Jia, T., et al., 2008) Durch sie kann ein chronischer Entzündungsprozess mit einem Progress der Erkrankung entstehen. Dabei nimmt auch die Anzahl der zirkulierenden 𝐿𝑦6𝐶^ℎ𝑖/𝐺𝑟 − 1⁺ Monozyten im Blut zu. (Tacke, F., Alvarez, D., et al., 2007)

𝐿𝑦6𝐶^𝑙𝑜𝑤/𝐺𝑟1⁻ Monozyten werden dagegen eher regulatorische Funktionen bei homeostatischen und entzündlichen Prozessen zugeschrieben und unterstützen damit die Gewebeheilung. (Thomas, G., Tacke, R., et al., 2015)

Erste Untersuchung brachten das Ergebnis, dass 𝐿𝑦6𝐶^ℎ𝑖/𝐺𝑟 − 1⁺ Monozyten am ehesten mit den 𝐶𝐷14⁺⁺𝐶𝐷16⁻ Zellen, den „klassischen“ Monozyten, vergleichbar sind. 𝐿𝑦6𝐶^𝑙𝑜𝑤/𝐺𝑟1⁻ Monozyten der Maus ähneln eher den „nicht klassischen“ 𝐶𝐷14⁺𝐶𝐷16⁺⁺ und den „intermediären“ Monozyten 𝐶𝐷14⁺⁺𝐶𝐷16⁺⁺ beim Menschen. (Geissmann, F., Jung, S., et al., 2003) „Klassische“

Monozyten zeigten eine eher inflammatorische Wirkung, welche die

Atheromentstehung grundsätzlich fördern. Im Gegensatz dazu demonstrierten Cros et al., dass sowohl die „klassischen“ 𝐶𝐷14⁺⁺𝐶𝐷16⁻ , als auch die

„intermediären“ Monozyten 𝐶𝐷14⁺⁺𝐶𝐷16⁺⁺ den 𝐿𝑦6𝐶^ℎ𝑖 Monozyten ähneln, wohingegen die „nicht klassischen“ 𝐶𝐷14⁺𝐶𝐷16⁺⁺ Monozyten eher mit den 𝐿𝑦6𝐶^𝑙𝑜𝑤 Monozyten zu vergleichen sind. (Serbina, N.V., Jia, T., et al., 2008) Diese neue Betrachtungsweise der dritten Monozytensubpopulation, die nur beim Menschen vorhanden ist, erklärt die Tatsache, dass der 𝐶𝐷14⁺⁺𝐶𝐷16⁺⁺ Monozyt derzeit eher als proinflammatorischer Phänotyp betrachtet wird.

Der Anstieg der 𝐶𝐷14⁺⁺𝐶𝐷16⁺⁺ Monozyten bei unseren Studienpatienten korrelierte mit einem höheren Erkrankungsstadium der pAVK und kann einen Krankheitsprogress möglicherweise vorausgehen. Da ein Anstieg an 𝐶𝐷14⁺⁺𝐶𝐷16⁺⁺ Monozyten ein kardiovaskuläres Ereignis bei KHK Patienten zeigt, (Rogacev, K.S., Cremers, B., et al., 2009) ergeben unsere Ergebnisse eine Übereinstimmung mit der Tatsache, dass eine kritische Extremitätenischämie mit einer ungünstigeren kardiovaskulären Situation einhergeht. (Reinecke, H., Unrath, M., et al., 2015)

Die Abnahme der „nicht klassischen“ 𝐶𝐷14⁺𝐶𝐷16⁺⁺ Monozyten bei unseren Patienten im Rutherfordstadium 5 und 6, kann gleichermaßen einen verzögerten oder beeinträchtigen Heilungsprozess anzeigen, wenn man davon ausgeht, dass die 𝐶𝐷14⁺𝐶𝐷16⁺⁺ Monozyten beim Menschen ebenfalls eher reparative Funktionen haben. Dafür gibt es aber bislang in der Literatur keine kausalen Belege.

𝐿𝑦6𝐶^𝑙𝑜𝑤 Monozyten bei der Maus, die den „nicht klassischen“ 𝐶𝐷14⁺𝐶𝐷16⁺⁺

Monozyten ähnlich sind, spielen eher eine Rolle bei der regulatorischen Funktion der Homeostase und beim Gewebeheilungsprozess. (Thomas, G., Tacke, R., et al., 2015) Potenziell wäre eine therapeutische Beeinflussung dieser protektiven 𝐶𝐷14⁺𝐶𝐷16⁺⁺ Monozyten ein neuer Ansatz für die Patienten mit fortgeschrittener pAVK, um den beeinträchtigen Heilungsprozess positiv zu unterstützen. Erste Beweise, dass eine Änderung der Monozytenzusammensetzung als möglich Therapiestrategie genutzt werden kann, liefert eine Studie bei Mäusen, bei der durch einen mononuklären

Zelltransfer eine belastungsabhängige arterielle Kollateralenentwicklung induziert wird. (Schirmer, S.H., Millenaar, D.N., et al.)

6.3. Phänotypische Charakterisierung der Monozytensubpopulationen

Für eine weitere phänotypische Charakterisierung der Monozytensubpopulationen in den verschiedenen Rutherfordstadien, untersuchten wir die Expression der charakteristischen Marker CCR2, CX₃CR1 und CD11b.

Klassische 𝐶𝐷14⁺⁺𝐶𝐷16⁻Monozyten im Menschen exprimieren vermehrt CCR2 und vermindert CX₃CR1. Entgegengesetzt verhalten sich die 𝐶𝐷16⁺ Monozyten.

(Wildgruber, M., Lee, H., et al., 2009) Diese Ergebnisse konnten anhand der graphischen Darstellung in unserer Studie bestätigt werden.

Die Expression von CCR2 führt zu einem Übertritt von Monozyten aus dem Knochenmark in das zirkulierende Blut. (Ylitalo, R., Oksala, O., et al., 1994; Tsou, C.L., Peters, W., et al., 2007) CCR2-/- Knockoutmäuse zeigen eine verminderte atherosklerotische Plaqueentwicklung. (Boring, L., Gosling, J., et al., 1998)

Eine Herunterregulierung des CX₃CR1 Rezeptoren auf der Monozytenoberfläche der Maus führt zu einer gestörten Defektheilung der Gefäßwand und damit zu einem Gefäßleck. (Kumar, A.H., Martin, K., et al., 2013) Landsman et al. zeigte, dass die CX₃CR1-CX₃CL1 Interaktion weniger Apoptose von Monozyten induziert.

(Landsman, L., Bar-on, L., et al., 2009)

CD11b wird an der Oberfläche von neutrophilen Granulozyten, Monozyten, natürlichen Killerzellen und B-Lymphozyten exprimiert. CD11b ist integraler Bestandteil des MAC-1 Antigenkomplexes. MAC-1 gehört zur Familie der β2-Integrine und ist ein Glykoprotein, bestehend aus der Untereinheit CD18 (β2-Integrin) und CD11b (α- Kette). Integrine sind Bestandteile der Adhäsionsmolekülkaskade und spielen eine entscheidende Rolle bei der Rekrutierung von Monozyten in den atherosklerotischen Plaque. Eine gesteigerte Expression von MAC-1 auf Monozyten führt zu einer vermehrten Schaumzellbildung im atherosklerotischen Plaque. (Lee, S.J., Choi, E.K., et al., 2014)

CCR2, CX₃CR1 und CD11b zeigten in unserer Studie auf den drei Monozytensubpopulationen keine signifikanten Expressionsunterschiede innerhalb der verschiedenen Rutherfordstadien. In Bezug auf diese Marker scheinen die Monozytensubpopulationen stabil zu sein. Weiterführende Studien

werden benötigt, um die Stabilität bezüglich dieser Oberflächenmarker auf den Monozytensubpopulationen in den verschiedenen Rutherfordstadien zu bestätigen.

Weiterhin untersuchten wir die Oberflächenmarker CD106/ VCAM-1 und CD162/

PSGL-1. Monozyten werden durch das Adhäsionsmolekül VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1) an das Endothel gebunden. (Cybulsky, M.I., Gimbrone, M.A., Jr., 1991) Eine erhöhte CD106/ VCAM-1 Expression wurde initial auf Gewebemakrophagen beschrieben. (Dutta, P., Hoyer, F.F., et al., 2015; Rice, G.E., Munro, J.M., et al., 1991) Bei einem Herzinfarkt (STEMI und NSTEMI) kommt es zu einer unterschiedlichen Expression von CD106/VCAM-1 Rezeptoren auf Monozytensubpopulationen (Shantsila, E., Tapp, L.D., et al., 2013). Die

„klassischen“ 𝐶𝐷14⁺⁺𝐶𝐷16⁻ exprimierten bei einem STEMI vermindert CD106/VCAM-1. Bei einem NSTEMI wurden vermehrt CD106/VCAM-1 Rezeptoren auf „nicht klassischen“ 𝐶𝐷14⁺𝐶𝐷16⁺⁺ und „intermediären“

𝐶𝐷14⁺⁺𝐶𝐷16⁺⁺ Monozyten exprimiert. (Shantsila, E., Tapp, L.D., et al., 2013) Ebenfalls wird die Expression von VCAM-1 bei hämatopoetischen Stammzellen der myeloiden Zellreihe beschrieben und beweist somit die Herkunft von Monozyten aus dem Knochenmark. (Ulyanova, T., Scott, L.M. et al., 2005)

Die Expressionsstärke, gemessen an der MFI, zeigte in unserer Studie im Gegensatz zu dem prozentualen Anteil CD106 positiver Zellen, signifikante Veränderungen in den verschiedenen Rutherfordstadien. Die MFI des CD106 Oberflächenmarkers zeigte in unserer Studie bei den „klassischen“ 𝐶𝐷14⁺⁺𝐶𝐷16⁻ Monozyten, ab dem Rutherfordstadium 4, eine verstärkte Expression. Diese unterschiedlichen Ergebnisse bei der pAVK und dem STEMI machen deutlich, dass beide Erkrankungen trotz gleicher Pathogenese einen unterschiedlichen Verlauf der Inflammation zeigen. Die Ergebnisse der KHK mit Herzinfarkt können nicht identisch auf die pAVK übertragen werden.

CD 162 gehört zu den P-Selektinen, welche mit dem Liganden PSGL-1 interagieren.

Mäuse mit vermindertem P-Selektin haben eine geringere Anzahl an Makrophagen im atherosklerotischen Plaque und entwickeln kleinere atherosklerotische Läsionen, im Gegensatz zu der Wildtyp-Maus.(Johnson, R.C.,

Chapman, S.M., et al., 1997) Die Expression von 𝐿𝑦6𝐶^ℎ𝑖/𝐺𝑟1⁺ Monozyten korreliert mit der Expression von PSGL-1, so dass man annehmen kann, dass P-Selektin inflammatorische Monozyten im atherosklerotischen Plaque rekrutiert.

(An, G., Wang, H., et al., 2008)

Die MFI des CD162 Oberflächenmarkers stieg in unserer Studie sowohl bei den

„klassischen“ 𝐶𝐷14⁺⁺𝐶𝐷16⁻ Monozyten, als auch bei den „intermediären“

𝐶𝐷14⁺⁺𝐶𝐷16⁺⁺Monozyten an. Somit ergibt sich ein weiterer Hinweis darauf, dass die „intermediären“ 𝐶𝐷14⁺⁺𝐶𝐷16⁺⁺ Monozyten eher den „klassischen“

𝐶𝐷14⁺⁺𝐶𝐷16⁻ Monozyten ähnlich sind und eine inflammatorische Funktion im atherosklerotischen Plaque haben. (Libby, P., Nahrendorf, M., et al., 2013; Schlitt, A., Heine, G.H., et al., 2004; Cros, J., Cagnard, N., et al., 2010)

Als weiterer prognostischer Biomarker für die pAVK wurde die Myeloperoxidase (MPO) gewählt, ein proinflammatorisches Schlüsselenzym aktivierter Makrophagen in atherosklerotischen Läsionen. (Sugiyama, S., Okada, Y., et al., 2001) Der Gehalt des intrazellulären Markers MPO ist bei den „klassischen“

𝐶𝐷14⁺⁺𝐶𝐷16⁻ Monozyten erhöht. (Wildgruber, M., Lee, H., et al., 2009) Makrophagen mit erhöhtem MPO Gehalt spielen eine wichtige Rolle bei der Plaquedestabilisierung und –ruptur beim akuten Koronarsyndrom. (Sugiyama, S., Okada, Y., et al., 2001) Unsere Studie zeigt, dass sowohl die „klassischen“

𝐶𝐷14⁺⁺𝐶𝐷16⁻ Monozyten, als auch die „intermediären“

𝐶𝐷14⁺⁺𝐶𝐷16⁺⁺ Monozyten intrazellulär einen erhöhten Gehalt an MPO aufweisen, der mit zunehmenden Rutherfordstadium ansteigt. Die steigenden intrazellulären Myeloperoxidasespiegel können damit als Indikator für eine erhöhte inflammatorische Last bei fortgeschrittener pAVK anzeigen. Ob die intrazelluläre MPO auch als Marker für potenziell vulnerable Läsionen im Rahmen der pAVK dienen kann, muss in weiteren Studien untersucht werden.

MPO und CD162 wurden sowohl bei den „klassischen“, als auch bei den

„intermediären“ Monozyten mit steigendem Rutherfordstadium hochreguliert.

Beide Subpopulationen zeigen somit einen ähnlichen Phänotyp und ähneln den proinflammatorischen 𝐿𝑦6𝐶^ℎ𝑖 Monozyten. (Ingersoll, M.A., Spanbroek, R., et al., 2010)

Weiterführende Studien werden benötigt um weitere Oberflächenmarker auf den Monozytensubpopulationen zu detektieren, die durch ihr Expressionsverhalten den Verlauf der Erkrankung vorhersagen können.