4.1 Studiendesign und Studienablauf
Es handelte sich um eine kontrollierte, klinische Studie mit Follow- Up Untersuchungen. Bei Erstkontakt der Patienten wurden die Einschluss-/ und Ausschlusskriterien überprüft. Den Patienten wurde vor Einleitung einer therapeutischen Maßnahme venös Blut abgenommen, um die Monozytensubpopulationen und deren Phänotyp zu bestimmen.
In dieser Studie wurde auf die Auswertung von Follow- Up Daten verzichtet. Ein Großteil der Patienten wurde invasiv behandelt und damit als Verlaufsgruppe unbrauchbar, weil zu viele Störgrößen die Laborergebnisse verfälschen würden.
Die konservative Verlaufsgruppe gestaltete sich als zu klein um valide Ergebnisse zu erhalten. Die Blutentnahme und Laboranalysen wurden damit nur zu einem Zeitpunkt durchgeführt.
4.2. Rekrutierung der Patienten
Im Zeitraum von 2012 bis 2014 wurden 143 Patienten mit pAVK prospektiv über das interdisziplinäre Gefäßzentrum der Klinik für vaskuläre und endvaskuläre Chirurgie, sowie der Abteilung für interventionelle Radiologie des Klinikums Rechts der Isar in München, zur Teilnahme für die Studie rekrutiert.
In die Studie wurden alle Patienten eingeschlossen, die eine nachweisbare periphere arterielle Verschlusskrankheit in den verschiedenen Rutherfordstadien 1-6 hatten. Ausschlusskriterien waren eine stattgehabte Intervention oder Operation an den Becken- und Beingefäßen in den letzten drei Monaten.
Die Studie wurde durch die Ethikkommission genehmigt und alle Teilnehmer gaben nach ausführlicher Aufklärung eine schriftliche Einverständniserklärung ab (Protokollnummer der Ethikkommission 5147/11).
Abbildung 4 Studiendesign
4.3. Patientenanamnese und Diagnostik
Eine gründliche Patientenanamnese wurde bei der Aufnahme erhoben. Die Patientenanamnese erfasste das Alter, das Geschlecht, den BMI, die Risikofaktoren Hypertonus, Nikotinabusus, Diabetes mellitus, Niereninsuffizienz, Adipositas, weitere kardiovaskuläre Komorbiditäten und die aktuelle Medikamenteneinnahme.
Alle Patienten erhielten eine klinische Untersuchung mit Pulsstatuserhebung, Laufbandtest und Messung des ABI Wertes vor und nach Laufbandbelastung. Der Laufbandtest wurde als eine standardisierte Untersuchung mit der Grundeinstellung von 10% Steigung und 3,5km/h durchgeführt. Sobald die Schmerzen einen Abbruch forderten, wurde der Laufbandtest beendet und die maximale Gehstrecke notiert.
Bildgebende Verfahren beinhalteten standardmäßig die Duplexsonographie der Becken- und Beingefäße und weiterführende bildgebende Verfahren, wie eine Magnetresonanztomographie oder eine Computertomographie, um die Ausdehnung der Erkrankung zu beurteilen (Einteilung gemäß der TASC Klassifikation) und eine mögliche Therapie planen zu können.
4.4. Blutentnahme für die Studie
Eine Blutentnahme erfolgte bei jedem rekrutierten Patienten. Die Probe wurde sofort im Labor weiterverarbeitet, um Blutkoagulation und Apoptose zu vermeiden. Die venösen Blutproben wurden in NH4-Monovetten gesammelt.
Die Zeit der venösen Stauung wurde versucht möglichst kurz zu halten und es wurde auf eine möglichst sterile Blutabnahme geachtet. Die aufbereiteten Blutröhrchen wurden mit Nummern codiert und nach Durchflusszytometrieanalyse in einer Blutdatenbank gesammelt.
4.5. Probenaufbereitung und Durchflusszytometrieanalyse
Das heparinisierte venöse Vollblut wurde 1:1 mit DPBS gemischt und vorsichtig auf 15ml eines Dichtegradienten pipettiert (Ficoll-Paque Plus, Dichte 1,077 g/ml, GE Healthcare, NJ). Dabei soll keine Durchmischung erfolgen. Das Dichtemedium wurde genutzt, um einen Dichtegradienten zwischen den zu separierenden Zellen und den subzellulären Bestandteilen des Blutes aufzubauen. Durch Nutzung der Kräfte bei Zentrifugation kam es zu einer Trennung in die verschiedenen Phasen.
Der Trennungsprozess wurde durch eine Zentrifugation bei 1600rpm für 20 Minuten bei 18°C durchgeführt. Dabei ergab sich die gewünschte Phasentrennung.
Die oberste gelbliche Schicht beinhaltet das Plasma. In der Interphase, der weißen Schicht darunter, befinden sich die mononukleären Zellen, welche über dem Dichtegradienten abpipettiert wurden. Am Boden des Probenröhrchens sammeln sich die Erythrozyten. Die abpipettierten Zellen wurden noch dreimal in DPBS gewaschen, um Verunreinigungen zu beseitigen.
Durch Zugaben von einem Nährmedium (80% fetal calf serum (FCS), 20% DMSO) wurden die Zellen bei -80°C bis zu weiteren Analysen tiefgefroren.
Die weiteren Analysen erfolgten mit der Durchflusszytometrie. Die Grundeigenschaften der Durchflusszytometrie sind charakterisiert durch Messung von Streulicht und Fluoreszenzsignale der Zellen. Jede Zelle wurde in einem Flüssigkeitsstrom durch den Messbereich des Laserstrahls geführt. Das entstandene Streulicht oder Fluoreszenzsignal wurde durch verschiedene Detektoren gemessen. Das Vorwärtsstreulicht (FSC=forward scatter) ist ein Maß für die Ablenkung des Laserstrahls, abhängig von der Größe der Zelle. Das Seitwärtsstreulicht (SSC=side scatter) misst die Änderung der Ausbreitungsrichtung des Laserstrahls und damit die intrazelluläre Beschaffenheit. Monozyten sind große Zellen und besitzen kaum Granula und können somit von Granulozyten und Lymphozyten unterschieden werden. Neben dem gestreuten Licht können auch multiple Fluoreszenzen verschiedener Wellenlängen gemessen werden, die durch markierte Antikörper mit Fluorochromen erzeugt werden.
Vor der Durchflusszytometrieanalyse stand die Aufbereitung der konservierten Zellen. Die Proben mussten langsam mit 1ml Medium (90% DMEM, 10% FCS) aufgetaut werden. Der Zellinhalt mit 10ml von diesem Auftaumedium wurde bei 4°C gehalten. Anschließend folgten zwei Waschvorgänge und eine Resuspendierung mit 1,5ml DPBS/2%FCS. Eine Kompensationsreihe diente zur Überprüfung der Färbungen und zur Kalibrierung des FACS Gerätes. Die Zellsuspensionen wurde mit Hilfe von Antikörpern, gekoppelt an Fluoreszenzen, im Verhältnis 1:100 gefärbt (alle von BD Bioscience): CD14-PerCP-Cy5.5/M5E2, CD16-PE-Cy7/3G8, CD106-PE/51-10C9, CX3CR1-FITC/2A9-1, CCR2-AlexaFluor647/48607, CD11b-V450/ICRF44, CD162-PE/KPL-1. Die Zellen wurden im Dunklen mit den Antikörpern bei 4°C für 30 Minuten inkubiert. Nach einem letzten Waschschritt mit DPBS/2%FCS waren die Proben, bis auf die intrazelluläre Färbereihe, für die Durchflusszytometrieanalyse fertig.
Die intrazelluläre Färbung für die Myeloperoxidase (MPO) erfolgte mit einem Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit (BD Bioscience). Erst die Inkubation mit Fixier/Permeabilisations Lösung ermöglichte eine intrazelluläre Färbung durch Perforation der Zellmembran. Danach erfolgte ein Waschvorgang mit der PermWash Pufferlösung. Der Antikörper wurde ebenfalls in der verdünnten PermWash Pufferlösung angesetzt und anschließend wurden die Zellen für 20 Minuten im Dunkeln inkubiert. Nach Komplettierung der Färbung erfolgte die FACS Analyse.
4.6. Auswertung
Die Analysen erfolgten mit einem CyAn™ ADP Durchflusszytometer (Beckman Coulter, Fichtenhain, Deutschland). Die Daten wurden mittels FlowJo v.8.5.2 (Tree Star, Inc., Ashland, Oregon, USA) analysiert.
4.7. Statistik
Die statistischen Auswertungen wurden mittels Prism 6.0 (Graph Pad, La Jolla, USA) durchgeführt. Die demografischen Patientendaten wurden als Median, oder als Häufigkeiten in Prozent angegeben. Vergleichende Statistik für die demografischen Daten erfolgten, je nach Merkmalscharakteristik, mit dem Chi-Quadrat Test oder Fisher- Exact Test.
Alter, Body-Mass-Index (BMI), schmerzfreie Gehstrecke und ABI wurden mit dem Spearman’s Korrelationskoeffizient verglichen. Die Vergleiche zwischen den sechs Rutherfordstadien wurden durch Korrelationsberechnungen nach Pearson vorgenommen.
Um mögliche Störgrößen zu eliminieren erfolgte eine Adjustierung mit Kovariablen für Alter, Geschlecht und Risikofaktoren (Diabetes, Nikotinabusus, Hypertonie und Hyperlipidämie).
Die Daten wurden durch Boxplots dargestellt, die jeweils Median, Minimum, Maximum und 25%/75% Percentile angeben. Das Signifikanzniveau wurde bei 5% festgesetzt.