4 Ergebnisse
4.1.3 PCR-Analysen der Leberbiopsien
In Tabelle 5 ist die relative Menge mRNA- Expression von ERα, GHR, JAK2, STAT5B, SOCS2, SOCS3, IGF-I und IGF-II im Vergleich zu zwei Housekeeping Genen in der Leber in der Lutealphase und in der Follikelphase dargestellt.
Tabelle 5: Relative mRNA-Expression während der Luteal- und der Follikelphase (unterteilt in ante/post ovulationem), als Housekeeping-Gene wurden GAPDH und RPS9 verwendet, es wurden die Werte der Follikelphase sowie ihre Untergruppen gegen die Lutealphase getestet, ** P < 0,01, * P < 0,05, (*) P < 0,1 Tendenz; außerdem wurde die mRNA-Expression vor und nach der Ovulation verglichen, a, b kennzeichnet einen Unterschied zwischen der mRNA-Expression vor und nach der Ovulation (P < 0,05)
Die relative mRNA-Expression von ERα, JAK2, STAT5B, SOCS3, IGF-I und –II war in der Luteal- und Follikelphase vergleichbar (Tabelle 5).
mRNA (RA) / Zeitpunkt
ERα GHR JAK2 STAT5B SOCS2 SOCS3 IGF-I IGF-II n
Lutealphase 9,86 ± 4,31 61,55 ± 30,65 2,64 ± 1,61 9,08 ± 5,43 12,49 ± 9,67 8,23 ± 4,67 9,23 ± 7,22 0,56 ± 0,31 56
Follikelphase 9,79 ± 4,24 69,89 ± 31,44 (*) 2,64 ± 1,61 9,02 ± 4,39 14,98 ± 9,73* 8,07 ± 4,12 10,00 ± 6,43 0,52 ± 0,24 56
◦ ante ovulationem 11,50 ± 4,01 98,77 ± 45,79 ** a 3,21 ± 1,45 10,03 ± 4,47 25,65 ± 12,86** a 8,85 ± 2,07 12,34 ± 7,84 0,58 ± 0,18 7
◦ post ovulationem 9,55 ± 4,25 65,76 ± 27,05 b 2,56 ± 1,34 8,88 ± 4,40 13,45 ± 8,30 b 7,96 ± 4,33 9,67 ± 6,23 0,51 ± 0,24 49
Ergebnisse 78
79 In der Lutealphase war die hepatische GHR-Expression in Tendenz niedriger als in der Follikelphase (P = 0,07; Tabelle 5 und Abbildung 22). Innerhalb der Follikelphase war die GHR-Expression kurz vor der Ovulation höher als direkt nach der Ovulation (P < 0,01). Die GHR-Expression vor der Ovulation war höher als während der Lutealphase (P < 0,01), wohingegen die GHR-Expression direkt nach der Ovulation mit der Expression in der Lutealphase vergleichbar war (P > 0,1).
Lutealphase vor Ov. nach Ov.
0 50 100 150
200
****
(*)
G H R m R N A ( R A )
Abbildung 22: Expression des Wachstumshormon-Rezeptors (GHR) in der Leber vor und nach der Ovulation und in der Lutealphase, ** P < 0,01, (*) P < 0,1 in Tendenz; RA; relative M
80
Die SOCS2-Expression war in der Lutealphase niedriger als während der Follikelphase (P < 0,05; Tabelle 5). Betrachtet man die SOCS2-Expression innerhalb der Follikelphase, wird deutlich, dass diese kurz vor der Ovulation höher war als direkt nach der Ovulation (P < 0,01). Nur kurz vor der Ovulation war die SOCS2-Expression deutlich höher als in der Lutealphase (P < 0,01), während sie kurz nach der Ovulation bereits wieder mit der Lutealphase vergleichbar war (P > 0,1, Abbildung 23).
Lutealphase vor Ov. nach Ov.
0 20 40 60
**
**
*
S O C S 2 m R N A ( R A )
Abbildung 23: Expression der Suppressor of cytokine signaling 2 (SOCS2) vor und nach der Ovulation und in der Lutealphase, ** P < 0,01, * P < 0,05; RA; relative abundance
81 4.2 In vitro Versuch
Im Folgenden werden die Ergebnisse des in vitro Teils der Arbeit beschrieben, welche am Modell zweier verschiedener Leberzellkulturen (HepG2-Zellen und primäre Rattenhepatozyten) generiert wurden.
4.2.1 Hormonanalysen im Medium vor Versuchsstart
Vor Versuchsstart wurden in den Medien folgende Hormonkonzentrationen gemessen.
Gesamtöstrogene und Progesteron
Im 0-Medium wurde eine geringe Konzentration von Gesamtöstrogenen nachgewiesen und Progesteron lag unterhalb der Nachweisgrenze (RPMI-Medium, Tabelle 6) oder nur knapp darüber (M199-Medium; Tabelle 7). Nach Zugabe der jeweiligen Steroidhormone in das E1-, E2-, P4- und E1, E2, P4-Medium wurden die zugesetzten Hormone sogar zu mehr als 100 % im Medium nachgewiesen.
Tabelle 6: Konzentrationen von Gesamtöstrogenen (E) und Progesteron (P4) im RPMI-Medium vor Versuchsstart; E1: Östron, E2: 17-β-Östradiol, P4: Progesteron
Medium Zusatz Konzentration P4
(ng/ml)
E (pg/ml)
0-Medium - < 0,09 29,2 ± 21,9
E1-Medium E1 1000 pg/ml < 0,09 1817,0 ± 60,8 E2-Medium E2 1000 pg/ml < 0,09 1059,1 ± 16,9 P4-Medium P4 20 ng/ml 26,7 ± 31,6 24,0 ± 13,4 E1, E2, P4
-Medium
E1, E2, P4 1000,1000 pg/ml
und 20 ng/ml 29,2 ± 1,3 3009,7 ± 21,7
82
Tabelle 7: Konzentration von Gesamtöstrogenen (E) und Progesteron (P4) im M 199-Medium vor Versuchsstart; E2: 17-β-Östradiol, P4: Progesteron
Medium Zusatz Konzentration P4
(ng/ml)
E (pg/ml)
0-Medium - - 0,17 ± 0,10 43,3
E2-Medium E2 1000 pg/ml 0,15 ± 0,03 1400,3 ± 409,6 P4-Medium P4 20 ng/ml 40,60 ± 4,90 101,8
4.2.1.1 Bovines Wachstumshormon, insulinähnlicher Wachstumsfaktor-I und -II
Im 0-Medium konnte vor Versuchsstart ferner GH, IGF-I und -II nachgewiesen werden (Tabelle 8).
Tabelle 8: Konzentration an bovinem Wachstumshormon (bGH) und insulinähnlichem Wachstumsfaktor-I und -II (IGF-I, -II) im Zellkultur-Medium vor Zellkontakt
Medium bGH (ng/ml) IGF-I (ng/ml) IGF-II (ng/ml)
0-Medium (RPMI) 17,0 ± 16,8 97,6 ± 58,6 10,6 ± 4,2 0-Medium (M 199) 13,0 ± 8,4 28,3 ± 2,1 11,4 ± 1,3
83 Die IGF-I- und -II-Konzentration im 0-Medium (RPMI) war über sechs Tage Lagerung im Kühlschrank hinweg konstant (Abbildung 24).
Abbildung 24: IGF-I-, –II-Konzentration (ng/ml) im 0-Medium nach der Lagerung im Kühlschrank bei 5 °C über sechs Tage hinweg
4.2.2 Charakterisierung von HepG2-Zellen
Die HepG2-Zellen zeigten nach Adhäsion typische kuboidale Morphologie (Abbildung 25).
Abbildung 25: HepG2-Zellen; A: in der Thomakammer zur Zellzählung; B: in Kultur; jeweils 100 fache Vergrößerung (Objektiv 10 x, Okular 10 x)
84
4.2.2.1 Wachstumskurve
Zur Charakterisierung der HepG2-Zellen wurde ihre Wachstumsgeschwindigkeit in Form einer Wachstumskurve bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass nach fünf Tagen (3,7 x 105 ± 0,35 x 105 Zellen) die Zellzahl deutlich höher war als zum Zeitpunkt der Aussaat (1,6 x 105 Zellen, P < 0,01). Überdies war die Zellzahl nach insgesamt zehn Tagen Kultur (1,7 x 106 ± 1,7 x 105 Zellen) deutlich höher als nach fünf Tagen (P < 0,001). Die Wachstumskurve ist in Abbildung 26 dargestellt.
Abbildung 26: Wachstumskurve der HepG2-Zellen über zehn Tage; ** P < 0,01, *** P < 0,001
4.2.2.2 Nachweis des GHR auf HepG2-Zellen mittels Durchflusszytometrie Mit Hilfe der Durchflusszytometrie konnte gezeigt werden, dass HepG2-Zellen den GHR exprimieren. Hepatozyten, welche vor der Inkubation mit einem Fluoreszenzfarbstoff-markierten Antikörper gegen GHR mit Hilfe von Ethanol permeabilisiert wurden, zeigten eine höhere (213 ± 180 FI) mittlere PE-Fluoreszenz-Intensität (FI) für Licht der Wellenlänge 580 nm ± 30 verglichen mit HepG2-Zellen
***
**
85 deren GHR nicht durch Vorbehandlung für den GHR-Antikörper zugänglich gemacht wurden (81 ± 38 FI). Durch eine weitere Behandlung der HepG2-Zellen mit Triton zur Permeabilisierung verstärkte sich dieser Effekt (958 ± 513 FI, Abbildung 27).
Abbildung 27: Fluoreszenzprofil der HepG2-Zellen; rot: Negativkontrolle, nicht permeabilisierte HepG2-Zellen, keine Bindung des GHR-Antikörpers, grün: mit Ethanol fixierte HepG2-Zellen, nur eingeschränkte Bindung des GHR-Antikörpers, blau: mit Triton vorbehandelte HepG2-Zellen, mit Fluoreszenzfarbstoff-markiertem GHR-Antikörper behandelt.
4.2.2.3 IGF-Konzentration im Medium nach Kultur mit HepG2-Zellen
Die viertägige Kultivierung von HepG2-Zellen führte zu keiner Veränderung der IGF-I- und –IIGF-I-Konzentration im 0-Medium (P > 0,05; Abbildung 28; Abbildung 29).
86
vor Zellkontakt nach Zellkontakt 0
20 40 60
IGF-I (ng/ml)
Abbildung 28: Insulinähnlicher Wachstumsfaktor-I (IGF-I)-Konzentration in ng/ml im Zellkulturmedium vor Kontakt mit Hepatozyten und nach viertägiger Kultivierung der HepG2-Zellen, dargestellt ist jeweils der Median und der Interquartil-Abstand
vor Zellkontakt nach Zellkontakt 0
10 20 30
IGF-II (ng/ml)
Abbildung 29: Insulinähnlicher Wachstumsfaktor-II (IGF-II)-Konzentration in ng/ml im Zellkulturmedium vor Kontakt mit Hepatozyten und nach viertägiger Kultivierung der HepG2-Zellen, dargestellt ist jeweils der Median und der Interquartil-Abstand
87 4.2.3 Kurzzeit-Einfluss von Sexualsteroidhormonen auf die IGF-Produktion in
HepG2-Zellen
4.2.3.1 Hormonanalyse im Medium IGF-I
Nach 24 Stunden Kultur war die IGF-I-Konzentration in allen Medien höher als vor Versuchsstart (P < 0,05). Nach 48 Stunden Kultur und GH-Einwirkung war diese jedoch nur noch im P4- und E1, E2, P4-Medium erhöht.
Abbildung 30 zeigt die IGF-I-Konzentration im Medium pro 1 x 107 HepG2-Zellen als Differenz zur IGF-I-Konzentration vor Versuchsstart.
- - E1 E2 P4 E1, E2, P4 - - E1 E2 P4 E1, E2, P4 0
50 100 150
Zusätze:
GH-Stimulation
(24 h Inkubation): - - - + + + +
Inkubation im
Medium: 24 Stunden 48 Stunden
-- +
a
b
IGF-I (ng/ml)
Abbildung 30: Insulinähnlicher Wachstumsfaktor-I (IGF-I)-Konzentration pro 1 x 107 Zellen in den verschiedenen Medien nach 24 h und 48 h HepG2-Zellen-Kultur und Einwirkung von Wachstumshormon (GH), als Differenz zur IGF-I-Konzentration im Medium vor Versuchsstart;
dargestellt ist jeweils der Median und die Interquartil-Abstände; E1: Östron, E2: 17-β-Östradiol, P4: Progesteron; a, b: a ist niedriger als b (P > 0,05)
88
Nach 24 Stunden Kultur war lediglich die IGF-I-Konzentration im E1, E2, P4-Medium höher als im 0-Medium (P < 0,05). In allen anderen Medien waren die IGF-I-Konzentrationen vergleichbar (Abbildung 30).
Ferner war die IGF-I-Konzentration nach der Kultur über insgesamt 48 Stunden und GH-Einwirkung in allen Medien mit der nach 24 Stunden vergleichbar. Die Einwirkung von GH hatte keinen stimulierenden Effekt auf die IGF-I-Konzentration im Medium (Abbildung 30).
IGF-II
Im Vergleich zu der IGF-II-Konzentration vor Versuchsstart, war diese nach 24 Stunden nur im 0-Medium erniedrigt (P < 0,05), in den Hormonmedien aber mit der IGF-II-Konzentration im Medium vor Versuchsbeginn vergleichbar. Nach 48 Stunden Zellkultur war die IGF-II-Konzentration bereits im 0-Medium und im E1-, E2- und E1, E2, P4-Medium unter GH-Zusatz höher als vor Versuchsbeginn (P < 0,05), in den restlichen Medien war sie vergleichbar.
Die Abbildung 31 zeigt die IGF-II-Konzentration im Medium pro 1 x 107 HepG2-Zellen als Differenz zur IGF-II-Konzentration vor Versuchsstart.
89
Abbildung 31: Insulinähnlicher Wachstumsfaktor-II (IGF-II)-Konzentration pro 1 x 107 Zellen in den verschiedenen Medien nach 24 und 48 Stunden HepG2-Zellen-Kultur und Einwirkung von Wachstumshormon (GH), als Differenz zur IGF-II-Konzentration im Medium vor Versuchsstart, dargestellt ist jeweils der Median und die Interquartil-Abstände; E1: Östron, E2: 17-β-Östradiol, P4: Progesteron; a, b: a ist niedriger als b; c, d: c ist niedriger als d (P < 0,05)
Nach 24 Stunden Kultur war im Vergleich zum 0-Medium in allen Hormonmedien eine höhere IGF-II-Konzentration nachweisbar (P < 0,05). Nach GH-Einwirkung und insgesamt 48 Stunden Kultur war dieser Effekt nur noch im E1 und E1, E2, P4– Medium ersichtlich (P < 0,05; Abbildung 31). Außerdem war die IGF-II-Konzentration in allen Medien nach 24 Stunden und nach 48 Stunden vergleichbar (Abbildung 31).
Der Zusatz von GH führte zu einer signifikant geringeren IGF-II-Konzentration im 0-Medium, dies konnte jedoch in den Hormonmedien nicht beobachtet werden. Die IGF-II-Konzentration in den Medien mit E1 war sogar höher als im 0-Medium mit GH (P < 0,05; Abbildung 31).
90
4.2.3.2 PCR-Analyse der Zellen
Abbildung 32 zeigt die RA der IGF-II-mRNA in den HepG2-Zellen nach 48 Stunden Kultur in den verschiedenen Medien.
- - E1 E2 P4 E1, E2, P4 0
500 1000 1500
Zusätze:
GH-Stimulation
(24 h Inkubation): - + + +
Inkubation im
Medium: 48 Stunden
++
a a
b
IGF-II mRNA (RA)
Abbildung 32: Relative Expression der IGF-II mRNA nach 48 Stunden Kultur der HepG2, mit und ohne Wachstumshormon (GH); a, b: P < 0,05, als Housekeeping-Gene wurde β-Aktin verwendet; RA:
relativ abundance
Die relative Menge der IGF-II mRNA war bei Zellen, die im E2–Medium kultiviert wurden höher als bei den im 0-Medium kultivierten (P < 0.05). Es war kein Einfluss von GH auf die IGF-II-Expression zu erkennen (P > 0,05).
91 Zusammenfassung der Ergebnisse:
IGF-I
• GH hatte keinen Effekt auf die IGF-I-Konzentration im Zellkulturmedium
• außer im E1, E2, P4-Medium war kein Effekt von Sexualsteroidhormonen auf die IGF-I-Konzentration im Medium erkennbar
IGF-II
• GH hatte einen supprimierenden Effekt auf die IGF-II-Konzentration im Medium
• Der Zusatz von Sexualsteroidhormonen führte nach 24 Stunden generell zu einer Erhöhung der IGF-II-Konzentration im Medium
• In Medien mit E1 waren die IGF-II-Konzentrationen unter GH-Einwirkung höher als im 0-Medium
IGF-II mRNA
• GH hatte keinen Effekt auf die IGF-II-mRNA-Expression
• E2 führte zu einer Erhöhung der IGF-II-Expression
4.2.4 Langzeit-Einfluss von Sexualsteroidhormonen auf HepG2-Zellen 4.2.4.1 Hormonanalyse im Medium
Wichtig für das Verständnis der Ergebnisse dieses Versuches ist es zu beachten, dass die IGF-I- und -II-Konzentration in den Medien nur die IGF-Syntheseleistung der HepG2-Zellen über die letzten drei Tage hinweg widerspiegeln kann, da der letzte Mediumwechsel zum Entnahme-Zeitpunkt jeweils drei Tage zurück lag.
IGF-I
Im Vergleich zu der IGF-I-Konzentration vor Versuchsstart, war diese in allen Medien nach sieben Tagen Kultur unverändert, während sie nach 14 und nach 21 Tagen Kultur in allen Medien deutlich erniedrigt war (P < 0,05).
92
Abbildung 33: Insulinähnlicher Wachstumsfaktor-I (IGF-I)-Konzentration pro 1 x 107 Zellen in den verschiedenen Medien nach sieben und 14 Tagen, Mediumwechsel intermittierend jeden dritten und vierten Tag; Darstellung als Differenz zur IGF-I-Konzentration im Medium vor Versuchsstart, gezeigt ist jeweils der Median und die Interquartil-Abstände; E1: Östron, E2: 17-β-Östradiol, P4: Progesteron;*:
Unterschied zu IGF-I-Konzentration nach sieben Tagen Kultur (P < 0,05); a ,b: a ist niedriger als b (P
< 0,05), c, d: c ist niedriger als d (P < 0,05)
Nach sieben Tagen Kultur konnte kein stimulierender Effekt von Sexualsteroidhormonen auf die IGF-II-Konzentration im Medium festgestellt werden.
Im Gegenteil, die IGF-I-Konzentration im E1-Medium war sogar niedriger als im 0-Medium (P < 0,05). Auch im Vergleich zu der IGF-I-Konzentration nach sieben Tagen Kultur, war diese nach 14 Tagen deutlich niedriger (P < 0,05). Des Weiteren war die
93 IGF-I-Konzentration nach 14 Tagen im P4- und E1, E2, P4-Medium niedriger als im 0-Medium (P < 0,05), in den restlichen Medien war sie vergleichbar.
Abbildung 34 zeigt die IGF-I-Konzentration in den Medien pro 1 x 107 HepG2-Zellen nach 14 und 21 Tagen Kultur und anschließender GH-Einwirkung als Differenz zu der IGF-I-Konzentration vor Versuchsstart.
- E1 E2 P4 E1,E2,P4 - E1 E2 P4 E1,E2,P4 -20
-10 0 10 20
Zusätze:
GH-Stimulation
(24 h Inkubation): - - - + + + + +
Entnahmen der
Proben nach: 14 Tage 21 Tage
IGF-I (ng/ml)
Abbildung 34: Insulinähnlicher Wachstumsfaktor-I (IGF-I)-Konzentration pro 1 x 107 Zellen im Medium nach 14 und 21 Tagen Zellkultur, abschließende Wachstumshormon (GH)-Stimulation über 24 Stunden, Mediumwechsel intermittierend jeden dritten und vierten Tag, die IGF-I-Konzentrationen sind als Differenz zur IGF-I-Konzentration vor Versuchsstart angegeben, dargestellt ist jeweils der Median und die Interquartil-Abstände; E1: Östron, E2: 17-β-Östradiol, P4: Progesteron
Die IGF-I-Konzentration nach 21 Tagen HepG2-Kultur und GH-Einwirkung war in allen Medien mit der IGF-I-Konzentration nach 14 Tagen Zellkultur vergleichbar.
Ferner konnte auch kein Effekt von Sexualsteroidhormonen auf die IGF-I-Konzentration nach 21 Tagen Kultur und GH-Stimulation beobachtet werden.
94 IGF-II
Sowohl nach sieben und 14 wie auch nach 21 Tagen Kultur der HepG2-Zellen war die IGF-II-Konzentration im zuletzt zugesetzten Medium durchgehend höher als vor Versuchsstart (P < 0,05).
In Abbildung 35 ist die IGF-II-Konzentration in den jeweiligen Medien pro 1 x 107 HepG2-Zellen nach sieben und 14 Tagen Kultur als Differenz zu der IGF-II-Konzentration vor Versuchsstart dargestellt.
Abbildung 35: Insulinähnlicher Wachstumsfaktor-II (IGF-II)-Konzentration pro 1 x 107 Zellen in den verschiedenen Medien nach sieben und 14 Tagen, Mediumwechsel intermittierend jeden dritten und vierten Tag; Darstellung als Differenz zur IGF-II-Konzentration im Medium vor Versuchsstart, gezeigt ist jeweils der Median und die Interquartil-Abstände; E1: Östron, E2: 17-β-Östradiol, P4: Progesteron; *:
Unterschied zu IGF-II-Konzentration nach sieben Tagen Kultur (P < 0,05), a ,b: a ist niedriger als b (P
< 0,05)
Nach sieben Tagen Kultur war nur die IGF-II-Konzentration im E2-Medium höher als im 0-Medium (P < 0,05), in allen anderen Medien war sie vergleichbar (Abbildung
95 35). Außerdem war nach weiteren sieben Tagen Kultur (insgesamt 14 Tage) im zuletzt zugesetzten 0- und E1-Medium ein erneuter Anstieg von IGF-II erkennbar (P <
0,05). In den anderen Medien war die IGF-I-Konzentration nach 14 Tagen mit der nach sieben Tagen vergleichbar. Am Tag 14 der Zellkultur konnte kein Effekt der verschiedenen Hormonmedien auf die IGF-II-Konzentration nachgewiesen werden, sie war in allen Medien vergleichbar (P > 0,05; Abbildung 35).
Abbildung 36 zeigt die IGF-II-Konzentration in den Medien pro 1 x 107 HepG2-Zellen nach 14 und 21 Tagen Kultur und anschließender GH-Einwirkung als Differenz zu der IGF-II-Konzentration vor Versuchsstart.
- E1 E2 P4 E1, E2, P4 - E1 E2 P4 E1, E2, P4
0 10 20 30 40 50
Zusätze:
GH-Stimulation
(24 h Inkubation): - - - + + + + +
Entnahmen der
Proben nach: 14 Tage 21 Tage
* *
a
b
IGF-II (ng/ml)
Abbildung 36: Insulinähnlicher Wachstumsfaktor-II (IGF-II)-Konzentration pro 1 x 107 Zellen im Medium nach 14 und 21 Tagen Zellkultur, abschließende Wachstumshormon (GH)-Stimulation über 24 Stunden, Mediumwechsel intermittierend jeden dritten und vierten Tag, die IGF-II-Konzentrationen ist als Differenz zur IGF-II-Konzentration vor Versuchsstart angegeben, dargestellt ist jeweils der Median und die Interquartil-Abstände; E1: Östron, E2: 17-β-Östradiol, P4: Progesteron; *: Unterschied zu IGF-II-Konzentration nach sieben Tagen Kultur (P < 0,05) a, b: a ist niedriger als b (P < 0,05)
96
Nach 21 Tagen Kultur und 24 Stunden GH-Einwirkung war die IGF-II-Konzentration im Vergleich zu der nach 14 Tagen unverändert. Interessanterweise war aber die IGF-II-Konzentration im zuletzt zugesetzten E2-Medium höher als im Basalmedium (P < 0,05).
4.2.4.2 PCR-Analyse der Zellen
Abbildung 37 und Abbildung 38 zeigen die relative Menge der IGF-II-Expression in den HepG2-Zellen nach sieben, 14 und 21 Tagen Kultur in den verschiedenen Medien und finaler GH-Einwirkung über 24 Stunden.
- E1 E2 P4 E1, E2. P4 - E1 E2 P4 E1, E2, P4 0
1000 2000 3000
Zusätze:
GH-Stimulation
(24 h Inkubation): - - - -
-Entnahmen der
Proben nach: 7 Tage 14 Tage
- - - -
-IGF-II mRNA Expression
Abbildung 37: Relative Menge (RA) der IGF-II mRNA nach sieben und 14 Tagen Kultur der HepG2, mit und ohne Wachstumshormon (GH), als Housekeeping-Gene wurde β-Aktin verwendet
97 Die IGF-II-Expression war nach sieben und nach 14 Tagen Kultur in den verschiedenen Medien vergleichbar (Abbildung 37).
- E1 E2 P4 E1, E2, P4 - E1 E2 P4 E1, E2, P4 0
1000 2000 3000
Zusätze:
GH-Stimulation
(24 h Inkubation): - - - + + + + +
Entnahmen der
Proben nach: 14 Tage 21 Tage
IGF-II mRNA Expression
Abbildung 38: Relative Expression der IGF-II mRNA nach 14 und 21 Tagen Kultur der HepG2, mit und ohne Wachstumshormon (GH), als Housekeeping-Gene wurde ß-Aktin verwendet
Auch nach 21 Tagen Kultur und finaler GH-Einwirkung über 24 Stunden war die IGF-II-Expression in den HepG2-Zellen unabhängig vom Medium mit der Expression nach 14 Tagen vergleichbar (Abbildung 38).
4.2.4.3 Harnstoffanalyse im Medium
Abbildung 39 zeigt die dreitägige Harnstoff-Syntheseleistung der HepG2-Zellen in den verschiedenen Medien nach sieben und 21 Tagen und finaler GH-Einwirkung.
98
- E1 E2 P4 E1, E2 ,P4 - E1 E2 P4 E1, E2, P4 0.00
0.05 0.10 0.15 0.20 0.25
Zusätze:
GH-Stimulation
(24 h Inkubation): - - - + + + + +
Entnahmen der
Proben nach: 7 Tage 21 Tage
a
b
Urea (nmol/ml)
Abbildung 39: Konzentration von Urea (Harnstoff) in nmol/ml im Medium nach 3 Tagen Inkubation des Mediums mit den HepG2-Zellen und sieben Tagen Zellkultur, sowie 21 Tagen Zellkultur inklusive 24 Stunden Inkubation mit hGH, dargestellt ist jeweils der Median und die Interquartil-Abstände, die Konzentrationen sind als Differenz zur Urea-Konzentration im Basalmedium vor Zellkontakt angegeben, E1: Östron, E2: 17-β-Östradiol, P4: Progesteron; a, b: a ist niedriger als b (P < 0,05)
Die Harnstoff-Konzentration im E2-Medium war nach sieben Tagen Zellkultur höher als im 0-Medium (P > 0,05). Ansonsten war die Konzentration von Harnstoff (Urea) in allen anderen Medien konstant.
99 Zusammenfassung der Ergebnisse
IGF-I
• GH hatte keinen stimulierenden Effekt auf die IGF-I-Konzentration im Medium
• Die IGF-I-Konzentration im zuletzt zugesetzten Medium sank über die gesamte Kulturdauer ab
• Sexualsteroidhormone hatten keinen stimulierenden Effekt auf die IGF-I-Konzentration im Medium
IGF-II
• GH hatte keinen stimulierenden Effekt auf die IGF-II-Konzentration
• Die dreitägige IGF-II-Syntheseleistung der HepG2-Zellen verhielt sich über 21 Tage Kultur hinweg konstant
• Nach sieben Tagen Kultur konnte eine Erhöhung der IGF-II-Konzentration im E1-Medium beobachtet werden, nach 21 Tagen und GH-Einwirkung eine Erhöhung im E2-Medium; abgesehen davon hatten die Sexualsteroidhormone keinen Einfluss auf die IGF-II-Konzentration im Medium
IGF-II mRNA
• Es war kein stimulierender Effekt von GH oder Sexualsteroidhormonen auf die IGF-II-mRNA-Expression zu erkennen
• Die IGF-II-Expression in den HepG2-Zellen war über 21 Tage hinweg konstant Harnstoff
• GH hatte keine Einfluss auf die dreitägige Harnstoff-Syntheseleistung
• Die dreitägige Harnstoff-Syntheseleistung war über 21 Tage hinweg konstant
• Nach sieben Tagen Kultur war die Harnstoff-Konzentration im E2-Medium höher als im 0-Medium, ansonsten war kein Einfluss von Sexualsteroidhormonen erkennbar
100
4.2.5 Vorversuch an primären Rattenhepatozyten
Um den Kurzzeit-Einfluss von Sexualsteroidhormonen auf die IGF-Produktion primärer Rattenzellen zu analysieren, wurde ein Vorversuch mit folgenden Ergebnissen durchgeführt.
4.2.5.1 Hormonanalyse im Medium IGF-I
Die IGF-I-Konzentration im Medium war sowohl nach 14-17 Stunden wie auch nach insgesamt 35-42 Stunden und finaler GH-Einwirkung deutlich geringer als vor Versuchsbeginn (148,7 ± 45,3 ng/ml; P < 0,01).
Des Weiteren zeigt die Abbildung 40 die IGF-I-Konzentration (nicht als Differenz zur IGF-I-Konzentration im 0-Medium) in den verschiedenen Medien nach der ersten (14-17 Stunden) und zweiten (35-42 Stunden) Kulturphase.
101 - - E1 E2 P4 E1, E2, P4 - - E1 E2 P4 E1, E2, P4 0
10 20 30 40
Zusätze:
GH-Stimulation
(24 h Inkubation): - - - + + + +
Inkubation im
Medium: 17-14 Stunden insgesamt: 35-42 Stunden
- - +
a IGF-I (ng/ml) b
Abbildung 40: Konzentration des insulinähnlichen Wachstumsfaktor-I (IGF-I) pro 1 x 106 Zellen nach 14-17 Stunden Kultur der primären Rattenhepatozyten mit den verschiedenen Medien und erneuter 21-25-stündiger Kultur (insgesamt 35-42 Stunden Kultur) der Zellen mit und ohne Wachstumshormon (GH); dargestellt ist jeweils der Median und die Interquartil-Abstände, E1: Östron, E2: 17-β-Östradiol, P4: Progesteron
Nach der ersten Kulturphase war die IGF-I-Konzentration im P4-Medium höher als im 0-Medium (P < 0,05). In allen anderen Medien war die IGF-I Konzentration vergleichbar. Ferner war die IGF-I-Konzentration nach der ersten Kulturphase und der zweiten Kulturphase vergleichbar.
Ein stimulierender Effekt von GH auf die IGF-I-Konzentration war nicht erkennbar und nach der zweiten Kulturphase war auch kein Einfluss der Sexualsteroidhormone auf die IGF-I-Konzentration mehr nachweisbar (Abbildung 40).
102 IGF-II
Die IGF-II-Konzentration war in allen Medien nach der ersten und zweiten Kulturphasen mit der vor Versuchsstart (15,1 ± 2,1 ng/ml) vergleichbar.
Abbildung 41 zeigt die IGF-II-Konzentration in den verschiedenen Medien jeweils nach der ersten und zweiten Kulturphase.
Abbildung 41: Konzentration des insulinähnlichen Wachstumsfaktor-II (IGF-II) pro 1 x 106 Zellen nach 14-17 h und insgesamt 35-42 h Kultur der primären Rattenhepatozyten in den verschiedenen Medien mit finaler Wachstumshormon (GH)-Einwirkung; dargestellt ist jeweils der Median und die Interquartil-Abstände, E1: Östron, E2: 17-β-Östradiol, P4: Progesteron; a ist niedriger als b (P < 0,05), c, d: c ist niedriger als d (P < 0,05)
Nach der ersten Kulturphase war die IGF-II-Konzentration im P4-Medium höher als im 0-Medium (P < 0,05). In allen anderen Medien war die IGF-II-Konzentration vergleichbar. Außerdem war die IGF-II-Konzentration nach der ersten und der zweiten Kulturphase vergleichbar. Auch im Anschluss an die zweite Kulturphase
103 konnte im P4-Medium eine höhere IGF-II-Konzentration als im 0-Medium nachgewiesen werden (P < 0,05), ansonsten war diese in den Medien vergleichbar.
Überdies konnte kein stimulierender Effekt von GH auf die IGF-II-Konzentration nachgewiesen werden (Abbildung 41).
Da nach einer Versuchsdauer von maximal 42 Stunden durchschnittlich nur noch 20,8 % ± 19,9 % der Zellen vital waren, wurde auf eine PCR-Analyse verzichtet und für den Hauptversuch eine entsprechend kürzere Kulturdauer gewählt.
Zusammenfassung der Ergebnisse IGF-I
• Es war kein Effekt von GH auf die IGF-I-Konzentration erkennbar
• Die Konzentration von IGF-I im Medium war nach der ersten und zweiten
• Die Konzentration von IGF-I im Medium war nach der ersten und zweiten