3 Material und Methoden
3.3 Statistische Auswertung
3.3.2 Statistische Auswertung der Ergebnisse der in vitro Versuche
Die Hormon-Konzentration der Zellkulturmedien der in vitro Versuche wurde jeweils pro Zelle berechnet, indem diese durch die Zellzahl dividiert wurde. Danach wurde die Hormon-Konzentration durch Multiplikation pro 1 x 107 HepG2-Zellen oder 1 x 106 primären Rattenzellen berechnet. Für die Auswertung des Versuches zum
72
Kurzzeiteinfluss von Sexualsteroidhormonen auf HepG2-Zellen (3.2.4) wurde die Zellzahl nach 24 Stunden Inkubation im Medium als 75 % der Zellzahl nach 48 Stunden angenommen (entsprechend der Wachstumskurve der HepG2-Zellen), da zu diesem Zeitpunkt keine Zellzahl durch Zählung ermittelt werden konnte.
Die RA der mRNA in den Zellen wurde ebenfalls mit der ∆Ct-Methode berechnet, wobei der MW der Housekeeping-Gene pro Versuch gebildet wurde und zunächst auf Vergleichbarkeit zwischen den Versuchen geprüft wurde.
Für die Datenanalyse der Versuche mit HepG2-Zellen wurde der Kruskall-Wallis Test und der Mann-Whitney Test gewählt, da aufgrund des relativ niedrigen Stichprobenumfanges nicht auf Gauß’sche Normalverteilung geprüft werden konnte.
Die Hormonkonzentrationen in den Medien werden im Folgenden als arithmetischer Mittelwert und Standardabweichung angegeben, während in den Säulendiagrammen jeweils der Median und die Interquartil-Abstände der Differenz zu den Konzentrationen im Medium vor Zellkontakt dargestellt werden.
Die Auswertung der Versuche an primären Rattenhepatozyten wurde ebenfalls mit dem Kruskall-Wallis Test und dem Mann-Whitney Test durchgeführt, sofern die Parameter aus dem Medium von verschiedenen Zellpopulationen stammten. Die Parameter nach unterschiedlich langer Inkubation mit denselben primären Rattenhepatozyten, wurden mit dem Wilcoxon signed rank Test analysiert. Die Hormon-Konzentrationen in den Medien werden ebenfalls als arithmetischer Mittelwert und Standardabweichung (Stab) angegeben, während in den Säulendiagrammen jeweils der Median und die Interquartil-Abstände der Hormon-Konzentrationen im Medium dargestellt werden.
Für die Signifikanzangaben in der vorliegenden Dissertation gilt Folgendes:
P > 0,10 n.s. nicht signifikant P < 0,10 (*) statistische Tendenz P < 0,05 * schwach signifikant P < 0,01 ** signifikant
P < 0,001 *** hoch signifikant
73 4 Ergebnisse
Im Folgenden werden zunächst die Ergebnisse des in vivo Versuches und anschließend die Ergebnisse des in vitro Teils an Zellkulturen (HepG2-Zellen, Primärhepatozyten der Ratte) beschrieben.
4.1 In vivo Versuch 4.1.1 Tiere
Die mittlere Zykluslänge der Färsen lag bei 20 ± 2 Tagen. In der Lutealphase konnte am Tag 12 ± 1 ultrasonographisch ein Gelbkörper-Durchmesser von im Durchschnitt 2,1 ± 0,4 cm gemessen werden. In der Follikelphase lag der Durchmesser des Follikels am Tag vor der Ovulation bei 1,3 ± 0,2 cm (Abbildung 18). Bei den meisten Tieren konnte die Ovulation, anhand der Abwesenheit des präovulatorischen Follikels, in den späten Abendstunden beobachtet werde.
Abbildung 18: Ultrasonographische Darstellung eines Ovars A: ultrasonographisch: mit Blüte-Gelbkörper am Tag 12 des Zyklus; B: ultrasonographisch: mit einem Follikel kurz vor der Ovulation
74
4.1.2 Hormonanalysen im Blut 4.1.2.1 Östrogene und Progesteron
Die Plasma-Konzentration an Östrogenen war in der Lutealphase niedriger (12,7 ± 3,6 pg/ml) als in der Follikelphase (17,2 ± 9,6 pg/ml; P < 0,01). Unterscheidet man innerhalb der Follikelphase zwischen vor und nach der Ovulation entnommenen Proben, wird deutlich, dass die Plasma-Östrogen-Konzentration der kurz vor der Ovulation beprobten Tiere deutlich höher (34,7 ± 5,3 pg/ml) war als nach der Ovulation (14,7 ± 0,8 pg/ml; P < 0,01). Sowohl vor als auch nach der Ovulation war die E-Konzentration höher als in der Lutealphase (P < 0,05).
Die Progesteron-Konzentration im Serum der Färsen war in der Lutealphase (5,9 ± 1,6 ng/ml) höher als in der Follikelphase (0,2 ± 0,1 ng/ml; P < 0,0001).
Innerhalb der Follikelphase waren die P4-Konzentrationen kurz vor (0,2 ± 0,1 ng/ml) und kurz nach der Ovulation (0,2 ± 0,2 ng/ml) vergleichbar und signifikant niedriger als in der Lutealphase (P < 0,05).
4.1.2.2 Wachstumshormon, insulinähnlicher Wachstumsfaktor-I und -II
Die Konzentration an Wachstumshormon im Plasma war während der Lutealphase (5,8 ± 4,9 ng/ml) niedriger als in der Follikelphase (11,9 ± 12,7; P < 0,0001;
Abbildung 19).
Innerhalb der Follikelphase waren die GH-Konzentrationen kurz vor (23,3 ± 26,7 ng/ml) und nach der Ovulation (10,2 ± 8,5 ng/ml) vergleichbar (P > 0,05), aber jeweils höher als in der Lutealphase (P < 0,001).
75
Lutealphase Follikelphase 0
10 20 30 40
50 ***
G H ( n g /m l)
Abbildung 19: Wachstumshormon (GH)-Konzentration im Plasma in ng/ml während der Luteal- und während der Follikelphase; dargestellt als Box-Plot-Diagramm mit Median, Quartilen und 5 %- sowie 95 %-Perzentil; *** P < 0,001
Die Serum-Konzentration von IGF-I war in der Lutealphase (260,1 ± 59,8 ng/ml) niedriger als in der Follikelphase (333,0 ± 73,6 ng/ml; P < 0,0001;
Abbildung 20). Innerhalb der Follikelphase war die Serum-Konzentration von IGF-I kurz vor (323,4 ± 78,0 ng/ml) und nach der Ovulation (334,3 ± 73,6 ng/ml) vergleichbar, jeweils jedoch höher als in der Lutealphase (P < 0,05).
76
Lutealphase Follikelphase 100
200 300 400
500 ***
IG F -I ( n g /m l)
Abbildung 20: Insulinähnlicher Wachstumsfaktor I (IGF-I)-Konzentration im Serum in ng/ml während der Luteal- und der Follikelphase; dargestellt als Box-Plot-Diagramm mit Median, Quartilen und 5 %- und 95 %-Perzentil; *** P < 0,001
Die IGF-II-Konzentration war in der Lutealphase (56,3 ± 9,4 ng/ml) höher als in der Follikelphase (49,2 ± 8,1 ng/ml; P < 0,0001, Abbildung 21). Innerhalb der Follikelphase war die IGF-II-Konzentration kurz vor (52,4 ± 8,2 ng/ml) und direkt nach der Ovulation (48,8 ± 8,1 ng/ml) vergleichbar. Die IGF-II-Konzentrationen der Tiere, denen kurz vor der Ovulation Blut abgenommen wurde, war ferner mit der IGF-II-Konzentration in der Lutealphase vergleichbar, während die IGF-II-IGF-II-Konzentration im Serum kurz nach der Ovulation deutlich niedriger war als in der Lutealphase (P < 0,001).
77
Lutealphase Follikelphase 20
40 60
80 ***
IG F -I I ( n g /m l)
Abbildung 21: Insulinähnlichem Wachstumsfaktor II (IGF-II)-Konzentration im Serum in ng/ml während der Luteal- und der Follikelphase; dargestellt als Box-Plot-Diagramm mit Median, Quartilen und 5%- und 95%-Perzentil; *** P < 0,001
4.1.3 PCR-Analysen der Leberbiopsien
In Tabelle 5 ist die relative Menge mRNA- Expression von ERα, GHR, JAK2, STAT5B, SOCS2, SOCS3, IGF-I und IGF-II im Vergleich zu zwei Housekeeping Genen in der Leber in der Lutealphase und in der Follikelphase dargestellt.
Tabelle 5: Relative mRNA-Expression während der Luteal- und der Follikelphase (unterteilt in ante/post ovulationem), als Housekeeping-Gene wurden GAPDH und RPS9 verwendet, es wurden die Werte der Follikelphase sowie ihre Untergruppen gegen die Lutealphase getestet, ** P < 0,01, * P < 0,05, (*) P < 0,1 Tendenz; außerdem wurde die mRNA-Expression vor und nach der Ovulation verglichen, a, b kennzeichnet einen Unterschied zwischen der mRNA-Expression vor und nach der Ovulation (P < 0,05)
Die relative mRNA-Expression von ERα, JAK2, STAT5B, SOCS3, IGF-I und –II war in der Luteal- und Follikelphase vergleichbar (Tabelle 5).
mRNA (RA) / Zeitpunkt
ERα GHR JAK2 STAT5B SOCS2 SOCS3 IGF-I IGF-II n
Lutealphase 9,86 ± 4,31 61,55 ± 30,65 2,64 ± 1,61 9,08 ± 5,43 12,49 ± 9,67 8,23 ± 4,67 9,23 ± 7,22 0,56 ± 0,31 56
Follikelphase 9,79 ± 4,24 69,89 ± 31,44 (*) 2,64 ± 1,61 9,02 ± 4,39 14,98 ± 9,73* 8,07 ± 4,12 10,00 ± 6,43 0,52 ± 0,24 56
◦ ante ovulationem 11,50 ± 4,01 98,77 ± 45,79 ** a 3,21 ± 1,45 10,03 ± 4,47 25,65 ± 12,86** a 8,85 ± 2,07 12,34 ± 7,84 0,58 ± 0,18 7
◦ post ovulationem 9,55 ± 4,25 65,76 ± 27,05 b 2,56 ± 1,34 8,88 ± 4,40 13,45 ± 8,30 b 7,96 ± 4,33 9,67 ± 6,23 0,51 ± 0,24 49
Ergebnisse 78
79 In der Lutealphase war die hepatische GHR-Expression in Tendenz niedriger als in der Follikelphase (P = 0,07; Tabelle 5 und Abbildung 22). Innerhalb der Follikelphase war die GHR-Expression kurz vor der Ovulation höher als direkt nach der Ovulation (P < 0,01). Die GHR-Expression vor der Ovulation war höher als während der Lutealphase (P < 0,01), wohingegen die GHR-Expression direkt nach der Ovulation mit der Expression in der Lutealphase vergleichbar war (P > 0,1).
Lutealphase vor Ov. nach Ov.
0 50 100 150
200
****
(*)
G H R m R N A ( R A )
Abbildung 22: Expression des Wachstumshormon-Rezeptors (GHR) in der Leber vor und nach der Ovulation und in der Lutealphase, ** P < 0,01, (*) P < 0,1 in Tendenz; RA; relative M
80
Die SOCS2-Expression war in der Lutealphase niedriger als während der Follikelphase (P < 0,05; Tabelle 5). Betrachtet man die SOCS2-Expression innerhalb der Follikelphase, wird deutlich, dass diese kurz vor der Ovulation höher war als direkt nach der Ovulation (P < 0,01). Nur kurz vor der Ovulation war die SOCS2-Expression deutlich höher als in der Lutealphase (P < 0,01), während sie kurz nach der Ovulation bereits wieder mit der Lutealphase vergleichbar war (P > 0,1, Abbildung 23).
Lutealphase vor Ov. nach Ov.
0 20 40 60
**
**
*
S O C S 2 m R N A ( R A )
Abbildung 23: Expression der Suppressor of cytokine signaling 2 (SOCS2) vor und nach der Ovulation und in der Lutealphase, ** P < 0,01, * P < 0,05; RA; relative abundance
81 4.2 In vitro Versuch
Im Folgenden werden die Ergebnisse des in vitro Teils der Arbeit beschrieben, welche am Modell zweier verschiedener Leberzellkulturen (HepG2-Zellen und primäre Rattenhepatozyten) generiert wurden.
4.2.1 Hormonanalysen im Medium vor Versuchsstart
Vor Versuchsstart wurden in den Medien folgende Hormonkonzentrationen gemessen.
Gesamtöstrogene und Progesteron
Im 0-Medium wurde eine geringe Konzentration von Gesamtöstrogenen nachgewiesen und Progesteron lag unterhalb der Nachweisgrenze (RPMI-Medium, Tabelle 6) oder nur knapp darüber (M199-Medium; Tabelle 7). Nach Zugabe der jeweiligen Steroidhormone in das E1-, E2-, P4- und E1, E2, P4-Medium wurden die zugesetzten Hormone sogar zu mehr als 100 % im Medium nachgewiesen.
Tabelle 6: Konzentrationen von Gesamtöstrogenen (E) und Progesteron (P4) im RPMI-Medium vor Versuchsstart; E1: Östron, E2: 17-β-Östradiol, P4: Progesteron
Medium Zusatz Konzentration P4
(ng/ml)
E (pg/ml)
0-Medium - < 0,09 29,2 ± 21,9
E1-Medium E1 1000 pg/ml < 0,09 1817,0 ± 60,8 E2-Medium E2 1000 pg/ml < 0,09 1059,1 ± 16,9 P4-Medium P4 20 ng/ml 26,7 ± 31,6 24,0 ± 13,4 E1, E2, P4
-Medium
E1, E2, P4 1000,1000 pg/ml
und 20 ng/ml 29,2 ± 1,3 3009,7 ± 21,7
82
Tabelle 7: Konzentration von Gesamtöstrogenen (E) und Progesteron (P4) im M 199-Medium vor Versuchsstart; E2: 17-β-Östradiol, P4: Progesteron
Medium Zusatz Konzentration P4
(ng/ml)
E (pg/ml)
0-Medium - - 0,17 ± 0,10 43,3
E2-Medium E2 1000 pg/ml 0,15 ± 0,03 1400,3 ± 409,6 P4-Medium P4 20 ng/ml 40,60 ± 4,90 101,8
4.2.1.1 Bovines Wachstumshormon, insulinähnlicher Wachstumsfaktor-I und -II
Im 0-Medium konnte vor Versuchsstart ferner GH, IGF-I und -II nachgewiesen werden (Tabelle 8).
Tabelle 8: Konzentration an bovinem Wachstumshormon (bGH) und insulinähnlichem Wachstumsfaktor-I und -II (IGF-I, -II) im Zellkultur-Medium vor Zellkontakt
Medium bGH (ng/ml) IGF-I (ng/ml) IGF-II (ng/ml)
0-Medium (RPMI) 17,0 ± 16,8 97,6 ± 58,6 10,6 ± 4,2 0-Medium (M 199) 13,0 ± 8,4 28,3 ± 2,1 11,4 ± 1,3
83 Die IGF-I- und -II-Konzentration im 0-Medium (RPMI) war über sechs Tage Lagerung im Kühlschrank hinweg konstant (Abbildung 24).
Abbildung 24: IGF-I-, –II-Konzentration (ng/ml) im 0-Medium nach der Lagerung im Kühlschrank bei 5 °C über sechs Tage hinweg
4.2.2 Charakterisierung von HepG2-Zellen
Die HepG2-Zellen zeigten nach Adhäsion typische kuboidale Morphologie (Abbildung 25).
Abbildung 25: HepG2-Zellen; A: in der Thomakammer zur Zellzählung; B: in Kultur; jeweils 100 fache Vergrößerung (Objektiv 10 x, Okular 10 x)
84
4.2.2.1 Wachstumskurve
Zur Charakterisierung der HepG2-Zellen wurde ihre Wachstumsgeschwindigkeit in Form einer Wachstumskurve bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass nach fünf Tagen (3,7 x 105 ± 0,35 x 105 Zellen) die Zellzahl deutlich höher war als zum Zeitpunkt der Aussaat (1,6 x 105 Zellen, P < 0,01). Überdies war die Zellzahl nach insgesamt zehn Tagen Kultur (1,7 x 106 ± 1,7 x 105 Zellen) deutlich höher als nach fünf Tagen (P < 0,001). Die Wachstumskurve ist in Abbildung 26 dargestellt.
Abbildung 26: Wachstumskurve der HepG2-Zellen über zehn Tage; ** P < 0,01, *** P < 0,001
4.2.2.2 Nachweis des GHR auf HepG2-Zellen mittels Durchflusszytometrie Mit Hilfe der Durchflusszytometrie konnte gezeigt werden, dass HepG2-Zellen den GHR exprimieren. Hepatozyten, welche vor der Inkubation mit einem Fluoreszenzfarbstoff-markierten Antikörper gegen GHR mit Hilfe von Ethanol permeabilisiert wurden, zeigten eine höhere (213 ± 180 FI) mittlere PE-Fluoreszenz-Intensität (FI) für Licht der Wellenlänge 580 nm ± 30 verglichen mit HepG2-Zellen
***
**
85 deren GHR nicht durch Vorbehandlung für den GHR-Antikörper zugänglich gemacht wurden (81 ± 38 FI). Durch eine weitere Behandlung der HepG2-Zellen mit Triton zur Permeabilisierung verstärkte sich dieser Effekt (958 ± 513 FI, Abbildung 27).
Abbildung 27: Fluoreszenzprofil der HepG2-Zellen; rot: Negativkontrolle, nicht permeabilisierte HepG2-Zellen, keine Bindung des GHR-Antikörpers, grün: mit Ethanol fixierte HepG2-Zellen, nur eingeschränkte Bindung des GHR-Antikörpers, blau: mit Triton vorbehandelte HepG2-Zellen, mit Fluoreszenzfarbstoff-markiertem GHR-Antikörper behandelt.
4.2.2.3 IGF-Konzentration im Medium nach Kultur mit HepG2-Zellen
Die viertägige Kultivierung von HepG2-Zellen führte zu keiner Veränderung der IGF-I- und –IIGF-I-Konzentration im 0-Medium (P > 0,05; Abbildung 28; Abbildung 29).
86
vor Zellkontakt nach Zellkontakt 0
20 40 60
IGF-I (ng/ml)
Abbildung 28: Insulinähnlicher Wachstumsfaktor-I (IGF-I)-Konzentration in ng/ml im Zellkulturmedium vor Kontakt mit Hepatozyten und nach viertägiger Kultivierung der HepG2-Zellen, dargestellt ist jeweils der Median und der Interquartil-Abstand
vor Zellkontakt nach Zellkontakt 0
10 20 30
IGF-II (ng/ml)
Abbildung 29: Insulinähnlicher Wachstumsfaktor-II (IGF-II)-Konzentration in ng/ml im Zellkulturmedium vor Kontakt mit Hepatozyten und nach viertägiger Kultivierung der HepG2-Zellen, dargestellt ist jeweils der Median und der Interquartil-Abstand
87 4.2.3 Kurzzeit-Einfluss von Sexualsteroidhormonen auf die IGF-Produktion in
HepG2-Zellen
4.2.3.1 Hormonanalyse im Medium IGF-I
Nach 24 Stunden Kultur war die IGF-I-Konzentration in allen Medien höher als vor Versuchsstart (P < 0,05). Nach 48 Stunden Kultur und GH-Einwirkung war diese jedoch nur noch im P4- und E1, E2, P4-Medium erhöht.
Abbildung 30 zeigt die IGF-I-Konzentration im Medium pro 1 x 107 HepG2-Zellen als Differenz zur IGF-I-Konzentration vor Versuchsstart.
- - E1 E2 P4 E1, E2, P4 - - E1 E2 P4 E1, E2, P4 0
50 100 150
Zusätze:
GH-Stimulation
(24 h Inkubation): - - - + + + +
Inkubation im
Medium: 24 Stunden 48 Stunden
-- +
a
b
IGF-I (ng/ml)
Abbildung 30: Insulinähnlicher Wachstumsfaktor-I (IGF-I)-Konzentration pro 1 x 107 Zellen in den verschiedenen Medien nach 24 h und 48 h HepG2-Zellen-Kultur und Einwirkung von Wachstumshormon (GH), als Differenz zur IGF-I-Konzentration im Medium vor Versuchsstart;
dargestellt ist jeweils der Median und die Interquartil-Abstände; E1: Östron, E2: 17-β-Östradiol, P4: Progesteron; a, b: a ist niedriger als b (P > 0,05)
88
Nach 24 Stunden Kultur war lediglich die IGF-I-Konzentration im E1, E2, P4-Medium höher als im 0-Medium (P < 0,05). In allen anderen Medien waren die IGF-I-Konzentrationen vergleichbar (Abbildung 30).
Ferner war die IGF-I-Konzentration nach der Kultur über insgesamt 48 Stunden und GH-Einwirkung in allen Medien mit der nach 24 Stunden vergleichbar. Die Einwirkung von GH hatte keinen stimulierenden Effekt auf die IGF-I-Konzentration im Medium (Abbildung 30).
IGF-II
Im Vergleich zu der IGF-II-Konzentration vor Versuchsstart, war diese nach 24 Stunden nur im 0-Medium erniedrigt (P < 0,05), in den Hormonmedien aber mit der IGF-II-Konzentration im Medium vor Versuchsbeginn vergleichbar. Nach 48 Stunden Zellkultur war die IGF-II-Konzentration bereits im 0-Medium und im E1-, E2- und E1, E2, P4-Medium unter GH-Zusatz höher als vor Versuchsbeginn (P < 0,05), in den restlichen Medien war sie vergleichbar.
Die Abbildung 31 zeigt die IGF-II-Konzentration im Medium pro 1 x 107 HepG2-Zellen als Differenz zur IGF-II-Konzentration vor Versuchsstart.
89
Abbildung 31: Insulinähnlicher Wachstumsfaktor-II (IGF-II)-Konzentration pro 1 x 107 Zellen in den verschiedenen Medien nach 24 und 48 Stunden HepG2-Zellen-Kultur und Einwirkung von Wachstumshormon (GH), als Differenz zur IGF-II-Konzentration im Medium vor Versuchsstart, dargestellt ist jeweils der Median und die Interquartil-Abstände; E1: Östron, E2: 17-β-Östradiol, P4: Progesteron; a, b: a ist niedriger als b; c, d: c ist niedriger als d (P < 0,05)
Nach 24 Stunden Kultur war im Vergleich zum 0-Medium in allen Hormonmedien eine höhere IGF-II-Konzentration nachweisbar (P < 0,05). Nach GH-Einwirkung und insgesamt 48 Stunden Kultur war dieser Effekt nur noch im E1 und E1, E2, P4– Medium ersichtlich (P < 0,05; Abbildung 31). Außerdem war die IGF-II-Konzentration in allen Medien nach 24 Stunden und nach 48 Stunden vergleichbar (Abbildung 31).
Der Zusatz von GH führte zu einer signifikant geringeren IGF-II-Konzentration im 0-Medium, dies konnte jedoch in den Hormonmedien nicht beobachtet werden. Die IGF-II-Konzentration in den Medien mit E1 war sogar höher als im 0-Medium mit GH (P < 0,05; Abbildung 31).
90
4.2.3.2 PCR-Analyse der Zellen
Abbildung 32 zeigt die RA der IGF-II-mRNA in den HepG2-Zellen nach 48 Stunden Kultur in den verschiedenen Medien.
- - E1 E2 P4 E1, E2, P4 0
500 1000 1500
Zusätze:
GH-Stimulation
(24 h Inkubation): - + + +
Inkubation im
Medium: 48 Stunden
++
a a
b
IGF-II mRNA (RA)
Abbildung 32: Relative Expression der IGF-II mRNA nach 48 Stunden Kultur der HepG2, mit und ohne Wachstumshormon (GH); a, b: P < 0,05, als Housekeeping-Gene wurde β-Aktin verwendet; RA:
relativ abundance
Die relative Menge der IGF-II mRNA war bei Zellen, die im E2–Medium kultiviert wurden höher als bei den im 0-Medium kultivierten (P < 0.05). Es war kein Einfluss von GH auf die IGF-II-Expression zu erkennen (P > 0,05).
91 Zusammenfassung der Ergebnisse:
IGF-I
• GH hatte keinen Effekt auf die IGF-I-Konzentration im Zellkulturmedium
• außer im E1, E2, P4-Medium war kein Effekt von Sexualsteroidhormonen auf die IGF-I-Konzentration im Medium erkennbar
IGF-II
• GH hatte einen supprimierenden Effekt auf die IGF-II-Konzentration im Medium
• Der Zusatz von Sexualsteroidhormonen führte nach 24 Stunden generell zu einer Erhöhung der IGF-II-Konzentration im Medium
• In Medien mit E1 waren die IGF-II-Konzentrationen unter GH-Einwirkung höher als im 0-Medium
IGF-II mRNA
• GH hatte keinen Effekt auf die IGF-II-mRNA-Expression
• E2 führte zu einer Erhöhung der IGF-II-Expression
4.2.4 Langzeit-Einfluss von Sexualsteroidhormonen auf HepG2-Zellen 4.2.4.1 Hormonanalyse im Medium
Wichtig für das Verständnis der Ergebnisse dieses Versuches ist es zu beachten, dass die IGF-I- und -II-Konzentration in den Medien nur die IGF-Syntheseleistung der HepG2-Zellen über die letzten drei Tage hinweg widerspiegeln kann, da der letzte Mediumwechsel zum Entnahme-Zeitpunkt jeweils drei Tage zurück lag.
IGF-I
Im Vergleich zu der IGF-I-Konzentration vor Versuchsstart, war diese in allen Medien nach sieben Tagen Kultur unverändert, während sie nach 14 und nach 21 Tagen Kultur in allen Medien deutlich erniedrigt war (P < 0,05).
92
Abbildung 33: Insulinähnlicher Wachstumsfaktor-I (IGF-I)-Konzentration pro 1 x 107 Zellen in den verschiedenen Medien nach sieben und 14 Tagen, Mediumwechsel intermittierend jeden dritten und vierten Tag; Darstellung als Differenz zur IGF-I-Konzentration im Medium vor Versuchsstart, gezeigt ist jeweils der Median und die Interquartil-Abstände; E1: Östron, E2: 17-β-Östradiol, P4: Progesteron;*:
Unterschied zu IGF-I-Konzentration nach sieben Tagen Kultur (P < 0,05); a ,b: a ist niedriger als b (P
< 0,05), c, d: c ist niedriger als d (P < 0,05)
Nach sieben Tagen Kultur konnte kein stimulierender Effekt von Sexualsteroidhormonen auf die IGF-II-Konzentration im Medium festgestellt werden.
Im Gegenteil, die IGF-I-Konzentration im E1-Medium war sogar niedriger als im 0-Medium (P < 0,05). Auch im Vergleich zu der IGF-I-Konzentration nach sieben Tagen Kultur, war diese nach 14 Tagen deutlich niedriger (P < 0,05). Des Weiteren war die
93 IGF-I-Konzentration nach 14 Tagen im P4- und E1, E2, P4-Medium niedriger als im 0-Medium (P < 0,05), in den restlichen Medien war sie vergleichbar.
Abbildung 34 zeigt die IGF-I-Konzentration in den Medien pro 1 x 107 HepG2-Zellen nach 14 und 21 Tagen Kultur und anschließender GH-Einwirkung als Differenz zu der IGF-I-Konzentration vor Versuchsstart.
- E1 E2 P4 E1,E2,P4 - E1 E2 P4 E1,E2,P4 -20
-10 0 10 20
Zusätze:
GH-Stimulation
(24 h Inkubation): - - - + + + + +
Entnahmen der
Proben nach: 14 Tage 21 Tage
IGF-I (ng/ml)
Abbildung 34: Insulinähnlicher Wachstumsfaktor-I (IGF-I)-Konzentration pro 1 x 107 Zellen im Medium nach 14 und 21 Tagen Zellkultur, abschließende Wachstumshormon (GH)-Stimulation über 24 Stunden, Mediumwechsel intermittierend jeden dritten und vierten Tag, die IGF-I-Konzentrationen sind als Differenz zur IGF-I-Konzentration vor Versuchsstart angegeben, dargestellt ist jeweils der Median und die Interquartil-Abstände; E1: Östron, E2: 17-β-Östradiol, P4: Progesteron
Die IGF-I-Konzentration nach 21 Tagen HepG2-Kultur und GH-Einwirkung war in allen Medien mit der IGF-I-Konzentration nach 14 Tagen Zellkultur vergleichbar.
Ferner konnte auch kein Effekt von Sexualsteroidhormonen auf die IGF-I-Konzentration nach 21 Tagen Kultur und GH-Stimulation beobachtet werden.
94 IGF-II
Sowohl nach sieben und 14 wie auch nach 21 Tagen Kultur der HepG2-Zellen war die IGF-II-Konzentration im zuletzt zugesetzten Medium durchgehend höher als vor Versuchsstart (P < 0,05).
In Abbildung 35 ist die IGF-II-Konzentration in den jeweiligen Medien pro 1 x 107 HepG2-Zellen nach sieben und 14 Tagen Kultur als Differenz zu der IGF-II-Konzentration vor Versuchsstart dargestellt.
Abbildung 35: Insulinähnlicher Wachstumsfaktor-II (IGF-II)-Konzentration pro 1 x 107 Zellen in den verschiedenen Medien nach sieben und 14 Tagen, Mediumwechsel intermittierend jeden dritten und vierten Tag; Darstellung als Differenz zur IGF-II-Konzentration im Medium vor Versuchsstart, gezeigt ist jeweils der Median und die Interquartil-Abstände; E1: Östron, E2: 17-β-Östradiol, P4: Progesteron; *:
Unterschied zu IGF-II-Konzentration nach sieben Tagen Kultur (P < 0,05), a ,b: a ist niedriger als b (P
< 0,05)
Nach sieben Tagen Kultur war nur die IGF-II-Konzentration im E2-Medium höher als im 0-Medium (P < 0,05), in allen anderen Medien war sie vergleichbar (Abbildung
95 35). Außerdem war nach weiteren sieben Tagen Kultur (insgesamt 14 Tage) im zuletzt zugesetzten 0- und E1-Medium ein erneuter Anstieg von IGF-II erkennbar (P <
0,05). In den anderen Medien war die IGF-I-Konzentration nach 14 Tagen mit der nach sieben Tagen vergleichbar. Am Tag 14 der Zellkultur konnte kein Effekt der verschiedenen Hormonmedien auf die IGF-II-Konzentration nachgewiesen werden, sie war in allen Medien vergleichbar (P > 0,05; Abbildung 35).
Abbildung 36 zeigt die IGF-II-Konzentration in den Medien pro 1 x 107 HepG2-Zellen nach 14 und 21 Tagen Kultur und anschließender GH-Einwirkung als Differenz zu der IGF-II-Konzentration vor Versuchsstart.
- E1 E2 P4 E1, E2, P4 - E1 E2 P4 E1, E2, P4
0 10 20 30 40 50
Zusätze:
GH-Stimulation
(24 h Inkubation): - - - + + + + +
Entnahmen der
Proben nach: 14 Tage 21 Tage
* *
a
b
IGF-II (ng/ml)
Abbildung 36: Insulinähnlicher Wachstumsfaktor-II (IGF-II)-Konzentration pro 1 x 107 Zellen im Medium nach 14 und 21 Tagen Zellkultur, abschließende Wachstumshormon (GH)-Stimulation über 24 Stunden, Mediumwechsel intermittierend jeden dritten und vierten Tag, die IGF-II-Konzentrationen ist als Differenz zur IGF-II-Konzentration vor Versuchsstart angegeben, dargestellt ist jeweils der Median und die Interquartil-Abstände; E1: Östron, E2: 17-β-Östradiol, P4: Progesteron; *: Unterschied zu IGF-II-Konzentration nach sieben Tagen Kultur (P < 0,05) a, b: a ist niedriger als b (P < 0,05)
96
Nach 21 Tagen Kultur und 24 Stunden GH-Einwirkung war die IGF-II-Konzentration im Vergleich zu der nach 14 Tagen unverändert. Interessanterweise war aber die IGF-II-Konzentration im zuletzt zugesetzten E2-Medium höher als im Basalmedium (P < 0,05).
4.2.4.2 PCR-Analyse der Zellen
Abbildung 37 und Abbildung 38 zeigen die relative Menge der IGF-II-Expression in den HepG2-Zellen nach sieben, 14 und 21 Tagen Kultur in den verschiedenen Medien und finaler GH-Einwirkung über 24 Stunden.
- E1 E2 P4 E1, E2. P4 - E1 E2 P4 E1, E2, P4 0
1000 2000 3000
Zusätze:
GH-Stimulation
(24 h Inkubation): - - - -
-Entnahmen der
Proben nach: 7 Tage 14 Tage
- - - -
-IGF-II mRNA Expression
Abbildung 37: Relative Menge (RA) der IGF-II mRNA nach sieben und 14 Tagen Kultur der HepG2, mit und ohne Wachstumshormon (GH), als Housekeeping-Gene wurde β-Aktin verwendet
97 Die IGF-II-Expression war nach sieben und nach 14 Tagen Kultur in den verschiedenen Medien vergleichbar (Abbildung 37).
- E1 E2 P4 E1, E2, P4 - E1 E2 P4 E1, E2, P4 0
1000 2000 3000
Zusätze:
GH-Stimulation
(24 h Inkubation): - - - + + + + +
Entnahmen der
Proben nach: 14 Tage 21 Tage
IGF-II mRNA Expression
Abbildung 38: Relative Expression der IGF-II mRNA nach 14 und 21 Tagen Kultur der HepG2, mit
Abbildung 38: Relative Expression der IGF-II mRNA nach 14 und 21 Tagen Kultur der HepG2, mit