4 Ergebnisse
4.2 In vitro Versuch
4.2.2 Charakterisierung von HepG2-Zellen
4.2.2.2 Nachweis des GHR auf HepG2-Zellen mittels Durchflusszytometrie84
GHR exprimieren. Hepatozyten, welche vor der Inkubation mit einem Fluoreszenzfarbstoff-markierten Antikörper gegen GHR mit Hilfe von Ethanol permeabilisiert wurden, zeigten eine höhere (213 ± 180 FI) mittlere PE-Fluoreszenz-Intensität (FI) für Licht der Wellenlänge 580 nm ± 30 verglichen mit HepG2-Zellen
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85 deren GHR nicht durch Vorbehandlung für den GHR-Antikörper zugänglich gemacht wurden (81 ± 38 FI). Durch eine weitere Behandlung der HepG2-Zellen mit Triton zur Permeabilisierung verstärkte sich dieser Effekt (958 ± 513 FI, Abbildung 27).
Abbildung 27: Fluoreszenzprofil der HepG2-Zellen; rot: Negativkontrolle, nicht permeabilisierte HepG2-Zellen, keine Bindung des GHR-Antikörpers, grün: mit Ethanol fixierte HepG2-Zellen, nur eingeschränkte Bindung des GHR-Antikörpers, blau: mit Triton vorbehandelte HepG2-Zellen, mit Fluoreszenzfarbstoff-markiertem GHR-Antikörper behandelt.
4.2.2.3 IGF-Konzentration im Medium nach Kultur mit HepG2-Zellen
Die viertägige Kultivierung von HepG2-Zellen führte zu keiner Veränderung der IGF-I- und –IIGF-I-Konzentration im 0-Medium (P > 0,05; Abbildung 28; Abbildung 29).
86
vor Zellkontakt nach Zellkontakt 0
20 40 60
IGF-I (ng/ml)
Abbildung 28: Insulinähnlicher Wachstumsfaktor-I (IGF-I)-Konzentration in ng/ml im Zellkulturmedium vor Kontakt mit Hepatozyten und nach viertägiger Kultivierung der HepG2-Zellen, dargestellt ist jeweils der Median und der Interquartil-Abstand
vor Zellkontakt nach Zellkontakt 0
10 20 30
IGF-II (ng/ml)
Abbildung 29: Insulinähnlicher Wachstumsfaktor-II (IGF-II)-Konzentration in ng/ml im Zellkulturmedium vor Kontakt mit Hepatozyten und nach viertägiger Kultivierung der HepG2-Zellen, dargestellt ist jeweils der Median und der Interquartil-Abstand
87 4.2.3 Kurzzeit-Einfluss von Sexualsteroidhormonen auf die IGF-Produktion in
HepG2-Zellen
4.2.3.1 Hormonanalyse im Medium IGF-I
Nach 24 Stunden Kultur war die IGF-I-Konzentration in allen Medien höher als vor Versuchsstart (P < 0,05). Nach 48 Stunden Kultur und GH-Einwirkung war diese jedoch nur noch im P4- und E1, E2, P4-Medium erhöht.
Abbildung 30 zeigt die IGF-I-Konzentration im Medium pro 1 x 107 HepG2-Zellen als Differenz zur IGF-I-Konzentration vor Versuchsstart.
- - E1 E2 P4 E1, E2, P4 - - E1 E2 P4 E1, E2, P4 0
50 100 150
Zusätze:
GH-Stimulation
(24 h Inkubation): - - - + + + +
Inkubation im
Medium: 24 Stunden 48 Stunden
-- +
a
b
IGF-I (ng/ml)
Abbildung 30: Insulinähnlicher Wachstumsfaktor-I (IGF-I)-Konzentration pro 1 x 107 Zellen in den verschiedenen Medien nach 24 h und 48 h HepG2-Zellen-Kultur und Einwirkung von Wachstumshormon (GH), als Differenz zur IGF-I-Konzentration im Medium vor Versuchsstart;
dargestellt ist jeweils der Median und die Interquartil-Abstände; E1: Östron, E2: 17-β-Östradiol, P4: Progesteron; a, b: a ist niedriger als b (P > 0,05)
88
Nach 24 Stunden Kultur war lediglich die IGF-I-Konzentration im E1, E2, P4-Medium höher als im 0-Medium (P < 0,05). In allen anderen Medien waren die IGF-I-Konzentrationen vergleichbar (Abbildung 30).
Ferner war die IGF-I-Konzentration nach der Kultur über insgesamt 48 Stunden und GH-Einwirkung in allen Medien mit der nach 24 Stunden vergleichbar. Die Einwirkung von GH hatte keinen stimulierenden Effekt auf die IGF-I-Konzentration im Medium (Abbildung 30).
IGF-II
Im Vergleich zu der IGF-II-Konzentration vor Versuchsstart, war diese nach 24 Stunden nur im 0-Medium erniedrigt (P < 0,05), in den Hormonmedien aber mit der IGF-II-Konzentration im Medium vor Versuchsbeginn vergleichbar. Nach 48 Stunden Zellkultur war die IGF-II-Konzentration bereits im 0-Medium und im E1-, E2- und E1, E2, P4-Medium unter GH-Zusatz höher als vor Versuchsbeginn (P < 0,05), in den restlichen Medien war sie vergleichbar.
Die Abbildung 31 zeigt die IGF-II-Konzentration im Medium pro 1 x 107 HepG2-Zellen als Differenz zur IGF-II-Konzentration vor Versuchsstart.
89
Abbildung 31: Insulinähnlicher Wachstumsfaktor-II (IGF-II)-Konzentration pro 1 x 107 Zellen in den verschiedenen Medien nach 24 und 48 Stunden HepG2-Zellen-Kultur und Einwirkung von Wachstumshormon (GH), als Differenz zur IGF-II-Konzentration im Medium vor Versuchsstart, dargestellt ist jeweils der Median und die Interquartil-Abstände; E1: Östron, E2: 17-β-Östradiol, P4: Progesteron; a, b: a ist niedriger als b; c, d: c ist niedriger als d (P < 0,05)
Nach 24 Stunden Kultur war im Vergleich zum 0-Medium in allen Hormonmedien eine höhere IGF-II-Konzentration nachweisbar (P < 0,05). Nach GH-Einwirkung und insgesamt 48 Stunden Kultur war dieser Effekt nur noch im E1 und E1, E2, P4– Medium ersichtlich (P < 0,05; Abbildung 31). Außerdem war die IGF-II-Konzentration in allen Medien nach 24 Stunden und nach 48 Stunden vergleichbar (Abbildung 31).
Der Zusatz von GH führte zu einer signifikant geringeren IGF-II-Konzentration im 0-Medium, dies konnte jedoch in den Hormonmedien nicht beobachtet werden. Die IGF-II-Konzentration in den Medien mit E1 war sogar höher als im 0-Medium mit GH (P < 0,05; Abbildung 31).
90
4.2.3.2 PCR-Analyse der Zellen
Abbildung 32 zeigt die RA der IGF-II-mRNA in den HepG2-Zellen nach 48 Stunden Kultur in den verschiedenen Medien.
- - E1 E2 P4 E1, E2, P4 0
500 1000 1500
Zusätze:
GH-Stimulation
(24 h Inkubation): - + + +
Inkubation im
Medium: 48 Stunden
++
a a
b
IGF-II mRNA (RA)
Abbildung 32: Relative Expression der IGF-II mRNA nach 48 Stunden Kultur der HepG2, mit und ohne Wachstumshormon (GH); a, b: P < 0,05, als Housekeeping-Gene wurde β-Aktin verwendet; RA:
relativ abundance
Die relative Menge der IGF-II mRNA war bei Zellen, die im E2–Medium kultiviert wurden höher als bei den im 0-Medium kultivierten (P < 0.05). Es war kein Einfluss von GH auf die IGF-II-Expression zu erkennen (P > 0,05).
91 Zusammenfassung der Ergebnisse:
IGF-I
• GH hatte keinen Effekt auf die IGF-I-Konzentration im Zellkulturmedium
• außer im E1, E2, P4-Medium war kein Effekt von Sexualsteroidhormonen auf die IGF-I-Konzentration im Medium erkennbar
IGF-II
• GH hatte einen supprimierenden Effekt auf die IGF-II-Konzentration im Medium
• Der Zusatz von Sexualsteroidhormonen führte nach 24 Stunden generell zu einer Erhöhung der IGF-II-Konzentration im Medium
• In Medien mit E1 waren die IGF-II-Konzentrationen unter GH-Einwirkung höher als im 0-Medium
IGF-II mRNA
• GH hatte keinen Effekt auf die IGF-II-mRNA-Expression
• E2 führte zu einer Erhöhung der IGF-II-Expression
4.2.4 Langzeit-Einfluss von Sexualsteroidhormonen auf HepG2-Zellen